Enzimología y Estructura de Proteínas

(BT5302/ BT7435)

Enzimología

Juan Pablo Rodríguez

- 2011 -
3. Catálisis por iones metálicos.
De acuerdo a la fuerza con que se une el metal, las enzimas se clasifican
en:

Metaloenzimas. El ion metálico se encuentra unido fuertemente y son

iones tales como Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, o Co2+.

Enzimas activadas por metales. Unen metal libremente de la solución y

son del tipo Na+, K+, Mg2+ o Ca2+.

Los iones metálicos participan en el proceso catalítico principalmente de

tres maneras:

- Uniéndose al sustrato de manera de orientarlo apropiadamente.

- Mediando reacciones de oxido-reducción a través de cambios
reversibles en el estado de oxidación del ion metálico.
- Estabilizando o enmascarando electrostáticamente cargas negativas.
Los iones metálicos pueden funcionar catalíticamente de varias maneras.

- Puede actuar como un catalizador electrofílico, estabilizando una carga

negativa en un intermediario de la reacción.

- Puede generar un nucleofilo aumentando la acidez de una molécula vecina,

como en el caso del agua en la hidratación del CO2 por anhidrasa carbónica.

- Se puede unir al sustrato, aumentando tanto el número de interacciones con

la enzima como la energía de unión.
¿Como facilita el Zinc la hidratación del CO 2?

Un dato importante proviene de la curva de pH de la hidratación de CO 2 catalizada enzimáticamente. A pH 8, la

reacción procede cerca de su velocidad máxima. A pH mas bajo, la velocidad disminuye. El punto medio de la
transición es cerca de pH 7, sugiriendo que un grupo con pKa= 7 juega un rol importante en la actividad de la
enzima y que la forma deprotonada de este grupo (pH alto) participa mas efectivamente en la catálisis. Aunque
algunos aminoácidos, como histidina, tienen pKa cerca de 7, hay muchas evidencias que sugieren que el grupo
responsable de esta transición no es el aminoácido sino el Zinc unido a la molécula de agua.

Efecto del pH en la Actividad de

Anhidrasa Carbónica
 pKa de la Molécula de Agua Unida a Zn2+

La unión de la molécula de agua al Zn 2+ reduce el pKa de la molécula de agua

de 15.7 a 7. Con este pKa mas bajo, se genera una concentración mayor de
ion hidróxido (unido a zinc) a pH neutro. Un ion hidróxido unido a zinc es
suficientemente nucleofílico para atacar el CO 2 mas facilmente que el agua.
 Mecanismo de Anhidrasa Carbónica

1. Zinc facilita la salida de un protón desde la molécula de agua, lo cual genera un

ion hidróxido.
2. El sustrato dioxido de carbono se une al sitio activo de la enzima y es ubicado
en una posición adecuada para reaccionar con el ion hidróxido.
3. El ion hidroxido ataca al dióxido de carbono, convirtiéndolo en el ion
bicarbonato.
4. El sitio catalítico se regenera con la salida del ion bicarbonato y la unión de otra
molécula de agua.

Así, la unión del agua al zinc favorece la formación del estado de transición, llevando
a la formación de bicarbonato facilitando la salida del protón y manteniendo los dos
reactivos muy cerca uno del otro.
4. Catálisis electrostática.

La unión del sustrato generalmente excluye al agua del sitio

activo.
La constante dieléctrica local se parece a un solvente orgánico,
donde las interacciones electrostáticas son mucho mas fuertes
que en solución acuosa.
5. Catálisis a través de efectos de proximidad y orientación.

Aunque las enzimas utilizan mecanismos que se parecen a reacciones

orgánicas modelos, ellas son catalíticamente mas eficientes que esos
modelos.

Esta eficiencia puede surgir de condiciones físicas específicas en el sitio

catalítico de la enzima que promueve la reacción química
correspondiente.

Los efectos mas obvios son:

- Proximidad
- Orientación

Los reaccionantes deben estar juntos y en la disposición espacial correcta

para que ocurra la reacción.
Efectos de Proximidad y Orientación.
Reacciones con cada vez menos grados de libertad.
Efectos de Proximidad y Orientación.
Efectos de Proximidad y Orientación.

OH O O
+ H2 O

COOH

OH
COOH

CH3 CH3 CH3

B
6. Catálisis por unión preferente al estado de transición.

El aumento de la velocidad enzimática es a menudo mucho mayor que lo

que pueden explicar los mecanismos descritos.

El factor mas importante de la catálisis enzimática es la unión al estado de

transición con mayor afinidad que los correspondientes sustratos y
productos.

La unión al estado de transición produce una tensión a sus sustratos para

que adopten la geometría de éste en un sitio donde no encaja el sustrato no
distorsionado.

Esto se basa en las evidencias que existen respecto del rol de la tensión en
reacciones orgánicas.
El reactivo tensado se parece mas al estado de transición de la reacción
que el correspondiente reactivo no tensado.

Si una enzima une preferentemente su estado de transición, análogos de

éste se comportan como potentes inhibidores de la enzima.
Inhibidor análogo al estado de transición
En resumen, las enzimas ejercen su poder catalítico:

1. Manteniendo los sustratos juntos y en la orientación adecuada.

2. Proveyendo los grupos ácidos y básicos en la orientación apropiada

para promover la transferencia de protones dentro del sustrato.

3. Los grupos en la enzima (especialmente los grupos nucleofílicos)

pueden formar enlaces covalentes con el sustrato para formar
estructuras que son mas reactivas que las originales.

4. La enzima es capaz de introducir torsión en los sustratos, quizás

acompañada con cambios conformacionales de la proteína.
Inmunoglobulinas o Anticuerpos:

Proteínas grandes (150.000 daltons),

Formadas por cuatro cadenas polipeptídicas:
dos cadenas pesadas y dos cadenas livianas
Contienen regiones variables
Altamente específicos
Anticuerpos Catalíticos: Abzymes

Aprovechando la gran especificidad de unión por el antígeno que

tienen los anticuerpos, se han desarrollado estrategias experimentales
para producir anticuerpos que catalizan reacciones químicas.

Estos anticuerpos catalíticos, o abzymes, se seleccionan desde

anticuerpos monoclonales generados por inmunización de ratones con
haptenos que semejan el estado de transición de la reacción catalizada
por la enzima.
Estrategias para generar anticuerpos con actividad catalítica:

i) Usar los anticuerpos para estabilizar estados de transición,

ii) Usar anticuerpos como trampas entrópicas,
iii) Generar anticuerpos con grupos catalíticos o cofactores.
Por ejemplo, abzyme 28B4 cataliza la oxidación por periodato de p-nitrotoluen-metil
sulfuro a sulfoxido, donde los electrones del átomo de S se transfieren al oxigeno.

La velocidad de esta reacción es acelerada por enzimas que estabilizan el estado de

transición de la reacción.

Para generar abzymes complementarias en estructura al estado de transición, los

ratones son inmunizados con un hapteno cuya estructura es un espejo de la estructura
y propiedades electrostáticas del estado de transición.

De los anticuerpos monoclonales generados con este hapteno, se encontraron muchos

que catalizan la oxidación del sulfuro, pero con un rango de afinidad de unión y
eficiencia catalítica muy amplio.

Abzyme 28B4 une el hapteno con alta afinidad (K d = 52 nM) y tiene una alta eficiencia
catalítica (k3/KM = 190,000 M-1s-1).
Las enzimas aumentan la velocidad de una reacción química
a través de mecanismos catalíticos concertados:

- Efectos de proximidad y orientación,

- Catálisis covalente
- Catálisis ácido-base general.

Introducción de Grupos Catalíticos:

- Introduciendo modificaciones al antígeno es posible generar grupos

catalíticos en los sitios de unión del anticuerpo.

- Uso de la mutagénesis sitio dirigida. Es posible introducir aminoácidos

específicos para aumentar la capacidad catalítica del anticuerpo.

- Modificación química
 RNA con Actividad Catalítica

RNAs forman un grupo de moléculas de sorprendente versatilidad.

 El “splicing” es catalizado principalmente por moléculas de RNA, con

proteínas jugando un rol secundario.

 Otra enzima que contiene componentes RNA clave es la ribonucleasa

P (RNAse P), la cual cataliza la maduración del tRNA removiendo
nucleotidos desde el extremo 5′ de la molécula precursora.

 El componente RNA de los ribosomas es el catalizador que lleva a

cabo la síntesis de proteínas.
 Auto-Splicing

• La reacción de auto-splicing requiere de la adición de nucleótido de guanosina,

como cofactor y no como fuente de energía, proporcionando un grupo atacante que
se incorpora en forma transiente en el RNA.
• G se une al RNA y ataca el sitio de splice 5’ para formar un enlace fosfodiester con
el extremo 5’ del intrón.
• Esta reacción de transesterificación genera un grupo 3′-OH en el extremo río arriba
del exón. Este nuevo grupo 3′-OH ataca el sitio de splice 3’. Esta segunda reacción
de transesterificación une los dos exones y produce la liberación de un intrón de 414
nucleotidos.
(En Tetrahymena, un protozoo ciliado)
Mecanismo de Auto-Splicing

 El análisis de la secuencia de bases del

precursor del rRNA sugiere que el sitio 5′ del
splice está alineado con los residuos catalíticos
por apareamiento de bases entre una región rica
en pirimidinas (CUCUCU) río arriba del exon y
una región rica en purinas (GGGAGG) en el
intron.

 El intrón lleva el cofactor guanosina y el sitio 5’

de splice de forma que el grupo 3′-OH de G puede
atacar nucleofílicamente el átomo de fósforo en el
sitio de splice.

 Otra parte del intrón permanece unida a la

parte río abajo del exón en posición para ser
atacado por el grupo 3′-OH recién formado en el
exón río arriba.

 Se forma un enlace fosfodiester entre los dos

exones, y el intrón se libera como una molécula
lineal.

 Al igual que la catálisis enzimática, la

autocatálisis de formación y rompimiento de
enlaces en este precursor de rRNA es altamente
específica.
Comparación entre tipos de Splicing

 Los exones que se juntan se muestran en azul

y amarillo y el grupo que ataca se muestra en
verde. El sitio catalítico está formado por el
propio intrón (rojo) en los splicing del grupo I y
grupo II.

 El auto splicing de Grupo I está mediado por

el cofactor guanosina.

 El grupo que ataca en el splicing de grupo II

es el 2′ OH de un adenilato específico del intrón.
Las enzimas inmovilizadas pueden ser clasificadas en las siguientes
cuatro categorías:

i) Absorbidas fuertemente a soportes insolubles

ii) Unidas covalentemente a un soporte sólido
iii) Atrapadas en una matriz (geles)
iv) Microencapsuladas.
Unión a un soporte sólido: la enzima se une a un soporte insoluble.

- Adsorción física
- Unión iónica
- Unión covalente

Enzimas atrapadas en matriz: se incorpora la

enzima en la trama de un gel semipermeable o
se encierra la enzima en una membrana
semipermeable.

Entrecruzamiento de moléculas de enzimas por

reactivos bi o multifuncionales.
Adsorción Física

Este método se basa en la adsorción física de la enzima sobre la superficie de un

soporte insoluble. Por eso, el método provoca poco o ningún cambio conformacional
de la enzima o destrucción de su sitio activo. Si se encuentra el soporte adecuado,
este método es simple y económico.

Desventaja: La enzima adsorbida se puede soltar durante su uso debido a lo débil que
son los enlaces de unión entre la enzima y el soporte.
Debido a los enlaces débiles involucrados, la desorción de la proteína es
provocada por cambios de temperatura, pH, fuerza iónica o aún la presencia de
sustrato.

Ventajas: Generalmente no requiere de reactivos y sólo de un mínimo de etapas de

activación.
La adsorción tiende a ser menos disruptiva de la enzima que los medios químicos de
unión ya que la unión es principalmente por enlaces de hidrógeno, enlaces
electrostáticos, etc .
El método de la unión iónica se basa en la interacción iónica de la enzima con
grupos de intercambio iónico en el soporte insoluble.

Polisacáridos y polímeros sintéticos que tienen grupos de intercambio iónico son los
mas usados como soportes.

La unión se lleva a cabo fácilmente y las condiciones son mucho mas suaves que las
necesarias para la unión covalente.

Este método de unión provoca pocos cambios en la conformación y sitio activo de la

enzima.

Las enzimas inmovilizadas con este método tienen alta actividad.

La enzima se puede soltar desde el soporte en condiciones de alta fuerza iónica o

variaciones de pH, porque las fuerzas de unión entre las proteínas y el soporte son
débiles.

La principal diferencia entre la unión iónica y adsorción física es que la unión de la

enzima al soporte es mucho mas fuerte en la unión iónica aunque mas débil que la
unión covalente.
La unión covalente se basa en la unión de la enzima a soportes insolubles a través de
enlaces covalentes.
Los grupos funcionales que pueden participar de esta unión son:

Amino, Carboxilo, Sulfidrilo, Hidroxilo, Imidazol, Fenólico, Tiol, Treonina, Indol

- Las condiciones de inmovilización por enlaces covalentes son mucho mas complejas y
mas drásticas que en el caso de la adsorción física y unión iónica.

- La unión covalente puede alterar la conformación y sitio activo de la enzima,

resultando
en una mayor pérdida de la actividad y/o cambios de afinidad por el sustrato.

- La unión entre la enzima y el soporte es tan fuerte que la enzima no se suelta aún en
presencia de sustrato o de soluciones de alta fuerza iónica.
 Aminoácido Grupo Nº Porcentaje
Reacciones

Lisina -amino 27 7,0

Cisteína Sulfihidrilo 31 3,4
Aspártico Carboxilo 4 4,8
Glutámico Carboxilo 4 4,8
Tirosina Fenol 16 3,4
Arginina Guanidinio 6 3,8
Histidina Imidazol 13 2,2
Triptofano Indol 7 1,2
Metionina Tioester 7 1,6
Serina Hidroxilo 0 7,8
Metionina Hidroxilo 7 1,6
Inmovilización en diferentes soportes sólidos.

Al momento de seleccionar el soporte es importante considerar los

siguientes factores:

1. Propiedades mecánicas: rigidez y durabilidad.

2. Forma física: gránulos, láminas, pared interna de un tubo.

3. Resistencia a ataque químico o microbiano.

4. Hidrofilicidad, manifestada por la capacidad de incorporar agua en su estructura.

5. Permeabilidad.

6. Capacidad para ser derivatizada sin modificar sus características.

7. Precio y disponibilidad.
 Reactor Tanque con agitación

Un reactor en un tanque con agitación es el tipo mas simple

de reactor. Se compone de un reactor y de un mezclador, agitador.

Este reactor es útil para soluciones de sustratos de alta viscosidad

y para enzimas inmovilizadas con relativamente baja actividad.

Sin embargo, las enzimas inmovilizadas tienden a inactivarse con la

agitación. Este sistema es utilizable para la producción de pequeñas
cantidades de reactivos.

Una modificación es un reactor en tanque continuo con agitación,

el cual es mas eficiente que el anterior, pero el equipamiento es
levemente mas complicada.
Reactor en columna

Son los reactores mas ampliamente usado para las enzimas inmovilizadas.
Se debe considerar la velocidad de flujo y el efecto de las dimensiones de
la
columna en la velocidad de la reacción.

Este tipo de reactores puede ser del tipo:

1. Flujo hacia abajo
2. Flujo hacia arriba
3. Reciclaje
Hidrólisis de Lactosa: Una importante aplicación de las enzimas inmovilizadas

El objetivo es convertir el disacárido lactosa, vía hidrólisis, en sus componentes: glucosa y galactosa.
Lactosa está normalmente en la leche humana y de vaca y es muy usada en fórmulas lácteas
infantiles.
Un gran problema con la lactosa es que muchas personas son intolerantes a la lactosa, es decir el
organismo es incapaz de digerirla.

Se estima que anualmente se acumulan 1.2 millones de toneladas de lactosa por el procesamiento
de la leche para producir diversos productos lácteos, como en el suero generado en la elaboración
de quesos.
La conversión de lactosa en glucosa y galactosa representa una manera de agregar valor al suero y
sus productos. Para la hidrólisis enzimática de la lactosa se han descrito varias ß-glicosidasas,
alguna de las cuales ya se encuentran en el mercado.
Independiente de la técnica utilizada para generar un sistema de
enzima inmovilizada, es importante tener en cuenta lo siguiente:

a) Enzima cargada
b) Comportamiento cinético
c) Estabilidad
d) Configuración del reactor.

Aplicaciones.

- Estudios Bioquímicos.
- Biotecnología.
 Actividad Enzimática (unidades totales)

Proteína Unida Proteína Solubilizada

Experimento 1
Tetrámero no tratado 3.10 -
Enzima tratada con PHMB 1.53 1.40
+ mercaptoetanol 1.53 1.39

Experimento 2
Enzima tratada con PHMB 1.53
Luego de tratamiento con EDTA
- Mn2+ 0
+ Mn2+ 0.76

Experimento 3
Enzima tratada con PHMB 1.51
Enzima unida a la matriz reasociada 3.05
 SUBUNIDADES SOLUBLES + Mn2+

PHMB 2-MERCAPTOETANOL

MB-TETRAMERO MB-DIMERO

EDTA
SUBUNIDADES
SOLUBLES EDTA
+
Mn2+
Mn2+

MB-MONOMERO MB-SUBUNIDAD

= Especies Activas = Especies Tratadas con PHMB = Especies Inactivas

Derivados Unidos a la Matriz Km Ki Lisina Ki Ornitina pH óptimo
(mM) (mM) (mM)

Monómeros 4.0 2.2 4.1 9.5

Dímeros 4.0 2.4 4.3 9.5
Tetrámeros 4.0 2.3 4.2 9.5