CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA

PERFORMANCE – HPLC
(2da Parte)
(High Performance Liquid Chromatography)

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

 INSTRUMENTACION
Inyector Cromatograma

Mezclador mAU

Bomba

Tiempo (min.)
Inyección

Columna

Detector

Solventes

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

 INSTRUMENTACION
Inyector Cromatograma

Mezclador mAU

Bomba

Tiempo (min.)
Inyección

Columna

Detector

Solventes

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

 INSTRUMENTACION
Inyector Cromatograma

Mezclador mAU

Bomba

Tiempo (min.)
Inyección

Columna

Detector

Solventes

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

 INSTRUMENTACION
Inyector Cromatograma

Mezclador mAU

Bomba

Tiempo (min.)
Inyección

Columna

Detector

Solventes

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

 INSTRUMENTACION
Inyector Cromatograma

Mezclador mAU

Bomba

Tiempo (min.)
Inyección

Columna

Detector

Solventes

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

 INSTRUMENTACION
Inyector Cromatograma

Mezclador mAU

Bomba

Tiempo (min.)
Inyección

Columna

Detector

Solventes

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

 INSTRUMENTACION
Inyector Cromatograma

Mezclador mAU

Bomba

Tiempo (min.)
Inyección

Columna

Detector

Solventes

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 INSTRUMENTACION
Inyector Cromatograma

Mezclador mAU

Bomba

Tiempo (min.)
Inyección

Columna

Detector

Solventes

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

 INSTRUMENTACION
Inyector Cromatograma

Mezclador mAU

Bomba

Tiempo (min.)
Inyección

Columna

Detector

Solventes

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

 INSTRUMENTACION
Inyector Cromatograma

Mezclador mAU

Bomba

Tiempo (min.)
Inyección

Columna

Detector

Solventes

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

 INSTRUMENTACION
Inyector Cromatograma

Mezclador mAU

Bomba

Tiempo (min.)
Inyección

Columna

Detector

Solventes

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

 INSTRUMENTACION
Inyector Cromatograma

Mezclador mAU

Bomba

Tiempo (min.)
Inyección

Columna

Detector

Solventes

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

 INSTRUMENTACION
Inyector Cromatograma

Mezclador mAU

Bomba

Tiempo (min.)
Inyección

Columna

Detector

Solventes

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

 INSTRUMENTACION
Inyector Cromatograma

Mezclador mAU

Bomba

Tiempo (min.)
Inyección

Columna

Detector

Solventes

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

 INSTRUMENTACION
Inyector Cromatograma

Mezclador mAU

Bomba

Tiempo (min.)
Inyección

Columna

Detector

Solventes

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

 INSTRUMENTACION
Inyector Cromatograma

Mezclador mAU

Bomba

Tiempo (min.)
Inyección

Columna

Detector

Solventes

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Componentes de un HPLC
• Bandeja de Solventes y Desgasificador.
• Bomba de Entrega de Solventes
• Inyector (Manual o Automático)
• Horno de Columna Reservorio
de Solventes
• Columna
Filtro
• Detectores Sinterizado
Filtro Pre-Columna

Filtro de
• Software y Computadora de Control Bomba de Solvente

Solventes

Inyector
Manual Guardacolumna

Columna
Regulador de
Contrapresión Reservorio
de
Desechos

Detector
Controlador

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Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)

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Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)

Bandeja de Solventes
• Se encarga de alojar en forma segura
los solventes que se preparan como
fase móvil.
• Por lo general son herméticos y a
prueba de derrames.
• Pueden alojar hasta 06 Frascos de 1 L

Desgasificador
• Se encarga de eliminar los gases
que se encuentran disueltos en la
fase móvil.
• Deben de tener la capacidad de
desgasificar hasta 05 líneas de
solventes

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Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)
Bomba de Entrega de Solventes
• Es el dispositivo que se encarga de
proporcionar la Fase Móvil.
• Opera a presiones que pueden variar de
acuerdo al flujo de la Fase Móvil y a su
composición.

Las bombas se pueden clasificar de la siguiente manera:

De presión constante:
• Presión directa mediante un gas.
• Intensificador neumático.
• Intensificador hidráulico.
De flujo constante :
• De Pistón.
• De Pistón recíprocas.
• De Jeringa.

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Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)
Bomba de Doble Pistón – Baja Presión

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Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)

Bomba de Doble Pistón para Alta Presión

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Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)
Sistema de Inyección
• Se encarga de introducir la muestra en el Cromatógrafo, manteniendo la
presión del sistema constante.
• Coloca la muestra en el flujo de la fase móvil.
Opciones:
• Inyección Manual • Inyección Automática.

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Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)
Sistema de Inyección Manual

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)
Sistema de Inyección Automático
• Dada la naturaleza separativa y analítica de la técnica de HPLC, estos
sistemas son muy empleados en el campo Clínica e industria,
Farmacéutica, en donde se requiere analizar gran número de muestras.

Ventajas:
• Alta precisión y exactitud en
la inyección.
• Alta Repetibilidad en los
resultados.
• Contaminación cruzada muy
cercana a Cero
• Confección de las Curvas de
Calibración rápidas, sencillas
y automatizadas.

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)
Horno de Columna
• Es el modulo en el cual se coloca la columna cromatografica, para
mantenerla a la temperatura que requiera el método analítico.
• Por lo general, se utiliza para elevar la temperatura por encima del
ambiente, sin embargo, en algunas aplicaciones, se requiere mantener la
temperatura por debajo de la temperatura ambiente

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)
Columnas
• Responsables de la separación de una mezcla, en ella se encuentra la
fase estacionaria.

Características generales de las columnas en HPLC

• Longitud : 4 a 30
cm.
• Diámetro Interno (I.D.) : 2 a 20
mm.
• Tamaño de partícula : 2 a 50
µm.
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Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)
Columnas
250 mm x 4.6 mm ID

Máximo Numero de
Platos Teóricos vs.
Tamaño de Partícula

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)
Detectore
s
Se encarga de dar una señal (Respuesta),
de un analito, luego de haber sido separado
por la columna e ingresar a la celda de
detección.

Los detectores se pueden clasificar en:

a) Detectores Universales
• Se basan en detectar cambios en una propiedad física, para todo
tipo de moléculas.
b) Detectores Selectivos
• Son opuestos a los anteriores, detectan una limitada serie de
compuestos.
c) Detectores Específicos
• Sólo pueden responder a un muy limitado grupo de moléculas.

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Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)
Detectores -
Absorbancia

La misma mezcla a diferentes 

Detección a 1
Abs. Abs. A
A1
214 nm
A2
B
a1
togram
Croma
tA tB t (min)

230 nm
Detección a 2
Abs.
Croma B
togram
a2 A
A
B 245 nm
1 2  (nm)
tA tB t (min)

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Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)
Detectores – Absorbancia con
Monocromador

Detectores – Absorbancia con Arreglo de

Diodos

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Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)
Detectores – Intensidad de
Fluorescencia

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)
Detectores – Índice de
Refracción

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica
Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica
Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica
Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica
Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica
Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica
Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica
Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica
Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica
Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica
Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica
Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica
Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica
Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica
Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica
Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)
PC y Software de
Control
Procesador de Datos o Software
• Permite el ingreso de datos para llevar a cabo la
separación cromatografica (Método Analítico).
• Procesa los datos obtenidos y permite
llevar a cabo ajustes para mejorar el
proceso de separación.
Principales Características:
• Amigable y Flexible.
• Permite el control total del equipo, así como de sus accesorios
• Permite confeccionar reportes personalizados.
• Permite trabajar en forma Post-Run

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

Componentes de un HPLC
Cromatógrafo Líquido (HPLC)
PC y Software de
Control
Computadora de Control
• Permite introducir ordenes, revisar datos,
almacenar resultados, etc.
• Debe de integrar totalmente las funcionalidades
del instrumento.

• No necesariamente debe de ser una PC

de estación. También puede utilizarse un
Ipad, una Tablett o LapTops.
Características:
• Rápida (Memoria de Alta Velocidad)
• Capacidad de Almacenamiento de Datos

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

 HPLC y UFLC

HPLC

0.0 3.0 6.0 9.0 12.0 15.0

(Min)

UFLC

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

(Min)

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HPLC y UFLC
Semejanzas
• El mismo principio de separación.
• Los mismos componentes.
• Las mismas Fases Móviles & Estacionarias.
• Cualitativo y Cuantitativo
• Las mismas aplicaciones.

Diferencias
• En UFLC utiliza 02 Bombas de Alta Presión
• En UFLC las columnas son mas pequeñas.
• En UFLC las partículas de relleno son menores
• En UFLC la presión de trabajo es mayor.

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

HPLC y UFLC
Ventajas y Desventajas
HPLC – Ventajas
• Métodos conocidos y optimizados.
• Trabajos a baja presión.
• Trabajo con Diferentes Detectores (UV, UV-Vis, DAD, FI, RI,
Conductividad, Electroquímico, ELSD, Masas.
• Opciones de Derivatización.
• Instrumento de bajo presupuesto.
• Gradiente Cuaternaria.

UFLC – Ventajas
• Velocidad de análisis (4 a 5 veces más rápida que HPLC
Tradicional).
• Mejor Resolución.
• Menor gasto de Fase Móvil.
• Permite trabajar con solventes acuosos a mayor presion.
• Ideal para LC-MS & LC-MS/MS.

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

HPLC y UFLC
Ventajas y Desventajas
HPLC – Desventajas
• Trabaja mejor a flujos relativamente altos, por lo que
requiere acortadores de flujo para trabajar con LC-MS.
• Limites de Presión (Proporciones de solventes acuosos
limitados).
• Mayor tiempo en las Corridas Cromatográficas.
• Mayor consumo de Fases Móviles.

UFLC – Desventajas
• Validación de métodos.
• Columnas de mayor costo.
• Sistema de mayor costo que un sistema HPLC.
• Detectores de Absorbancia (UV, UV-Vis, DAD),
Fluorescencia.
• Trabajos Binarios (No todos los sistemas)

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

UFLC
Tamaño de Partícula y Separación
Separación rápida con resolución, empleando partículas menores

Flujo: 0.2 mL/min Flujo: 0.7 mL/min Separación de Parabenos

A 0,2 mL/min A 0,7 mL/min
(Flujo Convencional) (Flujo
Elevado)

Temperatura
Presión de Columna / Relación con la Temperatura

Reducción de Curva de Van Deemter

la Presión
La Eficiencia de la
columna no es
reducida a tasas de
flujo más elevadas

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

UFLC
Efecto de la Elevación de la Temperatura
Mejor Eficiencia de la Columna: Aumento de N y Reducción de la presión
Fase Móvil : Agua/Acetonitrilo (3:7, V/V)
Flujo : 1.5 mL/minuto
Detector : UV, UV-Vis o DAD
Long. Onda : 245 nm
Picos : 1. Acetofenona
2. Propilfenona
3. Butilfenona
4. Pentilfenona
5. Hexanofenona
6. Heptanofenona
7. Octanofenona

Consumo de
Acetonitrilo:
10.5 mL

Consumo de
Acetonitrilo:
2.3 mL

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UFLC
Picos:
1. Cefadroxil
2. Cefaprina
3. Cefaclor
4. Cefalexina Consumo de
Consumo de 5. Cefadina Acetonitrilo:
Acetonitrilo: 6. Cefotaxima 1,7 mL
12,8 mL 7. Cefrazolina
8. Cefuroxima
9. Cefoperazona
10. Cefloxitina
11. Cefamandol A
12. Cefalotina
13. Cefamandol B

Fase Móvil: a) Agua/Acido Fórmico, b) Acetonitrilo. Gradiente a 40 °C. Flujo: 1.0 mL/min

UFLC – Minimiza el Ciclo de los Análisis

Columna : Shim-Pack XR-ODS (30 mm x 3 mm ID

x 2.2 um partícula)
Detector : UV o UV-Vis o DAD
Long. Onda : 245 nm
Fase Móvil : Agua/Acetonitrilo 4:6 a 2:9 en 0.4 min
Flujo : 3 mL/min
Volumen : 4 uL
Picos:
1. Acetofenona
2. Propilfenona
3. Butilfenona
4. Pentilfenona
5. Hexanofenona
6. Heptanofenona
7. Octanofenona

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HPLC y UFLC
Ventajas y Desventajas
125 1 VP-ODS (4.6 mm  150 mm, 5mm)
100 2 Flow rate : 1.0 mL/min
3
75 HPLC 4
50
5 N:14800
6 7
25

0
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0
12.5
min Increased speed
250mAU
1 Peaks; 1: Acetophenone
200 XR-ODS (3.0mm  75 mm, 2.2mm) 2: Propiophenone
2 Flow rate : 1.2 mL/min
3 3: Butyrophenone
150
UFLC
100
4
5 N:14200 4: Valerophenone
5: Hexanophenone
6 7
50 6: Heptanophenone
7: Octanophenone
0
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.50 min
2.25
mAU
Increased
150
1 separation performance
2 XR-ODS II (3.0mm  150 mm, 2.2mm)
125
3 Flow rate : 1.3 mL/min
100
4
75 UFLCXR 5
6
N:28100
50 7
25

0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 min
3.0

Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica

HPLC y UFLC
Ventajas y Desventajas
Programa de Transferencia de Método

60
Dpto. Química Analítica e Instrumentación Electromédica Peruana S. A. – División Analítica
 Gracias por
su
Atención !

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