Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed.

Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.

Procedimientos para la toma, transporte y manejo de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico.
OBJETIVOS Comprender la importancia del muestreo para tener un anlisis microbiolgico de alimentos fidedigno. Valorar la importancia de los procedimientos para la toma, transporte y manejo de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. Realizar la toma, transporte y manejo de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico.

GENERALIDADES En el anlisis microbiolgico de alimentos, son de primordial importancia para obtener resultados significativos y confiables, la adecuada seleccin de la muestra, la toma correcta de sta, los medios de conservacin y su transporte al laboratorio, Ello implica precisar el objetivo del estudio, esto es conocer la naturaleza de las muestras, la cantidad, el tamao o volumen del lote o partida, para que el anlisis, sea representativo del producto. Los alimentos se muestrean principalmente por tres razones: Realizar el control de la calidad y determinar la vida de anaquel. Verificar las tcnicas de manipulacin y produccin higinica. Sospechar de intoxicaciones o infecciones a travs de alimentos. En la mayora de los casos, el control de calidad se realiza por inters del productor para demostrar la calidad del producto que elabora y si es posible demostrar la superioridad frente a sus competidores. Sin embargo, el control sanitario de los alimentos plantea la necesidad de indicar una fecha de caducidad que garantice el periodo til o de seguridad para consumir dichos alimentos, esta fecha se establece con base en la vida de anaquel del producto. El incremento en la demanda de los consumidores por productos de buena calidad, ha marcado la pauta sobre la produccin higinica de los alimentos, as como el anlisis para determinar las condiciones de almacenamiento o manipulacin deficientes como parte del control de calidad de los mismos. En este sentido el muestreo debe disearse de tal forma que permita tomar una muestra representativa del alimento por analizar, as como la recoleccin de cualquier dato til. Otro aspecto importante que se debe tomar en cuenta es la

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uniformidad en los anlisis debido a que podra llegarse a conclusiones errneas, por ejemplo, los resultados que se expresan como presencia o ausencia de algn gnero de microorganismo, no son de valor a menos que se especifique la cantidad del alimento analizado. Las cuentas numricas de microorganismos pueden variar considerablemente de acuerdo con la tcnica analtica desarrollada, as como con los medios de cultivo utilizados en la misma, entre otros factores; esta variabilidad se elimina utilizando el mismo mtodo de dilucin, medios de cultivo, tiempos y temperaturas de incubacin, etc, de aqu la importancia de la aplicacin de las Normas Oficiales. Finalmente la evaluacin de la higiene del producto y la aceptabilidad por parte del consumidor, pueden seguirse apropiadamente slo si se tiene el historial del mismo. En casos de envenenamiento alimentario el muestreo se dirige primordialmente al producto consumido por el demandante, sin embargo, cualquier esfuerzo deber realizarse para colectar tanto los remanentes del alimento sospechoso, platillo de la comida ingerida, as como otros lotes obtenidos durante la misma recoleccin obtenida del establecimiento, incluso si no se trata del alimento sospechoso ser de gran valor, su anlisis. Por otra parte si el microorganismo causante del envenenamiento se conoce, la evaluacin puede limitarse a su bsqueda. En el diseo del plan de muestreo es muy importante que toda persona implicada en la recoleccin y envo de las muestras, as como el personal del laboratorio y los analistas que realizan la interpretacin de los resultados sean consultados en las primeras etapas del muestreo y anlisis microbiolgico de las muestras, por lo tanto debern definirse claramente los objetivos del anlisis para evitar prdida de tiempo y esfuerzo. Todos los anlisis microbiolgicos tienen sus limitaciones y stas se debern tener presentes antes de tomar cualquier accin seguida de un reporte del laboratorio. El acondicionamiento de la muestra que se va a analizar es de importancia fundamental, por ejemplo si las muestras se colectan inadecuadamente o no se evalan muestras representativas del lote, los resultados de laboratorio sern insignificantes, ya que las interpretaciones analticas de un lote grande se basan en una muestra relativamente pequea, es por esto que los procedimientos de muestreo deben aplicarse uniformemente. Una muestra representativa es esencial cuando estn distribuidos en el alimento microorganismos patgenos o toxinas y la comercializacin del mismo depende del contenido bacteriano demostrado en relacin a los estndares legales. El nmero de unidades que comprende una muestra de un lote de alimento determinado deber ser estadsticamente representativa, de acuerdo con la NMX-Z-12-1987, partes 1, 2 y 3 basada en Military Standard (Mil Std 105-D), Norma Militar Americana. La composicin y naturaleza de cada lote afecta la homogeneidad y uniformidad del total de la muestra. Un procedimiento estadstico de muestreo correcto, dependiendo si el alimento es slido,

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semislido, viscoso o lquido, deber determinarse por el muestreador apoyado en la NOM-109-SSA-1-1994 la cual determina los Procedimientos para la toma manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. En un muestreo es importante tener presente el objetivo del anlisis, por ejemplo si ste se realiza como control sanitario de forma rutinaria o si por el contrario se investiga una contaminacin por algn microorganismo patgeno en particular; otro aspecto importante para obtener resultados confiables es que la toma de muestras al azar de cada lote, para asegurar la representatividad del producto por analizar, adems es indispensable tener un control microbiolgico de los contenedores usados en la toma de muestras lo cual se logra manteniendo uno de ellos vaco, pero expuesto a las mismas condiciones de recoleccin de la muestra; tambin se debe considerar que de acuerdo a la capacidad de estos recipientes y la cantidad de muestra tomada de cada envase correspondiente a un lote, ser el nmero que de ellos se necesite; en el aspecto cuantitativo una muestra unitaria consiste de un mnimo de 100 g de alimento, que es el tamao usual de empaque para el consumidor del producto. Las condiciones de conservacin, transporte, tiempo comprendido entre la recoleccin de la muestra, su entrega en el laboratorio, as como la realizacin del anlisis influyen notoriamente en los resultados obtenidos, ya que la poblacin microbiana puede sufrir cambios cualitativos y cuantitativos, esto es apreciablemente cierto en los productos perecederos. Adems se deben tomar en consideracin los siguientes puntos para obtener resultados confiables: La recoleccin de las muestra se debe de efectuar evitando toda contaminacin externa, tanto ambiental, como humana para asegurar la integridad de la misma. Si es posible, enviar las muestras al laboratorio en el empaque original sin abrir. Si el producto es, o se encuentra en empaques de gran tamao para enviarlos al laboratorio, transferir la porcin representativa a un contenedor estril bajo condiciones aspticas, para lo cual es necesario esterilizar por separado utensilios de acero inoxidable como: cucharas, cuchillo, tenedor, esptulas y tijeras en autoclave o en horno, para que puedan ser utilizados en en la toma de muestra. El uso de alcohol y flamear para esterilizar utensilios o equipo puede ser peligroso y es inadecuado. Utilizar recipientes limpios, secos, libres de fugas, de boca ancha, estriles y de un tamao apropiado para la toma de las muestras del producto. En lo posible, evitar los recipientes de vidrio que pueden romperse y contaminar el producto alimenticio. Los contenedores como jarras de plstico o latas de metal, debern estar hermticamente cerrados y a prueba de fugas. Para materiales secos, utilizar cajas de metal estriles, latas, bolsas, o empaques con sellos o cierres adecuados. Las bolsas de plstico estriles (solamente para materiales secos, no congelados) o botellas de plstico, son empaques tiles para lneas de

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muestras. Se deber tener cuidado de no sobrellenar las bolsas o fracturar la bolsa por puncin. Identificar cada muestra unitaria (definida posteriormente en este apartado) con una etiqueta o maskingtape. No etiquetar con una pluma sobre el plstico porque la tinta puede penetrar en el contenedor. De ser posible obtener al menos 100 g de cada unidad de muestra. Enviar as mismo controles abiertos o cerrados, dentro de contenedores estriles junto con la muestra. Entregar las muestras al laboratorio rpidamente, manteniendo en lo posible las condiciones de almacenamiento originales. Cuando se colecten muestras lquidas, tomar una muestra adicional para llevar el control de la temperatura, se debe tomar la temperatura de la muestra control durante el muestreo y al llegar al laboratorio. Elaborar una historia de todas las muestras para los tiempos, fechas de recoleccin y llegada al laboratorio. Los alimentos enlatados o secos que no sean perecederos y sean colectados a temperatura ambiente, no necesitan ser refrigerados. Transportar los alimentos refrigerados o congelados en contenedores seguros y apropiados de construccin rgida, de tal manera que puedan llegar al laboratorio sin cambio alguno. Colectar las muestras congeladas en contenedores pre-enfriados. Colocar los contenedores en un congelador lo suficientemente grande para mantenerlos fros y espaciados; mantener en congelacin las muestras slidas congeladas todo el tiempo. No se debern congelar los productos refrigerados. Enfriar en hielo entre 0-4C las muestras refrigeradas, excepto las de mariscos y moluscos bivalvos y colectarlas en un contenedor con refrigerante capaz de mantener la temperatura de la muestra entre 0-4C hasta su llegada al laboratorio. A menos que se especifique de otra manera, las muestras refrigeradas en general no debern ser analizadas en un lapso mayor a 36 h despus del tiempo de recoleccin. Empacar las muestras de moluscos bivalvos desconchadas en hielo frap hasta su anlisis. Mantener los mariscos en un intervalo de temperatura entre 0 y 10 C. Examinar los mariscos o moluscos bivalvos en un perodo de 6 h y no ms de 24 h despus de que se hayan recolectado. Cabe destacar la importancia del muestreo y la conservacin para los alimentos perecederos ya que para fines oficiales la Ley General de Salud seala claramente que despus de la notificacin de los resultados del anlisis practicado, si existe alguna duda sobre la veracidad de stos, el particular puede impugnar dentro del plazo contemplado en la misma Ley, lo que da como consecuencia que la Secretara de Salud analice la muestra testigo en un laboratorio de tercera que sta seale en presencia de las partes interesadas y el resultado obtenido sea el que en forma definitiva acredite si el producto en cuestin rene o no los requisitos y especificaciones sanitarias. Sin embargo, los alimentos an en condiciones apropiadas de conservacin, pueden sufrir cambios significativos en sus caractersticas biolgicas y/o fisicoqumicas, provocando que los resultados de las muestras testigo sean improcedentes.

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Cualquier informacin relevante, como la que a continuacin se seala, debe acompaar a la muestra del alimento para asegurar que estar sujeta al anlisis ms adecuado y para permitir que el analista evale adecuadamente los resultados: Nombre y autoridad del oficial muestreador. Nmero de identificacin de la muestra. Fecha, hora y lugar del muestreo. Descripcin de la muestra incluyendo nmero de lote, cdigo de enlatado, etc. y datos de caducidad (sese por tanto tiempo, mejor antes de tanto tiempo, etc.). Razn del muestreo. Nombre del propietario, fabricante, manufacturador, importador, vendedor, comprador, etc. El proceso y fecha de coccin (si se conoce) de alimentos cocidos. Pas de origen, condiciones de almacenamiento en ese pas, condiciones y tiempo de transporte (si se conocen). Condiciones de almacenamiento del lugar del muestreo. Otros factores importantes, por ejemplo condicin del empaque, humedad, sanitizacin Mtodo de muestreo (al azar a travs del lote, al azar a travs de unidades accesibles, etc.). Condiciones de almacenamiento y transporte desde que la muestra fue tomada. Detalles clnicos y epidemiolgicos (en caso de sospecha de envenenamiento alimentario, as tambin en caso de que se considere como fuente de contaminacin con patgenos).

Las muestras de alimentos deben ser recibidas en el laboratorio en contenedores de varios tipos y deben utilizarse las tcnicas de asepsia al abrirse. El contenedor deber estar desinfectado con alcohol al 70%, si es necesario, para evitar la contaminacin de la muestra. Otros lotes de un producto similar pueden proporcionar un historial til y debern evaluarse junto con cualquier muestra sospechosa. Los siguientes detalles debern acompaar al formato: Apariencia- describir la muestra en trminos generales, por ejemplo: 70.0 g de rebanada de jamn cocido, envuelta en papel, color rosado. Debern registrarse los signos de deterioro, color anormal y presencia de hongos. Textura- El deterioro bacteriano puede causar que los productos se tornen suaves o semi-lquidos, esto aplica particularmente a los productos crnicos. Olor- Este es un indicador de descomposicin o contaminacin. Un anlisis organolptico incluye el sabor, pero STE NO DEBER REALIZARSE EN EL LABORATORIO.

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A. Manejo de Muestras Homogeneizado de Muestra

en

el

Laboratorio

Preparacin

del

Tan pronto como la muestra de alimento llega al laboratorio, el analista deber anotar las condiciones fsicas generales de la misma. Si la muestra no puede ser analizada inmediatamente, deber ser almacenada como se describe posteriormente. Si la muestra va a ser analizada para fines regulatorios, para investigacin de un brote por consumo de un alimento, o para una inspeccin bacteriolgica, es esencial el seguimiento estricto a las recomendaciones descritas a continuacin. B. Recibo de muestras. 1. Estado del contenedor de muestras. Examinar los contenedores de muestras con el objetivo de localizar posibles defectos fsicos graves. Inspeccionar cuidadosamente bolsas y botellas para comprobar que no presentan hoyos, fracturas, etc., adems corroborar que no exista contaminacin cruzada proveniente de los defectos descritos anteriormente y que invalidara el anlisis. 2. Etiquetado e Historial. Cada muestra debe estar sellada con tapa y acompaada de un reporte de recoleccin completo (como el que se indic anteriormente) y registrarse el nmero de muestra y la fecha. Asignar a cada muestra unitaria un nmero individual y analizarla separadamente a menos de que se trate de una muestra compuesta descrita en el captulo anterior. 3. Seguimiento de un plan de muestreo. La mayora de los alimentos se recolectan de acuerdo a un plan de muestreo. Dependiendo del alimento y el tipo de anlisis diseado, determinar el plan ms adecuado. 4. Almacenamiento. Si es posible, examinar las muestras inmediatamente despus de recibirlas. Sin embargo, si el anlisis debe ser pospuesto, almacenar las muestras congeladas a -20C hasta su realizacin. Refrigerar las muestras perecederas no congeladas de 0-4C por un periodo mximo de 36 h. Los alimentos no perecederos, enlatados o de baja humedad se almacenarn a temperatura ambiente hasta el anlisis. C. Descongelado. Utilizar una tcnica asptica para el manejo del producto congelado. Antes de manipular o analizar la muestra de alimento, limpiar las reas de trabajo y reas circundantes. Aunado a lo anterior humedecer el rea de trabajo y las reas circundantes con un agente germicida comercial. De preferencia no descongelar las muestras antes del anlisis. Si es necesario atemperar la muestra congelada para tomar una porcin analtica, descongelar en el

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empaque original o en el contenedor en el que se recibi en el laboratorio. Cuando sea posible, evitar la transferencia de la muestra a un segundo contenedor para descongelar. Normalmente la muestra puede ser descongelada de 2 a 5C en 18 h. Si se desea un descongelado rpido, someta la muestra a una temperatura menor a 45C por un tiempo no mayor a 15 min. Cuando se descongele una muestra a temperatura elevada (mayor a 45C), agitar la muestra continuamente en un bao de agua con termostato. D. Mezclado. En las muestras alimenticias puede presentarse una distribucin no homognea de los microorganismos. Para asegurar una distribucin ms uniforme, homogenizar circularmente las muestras unitarias lquidas y las muestras secas con una cuchara estril u otro utensilio antes de tomar la muestra analtica para la determinacin de microorganismos mesoflicos aerobios por el mtodo de cuenta en placa y el nmero ms probable para microorganismos coliformes. Utilizar el tamao de la muestra analtica recomendado en cada prctica. Si el contenido del empaque es obviamente no homogneo (por ejemplo, una comida congelada), examinar la muestra analtica del alimento macerado, o preferiblemente analizar cada porcin por separado, dependiendo del objetivo del anlisis. E. Pesado. Tare el vaso de licuadora o la bolsa de Stomacher; entonces pese aspticamente dentro del vaso de licuadora, el tamao de muestra analtica recomendado (si es congelado, pese antes de descongelar). Adicione la cantidad de diluyente necesario para tener una dilucin decimal (10-1). El volumen total de muestra ms diluyente deber cubrir completamente las aspas del vaso de licuadora. F. Molido y Diluido. Adicionar el volumen de solucin amortiguadora de fosfatos 0.1M pH 7.2 o agua peptonada al 0.1% estril necesario para obtener la primera dilucin decimal al vaso de licuadora y mezclar por 2 min. Este mezclado ser la dilucin 10-1. Realizar rpidamente diluciones decimales del homogenizado original, usando pipetas que descarguen el volumen requerido con precisin. No medir menos del 10% del volumen total de la pipeta, por ejemplo, no use pipetas con un capacidad mayor a 10 mL para medir volmenes menores a 1 mL; para medir volmenes de 0.1 mL, no utilizar pipetas con una capacidad mayor a 1 mL. Preparar todas las diluciones decimales con 90 mL de diluyente estril y 10 mL de la dilucin previa a menos que se especifique de otra manera. Mezclar todas la diluciones vigorosamente 25 veces en un arco de 30 cm. en 7 s. No deben excederse ms de 15 min. Desde el licuado de la muestra hasta que las diluciones correspondientes sean vertidas en el medio de cultivo adecuado.

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G. Homogeneizacin con Stomacher. La molienda con Stomacher como un medio para la preparacin de muestras fue introducida por Sharpe y Jackson en 1972. Fue sugerida como una alternativa muy til para la molienda en la preparacin de alimentos para anlisis microbiolgico. Los Stomachers (Tekmar Co., Cincinnati, OH) estn disponibles comercialmente en 3 tamaos, Stomachers 80, 400 y 3500, para el manejo de volmenes de 8-80, 40-400 y 300-3000 mL, respectivamente. El principio de operacin es muy sencillo. La muestra de alimento con el diluyente se coloca en una bolsa de plstico estril y se introduce en el Stomacher, una caja de metal rectangular con paletas de metal dentro, de tal manera que las paletas golpeen sobre la bolsa. Estas paletas, accionadas por un motor a velocidad constante, se movern hacia adelante y atrs golpeando literalmente la muestra. Este golpeteo liberar a las bacterias de las partculas de alimento, debido en parte a la agitacin violenta del lquido y en parte por la compresin que sufre la muestra por las paletas. No se necesita una homogenizacin completa de la muestra. Como las muestras de alimento se colocan en bolsas de plstico, los fabricantes recomiendan que muestras con huesos u otros objetos punzantes no se preparen con este mtodo.

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