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CarboxiHb Tecnica
CarboxiHb Tecnica
DE SODIO
VALIDACIN DEL MTODO PARA DETERMINACIN DE CARBOXIHEMOGLOBINA EN SANGRE TOTAL POR TCNICA ESPECTROFOTOMTRICA CON REDUCCIN CON DITIONITO DE SODIO
DIANA SHIRLEY RIOS DIAZ Cdigo: 05598358 Proyecto de Grado para optar al ttulo de Magster en Toxicologa
Directora: NANCY PATIO REYES Profesora Asociada Departamento de Toxicologa Facultad de Medicina
A Dios por permitirme alcanzar esta meta A mis Padres por su apoyo incondicional A mis hermanas, mis mayores cmplices Y a mis amigos
AGRADECIMIENTOS
A la profesora Nancy Patio Reyes por su valiosa colaboracin como mi directora, orientndome en este proyecto, apoyndome en cada paso.
Al departamento de Toxicologa y a todas las personas que hicieron posible la realizacin de ste trabajo
CARBOXIHEMOGLOBINA
SANGRE
TCNICA
CARBOXYHEMOGLOBIN
TOTAL
RESUMEN EN ESPAOL
Para evaluar la exposicin a CO se utiliza la COHB, por lo que el objetivo de este trabajo fue validar el mtodo para determinacin de sta por espectrofotometra, esta prueba se basa en la reduccin de la
Oxihemoglobina y la metahemoglobina al agregar Ditionito de Sodio. Los resultados obtenidos mostraron que la precisin tena un CV < al 10% en cada uno de los niveles y valores aceptables segn la media propuesta para cada control, al realizar el anlisis de varianza en la precisin intermedia de
los resultados, estos fueron admitidos. Adems no se observaron interferencias por lipemia o cianohemoglobina. La muestra procesada fue estable durante 15 das sin mostrar cambios significativos. En conclusin el desempeo del mtodo fue satisfactorio y coinciden con otros estudios de validacin realizados para ste mtodo, por lo que se puede considerar como una buena alternativa de cuantificacin de Carboxihemoglobina.
To assess exposure to CO, the COHB is used, so the aim of this study was to validate the method for determining it by spectrophotometry This test is based on the reduction of oxyhemoglobin and methemoglobin by adding sodium dithionite. The results showed that the accuracy had a CV <10% in each of the levels and acceptable values based on average proposal for each control, to perform the analysis of variance in accuracy intermediate results, they were admitted. In addition there were no lipemia or cianohemoglobina interference. The processed sample was stable for 15 days without showing significant changes. In conclusion, the performance method was satisfactory and consistent with other validation studies performed for this method, so it can be seen as a good alternative measurement of carboxyhemoglobin
TRADUCCION
CLAVES EN INGLS
_________________________________
Lista de Tablas
IX
Lista de Tablas
Tabla 1 Ventajas y desventajas de la espectrofotometra Vs. La Cromatografa gaseosa .............................................................................. 14 Tabla 2 Niveles de COHB para repetibilidad .............................................. 28 Tabla 3 Precisin Intermedia del nivel 1 ..................................................... 29 Tabla 4. Precisin Intermedia del Nivel 2 ................................................... 29 Tabla 5. Precisin Intermedia del Nivel 3 ................................................... 29 Tabla 6. Anlisis de Varianza Nivel 1 ........................................................ 30 Tabla 7. Anlisis de Varianza Nivel 2 ......................................................... 30 Tabla 8. Anlisis de Varianza Nivel 3 ......................................................... 30 Tabla 9. Porcentaje de COHB Vs. Concentracin plasmtica de triglicridos. ................................................................................................................... 31 Tabla 10. Porcentaje de COHB en muestra contaminada con Cianuro de Potasio ....................................................................................................... 32 Tabla 11. Niveles de COHB en sujetos expuestos y no expuestos a CO ... 34 Tabla 12. Comparacin de resultados entre el mtodo de Haldane y el mtodo de Bleuter & west con ditionito ...................................................... 36
Contenido
Lista de Figuras
Figura 1. Espectros de absorcin de las diferentes especies hemoglobnicas. ......................................................................................... 15 Figura 2. Absorcin de la Hemoglobina a 432 nm %COHB de 3,2 ........... 18 Figura 3. Absorcin de la Carboxihemoglobina a 420 nm %COHB de 22,5 ................................................................................................................... 18 Figura 4. Absorcin de la Hemoglobina a 432 nm %COHB de 60,5 ........ 19 Figura 5. Porcentaje de COHB a travs del tiempo .................................... 33
Contenido
XI
Abreviaturas
Abreviatura COHB HHB MetHB O2HB Trmino Carboxihemoglobina Hemoglobina Metahemoglobina Oxihemoglobina
XII
Contenido
Anexos
Anexo 1. Consentimiento informado de participacin en el estudio
Contenido
XIII
Contenido
Lista de Tablas ............................................................................................ IX Lista de Figuras ........................................................................................... X Abreviaturas ................................................................................................ XI Anexos ....................................................................................................... XII Resumen ..................................................................................................... 1 Introduccin ................................................................................................. 3 Planteamiento Del Problema ........................................................................ 5 Objetivos ...................................................................................................... 7 Objetivo General .................................................................................... 7 Objetivos Especficos ............................................................................ 7 1. Justificacin ........................................................................................... 8
2. Marco Conceptual .................................................................................... 9 2.1 2.2 Generalidades del Monxido de Carbono .................................... 9 Mecanismos de dao ................................................................. 10
2.2.1 Niveles de Carboxihemoglobina y manifestaciones clnicas .... 11 2.3 Anlisis de Carboxihemoglobina .................................................... 11 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 Pruebas de comparacin de color ....................................... 12 Co-Oximetros ...................................................................... 12 Cromatografa de Gases: .................................................... 13 Espectrofotometra .............................................................. 14
XIV
Contenido
3. Metodologa .......................................................................................... 17 3.1 Descripcin Del Procedimiento Analtico ....................................... 17 3.2 Materiales y Equipos ..................................................................... 19 3.2.1 Equipos ................................................................................... 19 3.2.2 Reactivos ................................................................................ 20 3.2.2.1 Preparacin de Reactivos .......................................... 20
3.2.3 Controles ................................................................................ 20 3.3 Procedimiento ................................................................................ 21 3.3.1 Clculos .................................................................................. 22 3.4 Diseo de la Validacin ................................................................. 22 3.4.1 Validacin de la metodologa optimizada. ................................ 22 3.4.2 3.5 3.6 Parmetros de desempeo ................................................. 23
4. Resultados ............................................................................................. 27 4.1 Precisin ........................................................................................ 27 4.1.2 Repetibilidad ............................................................................ 27 4.1.3 Precisin Intermedia ................................................................ 28 4.2 Especificidad ................................................................................. 31 4.3 Estabilidad de la Muestra............................................................... 32 4.4 4.5 5. 6. 7. Anlisis de muestras de pacientes ............................................. 33 Anlisis Adicionales ................................................................... 34
Resumen
Resumen
La contaminacin de nuestro medio ambiente por monxido de carbono es una de las ms importantes causas de intoxicacin y para evaluar la exposicin a ste gas se usa el anlisis de Carboxihemoglobina, como un Biomarcador de alta especificidad. Este anlisis permite al clnico diagnosticar a los pacientes, proponer un tratamiento y predecir un pronstico, tambin es esencial para determinar los niveles de exposicin ocupacional.
El objetivo del presente Trabajo fue validar el mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin de ditionito de sodio mediante espectrofotometra ultravioleta visible La metodologa se realiz utilizando controles comerciales para Cooximetra con valores determinados y unos rangos de aceptacin a base de hemoglobina humana purificada, estabilizantes y biocida en una matriz tamponada fisiolgicamente, de Instrumentation Laboratory. El Principio del mtodo indica que cuando se agrega ditionito de sodio como agente reductor a la sangre tanto la oxihemoglobina como la metahemoglobina pasan a la forma reducida, dando un espectro caracterstico, mientras que la mayor afinidad por el oxgeno que tiene la Carboxihemoglobina, evita que esta sea reducida, generando dos picos en diferente longitud de onda. Las absorbancias de los pigmentos son medidas a 420 y 432nm, a un pH de 6.85, con de absorcin de la COHB (mximo a 420nm) y de la HB a 432nm, en el anlisis se utilizo un Espectrofotmetro UV-Visible de Thermo
Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
Spectronic, modelo Heios Gamma, UVG 114504, longitud de onda 1901100 nm. Los parmetros evaluados fueron precisin, especificidad y estabilidad para muestras de sangre. Los Resultados obtenidos mostraron que la precisin tena un CV < al
10% en cada uno de los niveles y valores aceptables segn la media propuesta para cada control, al realizar el Anlisis de varianza para la precisin intermedia los resultados son admitidos. En cuanto a los interferentes no se observaron interferencias por lipemia o cianohemoglobina. Se observa que la lipemia y las altas concentraciones de triglicridos no presentan interferencia con los resultados de la COHB, tampoco se observ una variacin cuando se contamin la muestra con Cianuro de Potasio. La muestra procesada durante 15 das y conservada en refrigeracin no mostr cambios significativos en el porcentaje de saturacin de la COHB, siendo estable durante el tiempo de anlisis. En conclusin el desempeo del mtodo fue satisfactorio y coinciden con estudios de validacin realizados para ste mtodo por diversos autores; adems es una buena alternativa de cuantificacin de Carboxihemoglobina, dados los pocos mtodos que hay para hacerlo.
Introduccin
Introduccin
El monxido de carbono es considerado uno de los mayores contaminantes; sus principales fuentes son los vehculos automotores que utilizan gasolina o diesel y los procesos industriales cuyo aporte corresponde
aproximadamente a un 80% de las emisiones a la atmsfera. [1] Al ingresar al organismo el Monxido se une a la hemoglobina, formndose la Carboxihemoglobina COHB, por lo que sus niveles son un biomarcador de exposicin de alta especificidad. [2] Esta medicin es de suma importancia para hacer un diagnstico, guiar un tratamiento y predecir la evolucin de un paciente. Adems en el campo de la toxicologa ocupacional es primordial para conocer el nivel de exposicin de un trabajador al monxido de carbono. El laboratorio de Toxicologa de la Universidad Nacional debe responder a las necesidades de la poblacin para la medicin de Carboxihemoglobina y es por ello que busca validar un mtodo descrito en la literatura segn los modelos de aseguramiento de la calidad con el fin de estandarizarlo y obtener resultados confiables.
Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
Objetivos
Objetivos
Objetivo General
Validar el mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con ditionito de sodio.
Objetivos Especficos
Validar el mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con ditionito de sodio. Validar los parmetros de desempeo del mtodo de reduccin con ditionito de sodio para la determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total. Establecer el mtodo de anlisis rutinario de Carboxihemoglobina en el laboratorio de toxicologa de la Universidad Nacional. Realizar anlisis de Carboxihemoglobina en muestras de pacientes reales para verificar el comportamiento del mtodo validado.
Justificacin
1. Justificacin
La tcnica espectrofotomtrica para el anlisis de Carboxihemoglobina mediante el mtodo de reduccin con ditionito de sodio, est ampliamente descrita y evaluada por su sencillez, confiabilidad y bajo costo frente a tcnicas como la cromatografa de gases. Adems requiere poca cantidad de muestra y los resultados pueden obtenerse en corto tiempo, por lo que es importante en la determinacin de intoxicaciones agudas por CO dentro de la urgencia clnica. Permite diferenciar la COHB de otras especies hemoglobnicas pudindose obtener un porcentaje que permite clasificar los diferentes grados de exposicin y respuesta de un paciente o una poblacin, siendo esto de gran aplicacin en el rea ocupacional, ya que sus resultados permiten evaluar el riesgo de continuidad de un empleado en su sitio de trabajo. Mediante este estudio podemos conocer las ventajas y limitaciones del mtodo para ser implementado en forma rutinaria en el laboratorio de Toxicologa y en proyectos de investigacin del departamento.
Marco Conceptual
2. Marco Conceptual
2.1 Generalidades del Monxido de Carbono
El monxido de carbono es un gas, no irritante, sin olor, e inspido (Agency for Toxic Substances and Disease Registry [ATSDR] 2009). Tiene un peso molecular de 28,01, un punto de ebullicin de 191,5C, Punto de fusin de -205,02C, densidad de 1,250 g/L a 0C, es soluble en benceno (Hazardous Substances Data Bank [HSDB] 2010).
Las fuentes de exposicin a monxido de carbono incluyen inhalacin de humos de incendios, combustin de motores de vehculos, combustin incompleta de estufas de carbn, gasolina o keroseno, el cigarrillo y al cloruro de metileno. [3]
El CO es un producto intermedio de la combustin de todas las especies de carbn, en general las exposiciones no intencionales ocurren en incendios caseros o escapes de gas, tambin los trabajadores expuestos a humos de incendio o expuestos a ambientes contaminados como agentes de trnsito o conductores, y personas que utilizan cloruro de metileno de la fabricacin de pinturas; las exposiciones intencionales ocurren con fines suicidas. [4] Adems de la exposicin ambiental, nuestro organismo produce una
cantidad endgena de CO como resultado del catabolismo del HEM que puede llegar hasta el 0,7% en sujetos sanos. [5]
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Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
2.2
Mecanismos de dao
Una vez es absorbido, el monxido de carbono se une a la hemoglobina con una afinidad mayor que el oxgeno de 200 a 250 veces formando la Carboxihemoglobina. [6]
Esta unin disminuye la capacidad de la hemoglobina para unirse al oxgeno e impide la liberacin de este en los tejidos conllevando a una hipoxia celular, tambin interacta con los tomos de hierro de las citocromos impidiendo la cadena respiratoria mitocondrial, lo que empeora el cuadro. [1]
Los sntomas ms importantes se asocian principalmente al SNC y al corazn que son los rganos ms susceptibles a la hipoxia, sin embargo los signos de exposicin aguda a CO no son especficos e incluyen dolor de cabeza, fatiga, malestar, pensamiento confuso, nausea, mareo, disturbios visuales dolor en el pecho, dificultad para respirar, prdida de la
En las
personas que
tales ser ms de
para respirar o
dolor de
Los signos clsicos de intoxicacin por describen como labios de color rojo
cianosis
hemorragias retinianas.
Marco Conceptual
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produccin endgena de monxido de carbono, mientras que niveles de hasta un 5% pueden considerarse normales en entornos urbanos niveles de
o industriales.
monxido de carbono en los cigarrillos y los fumadores empedernidos por lo dems sanos pueden tolerar niveles de Carboxihemoglobina de hasta 15%. Los grados de intoxicacin han sido descritos como sin sntomas clnicos con COHB menores del 10%; la intoxicacin moderada por monxido de carbono con COHB entre el 10% y un 20-25%, con signos menores de intoxicacin, como dolor de cabeza, letargo o fatiga; y una intoxicacin grave por monxido de carbono con un nivel de COHB de ms de 20-25%, con prdida de la conciencia, confusin o signos de isquemia
cardiaca, o ambas [8], niveles mayores al 40% son incompatibles con la vida.
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Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
2.3.2 Co-Oximetros
Estos sistemas realizan una medicin al pasar una luz a travs de la muestra de sangre total, midiendo diferentes longitudes de onda, derivados de la hemoglobina poseen espectros de Los
absorbancia
caractersticos. Cada derivado absorbe la luz de manera diferente a diferentes longitudes de onda. Generalmente estn diseados para medir entre 4 y 128 longitudes de onda para las 4 principales especies hemoglobnicas (oxy, deoxy, carboxy y metahemoglobina) y se calculan segn la siguiente frmula:
Marco Conceptual
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Donde la O2HB, HHB, COHB y MetHB corresponden a os porcentajes de oxihemoglobina, deoxyhemoglobina, carboxyhemoglobina y metahemoglobina. [10]
En un estudio realizado [11] se encontr que en general los co-oximetros sobreestiman concentraciones menores o iguales a 2.5% por lo que pueden no ser tiles para algunas aplicaciones. Sin embargo en otro estudio los autores concluyeron que cuando hay ms de 4 longitudes de onda los COoximetros pueden eliminar interferencias de otras especies hemoglobnicas y ser muy preciso para la medicin de COHB en muestras post-mortem comparable con tcnicas espectrofotomtricas y cromatografa gaseosa. [12]
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Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
Tabla 1 Ventajas y desventajas de la espectrofotometra Vs. La Cromatografa gaseosa Principales ventajas y desventajas del mtodo espectrofotomtrico (manual y automatizado) y el mtodo de cromatografa gaseosa Espectrofotometra Cromatografa Gaseosa Ventajas: Ventajas: 1. Poca o ninguna preparacin de la 1. Alta especificidad para monxido de muestra carbono 2. Tiempo corto de anlisis (1 min por 2. No se afecta por sustancias Co-Oximetra) conocidas que causen interferencia 3. Fcil y Rpida Operacin espectral o qumica 4. Medicin de otro tipo de 3. Muy preciso (DE 0,1%) Hemoglobinas simultneamente 4. Muy poco volumen de muestra 2uL 5. Aplicable a sangre denaturada y de sangre muestra forenses luego del 5. Exactitud para todos los rangos de tratamiento apropiado saturacin de COHB (0-100%) 6. Puede ser altamente automatizado 6. Puede ser usado para otros anlisis (ciertos Co-Oximetros) tambin. 7. Costo relativamente bajo 8. Puede ser usado para otros anlisis tambin (manual) Desventajas Desventajas 1. Errores en la cuantificacin debido a 1. Considerable manipulacin y sustancias que causan interferencia preparacin de la muestra espectral o qumica 2. Requiere experiencia especializada 2. Inexactitud a bajas concentraciones para su operacin de COHB < 5% (DE >1%) 3. Muy larga para su uso en la urgencia 3. Sobreestimacin de COHB con rutinaria concentraciones mayores al 30% 4. Considerablemente costosa (aunque no sea importante 5. Se debe medir la HB t por otro clnicamente ni en forense) mtodo 4. Mejor uso en muestra bastante frescas
2.3.4 Espectrofotometra
La medicin del porcentaje de COHB en la sangre por la tcnica de espectrofotometra, se basa en comparacin de los espectros de absorcin de COHB con la oxihemoglobina o la hemoglobina reducida a una longitud de onda especifica, esta reduccin con un agente como el ditionito de sodio permite que la metahemoglobina y la oxihemoglobina se reduzcan ms no as la COHB, ya que el CO posee mayor afinidad por la hemoglobina, observndose diferencia mxima en los espectros a 540nm, mientras que a 579nm que es el punto isosbstico se presenta la misma absorbancia. [2]
Marco Conceptual
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La siguiente figura muestra los espectros de absorcin de las diferentes especies hemoglobnicas. [9]
Figura 1. Espectros de absorcin de las diferentes especies hemoglobnicas.
Diferentes autores han descrito varios mtodos para el anlisis de COHB por tcnica espectrofotomtrica, uno de estos utiliza una solucin de amonaco al 0,04% se hacen lecturas a 575 y 559 nm, este mtodo
descrito por Commins y Lawther ha sido criticado por su poca sensibilidad e interferencia con otras sustancias. [14] Otro mtodo el descrito por Beutler E & West C en 1984 [15], se basa en la produccin de 2 mezclas de pigmentos por la reduccin de oxihemoglobina y metahemoglobina con hidrosulfito de sodio, las absorbancias de los diferentes pigmentos se miden a 420 y 432nm, los resultados son reproducibles y estables si se mantiene un pH de 6,85 mediante el uso de soluciones buffer. Este mtodo es uno de los ms usados y ha mostrado buenos resultados para el anlisis de COHB. [16]
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Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
Metodologa
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3. Metodologa
3.1 Descripcin Del Procedimiento Analtico
Tcnica: Espectrofotometra Mtodo: Reduccin con Ditionito de Sodio segn descripcin de Ernest Beutler y Carol West. [15] Principio: Cuando se agrega Ditionito de Sodio como agente reductor a la sangre tanto la oxihemoglobina como la metahemoglobina pasan a la forma reducida, dando un espectro caracterstico, mientras que la mayor afinidad por el oxgeno que tiene la Carboxihemoglobina, evita que esta sea reducida, generando dos picos en diferente longitud de onda. Las absorbancias de los pigmentos son medidas a 420 y 432nm, a un pH de 6,85, los diferentes picos de absorcin de la COHB (mximo a 420nm) y de la HB reducida a 432nm se muestran en las siguientes figuras.
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Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
En concentraciones ms altas de Carboxihemoglobina como se muestran en las figuras 4 y 5 se observa que el espectro mximo se da a los 432nm
Metodologa
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Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
3.2.2 Reactivos
Potasio Dihidrogenofosfato, KH2PO4, M: 136.09g/mol Lote A917973824, Merck 1.04873.1000. Di-Potasio Hidrgeno Fosfato Anhidro, K2HPO4, M: 174,18g/mol Lote: 0000238908, PanReac. Sodio Ditionito, NaS2O4, M: 174,11g/mol Lote 0000158994, PanReac. 3.2.2.1 Preparacin de Reactivos Buffer: KH2PO4/K2HPO4, 0.1 mol/L, pH 6.85, ste buffer se debe mantener refrigerado. Solucin hemolizante: Buffer diluido 10 veces en agua, preparar cada semana. Solucin diluyente de COHB: Agregar 25 mg de Ditionito de Sodio en 20 mL del buffer justo antes de usar.
3.2.3 Controles
Utilizar controles para Co-oximetra con valores determinados y unos rangos de aceptacin a base de hemoglobina humana purificada, estabilizantes y biocida en una matriz tamponada fisiolgicamente, Laboratory. [17] de Instrumentation
Metodologa
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Nivel 1: con %COHb alto, coherente con los valores observados en victimas de inhalacin de humos y otras situaciones similares. Tiene una media establecida de 60,5%.
Referencia 3315250 MULTI -4 LEVEL 1, N1003500, Fecha de vencimiento: 31/12/2011 Nivel 2: es coherente con los valores observados en la poblacin normal. Est valorado en 3,2% de COHB Referencia 3314250 MULTI -4 LEVEL 2, N1003502, Fecha de vencimiento: 31/12/2011 Nivel 3: %COHB reflejan los lmites bajos clnicos, se valorado con un porcentaje de COHB de 22,5% Referencia 3313250 MULTI -4 LEVEL 3, N1003501, Fecha de vencimiento: 31/12/2011
3.3 Procedimiento
Utilizar sangre venosa tomada con Heparina de Sodio almacenadas de 4 a 8C. Agregar 100uL de sangre a 12mL de la solucin hemolizante y mezclar 3 veces Dejar a Temperatura ambiente por 10 minutos Tomar 100uL de este hemolizado y adicionarle 2.3mL de solucin diluyente de COHB Cubrir con parafilm, mezclar varias veces y dejar a temperatura ambiente por 10 minutos. Leer las absorbancias a 420 y 432nm, utilizar como blanco solucin diluyente de COHB.
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3.3.1 Clculos
Usar la siguiente ecuacin para calcular la fraccin de COHB (SCO) en sangre
AR es el radio A420/A432 del hemolizado en solucin diluyente COHB. Las tres constantes F1, F2, y F3 pueden ser calculadas de las absorbancias molares publicadas de la COHB a 420 y 432nm.
Precisin: Se describe como la proximidad de las medidas individuales de un analito cuando se aplica el procedimiento repetidamente a mltiples alcuotas de un volumen homogneo de la matriz biolgica. Se usan mnimo cinco determinaciones por concentracin. La precisin para cada
Metodologa
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Repetibilidad: resultados obtenidos por el mismo analista, el mismo da, en el mismo laboratorio. Estabilidad del analito: Se evalan las condiciones de almacenamiento (temperatura y recipiente) en el tiempo.
Calificacin del personal en el uso de los mtodos a validar. Calibracin de los instrumentos de medicin: espectrofotmetro, pHmetro y balanza analtica.
Se evalan los parmetros de desempeo de la metodologa propuesta comparada con la respuesta de los tres niveles de control as:
Precisin: La repetibilidad
controles en los rangos alto, medio y bajo con un nmero de rplicas de 10 en el mismo da por la misma analista. Las lecturas de absorbancia se realizarn por duplicado, se hallar promedio y CV. La precisin intermedia se lleva a cabo con los 3 niveles de control, con 5 rplicas en absorbancias. 5 diferentes das y lectura doble de las
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3.5
Implementacin
del
mtodo
en
muestras
humanas
Para comprobar el funcionamiento del mtodo se analizan 10 muestras de 4 personas no expuestas, de 4 personas expuestas (fumadores) y 2 muestras saturadas con monxido de carbono para tener los posibles niveles que podemos encontrar en los pacientes. A cada muestra se le realizar doble lectura. Se tendrn en cuenta los aspectos ticos para el manejo de muestras biolgicas reglamentados por la Universidad Nacional.
Metodologa
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Dilemas ticos inherentes a la investigacin El sujeto podra preocuparse por molestias durante la toma de la muestra, que se generan al pinchar la piel de la persona para obtener la muestra, adems por ser un proceso invasivo se pueden presentar riesgos que incluyen: Hematoma, Obstruccin de la aguja con fibrina, Infeccin y dolor en el sitio de la toma, trombosis, sangrado excesivo, desmayo o sensacin de mareo. Para evitar o minimizar estas complicaciones este procedimiento fue llevado a cabo por la investigadora que es bacteriloga con 5 aos de experiencia en la toma de muestras clnicas bajo las normas de bioseguridad para garantizarle todas las condiciones a la persona, se utiliz material nuevo y desechable para cada paciente. La toma de las muestras se realiz en presencia de un mdico que pudiese atender cualquier eventualidad que se presentase.
Procedimiento para la toma del consentimiento informado 1. Se explic al sujeto brevemente la investigacin a realizar. 2. Se pregunt al sujeto si deseaba participar en la investigacin. 3. Se dio a conocer el formulario del consentimiento informado. 4. Se explic al sujeto el contenido de dicho formulario. 5. Se solicitan las firmas correspondientes.
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Texto completo del formulario del Consentimiento informado Ver Anexo 1. Formato de toma de muestra Ver Anexo 2. Condiciones de Bioseguridad Las muestras fueron tomadas mediante el uso de sistema vacuntainer con agujas y tubos al vacio nuevos y estriles y el cambio de guantes entre toma y toma de muestras. El material usado fue descartado segn
protocolos de manejo de materiales de riesgo biolgico en guardianes de bioseguridad para material cortopunzante y bolsas rojas.
Resultados
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4. Resultados
4.1 Precisin
4.1.2 Repetibilidad
La repetibilidad se realiz aplicando el mtodo a controles en los rangos alto, medio y bajo con un nmero de rplicas de 10 en el mismo da, con lectura de absorbancias por duplicado, los resultados se presentan en la Tabla 2, se calcul la media, desviacin estndar y coeficiente de variacin para cada nivel.
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Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
Nivel 1 1 1B 1C 1D 1E 1F 1G 1H 1I 1J 1K 1L Media DE CV
%COHB 58,56 55,75 58,03 58,74 58,76 56,51 57,60 50,12 56,68 54,42 56,85 52,21 56,18 2,71 4,83
Nivel 2 2A 2B 2C 2D 2E 2F 2G 2H 2I 2J 2K 2L Media DE CV
%COHB 2,48 2,90 2,88 2,97 3,36 3,10 3,08 3,11 3,19 3,22 3,03 3,18 3,04 0,22 7,33
Nivel 3 3 3B 3C 3D 3E 3F 3G 3H 3I 3J 3K 3L Media DE CV
%COHB 17,21 18,40 18,02 17,99 18,18 18,07 18,33 18,55 18,40 17,76 18,00 18,81 18,14 0,41 2,26
Podemos observar que los coeficientes de variacin en los diferentes niveles no superan el 10%, el nivel 3 de concentracin media de COHB es el que menos variacin presenta mientras que el nivel bajo es el que ms vara, pero todos dentro del rango permitido.
29
%COHB DIA %COHB DIA %COHB DIA %COHB DIA %COHB DIA 1 57,32 57,14 58,36 58,66 58,92 2 58,17 57,43 58,09 56,19 57,76 3 59,11 56,56 57,99 54,63 55,24 4 49,30 57,67 57,11 59,84 58,23 5 55,99 56,05 57,29 51,98 49,91
%COHB DIA %COHB DIA %COHB DIA %COHB DIA %COHB DIA 1 4,47 4,68 4,77 4,91 5,03 2 4,91 5,03 4,96 5,17 5,08 3 4,74 4,90 5,13 4,97 5,01 4 4,66 4,79 4,97 4,93 4,97 5 4,42 4,79 4,48 5,04 4,81
%COHB DIA %COHB DIA %COHB DIA %COHB DIA %COHB DIA 1 17,72 20,36 19,60 20,15 19,42 2 19,69 16,59 17,58 18,82 15,53 3 19,65 20,35 21,13 18,73 19,04 4 19,47 18,57 22,35 19,48 18,40 5 18,10 20,92 22,26 23,98 21,48
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Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
Tabla 6. Anlisis de Varianza Nivel 1 Origen de las variaciones Entre grupos Dentro de los grupos Total 126,239435 169,442356 20 24 6,31197175 Suma de cuadrados 43,2029209 Grados de libertad 4 Promedio de los cuadrados 10,8007302 F 1,71114997 Probabilidad 0,18703536 Valor crtico para F 2,8660814
Tabla 7. Anlisis de Varianza Nivel 2 Valor Origen de las variaciones Entre grupos Dentro de los grupos Total 0,64032696 0,97791968 20 24 0,03201635 Suma de cuadrados 0,33759272 Grados de libertad 4 Promedio de los cuadrados F Probabilidad 0,06449945 crtico para F 2,8660814
0,08439818 2,63609637
31
Valor Origen de las variaciones Entre grupos Dentro de los grupos Total 37,4877492 51,3488019 20 24 1,87438746 Suma de cuadrados 13,8610528 Grados de libertad 4 Promedio de los cuadrados F Probabilidad 0,15911855 crtico para F 2,8660814
3,46526319 1,84874433
Los resultados del ANOVA no rechazan los resultados de la precisin intermedia, y permiten aceptarlos.
4.2 Especificidad
Se tom la muestra del sujeto 1 y se false con plasma lipmico para obtener diferentes concentraciones de Triglicridos (Anexo 3) y se obtuvieron los resultados que se muestran en la tabla 9, presentndose un CV de 2,8%.
Muestra
Rplica A B A B A B
TGN1
TGM2
471
TGA3
1.014
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Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
Para determinar posible interferencia de cianohemoglobina se contamin una muestra con 10 mg/dL de una solucin de Cianuro de Potasio que se identific como CC, la muestra sin cianuro se proces con el cdigo SC, los resultados se muestran en la tabla 101
Muestra SC
Rplica A B A B
CC
33
%COHB
3,9 3,8 3,7 3,6 3,5 3,4 3,3 3,2 3,1 3 2,9 3,84 3,7 3,54 3,4 3,3 3,22 %COHB
DIA 1
DIA 2
DIA 3
DIA 5
DIA 7
DIA 15
4.4
Para determinar el comportamiento del mtodo en muestra reales se tomaron muestra a 10 individuos en tubos con heparina de sodio. Los resultados se resumen en la siguiente tabla, se realiz doble montaje para cada muestra con diferentes grados de concentracin de COHB en cada muestra. Los resultados de cada paciente no muestran una variacin significativa entre cada rplica, y se correlacionan con los niveles de exposicin de los participantes.
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Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
Muestra SUJETO 1
Sexo F
Exposicin a CO No fuma
Rplica A B A B A B A B A B A B A B A B A B A B
%COHB 3,02 3,31 7,23 7,53 3,6 3,82 4,12 3,93 4,7 4,74 4,12 4,09 3,92 4,01 3,87 3,83 27,62 27,62 30,79 31,74
SUJETO 2
SUJETO 3
No fuma
SUJETO 4
No fuma
SUJETO 5
SUJETO 6
SUJETO 7
SUJETO 8
SUJETO 9
SUJETO 10
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utilizado en el laboratorio de Toxicologa de la Universidad Nacional [20], y simultneamente por el mtodo a implementar. Para cada mtodo se procesaron los tres niveles de control con resultados que permitieron aceptar los resultados de los pacientes. Se realiz una prueba t de student para comparar las dos medias estas muestran valores diferentes con un porcentaje ms bajos de COHB en las muestras procesadas por el mtodo de Haldane con una media de 2,77, mientras que las muestras reducidas con ditionito tiene un promedio de porcentaje de COHB de 3,9.
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Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
Tabla 12. Comparacin de resultados entre el mtodo de Haldane y el mtodo de Bleuter & west con ditionito
Muestra CONDUCTOR1 CONDUCTOR2 CONDUCTOR3 CONDUCTOR4 CONDUCTOR5 CONDUCTOR6 CONDUCTOR7 CONDUCTOR8 CONDUCTOR9 CONDUCTOR10 CONDUCTOR11 CONDUCTOR12 CONDUCTOR13 CONDUCTOR14 CONDUCTOR15 CONDUCTOR16 CONDUCTOR17 CONDUCTOR18
%COHB Ditionito 4,58 4,19 4,01 3,70 3,55 3,51 3,68 3,85 3,75 3,81 3,79 3,88 4,49 3,40 3,81 4,09 4,30 3,81 3,90
MEDIA
Discusin de Resultados
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Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
valorados para metahemoglobina por lo que esta especie hemoglobnica tampoco interfiere con este mtodo. La muestra procesada durante 15 das y conservada en refrigeracin no mostr cambios significativos en el porcentaje de saturacin de la COHB, siendo estable durante el tiempo de anlisis. Debe recordarse que la muestra debe estar completamente tapada en el tubo primario y guardada entre 4 y 8c. Al procesar muestras reales se correlacionan con las fuentes de exposicin a CO, obtenindose valores ms altos en pacientes que consumen cigarrillo, sin embargo no se compararon estos resultados con otro mtodo pero se procesaron junto a los controles que fueron aceptables. Al realizar anlisis de 18 conductores de buses por el mtodo propuesto para la validacin y el mtodo de Haldane, la prueba t de Student rechaza la igualdad de las dos medias, sin embargo el mtodo de Haldane no muestra resultados con cifras decimales, lo que puede influir en ste resultado, las muestras estaban tomadas en tubo tapa lila con EDTA, y fueron procesadas los mismos das, ambos mtodos fueron evaluados con los controles estaban dentro de los rangos aceptables, cabe enfatizar que estas muestras corresponden a personal expuesto por su profesin a CO. Se sugiere realizar una comparacin de los dos mtodos con mayor nmero de muestras y utilizando tanto muestras tomadas con Heparina de sodio y con EDTA.
39
Conclusin
40
6. Conclusin
Los resultados obtenidos permiten aceptar la validacin del mtodo ya que los parmetros de desempeo estn de acuerdo a lo establecido para la validacin de mtodos analticos de la CDER de 2001
Bibliografa
41
7. Bibliografa
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Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
9. Widdop B, Analysis of carbon monoxide, Review Article. The Association of Clinical Biochemists . 2002 10. Aaron A, Genevieve S, Steink J, Shepherd P. Co-Oximetry Interference by Hemoglobin-Based. International Anesthesia
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Bibliografa
43
19. Hampson N, Stability of carboxyhemoglobin in stored and mailed blood samples. The American journal of emergency medicine . 2008 20. Prez T, Patio N, Manual para el Anlisis Toxicolgico en el
Anexos
44
Anexos
Anexos
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Anexo 1
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE TOXICOLOGA MAESTRA EN TOXICOLOGA CONSENTIMIENTO INFORMADO DE PARTICIPACIN EN EL ESTUDIO
Yo _______________________________________________, he sido informado(a) que la Maestra en Toxicologa de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia, va a llevar a cabo el proyecto de investigacin para la Validacin del Mtodo Para Determinacin
De Carboxihemoglobina En Sangre Total Por Tcnica Espectrofotomtrica Con Reduccin Con Ditionito De Sodio con el fin de obtener un mtodo analtico confiable para determinar exposicin a Monxido de Carbono Yo he elegido participar libremente en el estudio, entiendo que esto significa responder una entrevista para la historia clnica en la cual se exploran algunos aspectos de mi vida, en especial relacionados con mis antecedentes de consumo de tabaco y exposicin a monxido de carbono, adems para tal fin me ser tomada una muestra de sangre, lo que puede generar molestias leves asociadas al uso de aguja estril para la toma de la muestra. Para evitar estas complicaciones la muestra ser tomada por personal altamente calificado y entrenado en la toma de muestras y se har en presencia de un mdico capacitado para resolver cualquier tipo de reaccin adversa o inquietud que pudiera presentarse. Entiendo que dentro del estudio no se me realizar ningn tipo de seguimiento familiar, laboral o judicial y dado que mi participacin es enteramente voluntaria puedo rehusarme a contestar cualquier pregunta o retirarme voluntariamente en cualquier momento del estudio sin que esto acarree algn tipo de consecuencia. Entiendo que participar en el estudio no conlleva riesgo alguno, que la informacin y muestra obtenidas de m sern tratadas de forma confidencial y que no voy a ser identificado personalmente en los resultados del estudio, que no obtendr remuneracin econmica y el beneficio se recibir por medio del conocimiento generado en el presente estudio. Sin embargo, si al participar se me encuentra alguna condicin que requiera tratamiento se me ofrecer orientacin mdica al respecto. Se me ha preguntado si tengo alguna duda acerca del estudio en este momento y si tuviese en el futuro alguna duda del mismo puedo obtener informacin en el Departamento de Toxicologa, en la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia.
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Validacin del mtodo para determinacin de Carboxihemoglobina en sangre total por tcnica espectrofotomtrica con reduccin con Ditionito de Sodio
Anexo 2
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE TOXICOLOGA MAESTRA EN TOXICOLOGA FORMATO DE TOMA DE MUESTRA SANGRE VENOSA PARA ANALISIS DE CARBOXIHEMOGLOBINA Fecha: ____, ____, ____ Da Mes Ao Hora: _______
No. Identificacin de la muestra: ________________ Nombre completo del paciente: _______________________________________________ Documento de identidad: __________________________ Edad: _________________ Gnero:________________ Estado civil: ____________ Lugar de Trabajo: ____________________ Lugar de residencia: ____________________ En su residencia cocinan o han cocinado los alimentos con lea o carbn? _____________ Reside en cerca de algn sitio donde elaboren ladrillo cocido para la construccin?______ Es o ha sido fumador de cigarrillo, tabaco, pipa o cualquier otra sustancia?_____________ Con que frecuencia?________________________________________________________ Medicamentos en uso: _____________________________________________________
Anexos
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Anexo 3
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Anexos
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