Medios diferenciales

Medios diferenciales
Son empleados para detectar reacciones bioqumicas, con carcter diferencial de grupos, gneros o especies microbianas, mediante el viraje de color del indicador presente en el medio, demostrando algunas de sus caractersticas. Estos medios son el TSI, LIA, Citrato de Simmons, SIM, Caldo rea.

Medios diferenciales
LIA
UREA

TSI (Triple Sugar Iron)

Color: rojo ladrillo
Inhibidores: no tiene Indicador: rojo de fenol Sustratos principales: lactosa, sacarosa y glucosa (la proporcin en el medio de lactosa y sacarosa es de 10: 1 con la glucosa) Sustratos secundarios: tiosulfato sdico, peptona, citrato frrico amoniacal y extractos.

Se siembra por picadura profunda con aguja y luego se siembra por estras en el pico

TSI (Triple Sugar Iron)

TSI (Triple Sugar Iron)

En este medio se busca determinar la capacidad de la bacteria para degradar los azcares y la formacin de gas y de H2S.La fermentacin aerbica se produce en el pico de tubo y la anaerbica en el fondo del tubo. La degradacin de la lactosa ocurre en la parte superior, la de la sacarosa en la parte intermedia y la de la glucosa en la parte profunda, producindose un viraje del rojo al amarillo. El tiosulfato es reducido a H2S quien reacciona con el citrato frrico amoniacal para dar formacin al sulfuro de fierro que es de color negro.

La presencia de gas se debe al CO2 producto de la fermentacin.

TSI (Triple Sugar Iron)

1.- Rx en bacterias glucosa, lactosa y sacarosa +

A/A +;Ej.:

A/A -;Ej.:

Escherichia coli

Vibrio cholerae

TSI (Triple Sugar Iron)

A/A ++, ++
Ej.: Citrobacter freundii

TSI (Triple Sugar Iron)

2.- Rx en bacterias solo fermentadoras de glucosa (glucosa +; lactosa y sacarosa -)

K/A -, ++++ Ej.: Proteus

K/A -;Ej.: Shigella

mirabilis

flexneri

TSI (Triple Sugar Iron)

3.- Bacilos no fermentadores

N/N -;Pseudomonas * Este resultado no es de una enterobacteria

LIA (Lysine Iron Agar)

Color: lila
Inhibidores: no tiene Indicador: prpura de bromocresol

Sustratos principales: lisina y glucosa

Sustratos secundarios: peptona, tiosulfato de sodio, extracto de levaduras. Se siembra por picadura profunda con aguja y luego por estras en el pico

LIA (Lysine Iron Agar)

LIA (Lysine Iron Agar)

En este medio se permite evidenciar la descarboxilacin del aminocido lisina en la diamina cadaverina, como tambin la desaminacin de la lisina en un alfa cetocido. Esta 2 reacciones se ponen de manifiesto por el viraje del indicador prpura de bromocresol. La formacin de H2S se pone de manifiesto por la presencia del tiosulfato sdico, que dar formacin al sulfato frrico. Tambin puede verificarse la formacin de gas a partir de la degradacin de la glucosa.

LIA (Lysine Iron Agar)

1.- Lisina descarboxilasa +
lisina descarboxilasa

Lisina

cadaverina (alcaliniza el medio)

Ej.: Escherichia coli

LIA (Lysine Iron Agar)

2.- Lisina descarboxilasa +, H2S +

Ej.: Salmonella

LIA (Lysine Iron Agar)

3.- Lisina descarboxilasa -

Ej.: Shigella

LIA (Lysine Iron Agar)

4.- Lisina deaminasa +

Lisina

Lisina deaminasa

alfa cetcido

Ej.: Proteus mirabilis

LIA (Lysine Iron Agar)

N/N -;Pseudomonas * Este resultado no es de una enterobacteria

Citrato de Simmons
Color: verde
Inhibidor: no tiene Indicador: azul de bromotimol

Sustrato principal: citrato de sodio

Sustratos secundarios: fosfato dipotsico, cloruro de sodio, sulfato de magnesio y fosfato monoamnico.

Se siembra por picadura profunda con aguja y luego por estras en el pico.

Citrato de Simmons

Citrato de Simmons
Este medio nos permite comprobar la capacidad de la bacteria de utilizar el citrato como fuente exclusiva de carbono. La degradacin del citrato conlleva a la alcalinizacin del medio y el viraje del indicador azul de bromotimol de verde a azul prusia.

Con este medio podemos diferenciar entre las coliformes fecales y bacterias de los grupos Enterobacter y Citrobacter as como algunas especies del grupo Salmonella.

Citrato de Simmons
1.- Citrato positivo:
La bacteria consume el citrato como fuente exclusiva de carbono Cit- Na+
citritasa

Cit+ Na+ OH alcaliniza el medio

Ej.: Klebsiella pneumoniae

Citrato de Simmons
2.- Citrato negativo

La bacteria no consume el citrato como fuente de carbono.

Ej.: Escherichia coli

SIM (Sulfuro-Indol-Motilidad)
Color: crema Inhibidores: no tiene Indicador: no tiene Sustrato principal: peptona Sustrato secundario: tiosulfato sdico, hierro y amonio Este medio se utiliza para comprobar la motilidad, la formacin de H2S y la produccin de indol por parte de la bacteria. Se siembra por picadura

SIM (Sulfuro-Indol-Motilidad)
La motilidad se pone de manifiesto por la turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del canal de la picadura. La no motilidad se caracteriza por el crecimiento producido exclusivamente a lo largo de la lnea de inoculacin. La produccin de H2S se reconoce por el ennegrecimiento de la zona de crecimiento o del medio debido a la presencia del tiosulfato sdico. Para la demostracin del indol se usa el rvo de Kovacs, que manifiesta la degradacin del triptfano por la enzima triptofanasa en indol, que se combina con el aldehdo presente en el rvo de Kovacs, para producir un color rojo.

SIM (Sulfuro-Indol-Motilidad)
1.- Motilidad positiva Presencia de turbidez difusa en el medio.
Ej.: Escherichia

2.- Motilidad negativa

Presencia de crecimiento solo en el sitio de puncin Ej.: Klebsiella

coli

oxytoca

SIM (Sulfuro-Indol-Motilidad)
1.- H2S positivo 2.- H2S negativo

Ej.: Proteus vulgaris

Ej.: Escherichia coli

SIM (Sulfuro-Indol-Motilidad)
1.- Indol positivo 2.- Indol negativo

Ej.: Escherichia coli

Ej.: Salmonella sp.

Caldo rea
Color: rosado Inhibidor: no tiene

Indicador: rojo de fenol

Sustrato principal: rea Sustrato secundario: extracto de levaduras, fosfato monopotsico y fosfato disdico. Este medio no se autoclava

Caldo rea
En este medio se observa la capacidad de la bacteria de degradar la rea por medio de la enzima ureasa formando amoniaco y carbonato de amonio, que alcalinizan el medio por lo cual el rojo de fenol vira a un rojo cereza. Bacterias rea + rpida: Proteus y Providencia Bacterias rea + retardada: Klebsiella, Citrobacter y

Enterobacter.
Shigella

Bacterias rea negativa: Escherichia coli, Salmonella,

Caldo rea
1.- rea positiva
Rpida Ejm.: Proteus Retardada Ejm.: Klebsiella

mirabilis

pneumoniae

Caldo rea
2.- rea negativa

Ej.: Escherichia coli

Otros medios diferenciales y pruebas bioqumicas

KIA (Kligler Iron Agar)

Color: rojo
Inhibidor: no tiene Indicador: rojo de fenol

Sustratos principales: lactosa y glucosa

Sustratos secundarios: peptona, extractos y tiosulfato sdico.

Se siembra por picadura profunda con aguja y luego se siembra por estras en el pico

KIA (Kligler Iron Agar)

Este medio se emplea para la identificacin de bacilos gram basada en la fermentacin de la lactosa y la glucosa y en la produccin de H2S.
Los organismos que fermentan glucosa pero no lactosa mostrarn un crecimiento K/A, mientras que los que si fermentan lactosa mostrarn un resultado A/A, con o sin formacin de gas . La formacin de H2S se demostrar por el ennegrecimiento del medio. Si el tubo no muestra ningn cambio es porque la bacteria no consume ni lactosa ni glucosa.

KIA (Kligler Iron Agar)

A/A +;Ejm: Escherichia

K/A -;Ejm:Shigella

K/A -;++++

coli

Ejm: Proteus

MIO (Motilidad-Indol-Ornitina)
Color: lila Inhibidor: no tiene Indicador: prpura de bromocresol

Sustratos principales: ornitina y glucosa.

Sustratos secundarios: peptona, triptona y extractos.

Se siembra por picadura profunda

MIO (Motilidad-Indol-Ornitina)
Este medio se usa para la identificacin de enterobacterias en base a su movilidad, produccin de indol y actividad de ornitina descarboxilasa. El aminocido ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina descraboxilasa para producir la diamina putrescina y CO2, implicando una alcalinizacin del medio. La motilidad se demuestra por un enturbamiento del medio o un crecimiento que se difunde desde la lnea de inoculacin. Los cultivos no mviles no muestran este crecimiento difuso, sino que ms bien crecen a lo largo de la lnea de inoculacin. La prueba del indol se basa e la eaccin que s eproduce con el rvo de Kovacs.

MIO (Motilidad-Indol-Ornitina)
M: negativa I: positivo

O: negativo
Ej.: Klebsiella oxytoca

MIO (Motilidad-Indol-Ornitina)
M: positiva I: negativo

O: positiva
Ej: Enterobacter aerogenes

MIO (Motilidad-Indol-Ornitina)
M: positiva I: positivo O: positivo

Ej.: Escherichia coli

Prueba de la Catalasa o Peroxidasa

La catalasa es una enzima respiratoria presente en las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que descomponen el H2O2 que se forma como producto final del metabolismo de los carbohidratos, que reacciona y forma H2O y O2. En los tubos con la bacteria desarrollada se le vierte 2 gotas de H2O2 y si inmediatamente se forman burbujas se anota que la prueba es +; de no existir burbujas, la prueba es negativa. Esta prueba sirve para diferenciar cultivos de Streptococcus y Staphylococcus, ya que el Staphylococcus es catalasa + y el Streptococcus es catalasa - . Del mismo modo sucede con Bacillus que es catalasa + y Clostridium que es -

Prueba de la Catalasa o Peroxidasa

Prueba de la Coagulasa
La coagulasa es una enzima semejante a la protrombina, producida por ms del 96% de Staphyloccocus patgenos. La coagulasa libre es liberada por la bacteria en el medio que la rodea, siendo su determinacin realizada en tubos. El clumping factor est fijado a la bacteria y depende de una sustancia de la membrana microbiana, que se combina con el fibringeno del plasma y favorece la aglomeracin de Staphylococcus, realizndose en un portaobjetos. Generalmente la coagulasa libre y el clumpling factor coexisten en las cepas patgenas.

Prueba de la Coagulasa

Coagulasa +

Coagulasa -

Prueba de la Coagulasa
1.- Determinacin de la coagulasa libre
Se hacen subcultivos a partir de cepas seleccionadas en caldo Infusin Cerebro-Corazn y se deja incubando a 37C 24h. Aadir 0,1ml del cultivo a 0,3ml de plasma y dejar incubando a 37C. A las 4h examinar los tubos para ver si el medio aparece coagulado, si es negativo, se examina hasta las 24h. Interpretacin: Negativo: Ningn signo de formacin de fibrina Positivo: - 1+: Presencia de pequeos cogulos organizados

Prueba de la Coagulasa
- 2+: pequeo o pequeos cogulos organizados. - 3+: gran cogulo organizado.

- 4+: todo el contenido aparece coagulado.

2.- Determinacin del clumping factor Se colocan sobre un portaobjetos 2 gotas de SSF estril y en ella se homogeniza la cepa con un asa. Dejar caer una gota de plasma y homogenizar durante 15 a 20, en este perodo de tiempo, se observar que si los Sthaphylococus se agrupan rpidamente son coagulasa + y si la cepa permanece sin cambios es coagulasa -.

Prueba de la Coagulasa

Prueba de la Coagulasa

Prueba de la Citocromo Oxidasa

La reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidacin del citocromo que es reducido por el oxgeno molecular que produce agua o perxido de hidrgeno segn la especie bacteriana. La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para identificar todas las especies de Neisseria (+)y diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias. El reactivo ms recomendado para esta prueba es el rvo de Kovacs, ya que es menos txico y ms sensible que el rvo de Gordon y Mc Leod. Este reactivo tie las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a prpuranegruzco intenso.

Prueba de la Citocromo Oxidasa

Mtodo en placa directa Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla. Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reaccin se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos.

Prueba de la Citocromo Oxidasa

Mtodo indirecto sobre papel

Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri. Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel. Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado. La reaccin de color positiva se produce a los 5-10 segundos.

Prueba de la Citocromo Oxidasa

Prueba de la Citocromo Oxidasa