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Resumen

Biologa de las clulas madre

Antonio Bernard
Departamento de Cardiologa Regenerativa Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC)

Dos caractersticas son definitorias de una clulas madre (CM), permitiendo adems diferenciarlas de la gran mayora de las clulas constitutivas de un organismo adulto: a) poseer una capacidad muy importante de proliferacin, pero manteniendo su estadio indiferenciado (automantenimiento), y b) ser capaces de generar progenie, perteneciente a varios linajes celulares del organismo (pluripotencia). El control de su capacidad de proliferacin versus diferenciacin se produce en localizaciones especializadas, denominadas nichos, y alteraciones de este mecanismo bsico pueden estar implicadas en muchas patologas humanas. El potencial teraputico que encierra el concepto de clula madre en su conjunto es enorme, pero debemos de ser capaces de explotarlo adecuadamente.

Introduccin
Qu es una clula madre? Dnde podemos encontrar las clulas madre? Para qu sirven las clulas madre en el individuo adulto? Cuantas tenemos? Qu podemos esperar de la revolucin tecnolgico-teraputica que se nos avecina? Buenas preguntas que tienen una respuesta cambiante cada semana que transcurre. El misterio de la vida se concreta, desde una perspectiva meramente biolgica, en cmo la complejidad de un organismo se encuentra pre-

programada en un minsculo embrin (zigoto). Cuanto ms ampliamos nuestro conocimiento molecular y celular, ms lejos nos parece estar del maravilloso modelo de regulacin (a corto, medio y largo plazo) que se encierra en esa clula. El zigoto, tras su implantacin, y con la ayuda del ambiente propicio aportado por las estructuras maternas, desarrolla todo su potencial biolgico, generando una constelacin estructurada de tipos celulares cuyo resultado final es un nuevo organismo. Durante los estadios tempranos del desarrollo embrionario se pueden identificar y aislar clulas con capacidad totipotencial, trmino que se emplea para indicar que a partir de ellas se pueden generar todos los tipos celulares del organismo adulto. Estas clulas totipotenciales embrionarias se denominan clulas madre (tambin conocidas como clulas stem del ingls, o clulas troncales). En ratn, hace ms de 20 aos (Martn, 1981; Evans et al., 1981; Bradley et al., 1984) aislaron y caracterizaron lneas celulares (fig. 1) con estas caractersticas (embryonic stem cells, ES), obtenidas de la masa interna de embriones en estadios tempranos de desarrollo, denominado blastocisto (Bongso et al., 1994). La caracterizacin inicial de estas clulas madre permiti el establecimiento indefinido in vitro de lneas celulares capaces de dar origen a un ratn indistinguible de sus congneres, siendo adems capaces de trasmitir su informacin en
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la lnea germinal. Posteriormente se demostr la posibilidad de su manipulacin gnica convirtindose en clulas clave para la generacin de modelos animales capaces de desarrollar enfermedades anlogas a las presentes en humanos para el estudio de enfermedades humanas y en una herramienta insustituible para desvelar la funcin de los genes in vivo. La trascendencia de este cuerpo de trabajo para el desarrollo de la

biomedicina moderna ha sido reconocida mediante la concesin del premio Nobel de Fisiologa o Medicina (2007) a los doctores Mario R. Capecchi, sir Martin J. Evans y Oliver Smithies. Sin embargo, el concepto de CM se origina mucho antes (Ferrebee et al., 1958), y deriva de los trabajos pioneros que permitieron desarrollar el trasplante de mdula sea y salvar muchas vidas. La mdula sea es el rgano don-

Ovocito fertilizado (129Svj)

Lnea de ratn manipulada genticamente: Estudios bsicos Modelos de enfermedad

Transmisin a lnea germinal?

Blastocistos

Hembra seudopreada receptora CD Iblanco Implantacin

ES (129Svj)

Blastocistos (CD I)

Masa interna del blastocisto

Microinyeccin o agregacin Manipulacin gentica/ caracterizacin Lnea de clulas ES (129Svj) pardo

Figura 1. Esquema de la obtencin de animales manipulados genticamente mediante la utilizacin de clulas stem embrionarias (mES).
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de se producen las clulas sanguneas a partir de distintos progenitores mediante una organizacin piramidal (fig. 2) que, tras ejecutar un complejo programa de desarrollo, originan los cientos de millones de clulas funcionales que necesita el organismo diariamente en su sangre y rganos linfoides secundarios (donde madura la respuesta inmunitaria). El truco es que el funcionamiento de por vida de este dinmico sistema (linfohematopoytico) est garantizado si se consigue mantener un pequeo nmero de clulas madre (0,01-0,1% de la celularidad de la mdula sea) alojadas en lo ms ntimo de los huesos del individuo. Si conseguimos extraer y trasplantar un nmero suficiente de estas clulas madre hematopoyticas, conseguiremos que el organismo receptor pueda reconstituir y mantener su sistema linfohematopoytico totalmente funcional durante el resto de la vida. Estos trabajos pioneros merecieron la concesin del premio Nobel de Fisiologa o Medicina (1990) a E. Donnall Thomas.

En este sentido amplio, y desde la dcada de 1960, el estudio del sistema linfohematopoytico y el transplante de medula sea ha sido la escuela donde se han creado y desarrollado la gran mayora de los conceptos que hoy da se manejan sobre la biologa y fisiologa de las clulas madre. En trminos generales, el trasplante de mdula sea, la reparacin de cartlago articular y el trasplante de piel artificial a grandes quemados (fig. 3) se pueden considerar los verdaderos antecedentes de la actual revolucin en medicina megenerativa.

Definicin de clula madre

Las caractersticas ms impor tantes que permiten definir a las CM y diferenciarlas de la gran mayora de las clulas constitutivas de un organismo adulto son dos. La primera es que en condiciones de cultivo adecuadas,

Figura 2. Esquema de la organizacin piramidal del sistema linfohematopoytico.

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tienen una capacidad ilimitada de dividirse; as una CM es capaz de generar un nmero inmenso de clulas, manteniendo sus mismas caractersticas por el contrario, todas las dems clulas de las que todos estamos constituidos, las denominadas clulas somticas, poseen un nmero limitado de divisiones (se calcula que slo pueden dividirse alrededor de cincuenta veces, al cabo de las cuales mueren). La segunda es que las CM son capaces de generar varios de los linajes celulares de los que est constituido un individuo: clulas de corazn, de hgado, de rin, neuronas, msculo, etc. Hasta el momento se han identificado clulas con caractersticas de CM de 4 orgenes distintos: de origen embrionario, clulas madre germinales, clulas madre procedentes de carcinomas embrionarios (terato-carcinomas) y clulas madre procedentes de tejidos som-

ticos, y aisladas de individuos adultos, las que denominaremos CMA (clulas madre adultas). En la actualidad, aunque todava se encuentran en fase de estudio y evaluacin, estas fronteras estrictas han desaparecido debido al desarrollo de la tecnologa de reprogramacin gentica. Esto permite obtener clulas con propiedades muy similares a las embrionarias (iPS; induced Pluripotent Stem Cells) a partir de numerosos tipos celulares adultos (p. ej., Park et al; 2008) que incluyen fibroblastos, queratinocitos, MSC, etc. Aunque las posibilidades abiertas son enormes, quedan por resolver varios temas tcnicos y garantizar su bioseguridad. Pero aun ms interesante es el hecho de que con esta misma tcnica de reprogramacin gentica se han conseguido obtener de forma directa cardiomiocitos a partir de fibroblastos (Ieda et al., 2010) Claramente, el sinfn de posibilidades que se abren est an por desarrollarse.

Medicina regenerativa: de la realidad clnica actual a un futuro prometedor

Transplante de mdula sea Reparacin cartlago Piel. Quemados

Sistema linfohematopoytico

Figura 3. Antecedentes de la medicina regenerativa.

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Hasta hace una dcada, las nicas CMA de mamferos cuya existencia haba sido demostrada de forma concluyente eran las clulas madre hematopoyticas (CMH, o HSC, del ingls Hematopoietic Stem Cells), responsables de la produccin de todos los linajes sanguneos. Se postulaba la existencia de CMA en otros tejidos altamente proliferativos, como la piel y el hgado, pero el concepto genrico de clula madre adulta como tipo celular existente en todos los tejidos es un paradigma bastante reciente. En la actualidad, sabemos que la diversidad de CMA equivale prcticamente a la variedad de tejidos del organismo adulto. De hecho, probablemente es mayor, pues algunos tejidos, cmo la mdula sea, contienen ms de un tipo de CMA. En la divisin celular tpica, las dos clulas hijas generadas son equivalente entre s y a la clula progenitora de la que derivan (divisin simtrica). Posteriormente, las clulas descendientes (progenie) pueden evolucionar por distintas vas, bien siguiendo unos programas determinados de diferenciacin o bien pueden mantener su potencial inicial. El mantenimiento de una relacin adecuada entre la tasa de proliferacin y diferenciacin permite en la mayora de los tejidos establecer un control homeosttico de su forma

y tamao, evitando un crecimiento descontrolado que se asocia, p. ej., con los procesos tumorales. Por el contrario, las CM parece que estn reguladas por un mecanismo de divisin conservador (asimtrico), de forma que en su divisin se genera una clula equivalente a la original y otra que da cuenta del resto del programa de diferenciacin. Este mecanismo de automantenimiento (en ingls, self-renewal) permite controlar de forma estricta el nmero de CM que existe en un determinado rgano (fig. 4). Se ha asumido que las CM presentes en el organismo adulto (CMA) deben de poseer, en trminos generales, un menor potencial que las presentes durante el desarrollo embrionario y fetal. Sin embargo, aunque en lgica es fcil asumir este principio, demostrarlo es mucho ms complicado. Adems, al menos en el organismo adulto, no todas las clulas madre de un rgano participan activamente en el proceso de regeneracin y mantenimiento de la funcionalidad. Slo unas pocas estn contribuyendo de forma simultnea a la creacin de un tejido, en un momento dado. La mayora se encuentra en un estado de reposo (conocido como quiescencia), lo que las protege tanto de agresiones externas, fsicas o qumicas, como del proceso de enve-

GI/S

G0

Divisin simtrica

Divisin asimtrica

Figura 4. Esquema comparativo de la divisin simtrica en comparacin con la divisin asimtrica.

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jecimiento celular. Cuando las CMA responsables en un momento dado de la regeneracin tisular agotan sus posibilidades, son sustituidas paulatinamente por la progenie de otras nuevas. Las nuevas clulas as generadas representan diferentes clones y el fenmeno responsable del proceso se denomina sucesin clonal. En definitiva, una CM se define, funcionalmente, como una clula capaz de automantenerse (mediante el mecanismo de divisin asimtrica) y con potencial de generar (mediante diferenciacin de sus clulas descendientes) varios linajes celulares (pluripotencia) o todo un organismo (totipotencia). Por lo tanto, no todas las CM son equivalentes y aunque la mayora de las veces se definen por su origen (embrionarias, adultas, etc.) no siempre estos trminos equivalen necesariamente a un mayor potencial de desarrollo o, incluso, de potenciales aplicaciones biomdicas. Los mecanismos por medio de los cuales ocurre esta diferenciacin, los genes implicados y la posibilidad de incrementar la eficiencia en su aislamiento y/o caracterizacin constituyen una de las reas ms relevantes en la actualidad de la biologa y de la biomedicina.

Clulas madre adultas. Tipos y origen

El origen embrionario de todos los tipos de CMA es, en ltima instancia, el mismo que el de los restantes tipos de clulas somticas presentes en el organismo adulto, es decir, las clulas pluripotentes de la masa interna del blastocisto. Sin embargo, es muy poco lo que se conoce de los precursores especficos de cada tipo de CMA, ms all de la hoja embrionaria a la que pertenecen (ectodermo, mesodermo o endodermo). En el organismo adulto la inmensa mayora de sus clulas se encuentran en un estado, que denominamos postmittico, en el que raramente se dividen y multiplican. Estn ejerciendo las funciones para las que han sido programa44

das y slo en casos excepcionales (daos de diversa ndole) salen de su letargo y, en la medida que les permita su entorno y su propio potencial, repararn el dao producido. A esta regla general slo escapan cuatro rganos que se encuentran en una situacin de alta actividad fisiolgica: a) la mdula sea, por la exigente demanda de clulas sanguneas y mediadoras de la respuesta inmune; b) las gnadas, que generan constantemente clulas germinales; c) el hgado, que tiene una gran capacidad de regeneracin, y d) los epitelios, sobre todos el intestinal y el epidrmico, que estn en una continua renovacin. En los cuatro rganos existen poblaciones con caractersticas de CM, especficas de tejido, que dan justificacin a dicho potencial. En los ltimos aos el panorama respecto al cerebro ha cambiado dramticamente. Se crea que el nmero de neuronas y la estructura cerebral quedaba determinado en los primeros aos de vida, y que posteriormente slo se producan re-estructuraciones y perdida de conexiones (plasticidad neuronal). Sin embargo, actualmente sabemos que el cerebro es tambin un rgano muy activo que puede generar nuevas neuronas (se ha estimado que puede llegar a producir 105 al da). Estas clulas tienen que producirse a partir a clulas madre alojadas en el cerebro. De manera transitoria, en el momento del parto una gran proporcin de clulas hematopoyticas se encuentran en la sangre contenida en el cordn umbilical y en la placenta. Si se recoge entonces adecuadamente la sangre placentaria se puede obtener una poblacin muy sustancial de clulas madre hematopoyticas, con la que se han establecido los denominados Bancos de Sangre de Cordn. Esta fuente es ideal para el trasplante en nios o adultos de bajo peso con enfermedades hematolgicas severas.

Clulas madre linfohematopoyticas (CMH)

Como ocurre con muchos otros aspectos de su biologa, el origen embrionario de las CMH es el mejor estudiado de todos los tipos de

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CMA. Desde principios del siglo XX se cree que las CMH derivan de un precursor ms primitivo, comn con el linaje endotelial, al que se denomina hemangioblasto, cuya existencia ha sido confirmada por diversos estudios experimentales en distintos estadios de desarrollo (Pelosi et al., 2002). La hematopoyesis se inicia en el embrin de mamfero en el saco vitelino (semana 5 de gestacin en humanos; d7-7,5 en ratn). Sin embargo, los precursores hematopoyticos del saco vitelino slo son los responsables de la hematopoyesis embrionaria, y no dan origen posteriormente a las CMH presentes en el adulto. De hecho, la capacidad de los progenitores primitivos (CD34+/CD117+) aislados del saco vitelino para contribuir a la hematopoyesis en adultos es limitada. Las CMH responsables de la hematopoyesis definitiva en adultos se originan en la regin del mesodermo denominada aorta-gnada-mesonefros (AGM), derivada de la esplacnopleura para-artica. Tras el saco vitelino, la hematopoyesis tiene lugar en el bazo, hgado y ndulos linfticos, hasta el momento en que se desarrolla la mdula sea, que eventualmente asume la tarea de producir clulas sanguneas para todo el organismo adulto. Las CMH de la mdula sea se hallan en una concentracin aproximada de 1 por cada 10.000 clulas mononucleares; tambin pueden obtenerse de la sangre perifrica, ya que son capaces de abandonar la mdula sea y pasar a la circulacin sangunea, en un proceso denominado movilizacin. Las CMH se caracterizan por su pequeo tamao, una gran relacin ncleo:citoplasma, la ausencia de marcadores de linaje (Lin-), un bajo marcaje con tintes vitales como Hoechst 33342 y la presencia de varios marcadores de superficie, entre los que se encuentran (humano): CD34, CD90, CD117 (c-kit) y CD133. Una poblacin celular altamente enriquecida con CMH puede obtenerse mediante seleccin por citometra de flujo de clulas que expresan alguno de dichos marcadores (tradicionalmente CD34). Sin embargo, ninguno de ellos por s solo, ni en combinaciones simples, permite identificar especficamente una CMH.

CMA no-linfohematopoyticas
El mayor problema actual al que se enfrenta el biotecnlogo, el ingeniero gentico o celular, o el clnico, que pretenden utilizar CM con fines teraputicos, es que, en la mayora de los casos (hay notables excepciones), estas CM una vez extradas de su entorno natural tienen una gran tendencia a diferenciar perdiendo, total o parcialmente, su toti- o pluripotencia. Este problema parece estar relacionado con el bajo nivel de conocimiento de su regulacin. En el momento que obtengamos la informacin adecuada, se podrn mantener ex vivo en mejores condiciones que permitan preservar su potencial, aspirando incluso a expandir su nmero para llegar a situaciones ptimas para su aplicacin clnica. Esto debera de ser posible para todos los tipos de CMA que se conocen (fig. 5).

Clulas madre mesenquimales (CMM)

Adems de CMH, la mdula sea contiene al menos otro tipo de CMA, denominadas clulas madre mesenquimales (CMM, o MSC, del ingls Mesenchymal Stem Cells), las cuales son clulas fibroblastoides precursoras de todos los tipos de tejidos conectivos no hematopoyticos (hueso, grasa, cartlago, etc.) (Pittenger et al., 1999). Las CMM no se encuentran slo en la mdula sea, sino tambin en el estroma de virtualmente todos los rganos, por ejemplo en el tejido adiposo subcutneo (Zuk et al., 2002) o el cartlago articular (De la Fuente et al., 2004). Las CMM se obtienen generalmente mediante seleccin por adherencia a plstico de cultivo celular, pues son capaces de adherirse y crecer en condiciones en las que otros tipos celulares habitualmente no proliferan. No poseen ningn marcador especfico, pero presentan un perfil homogneo y reproducible de antgenos de superficie, que habitualmente se define como: CD9+/CD13+/CD29+/CD14/CD34/ CD44+/CD45/CD90+/CD105+. Debido a su relativamente sencilla obtencin, su elevada capacidad de proliferacin ex vivo (a diferencia de las CMH) y a su amplio
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potencial de diferenciacin, las CMM son uno de los tipos de CMA ms empleados en terapia celular. Adems, en determinadas condiciones experimentales, las CMM han mostrado la capacidad de diferenciarse en linajes celulares no conectivos, tales como el endotelial y el neuronal. Por ltimo, una propiedad especialmente interesante de las CMM, es que son capaces, tanto in vitro como in vivo, de inhibir la respuesta inmunitaria (Rasmusson et al., 2006). Esta capacidad de inmunorregulacin incluye la inhibicin de la activacin de clulas T, B, NK y de la maduracin de clulas dendrticas, as como la proteccin frente a patologas inflamatorias y/o autoinmunes, incluido el rechazo a trasplantes.

Clulas madre epidrmicas (CME)

Fuera de la mdula sea, uno de los tejidos donde se supona desde haca dcadas la existencia de CM, dado su carcter altamente proliferante, era la epidermis. En la actualidad sabemos que existen clulas madre epidrmicas (CME o EpSC, del ingls Epidermal Stem Cells) al menos en dos localizaciones distintas. En primer lugar, en la membrana basal interfolicular se estima que entre el 1 y el 2% de las clulas son CME, con fenotipo p63+, las cuales son capaces de generar queratinocitos que, al migrar hacia la superficie, dan lugar a la formacin de la epidermis (Pellegrini et al., 2001). En segundo lugar, en el interior de los folculos pilosos, en concreto

Tejidos extraembrionarios

CM Lquido amnitico

CM Sangre de cordn umbilical

CM Membrana amnitica

CM Cordn umbilical CM linfohematopoyticas CM mesequimales CM epiteliales CM neuroepiteliales CM germinales CM intestinales CM neurales CM de msculo esqueltico (satlite) CM hepticas (ovales) CM endoteliales CM cardiacas CM pancreticas CM renales CM de neumocitos MAPC? ? CM tumorales

Tejidos embrionarios o adultos

CM embrionarias

CM fetales

CM adultas

Nacimiento

Figura 5. Clulas madre. Origen, ontogenia y tipos.

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en la regin denominada bulge, se ha descrito la existencia de una poblacin de clulas madre ms primitivas, con fenotipo CD34+/queratina 15+/integrina 6+, capaces de dar lugar no slo a la epidermis propiamente dicha, sino tambin a los folculos y a las glndulas sebceas. En el hombre, sin embargo, la identificacin de las CME interfoliculares resulta ms difcil, y se han propuesto varios fenotipos diferentes para las CME del bulge, siendo uno de ellos CD200+/ CD34/CD24/CD71/CD146 (Ohyama et al., 2006). Al igual que ocurre con otros tipos de CMA, existen estudios que indican que las CME muestran plasticidad en determinadas condiciones experimentales (Toma et al., 2001).

CMA que han despertado un especial inters en medicina regenerativa son los siguientes: Clulas madre endoteliales. Se ha descrito la existencia de precursores endoteliales (que algunos autores consideran clulas madre) tanto en mdula sea como circulantes (Asahara et al., 1997). Estas clulas estn relacionadas con las CME y han despertado un gran inters por sus posibles usos en el tratamiento de la patologa isqumica. Clulas madre de msculo esqueltico. Tradicionalmente se han denominado clulas satlite, y se definen por la expresin del factor de transcripcin Pax3. En ratn se ha demostrado que esta poblacin posee el fenotipo CD34+/CD45/Sca1 (Montarras et al., 2005). Clulas madre pancreticas. La evidencia experimental sugiere la existencia de uno o varios tipos de clulas madre en el pncreas. Las CM capaces de diferenciarse a clulas beta parecen ser clulas presentes en los islotes y en los ductos pancreticos positivas en neurogenina-3 (Seaberg et al., 2005). Clulas madre cardiacas. Diversos grupos han comunicado en los ltimos aos el aislamiento a partir de miocardio de clulas capaces de diferenciarse a cardiomiocitos, endotelio y msculo liso, aunque an existe controversia sobre su relevancia, origen y fenotipo. La mayor parte de los trabajos identifican como clulas madre cardiacas a las CD117+/Sca-1+ (Barile et al., 2007). Por ltimo, diversos trabajos han descrito la existencia de CMA pluripotentes (o, al menos, con una extensa multipotencia) en diversos tejidos de mamferos. Destacan en este campo los trabajos de la doctora Catherine Verfaillie, en los que se describe el aislamiento a partir de la mdula sea y otros tejidos de diversas especies de mamferos de clulas capaces de diferenciarse tanto in vitro como in vivo a prcticamente todos los linajes celulares somticos, a las cuales denominan MAPC (Multipotent Adult
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Clulas madre neurales (CMN)

Al contrario que la mdula sea o la epidermis, ambos tejidos con una elevada tasa de recambio (turnover) celular, el descubrimiento de CM en el SNC constituy sin duda una de las mayores sorpresas de la biologa en los inicios del presente siglo (Doetsch et al., 1999). Las clulas madre neurales (CMN o NSC, del ingls Neural Stem Cells) presentes en el cerebro adulto de mamferos tienen su origen en clulas de la cresta neural, y se localizan principalmente en la regin subventricular y en la regin subgranular del giro dentado del hipocampo. El principal marcador de estas clulas es la nestina, y su aislamiento se realiza mediante el cultivo celular en presencia de los factores de crecimiento EGF y bFGF, condiciones en las que crecen en forma de agregados esfricos en suspensin, denominados neuroesferas. Los cultivos de neuroesferas permiten obtener grandes cantidades de CMN, capaces de diferenciarse tanto a neuronas como a gla (astrocitos y oligodendrocitos).

Otras CMA
Las CM hematopoyticas, mesenquimales, neurales y epidrmicas son las ms estudiadas y mejor conocidas hasta el momento, pero no son los nicos tipos de CM demostrados en los tejidos somticos del adulto. Otros tipos de

Progenitor Cells), y que son similares a las CMM pero negativas para los marcadores CD44 y HLA-I (Jiang et al; 2002). Dichos trabajos, sin embargo, no han podido ser adecuadamente reproducidos por muchos grupos y, en la actualidad, las MAPC se consideran en general ms como el resultado de algn tipo de modificacin inducida por las condiciones de cultivo ex vivo que como un tipo celular presente en condiciones fisiolgicas in vivo.

tores. Sin embargo, algo que tienen en comn los mecanismos de autorrenovacin de todas las CM, es que todos ellos dependen de un conjunto especfico de seales extracelulares, que es distinto para cada tipo de CM y que incluye: seales solubles, tanto paracrinas como autocrinas, interacciones con la matriz extracelular, e interacciones clula-clula. Segn su efecto sobre las clulas, dichas seales mantenedoras de la autorrenovacin pueden clasificarse en: Seales de proliferacin: inducen la divisin celular. Seales de quiescencia: inducen la ralentizacin del ciclo celular en G0, estado en el cual la clula puede mantenerse durante periodos prolongados sin diferenciarse ni sufrir daos genticos. Seales inhibidoras de la diferenciacin: contribuyen a mantener la expresin de genes que inhiben los procesos de diferenciacin celular. Seales de supervivencia: proporcionan una seal sin la cual la CM entrara en senescencia/apoptosis, o bien protegen de la accin de otras seales capaces de inducir dicha apoptosis. El conjunto de todas estas seales que constituyen el microambiente especializado de una determinada CM es lo que se denomina nicho. El concepto de nicho, derivado de nuevo del estudio del sistema hematopoytico (fig. 6) es fundamental para la comprensin de la biologa de las CM. En el nicho adecuado, las CM son capaces de autorrenovarse; fuera de l, las CM se diferencian o mueren. Por tanto, las caractersticas del nicho fisiolgico son dominantes y controlan el equilibrio proliferacin/quiescencia/diferenciacin, as como determinantes de la expresin de potencial que se le permite a esa CM en dicha localizacin anatmica. Cada tipo de CMA reside por tanto slo en localizaciones anatmicas muy precisas dentro del organismo, donde se dan las seales que constituyen su correspondiente nicho. Este estricto control de la

El concepto de nicho y el control de la autorrenovacin

Las CM son, junto con las clulas tumorales, las nicas clulas de mamferos capaces de proliferar y mantener su potencial de diferenciacin indefinidamente. Esta capacidad de dividirse de forma ilimitada para dar lugar a otras CM equivalentes a ellas es lo que se denomina automantenimiento o autorrenovacin (self-renewal). La autorrenovacin es un proceso biolgico de enorme relevancia, pues encierra las claves tanto de la regeneracin y homeostasis tisular como del desarrollo, el envejecimiento y el cncer. A pesar de ello, nuestra comprensin de dicho proceso es an muy limitada. La mayora de lo que conocemos acerca de los mecanismos de autorrenovacin se ha averiguado en el modelo de clulas madre embrionarias (ESC, del ingls Embryonic Stem Cells). En dicho modelo se han identificado una serie de seales extracelulares (LIF, BMP, FGF, etc.) que contribuyen a mantener la expresin de varios factores de transcripcin (Oct4, Nanog, Sox2 y otros), los cuales a su vez actan como genes maestros que mantienen el estado pluripotente de las clulas (Rao et al., 2004). No se comprende muy bien el posible papel de los mencionados genes de pluripotencia en la autorrenovacin de las CMA, pero todas las evidencias indican que son bastante especficos de ESC y que la autorrenovacin en CMA es regulada principalmente por otros fac48

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autorrenovacin es una de las diferencias esenciales entre una CM y una clula tumoral, la cual no parecen presentar dichas restricciones. Los nichos de algunos tipos de CMA han sido localizados de forma precisa, y ya han sido mencionados anteriormente, como por ejemplo los de las CME (capa basal de la epidermis y bulge de los folculos), las CMN (regin subventricular y giro dentado) y las CM intestinales (fondo de las criptas). En otros tipos de CMA, sin embargo, la localizacin del nicho es an poco precisa. En el caso de las CMH, se ha descrito que se localizan mayoritariamente cerca de la superficie sea, pero tambin asociadas con el endotelio sinusoidal (Wilson et al., 2006). An no se comprende bien la relacin entre ambos tipos de nicho, ni su probable funcin diferencial en la biologa de las CMH.

Las principales rutas de sealizacin reguladoras de la autorrenovacin conocidas en CMA son Wnt, Notch y Hedgehog (Blank et al., 2008). Una caracterstica comn de todas estas seales es que pueden regular la autorrenovacin en distintos sentidos (inducindola o inhibindola) dependiendo del contexto, y probablemente como resultado de equilibrios cuantitativos. As, por ejemplo, la activacin de Notch es esencial para la autorrenovacin de las CMH, pero en CMN puede promover tanto la autorrenovacin en algunos casos como la diferenciacin a gla en otros. La sealizacin por Wnt a travs de la ruta cannica (-catenina) promueve la autorrenovacin en CMH, CMM, CMN, CME y en las CM intestinales. Sin embargo, en las CMH la delecin de -catenina no afecta a la capacidad de autorrenovacin, por lo que, o bien la sealiza-

Autorrenovacin frente a diferenciacin (el nicho)

M IL-I TNF etc. IL-I TNF IL-6 +

Self-renewal

TGF- pEEDCK Commitment differentiation

+ ECM-b GF + LIF TGF- etc.

CSFs SCF IL-3 sGF IL-6 mb-GF IL-II etc. IL-6 Stromal cell

CAM

MSC

Figura 6. Definicin y estructura funcional del nicho hematopoytico.

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cin por Wnt no es necesaria, o bien sealiza por medio de la va no cannica en estas clulas. De forma contraria, la acumulacin de Wnt-3a en el suero plasmtico del ratn se ha asociado recientemente al fenmeno de envejecimiento fisiolgico, al menos de las clulas satlite musculares (Brack et al., 2008) Por su parte, Sonic Hedgehog tambin promueve el mantenimiento de las CMH, CMN y CME. Al menos en las CMH, dicha actividad tiene lugar a travs de un mecanismo dependiente de BMP-4. La ruta de sealizacin de TGF-/ BMP (mediada por Smads) se ha estudiado extensamente en CMH, y se sabe que TGF- es uno de los ms potentes inhibidores de la autorrenovacin de CMH. Debido al alto nivel de redundancia de las protenas Smad, su papel en el automantenimiento de las CMA an no se comprende de forma completa. Los programas genticos especficos responsables del control de la autorrenovacin de CMA son considerablemente menos conocidos que las seales extracelulares que los regulan. Hasta

el momento, los genes de autorrenovacin mejor estudiados en CMA pertenecen a la familia de las protenas Polycomb. Las protenas del grupo Polycomb (PcG) se asocian en grandes complejos que reprimen la trascripcin de otros genes mediante modificaciones de la estructura de la cromatina. Entre los genes PcG se han identificado varios que participan en la regulacin de la autorrenovacin de CMA. Entre ellos, el mejor conocido es Bmi1 (Park et al., 2003), cuya expresin es necesaria para el mantenimiento de las CME y CMN. Bmi1 promueve la proliferacin de las CMA principalmente reprimiendo la ruta de senescencia celular inducida por p16Ink4a y p19Arf.

Plasticidad de las CMA

En los ltimos 7-8 aos ha existido una amplia polmica, que todava persiste en algunos extremos, sobre el novedoso concepto de la plasticidad celular, principalmente establecido sobre experimentacin realizada con CMH (fig. 7). Por

SNC Sistema nervioso PEC (mdula sea) Tumor in situ

Clula oval Hgado

Clula satlite SCE Msculo Folculo piloso Criptas intestinales Queratinocitos-epidermis

Figura 7. Plasticidad de clulas madre hematopoyticas (CMH).

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plasticidad celular entendemos el fenmeno por el cual una CMA, extrada de su nicho natural, manipulada o no ex vivo, y trasplantada en otro entorno fisiolgico, es capaz de dar lugar a otros linajes celulares no previstos segn su programa de desarrollo estndar. En este proceso se han implicado diferentes mecanismos, no totalmente clarificados, y que incluyen dediferenciacin, transdiferenciacin y reprogramacin. Hoy en da algunos de los postulados iniciales no se han confirmado, pero otros s (Rov y Gratwohl, 2008). En la actualidad se est investigando la terapia celular con CMH como posible procedimiento teraputico para el tratamiento de muy diversas patologas no relacionadas con el sistema linfohematopoytico. Las principales aplicaciones en este sentido son la reparacin/regeneracin heptica y el tratamiento de la isquemia. La capacidad de las CMH para generar nuevas clulas hepticas se ha demostrado en varios modelos animales de insuficiencia heptica (Lagasse et al., 2000), y su posible aplicacin en clnica ofrece una importante promesa teraputica en este tipo de patologas. Sin embargo, la formacin de nuevos hepatocitos no se debe a la diferenciacin de las CMH, sino a un proceso de fusin de dichas clulas (u otros tipos derivadas de ellas, como los macrfagos) con los hepatocitos preexistentes (Wang et al., 2003). Este descubrimiento, no obstante, no invalida la posibilidad de tratar eficazmente enfermedades metablicas o infecciosas hepticas mediante el trasplante de CMH, y se estn investigando activamente las propiedades biolgicas de las clulas resultantes de la fusin. La isquemia cardiaca es otra de las patologas que se est abordando mediante el trasplante de CMH. Los trabajos iniciales en roedores (Orlic et al., 2001) promovieron el desarrollo de numerosos estudios preclnicos y clnicos de terapia celular motivados por la hiptesis de que las CMH poseen una plasticidad suficientemente elevada cmo para transdiferenciarse a clulas del linaje cardiomioctico. Sin embargo, estudios posteriores parecen descartar que di-

cha transdiferenciacin tenga lugar en una proporcin significativa en las condiciones experimentales habituales (Murry et al; 2004) aunque la transdiferenciacin in vivo se ha sustanciado en diferentes estudios realizados sobre varones que recibieron un trasplante de corazn cuyo donante era una mujer, sin la aparente mediacin de mecanismos de fusin (Angelini et al., 2007). Por tanto, sigue la polmica. Por otra parte, la posible capacidad proangiognica est siendo investigada en el tratamiento de la isquemia perifrica (Pearce et al., 2008). De forma anloga, el potencial de las CMH para la transdiferenciacin in vivo en clulas del sistema nervioso central tambin se ha sustanciado en diferentes estudios realizados sobre mujeres que recibieron un trasplante de mdula sea cuyo donante era un varn (Cogle et al., 2007). En definitiva, la plasticidad celular de diferentes CMA es una nueva opcin teraputica que necesitar mucho ms tiempo para ser evaluada con solidez, lo cual no la descarta cmo plausible aunque complicada en trminos de eficacia en algunas indicaciones.

Clulas madre embrionarias humanas

Recientemente (Thomson et al., 1998; Reubinoff et al., 2000) se han conseguido las primeras lneas de clulas madre embrionarias humanas (hES), aunque por el momento las condiciones de cultivo y expansin in vitro no estn definidas al nivel de sus homlogas de ratn. No obstante, dada la amplia experiencia que se ha adquirido con las clulas ES de ratn (mES), el mero hecho de su existencia ha abierto un gran debate social y cientfico-tico sobre lo que puede y/o debe ser investigado al amparo de la financiacin pblica, y sobre reformas en las leyes correspondientes que regulen la actividad general y econmica en torno a este nuevo potencial teraputico.
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Como hemos comentado anteriormente, la gran ventaja terica de partir de hES es que stas clulas deben de poseer el potencial (por definicin) de generar cualquier tipo celular humano. Esta premisa, sin embargo, es difcil de confirmar experimentalmente. De hecho, no existe una prueba formal de que las clulas hES que se manejan sean totalmente equivalentes a las mES; en este sentido, ambas clulas tienen diferentes requerimientos de crecimiento y parecen ser bastante ms inestables genticamente (Baker et al., 2007). Sin duda es necesario acumular mucha ms experiencia sobre el comportamiento de stas clulas en cultivo, antes de plantearse su empleo en procedimientos clnicos. En todo caso, la utilizacin de hES obliga a controlar, de forma reproducible, su capacidad de diferenciacin a clulas o progenitores del linaje celular de inters. As, se han realizado avances muy significativos (p. ej., Narazaki et al., 2008), aunque tambin se ha evidenciado que la identificacin y caracterizacin de las clulas derivadas ha de ser exhaustiva, ya que los marcadores simples que sirven en clulas primarias somticas, pueden no ser equivalentes sobre estas clulas obtenidas artificialmente (Martin et al., 2008). Finalmente, la utilizacin generalizada de tcnicas basadas en hES obligara a disponer bien de un panel amplio de lneas celulares que pudiesen cubrir los haplotipos ms comunes en una determinada poblacin humana, o bien a desarrollar una tecnologa eficaz para conseguir el clonado teraputico. Ninguna de las dos situaciones son posibles en la actualidad, aunque pueden convertirse en una realidad (Cibelli et al., 2007). En todo caso, el traslado de esta tecnologa a ensayos clnicos requerir muy probablemente el disponer las lneas equivalentes en algn modelo animal grande, cmo recientemente se ha conseguido en el perro (Schneider et al., 2008).

nes de genes cuya expresin exgena en una clula diferenciada puede, por s sola, promover su reprogramacin y desdiferenciacin a clula pluripotente (Takahashi et al., 2007). Este resultado ha sido ya validado por numerosos grupos y abre definitivamente una nueva va (la tercera va) para obtener clulas pluripotenciales humanas. Evidentemente, este nuevo tipo celular, iPS, debe poseer muchas de las propiedades/cualidades de las hES, pero con la ventaja de poder obtener fcilmente una lnea autloga de un ser humano concreto. Los resultados relacionados con la induccin selectiva de diferentes linajes todava es muy reducida, pero prometedora (p. ej., Park et al., 2008), y habr que acumular ms experiencia sobre estas clulas para evaluar su inters final como dianas de procedimientos de ingeniera tisular. En todo caso, la mayora de las reflexiones realizadas en el apartado anterior (hES) se aplicaran tambin a sta nueva opcin teraputica.

Una realidad incipiente. Una nueva visin de algunas patologas humanas

Hay que seguir alimentando el entusiasmo y el soporte social que las nuevas posibilidades teraputicas basadas en la utilizacin de CM han resucitado, pero manteniendo paralelamente un gran rigor y una extremada cautela. Es necesario transmitir a la poblacin la informacin de forma equilibrada, y explicando que cualquier avance significativo en el laboratorio tardar ms de 10 aos en convertirse en una realidad clnica establecida. Las expectativas que gener en su da la posibilidad de introducir en el organismo vivo nuevas versiones correctas de los genes que contenan mutaciones asociadas a enfermedades genticas humanas (terapia gnica) fueron extraordinarias. La realidad sin embargo se mostr mucho ms exigente que la voluntad, y

La tercera va
Se han identificado recientemente, tanto en ratn como en el hombre, varias combinacio52

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han sido necesarios ms de 25 aos para que los primeros beneficios clnicos (y no exentos de problemas) hayan sido una realidad. Las consecuencias las hemos sufrido todos, incluyendo investigadores, clnicos y pacientes. Sinceramente, esperamos que no ocurra lo mismo con las infinitas posibilidades que la combinacin de terapia celular/gnica pueden abrir al arsenal teraputico de la humanidad. Debemos reconocer que aunque los avances en el conocimiento de la biologa de las CM han sido enormes en la ltima dcada, todava estamos lejos de controlar completamente los sistemas. Sin ir ms lejos, en los ltimos aos han surgido del genoma humano nuevos jugadores que eran completamente desconocidos en mamferos hace unos aos; nos estamos refiriendo a los RNA de corto tamao y no codificantes (microRNA; miRNA) que parecen jugar un papel importante en el control fino de las transcripcin/traduccin (Garzon y Croce, 2008). Su papel en cncer humano es indudable, pero su potencial papel sobre la biologa de CMA es todava muy mal conocido. Por tanto, debemos de ser humildes, y avanzar al ritmo que el conocimiento bsico nos permita, sabiendo aprovechar, al mximo, las opciones realistas que existan en cada momento. Por ltimo, no todo son bondades en el nuevo universo de la clula madre, y su estudio nos ha abierto los ojos a nuevos conceptos que hace unos aos eran pura especulacin. Se ha demostrado que ciertas poblaciones celulares, originarias de la mdula sea, pero que pueden pasar a la circulacin en determinadas circunstancias, tienen un papel importante en el desarrollo de lesiones arteriosclerticas, as como en el establecimiento de la vasculatura tumoral en varios modelos. Los mecanismos moleculares que activan esta movilizacin patolgica de clulas madre no se conocen en detalle, pero esta realidad fisiolgica se est intentando explotar para generar nuevas posibilidades teraputicas; precursores angioblsticos, aislados de sangre perifrica o de mdula sea, se intentan utilizar como vehculos celulares para conseguir pro-

ducir biomolculas de inters teraputico en zonas localizadas del cuerpo (tumores secundarios, pre-lesiones malignas o arterioesclerticas, etc.). Estas estrategias de terapias combinadas (celular-gnica) estn dando sus primeros frutos en un nivel bsico. Ms an, una vieja teora se va convirtiendo en una realidad clnica da a da. Los tumores slidos son aglomeraciones de clulas muy heterogneas gentica y funcionalmente. En varios modelos de tumores slidos humanos se ha podido constatar que dentro de los tumores existe una poblacin muy minoritaria de clulas que es la responsable de garantizar la propiedades del tumor y su agresividad (su trasplante en modelos animales es capaz de reestablecer el tumor). Esto ha reabierto la discusin sobre la existencia de las clulas madre tumorales (CMT o CSC, del ingls Cancer Stem Cells), inicialmente propuesto desde la hematoncologa, y las implicaciones que esto tiene sobre la efectividad de las terapias (Glinsky, 2008). La realidad es que las clulas tumorales y ciertas poblaciones de clulas madre poseen ciertas propiedades muy asimilables y pueden estar relacionadas (fig. 8); los prximos aos nos depararn con seguridad nuevas sorpresas y, probablemente, una nueva visin de muchas de las patologas humanas.

Homeostasis de los tejidos y los rganos Fisiologa normal Positivos Negativos

Nuevas Nuevas Clulas madre adultas implicaciones posibilidades fisiopatolgicas teraputicas

Cncer (stem cells)

Figura 8. Equilibrios funcionales en clulas madre adultas.

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Aislamiento celular/caracterizacin

Cultivo ex vivo

Reimplantacin autloga Diferenciacin controlada ex vivo? Biomateriales?

Implantacin alognica Expansin ex vivo

Modificacin gentica?

Figura 9. Estructura de un ensayo de terapia celular tpico.

Un futuro prometedor
El potencial teraputico de las clulas madre es enorme. Basta pensar en la cantidad de personas que todava mueren a la espera de un trasplante de rgano vital, a sabiendas que de conseguir un donante adecuado, esto les ofrecera unos cuantos aos con calidad de vida. En otros casos, algunos rganos del paciente sufren daos debidos a procesos traumticos, patolgicos o causados por hbitos insanos, que solamente pueden ser aliviados mediante complejos procedimientos clnico-quirrgicos. La tecnologa asociada a la manipulacin de clulas madre empieza a ofrecer un futuro en todos estos campos. Poniendo por delante que estamos hablando casi siempre de resultados obtenidos en modelos animales de experimentacin (rata, ratn y, en el mejor de los casos, cerdo) y que su traslado al ser humano es abismal, el futuro es muy prometedor. Prcticamente a diario se hacen pblicos en las revistas cientficas ms prestigiosas resultados espectaculares. Como ejemplo citemos solamente los primeros resultados de seguridad/ factibilidad (fase I) de empleo de clulas de medula sea (movilizadas a sangre perifrica) en el tratamiento del fallo heptico crnico (Levicar et al., 2008).
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Sin embargo, cualquier revolucin tcnica, y no digamos mdica, requiere su tiempo de acumulacin de experiencia, reflexin y evaluacin en una muestra significativa de la poblacin. En todas las diferentes etapas implicadas en el desarrollo de cualquier aplicacin clnica de CM (fig. 9) se esperan avances significativos y, muy probablemente, el formato de la produccin celular asociada a los ensayos clnicos en los prximos aos se parecer poco a los actuales. Dmosle tiempo al tiempo y dejemos que este valor absoluto ponga a cada uno en su lugar.

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