MICROBIOLOGIA APLICADA Manual de Laboratorio

PRACTICA Nm. 7 ESTERILIZACION POR CALOR SECO Y CALOR HUMEDO I. OBJETIVO Demostrar la diferencia de penetrabilidad del calor seco y del calor hmedo usando como indicador la viabilidad de una bacteria.

II. INTRODUCCION Existen diversos mtodos fsicos de esterilizacin y de inhibicin del crecimiento microbiano, como pueden ser el calor, la filtracin y la radiacin, pero el ms ampliamente usado es el calor, ya sea hmedo seco, los cuales tienen diferente penetrabilidad. Conforme aumenta la temperatura por encima de la temperatura mxima de crecimiento, se producen efectos letales en los microorganismos. La muerte de las bacterias por el calor es consecuencia de la desnaturalizacin de sus protenas. Los enlaces intracelulares e intermoleculares (puentes de Hidrgeno), de las protenas de los cuales depende su funcionalidad son ms lbiles cuando las protenas estn hidratadas que cuando no lo estn, de tal manera que el calor hmedo es ms efectivo en la desnaturalizacin de enzimas y otros componentes proteicos importantes para la clula que el calor seco. Es por eso que se dice que el calor hmedo tiene mayor penetrabilidad que el calor seco. El calor, de cualquier forma, es utilizado extensamente como un agente letal bacteriano y se puede aplicar a numerosos instrumentos, materiales y substancias, con el propsito de matar a las bacterias que ellos contengan. Este proceso se flama Esterilizacin y al material, cultivo medio de cultivo sometido a ste, se le denomina entonces Estril, es decir, desprovisto de toda forma viviente.

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El calor puede ser generado en diversos aparatos y por lo tanto se puede esterilizar por calor hmedo y por calor seco. En ambos casos hay numerosos factores que condicionan la efectividad del proceso: Cantidad de agua, temperatura, presin, tiempo de contacto, superficie de esterilizacin, pH, edad de las bacterias, la presencia o no de esporas, composicin del medio de suspensin, etc. Las clulas vegetativas y las endosporas bacterianas de un mismo organismo varan considerablemente en cuanto a su resistencia al calor. La muerte de los microorganismos es ms rpida a pH cido. Las concentraciones elevadas de azcares, protenas o grasas disminuyen la penetracin del calor y habitualmente aumentan la resistencia de los organismos al calor, mientras que las elevadas concentraciones de sal pueden incrementar o bien reducir la resistencia al calor, dependiendo del organismo.

III. MATERIAL Y SUBSTANCIAS 2 tubos de ensayo conteniendo cada uno un aplicador contaminado con cultivo bacteriano. 2 tubos de ensayo conteniendo caldo nutritivo estril. Gradilla. Canastilla para colocar los tubos rotulados con A. Vaso de precipitados para colocar los tubos rotulados con H. Mechero Bunsen. Cerillos encendedor. Masking tape. Asa bacteriolgica. Autoclave. Horno de calor seco. IV. TECNICA 1. Rotular uno de los tubos conteniendo un aplicador contaminado con la palabra Horno y el otro con la palabra Autoclave, anotando adems el nombre del alumno o nmero de equipo, para su identificacin.

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2. Esterilizar los cultivos por el mtodo correspondiente, segn el rtulo, en ambos casos a una temperatura de 121 C y un tiempo de 15 minutos. 3. Despus de este perodo, sacar los tubos y aadirles, en condiciones aspticas, caldo nutritivo estril. 4. Incubar a 37 C, por 24-48 horas. 5. Despus de este perodo observar si hubo o no desarrollo en los tubos, el cual se manifiesta mediante turbidez del medio. 6. Anotar los resultados y sacar conclusiones en cuanto al poder de penetrabilidad del calor seco y del calor hmedo.

MANEJO DE AUTOCLAVE: 1. Asegurarse de que haya un buen nivel de agua en el autoclave. Si no hay suficiente, agregarla hasta que casi llegue a la parrilla inferior. 2. Introducir el material que se va a esterilizar procurando que quede bien colocado para evitar algn problema y cerrar la puerta ajustndola bien. Debe de quedar hermticamente cerrado. 3. Abrir la vlvula de salida de vapor y encender la fuente de calor del autoclave. 4. A medida que suba la temperatura del agua (ver el termmetro), empezar a salir una mezcla de vapor-aire por la vlvula de salida de vapor, dejar que escape esta mezcla hasta que solo salga un flujo continuo de vapor y el aire haya sido eliminado; a sto se le flama purgar el autoclave. 5. Una vez purgado el autoclave, cerrar la vlvula de salida de vapor y dejar que la presin suba hasta 15 libras por pulgada cuadrada (vigilar el manmetro), lo que proporciona una temperatura de 121 C. Observar que no es la presin del autoclave lo que mata a los microorganismos sino la elevada temperatura que puede alcanzarse cuando el vapor de agua se somete a presin. 6. En ese momento empezar a contar el tiempo. 7. Transcurridos 15 minutos a 15 libras de presin, apagar la fuente de calor y dejar que el autoclave se enfre slo (no abrir la vlvula de salida de vapor), hasta que la presin haya bajado a 0 libras.

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8. Abrir el autoclave y sacar el material.

MANEJO DEL HORNO DE CALOR SECO: 1. Para efectos de esta prctica, encender el horno elctrico y mediante el termostato, elevar la temperatura hasta que llegue a 121 C y mantener esta temperatura constante. 2. Introducir el material a esterilizar y cerrar la puerta. 3. Empezar a contar 15 minutos de exposicin a esa temperatura. 4. Despus de este perodo, apagar el horno, abrir la puerta y sacar el material. Si an est caliente, usar un guante de asbesto.

V. CUESTIONARIO 1. Dibujar y describir un Autoclave y un Horno de calor seco. 2. Qu tipo de material se puede esterilizar en el Horno de calor seco y en el Autoclave? Dar ejemplos. 3. Cul es la temperatura y el tiempo que se requieren para lograr la esterilizacin en el Horno de calor seco? 4. Por qu es necesario ajustar el tiempo y la temperatura para lograr la esterilizacin? 5. En qu consisten los mtodos de Arnoldizacin y Pasteurizacin?

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