MÉTODOS D E

DIAGNÓSTICO E N
MICROBIOLOGÍA
César Mauricio Ayala
Tatiana Marcela Cáceres
Jose Manuel Caro
Laura María Chaparro
 Métodos basados en criterios morfológicos
- Microscopía ( Tinción de Gram)

Forma Cápsula Endóspora Tamaño Bordes

cocos, presente o ovales, cortos abultados,

bacilos, ausente esféricas, largos paralelos,
cocobacilos terminales, cóncavos,
filamentosos subterminales irregulares
, bacilos
curvos, etc
Extremos Disposición Formas Tinción

redondeados, parejas, variación en forma uniforme

puntiagudos cadenas, y tamaño irregular,
ramificados, bipolar,
tétradas, fusiformes, etc.
etc
racimos,
etc.
- Macroscopía
 Métodos basados en tinción diferencial

Tinción de
Gram
Ziehl
Neelse
n
Tinción de
esporas
Tinción de estructuras específicas

La tinción negativa revela la presencia de cápsulas

alrededor de la bacteria.

Se mezclan las bacterias con tinta china o

nigrosina y se extiende en una capa fina sobre un
portaobjeto, en el microscopio se podrá observar
que aparecen cuerpos más claros debido a que la
tinta no penetra ni la célula ni la cápsula.
Tinción de flagelos

Tinción de Leifson. Tiene 3 colorantes:

→ F ucsina básica en Alcoholetílico

al 95%, en 1.27%.

→ Ácido tánico en agua destilada, en 3%.

→ Clorurodesodio en agua
destilada, 1.5%.

Se deja por 1 0 minutos.

 Métodos basados en pruebas bioquímicas
Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar bacterias,
estas pruebas se fundamentan en demostra r:

Degradación de compuestos.
Fermentación de azúcares.
Producción de compuestos
Presencia de enzimas.
coloreados.
Existen flujogramas para la identificación bacteriana, mediante pruebas bioquímicas
de microorganismos. Por ejemplo, la presencia de un cocobacilo gram negativo,
facultativo, fermentador de glucosa y oxidasa negativo, nos indica la presencia de
una enterobacteria, para determinar su género podemos seguir el siguiente esquema.
 Sistemas miniaturizados

El tiempo necesario para la identificación de bacterias puede reducirse

considerablemente con el uso de sistemas miniaturizados basados en pruebas
bioquímicas, estos sistemas han sido diseñados para realizar varias pruebas
bioquímicas simultáneamente y permitir la identificación en un menor tiempo.
BBL Crystal
 Lectura de las pruebas
Manual Computarizada
SISTEMAS MINIATURIZADOS API
Consisten en un dispositivo de plástico con
varios microtubos que contienen diferentes
medios de cultivo deshidratados o
diferentes sustratos de enzimas de acuerdo
al tipo de prueba requerida.

Algunas pruebas bioquímicas que pueden

realizarse con estossistemas son: de
fermentación carbohidratos,
determinación de la producción de H 2 S,
determinación de la hidrólisis de la
gelatina, entre otras.
 API® 2 0 E

Permite la identificación de enterobacterias y de

otros bacilos gram negativos. Es una galería
conformada por 2 0 microtubos.
 API® 2 0 N E
Permite identificar bacilos gram negativos no pertenecientes al grupo de las
enterobacterias como por ejemplo Pseudomonas, Acinetobacter, Flavobacterium,
Moraxella, Vibrio, Aeromonas, entre otros. Galería conformada por 2 0 microtubos.
 API® 2 0 A
Permiten identificar bacterias anaerobias. Galería conformada por 2 0 microtubos.
Una vez inoculada la galería con la suspensión del microorganismo a identificar, el
sistema requiere ser incubado en una jarra Gaspak® u otro sistema que provea
condiciones de anaerobiosis.
 API® S T A P H
Este sistema permite la identificación de microorganismos pertenecientes al género
Staphylococcus, Micrococcus y Kocuria. Es una galería conformada por 2 0
microtubos.
 OTROS SISTEMAS API®

Existen otros sistemas miniaturizados API®;

entre ellos podemos señalar el A PI® 2 0
STR E P, A PI® CAMPY, el API®
el el A PI® CANDIDA.
CORYNE,
En la figura podemos observar el A PI® 5 0 –
CHL utilizado para la identificación de
Lactobacilos. Es una galería conformada por
5 0 microtubos.
 Procedimiento
1. Tomar 3-4 colonias aisladas y disolver en 5mL de
solución salina o agua estéril.

2. Llenar con la solución bacteriana los tubos de todos

los pocillos.

3. Llenar hasta la cúpula los pocillos CIT, V P, GEL...

4. Tapar con parafina líquida las cúpulas de los pozos

ADH, LDC, ODC, URE, H 2 S... para obtener una
ambiente de anaerobiosis.

5. Poner la tira de pruebas en una cámara húmeda de

incubación a 3 7 ° C de 18-24 horas.
 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Se basa en la observación de las coloraciones desarrolladas. Se compara el color

obtenido en cada microtubo con el que muestra la carta de colores y se establece un
resultado positivo ( + ) o negativo (-).
Se obtiene un código de 7 dígitos denominado “perfil numérico” que resulta de la
suma de los valores correspondientes a las pruebas positivas asignados
previamente en la planilla. En algunos sistemas miniaturizados se recomienda la
realización de pruebas bioquímicas adicionales, que permiten obtener dos
dígitos más. El código obtenido se corresponderá a un determinado género o
especie de acuerdo a la información contenida en las bases de datos
suministradas por el fabricante y que pueden encontrarse disponibles en forma
impresa y/o electrónica.
 Información importante
Con fines de control microbiológico, la USP(estándares de referencia) indica
cuales son las pruebas bioquímicas mínimas que se requieren para la identificación
de los microorganismos objetables, pero no descarta que se utilicen sistemas
miniaturizados donde se realizan un número mayor de pruebas bioquímicas.

Cada casa fabricante tiene su propia presentación, cálculos, manuales, etc.

Una limitación de este tipo de método de identificación es la aparición de cepas

mutantes y la adquisición de plásmidos que pueden dar origen a cepas con
características diferentes.

Este método también ha sido desarrollado para la identificación de levaduras y de

otros hongos.
 Métodos basados en tipificación de fagos
La interacción entre un virus bacteriano
(fago) y su célula bacteriana sensible es
sumamente específica, ya que el proceso
de adsorción se encuentra mediado por
receptores específicos tanto en el virus
como en la célula bacteriana.

El uso de fagos permite

específicos identificar y
subclasificar dentro de una bacterias
misma especie.
En un agar se inocula un cultivo puro de una determinada bacteria y se añade
una alícuota de un fago específico. Éste puede ocasionar la lisis de las bacterias,
hecho que se evidencia en el cultivo como zonas claras definidas, denominadas
placas, que indican que hubo infección y lisis celular.
Métodos basados en pruebas inmunológicas

1. Pruebas serológicas

2. Detección de Antígenos
Pruebas
serológicas
Las pruebas serológicas constituyen un método
indirecto de diagnóstico al detectar en el suero del
paciente los anticuerpos formados frente al
microorganismo causante de la infección.

Se utilizan como diagnóstico confirmatorio después de

la identificación por diferentes métodos, como los
bioquímicos.
Cada uno de los métodos tiene su
fundamento particular, pero en
general, todos se basan en la
reacción de un antígeno presente
en el agente microbiano con su
anticuerpo correspondiente.

Pueden ser de gran utilidad en la

identificación microbiana en
muestras puras o en muestras
biológicas.
➔ Aglutinación directa

Se basan en la unión de antígenos particulados a los

anticuerpos. Son pruebas sensibles pero poco
específicas.

Se prepara una suspensión del microorganismo

(antígeno), y se le agrega al suero del paciente, si
hay anticuerpos, se producirá la aglutinación. Puede
realizarse sobre un portaobjetos, en tubos de
ensayo o en placas de microtitulación.

Se hacen diluciones del suero para ver el título de

anticuerpos.
→ Aglutinación

Con anticuerpos particulados se permite la

detección de antígenos
solubles.
Prueba rápida.
 Aglutinación con rosa de
Bengala empleada en el
diagnóstico de la
brucelosis.

En casos de meningitis, se puede detectar en el LCR la presencia de antígenos

de Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningiditis
y de Streptococcus beta hemolítico grupo B.
➔ Inmunofluorescencia
Pueden utilizarse para detectar anticuerpos o para detectar la presencia de un
patógeno. En ambos casos la reacción finaliza mediante la adición de un anticuerpo
conjugado a una sustancia fluorescente.

Se usa en la detección Bordetella

pertussis, Rickettsia y Chlamydia
trachomatis.

Rickettsia typhi IFA

 ★ Directa: La muestra, se pone en contacto con el antisuero
específico marcado con una sustancia fluorescente
(rodamina o fluoresceína). Se espera un tiempo para que
se dé la reacción antígeno-anticuerpo.

★ Indirecta: Se utiliza el anticuerpo específico no marcado

y posteriormente se utiliza un anti anticuerpo marcado.

Se expone la lámina a la radiación ultravioleta para visualizar

la reacción, se observa con el microscopio de fluorescencia.
 ➔ ELISA (ENZIMOINMUNOANÁLISIS)
Muy sensible y específica.

La reacción Ag-Ac tiene lugar sobre un soporte sólido, normalmente una microplaca
de plástico, a la que se ha adsorbido un antígeno o un anticuerpo. Si el suero posee
anticuerpos contra ese antígeno, éstos se habrán fijado a él, arrastrándose mediante
el lavado el resto de inmunoglobulinas presentes.
La reacción final se revela mediante un enzima
que modifica un substrato que adquiere color.

ELISPOT: Permite conocer de forma

cuantitativa el antígeno, incluso identifica el
número concreto de células donde se encuentra.
El color que se produce es proporcional a la cantidad de anticuerpo específico que
se fija al antígeno.

El método se utiliza en la detección de

Chlamydia trachomatis, Neisseria
gonhorreae.
Detección de
antígenos
Detección del microorganismo por el uso de anticuerpos específicos marcados,
que pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales.

→ Aglutinación

→ Inmunofluorescencia

→ Inmunofluorescencia directa

→ Enzimoinmunoanálisis
 Método de espectrofotometría de masas
MALDI-TOF

Consiste en una ionización suave del analito que provoca la evaporación de

moléculas termolábiles, no volátiles tales como proteínas y lípidos en un rango de
2 a 2 0 KDa.

Muy utilizada para obtener un espectro propio de un organismo y comparándolo

con bases de datos, identificar a nivel de género, especie e incluso cepa aislados
bacterianos y fúngicos. También es posible identificar virus.
En este tipo de espectrometría es de suma importancia la matriz ya que
funciona como un transmisor, transfiriendo la energía necesaria para
la ionización, del láser a las moléculas de la muestra.
Aplicaciones
La identificación bacteriana de acuerdo a su perfil de proteínas fue propuesta hace
décadas pero era poco usado.

Actualmente, cada vez aparecen más trabajos que han estudiado su eficacia en la
identificación de aislamientos clínicos de bacterias Gram positivas y Gram negativos
de diversos orígenes directamente desde los medios de cultivo habituales y sin
condiciones especiales, como método de rutina.
Se basan en la detección de proteínas ribosómicas S y L:

- Se utiliza directamente una colonia bacteriana.

- Comparan perfil o huella espectral desconocida frente a las de bacterias

conocidas.

- Comparación de espectros generados con bases de datos previas.

- Rapidez de la técnica (aprox. 9 0 microorganismos / hora).

- Identificación a nivel de género y especie, en ocasiones subespecies.

 Métodos de detección molecular
PCR, Nothern blot, Southern blot, Western blot y Dot blot, RT-PCR, PCR-
ELISA

PCR in situ
PCR
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR permite generar una gran cantidad
de copias de un fragmento de DNA (ácido desoxirribonucleico).
Tipos de PCR

❖ PCR anidada → el producto de una amplificación es el molde de la siguiente.

❖ PCR multiplex → se amplifica más de una secuencia en una misma reacción

con el uso de varios pares de primers. Los amplificados se verán como
múltiples bandas en un gel.

❖ PCR in situ → es realizada sobre secciones histológicas o células, donde los

productos generados pueden visualizarse en el sitio de la amplificación.
❖ PCR tiempo real → Cuantifica
la cantidad de ADN o ARN
amplificado en cada momento.
Pa ra ello se emplea una sonda
unida a dos fluorocromos que
hibrida en la zona intermedia
entre el cebador forward y el
reverse, cuando la sonda está
in tacta, presentan una
transferencia energética de
fluorescencia por resonancia,
no producida cuando la sonda
está dañada y los dos
fluorocromos están distantes.
❖ RT-PCR → el molde es el ARN, se usa la transcriptasa inversa para pasar
ARN a ADNc. Requiere dos tipos de cebadores, uno denominado
antisentido que inicia la reacción de RT-PCR y el cebador denominado
sentido que realiza el duplex de ADNc. Útil cuando se disponen pequeñas
cantidades de ARN.

❖ Variantes de la PCR → secuenciación, pirosecuenciación.

→ La hibridación in situ (ISH)
Es una técnica que se utiliza para la localización y la
detección de secuencias de ADN y de ARN específicas
en las células, a través de una secuencia
complementaria.

Se fundamenta en complementariedad de bases de

ácidos nucleicos. Se utilizan sondas de ADN, son
secuencias de oligonucleótidos de ADN marcados, con
un elemento radioactivo (32P,125I, 35S) o con una
proteína unida a una enzima como la fosfatasa alcalina.
La unión de la sonda a la secuencia complementaria se detecta mediante la señal
radiactiva que emite la sonda o mediante métodos enzimáticos.
 → Western blot:
Se usa para identificar y caracterizar proteínas
específicas en una mezcla compleja, el reconocimiento
es por reconocimiento entre antígeno y anticuerpo, se
revela por actividad fluorescente o enzimática. Consta
de tres etapas:

1. Separación por tamaño (acrilamida)

2. Transferencia a un soporte sólido (nitrocelulosa)

3. Visualización mediante la marcación de proteínas

con el uso de anticuerpos primarios o secundarios
apropiados.
→ Southern blot

Permite detectar la presencia de una secuencia de

ADN concreta en una mezcla compleja.

→ Se hace electroforesis en gel de agarosa con el fin

de separar los fragmentos de ADN (obtenidos con
las enzimas de restricción).

→ Se transfiere a una membrana en la cual se

efectúa la hibridación de la sonda.
→ Northern blot
Variante del Southern blot, usada para
separación del RNA.

1. Aislamiento del RNA.

2. Desnaturalización del RNA.

3. Separación por electroforesis.

4. T ransferencia a membrana
de
nitrocelulosa o nylon.
5. Hibridación con sonda específica.