Aplicación del ensayo de

reactividad peptídica directa

(DPRA) a mezclas: Desafíos y
oportunidades
Nicolas Garzon Alvarez & Katherine Romero
 CONTENIDO
GENERALIDADES SOBRE DAC

DPRA INTRODUCCION Y V/D

OBJETIVO

PROCEDIMIENTO

RESULTADOS

DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

REFERENCIAS
 Dermatitis alérgica de contacto (DAC)
Es una respuesta de hipersensibilidad tipo 4 por
parte del sistema inmune a una molécula pequeña
(menor a 500 Da) que entra en contacto con la piel
de un individuo sensibilizado [1]

La morfología y la ubicación de la dermatitis

suelen ser el mejor indicador del agente causante
junto a la prueba del parche [2]
Imagen 01 tomada de: https://www.cigna.com/es-us/knowledge-
center/hw/dermatitis-por-contacto-tp12544
 VÍA DE RESULTADOS ADVERSOS
1 3

ACTIVACIÓN DE
HAPTENACION
CÉLULAS
DENDRÍTICAS

2
4

ACTIVACIÓN DE PROLIFERACIÓN
QUERATINOCITOS DE LINFOCITOS T
 DPRA: Introducción

● El método DPRA asume que los alérgenos son ● Los valores de depleción de estos aminoácidos

moléculas pequeñas electrofílicas que permiten clasificar las sustancias en una de las

reaccionan con grupos nucleofílicos de los cuatro categorías de reactividad y discriminar

aminoácidos y por lo tanto unirse entre sensibilizadores cutáneos y no

covalentemente a ellas. sensibilizadores.

● La simulación de la unión covalente consiste ● El DPRA ofrece predicción de hasta el 89% de

en cuantificar la reactividad de los posibles sensibilizadores .

sensibilizadores hacia los aminoácidos lisina y

cisteína.
 VENTA JAS Y DESVENTA JAS

1. Es una prueba rápida

2. No requiere una compleja configuración
instrumental 1. Aplicable solo para sustancias
3. Tiene una precisión de hasta el 89% midiendo químicas individuales
la sensibilización - EXTRACTOS
4. Simula in chemico la unión hapteno-proteína - ACEITES ESENCIALES
5. Se cuantifica la reactividad de la unión 1. No es una prueba independiente
hapteno-lisina y hapteno-cisteína
 LIMITACIONES DE LA PRUEBA

CLASE DE SUSTANCIA MOTIVO

Metales No se unen a proteínas por unión covalente.
Pro-haptenos Requieren bioactivación enzimática para ejercer su
potencial de sensibilización cutánea.
Pre-haptenos Sustancias químicas que se vuelven sensibilizantes después
de una transformación (oxidación).
Sustancias que absorben a 220 nm y coeluyen No es posible calcular el porcentaje de agotamiento de los
péptidos.
Mezclas complejas de composición desconocida No se puede aplicar el método de peso molecular.
Sustancias que no se diluyen en solventes adecuados a 100 No se generará una exposición suficiente.
mM
 OBJETIVO

Ampliar el ámbito de aplicabilidad de la

prueba DPRA a mezclas desconocidas
 PROCEDIMIENTO
EXPERIMENTO 1 : Concentración desconocida de EXPERIMENTO 2: mezcla de ingredientes
sustancias químicas de prueba. desconocidos:
A. No sensibilizadores cutáneos
B. Un sensibilizador cutáneo en combinación con un no
sensibilizador cutáneo
C. Dos sensibilizadores cutáneos.
 PROCEDIMIENTO
1. Preparación de soluciones stock de péptidos 0.667 mM

- Cisteína en buffer fosfato a pH 7.5

- Lisina en buffer acetato de amonio a pH 10.2

2. Incubación:
Condiciones: 24 h, 25°C, en ausencia de luz
- Cisteína:sustancia (1:10) en acetonitrilo
- Lisina:sustancia (1:50) en acetonitrilo
CONTROLES POTENCIA SUSTANCIA

Controles negativos Ninguno Péptidos (lisina y cisteína), acetonitrilo

Control positivo Sensibilizante moderado Aldehído cinámico a 100 mM, acetonitrilo
 PROCEDIMIENTO
3. Análisis por HPLC
- Columna Zorbax SB-C18; 2,1 × 100 mm
- Detector: UV a 220 nm
- Volumen de inyección: 7 µL
- Temperatura: 30°C
- Se midió la depleción de péptido porcentual
Modelo de cisteína/lisina
Modelo de cisteína
 RESULTADOS
Concentración Clasificación
Compuesto DPRA
EXPERIMENTO 1: EC3, mM LLNA
Sustancias individuales 2,4-DNCB 3,95 Sensitizer Sensitizer

● 2,4-Dinitroclorobenceno Formaldehído 133,20 Sensitizer Sensitizer

● 6-Metilcumarina Aldehído cinámico 151,33 Sensitizer Sensitizer
● Cinamaldehído Citral 374,41 Sensitizer Sensitizer
● Citral Eugenol 791,72 Sensitizer Sensitizer
● Eugenol Linalol 1994,90 Sensitizer Sensitizer
● Formaldehído
6-Metilcoumarina 1994,90 Non-sensitizer Non-sensitizer
● Ácido láctico
Ácido láctico 1994,90 Non-sensitizer Non-sensitizer
● Linalol
Oxazolona 0,46 Non-sensitizer Sensitizer
● Oxazolona
 RESULTADOS

EXPERIMENTO 2A:
Mezcla de NO sensibilizantes

● 1-Butanol
● 6-Metilcumarina
● Ácido láctico
● 4-Metoxiacetofenona
● Glicerol
● Alcohol bencílico
● Isoftalato de dimetilo
● Propilparabeno
Concentración de 100 mM
 RESULTADOS
EXPERIMENTO 2B:

Mezcla NO sensibilizante Sensibilizante (potencia)

● 1-Butanol ● 2,4-DNCB (Extremo)

● 6-Metilcumarina ● Formaldehído (Fuerte)
● Ácido láctico ● Bencilidenoacetona (Moderado)
● 4-Metoxiacetofenona ● Farnesal (Débil)
● Glicerol
● Alcohol bencílico
Concentración de 100 mM
● Isoftalato de dimetilo
● Propilparabeno
Concentración de 100 mM
RESULTADOS
 RESULTADOS

EXPERIMENTO 2C: Mezcla de 2 sensibilizantes

2,4- DNCB Formaldehído Farnesal 1-Butanol

Sustancias sensibilizantes
(Extremo) (Moderado) (Débil) (No sensibilizante)
Oxazolona (Extremo) 1 2 3 4
Bencilideneacetona (Moderado) 5 6 7 8
2,3-Butanediona (Débil) 9 10 11 12
Ácido láctico (No sensibilizante) 13 14 15 16
 RESULTADOS
EXPERIMENTO 2C: Mezcla de 2 sensibilizantes

2,4- DNCB Formaldehído Farnesal 1-Butanol

Sustancias sensibilizantes
(Extremo) (Moderado) (Débil) (No sensibilizante)
Oxazolona (Extremo) 93,7 77,8 65,9 73,9
Bencilideneacetona (Moderado) 99,8 88,4 96,0 93,7
2,3-Butanediona (Débil) 99,5 87,0 81,9 79,3
Ácido láctico (No sensibilizante) 99,9 46,6 37,3 0
 RESULTADOS

Farnesal 1-Butanol
Sustancias sensibilizantes 2,4- DNCB (Extremo) Formaldehído (Moderado)
(Débil) (No sensibilizante)
Oxazolona (Extremo) 1 2 3 4

Bencilideneacetona (Moderado) 5 6 7 8

2,3-Butanediona (Débil) 9 10 11 12

Ácido láctico (No sensibilizante) 13 14 15 16

 Conclusiones
1. La prueba DPRA presenta una limitación potencial cuando se prueban sensibilizadores cutáneos extremadamente
diluidos.

2. Las pruebas in vivo, es decir, LLNA, enfrentan limitaciones similares.

3. Los resultados de DPRA obtenidos de mezclas desconocidas deben interpretarse con precaución, porque pueden estar
presentes compuestos sensibilizantes extremos en concentraciones muy bajas que darán falsos negativos.

4. La acción conjunta de dos químicos sensibilizantes en una mezcla no es mayor que el efecto del sensibilizante más fuerte.
GRACIAS
 Referencias
Marcelis, Q., Deconinck, E., Rogiers, V., Vanhaecke, T., & Desmedt, B. (2023).
Applicability of the DPRA on mixture testing: challenges and opportunities.
Archives of Toxicology, 97(9), 2453-2461.

1. Katzung, B. G., Trevor, A. J., & Pacheco, M. D. R. C. (1991). Farmacologia. El

Manual Moderno.
2. Kimber, I., Basketter, D. A., Gerberick, G. F., & Dearman, R. J. (2002). Allergic
contact dermatitis. International immunopharmacology, 2(2-3), 201-211.