La diversidad y la especificidad simbiótica del

Rhizobium asociado con fréjol (Phaseolus vulgaris L.)

en los centros de origen del cultivo: Ecuador y México.
 Bosquejo

* Importancia del frejol (Phaseolus vulgaris)

* Centros de origen

* Diseminacion del cultivo y su Rhizobium

* Objetivos de la investigacion

* Diversidad del Rhizobium asociado con P. vulgaris en Ecuador

y comparaciones con el Rhizobium de Mexico.

* Filogenia del Rhizobium asociado con el frejol en Minnesota

como area secundaria de produccion frejolera.

* Conclusiones

* Agradecimientos
El frejol (P. vulgaris) es la leguminosa mas inportante
en el mundo (www.CIAT.CGIAR.ORG).

“Alimento perfecto” : proteina, fibra, carbohidratos,

vitaminas, minerales.

En paises en vias de desarrollo: alimentacion prioritaria.

Los rendimientos son bajos (~ 0.50 ton/ha)

Causas: Abastecimiento de agua inadecuado, enfermedades,

condiciones pobres del suelo (ej. bajo N).
 Centros de origen de
P. vulgaris

2500BP

Mesoamerica

Andes (South America)

4400BP
 Diseminación del fréjol

700 BP 500 BP

2000 BP
Transporte del frejol desde los centros de origen a otras
regiones del mundo.

Rhizobium transportado como contaminante de semilla.

Rhizobium sobrevive en la semilla de tres a cinco anos

despues de la cosecha. (Perez-Ramirez et al. 1998).
En su nuevo hábitat el Rhizobium
habría sido expuesto a diferentes
condiciones ambientales.

Efectos “founder”.

Posibilidad de otros Rhizobium de asociarse con Phaseolus.

A parte de implicaciones de la diversidad de Rhizobium los

cambios en microsimbionte podría impactar la eficiencia de
la interacción hospedero-Rhizobium, nodulación
y la fijación de nitrógeno.
Esta investigación examinó:

- Diferencias en la biodiversidad del Rhizobium

asociado con frejol en Ecuador y Mesoamerica.

- La contribucion de otros “rhizobios” infectivos en frejol

a la nodulacion y fijacion del N2 .

- Las consecuencias del transporte del hospedero

y su Rhizobium sobre la simbiosis con P. vulgaris en
Minnesota como region secundaria de produccion de
frejol.
Diversidad del rhizobio asociado con Phaseolus vulgaris L.
en Ecuador, y comparaciones con el rhizobio.de México.

Loja-Ecuador
Photo CIAT
 Diferencias entre los acervos geneticos

de frejol Andino y Mesoamericano

- Morfologicas y agronomicas
(Singh et al. 1991)

- Moleculares (phaseolin)
(Gepts and Bliss, 1996; Koenig et al. 1990)

- Geneticas
(Koinage and Gepts, 1992)
Debilidad del Hibrido F1

genotipos (phaseolin)
“S” x “T” or “C”

Crecimiento reducido
Chlorosis en la hoja
Raices adventicias
Letalidad
*
- Topografía:
Ambientes unicos y aislados
Aislamiento geografico y genetico
- Co-evolution Frejol-Rhizobium
- Diferencias en la diversidad de Rhizobium
Rhizobium nodulando Phaseolus:

* Rhizobium etli: asociado con frejol

en los centros de origen
(Souza et al. 1994).

* R. tropici
* R. leguminosarum bv. phaseoli
* R. giardinii
* R. gallicum
* Bradyrhizobium spp.
* Dalea sp. Rhizobium
Estudios sobre la diversidad de Rhizobium
asociado con fréjol

* Enfasis en R. etli y R. tropici

* Rhizobium del centro de origen Mesoamericano

Diversidad genetica alta

(Pinero et al., 1988; Souza et al., 1994).

Inclusion del Rhizobium de Dalea ?

Dalea spp. son nativas de esta region.

(Barneby, 1981, 1988, 1990)

Rhizobium de Dalea nodula y fija N2 con frejol.

(Graham et al., 1999)
 É s t e e s t u d i o:

1. Contrasta Rhizobium de los Andes

(Ecuador) y Mesoamerica usando
métodos fenotípicos y filogenéticos.

2. Examina diferencias en el número y

diversidad del Rhizobium de fréjol
aislados del suelo usando germoplasma
Andino (Ecuador) y Mesoamericano
como hospederos.
 Materiales y Métodos

Cepas (103) : Ecuador, Mexico, Peru, Argentina.

Cepas control.

Caracterizacion fenotipica:

- Fuentes de C and N
- Antibioticos
- Metales pesados
- Vitaminas
- Tolerancia a NaCl
- Crecimiento en pH: 4.5, 5.0 and
8.5
- TY-Ca and LB

Crecimiento (28C): 7 days

 Rango hospedero

Phaseolus
Macroptilium
Leucaena
Dalea
Coronilla
Onobrychis
Nodulacion evaluada a los 21 dias

Indices de similaridad: NTSYSpc,UPGMA.

Analisis de “clusters”
 Principio del “fingerprint” genómico BOX-PCR
1. 2. 3.

Elementos
repetitivos (BOX)
conservados

Génoma
bacteriano

Amplificación de las regiones

Genómicas usando el primer BOX
T

Time
35 ciclos PCR
Source: Rademaker et al., 1997
 Versalovic et al. 1994

BoxA1R- PCR
Comparar cepas de Ecuador y Mexico (celulas enteras).
Estudiar biodiversidad del Rhizobium aislado del nodulo.
1 Kb DNA
ladder
(bp)

2036
1636

1018

506

220
 Análisis asistido por computadora

“Fingerprint”
Captura de la imagen
Conversion
Normalizacion
Curva densitometrica
Correlacion Pearson’s
UPGMA
Analisis de “clusters”
Dendograma
Courtesy: Dr. Mike Sadowsky
 Diversidad Genética (DG):

Shannon-Weaver index
(Goodwin et al., 1995; Mahuku et al., 1998; Coutinho et al., 1999)

H = - Σ pi x ln pi

H = DG
pi = frequencia of aislamientos pertenecientes
a cada clase de bandas.
ln = log natural
aislamientos
 Número más probable (Fundas de crecimiento):

Para determinar la influencia del origen del cultivar de

fréjol en el número (cells/g soil) y diversidad de
Rhizobium.
Suelos: Poconichim (Chiapas - Mexico)
Cotacachi, Caňicapac, Mater (Ecuador).

Cultivares: Puebla 152 (Mexico)

Bolones: 6, Caňicapac, y Mater (Ecuador).
Dalea aurea y D. leporina

- Cuatro reps por cada dilucion 10X del suelo

- Crecimiento de plantas en camaras de crecimiento
(14h fotoperiodo y 25/18 C dia/noche T).
- Cosecha: 5 semanas despues de inoculacion
- NMP (cells /g soil): MPNES (NifTAL,HI)
- Nodulos usados para estudios de diversidad.
Resultados:
1
Relaciones fenotípicas
Dos principales clusters:

1. Todos los aislamientos de México

pero incluyo cepas nodulando
Dalea leporina y/o Macroptilium
and Leucaena, a mas de P. vulgaris. 2

2. Rhizobium de losAndes
- Algunos “subclusters”
- Alta diversidad
- Nodulación: P. vulgaris
 N and C M

P2

M
D D

Cepas de:
S
M = Mexico
D = Dalea
C = Region Central (Ecuador)
M N = Region Norte (Ecuador)
S = Region Sur (Ecuador)

P1

(BOXA1R-PCR) Relaciones genéticas entre aislamientos de Ecuador y México

 Suelo / Hospedero NMP D.G.
(cells/g soil)

1. Poconichim/ Puebla 152 6.09 x 105 3.29

Poconichim/ Bolon 6 3.59 x 105 3.50 ***

Poconichim / Dalea 28

2. Cotacachi / Puebla 152 3.59 x 103 2.56

Cotacachi / Bolon 6 3.36 x 103 2.59

 Suelo: Poconichim (Chiapas)

Pearson correlation (Opt:1.00%) [0.0%-100.0%]

Hosp: Puebla (local)
Bolon 6 (no local)
BOXA1R BOXA1R

Dalea

100
65

75

85

95
70

80

90
B22
B4
B24
B1
P14
6917
B3
P22
P24
P13
Phaseolus rhizobia
P16
B11
B17
P4
P21
B21
P7
1632
1899 UMR1632 (R. etli)
D14

Limitada contribucion del Rhizobium de Dalea D2

D4
D11
D24
Dalea rhizobia
- Baja población en el suelo
D16
D15

- Limitada competitividad
D23
6815
 Comparación del Rhizobium aislado de sitios en
el Sur del Ecuador

Suelo / cultivar NMP D.G.

1. Mangucusana / Cargabello 2.30 x 105 3.30

Mangucusana / Bolon (local) 2.30 x 105 3.30 NS

2. Mater / Imbabello 7.81 x 105 2.68

Mater / Machete (local) 3.75 x 106 2.81***

3. Canicapac / Imbabello 3.59 x 105 3.35

Canicapac / Bolon (local) 5.46 x 105 3.54***

 BOX A1R-PCR
Pearson correlation (Opt:1.00%) [0.0%-100.0%]
BOXA1R BOXA1R

Suelo: Caňicapac (C )

100
10

20

30

40

70

90
50

60

80
1899
6815
CB1-6
CB1-13 - Bolon local (B1)
- Imbabello (I)
CB1-23
6917
CB1-11
CI-13
CI-18
CI-23
CI-16
CI-19
CI-5
CI-20
CB1-10
CB1-22
CB1-12
CB1-18
CB1-8
CB1
CI-8
CI-10
CI-17
CB1-5
CB1-14
CB1-2
CB1-15
CB1-19
CB1
CB1-4
CI-12
CI-2
CB1-1
CI-24
CI-21
CI-15
CI-11
CI-22
CI-1
CI-6
1632
CB1-9
CB1-20
CB1-7
CB1-25
CB1-24
CB1-3
CB1
CB1-17
CB1-16
CI-3
CI-25
CI-7
 Pearson correlation (Opt:1.00%) [0.0%-100.0%]
BOXA1R
BOXA1R-PCR

Suelo Mater (M)

100
30

45

55

70

80

95
20

25

35

40

50

60

65

75

85

90
6917
MMA-14
MMA-15
MMA-21
MMA-18
MMA-25
MMA-16
MMA-1
MMA-5
MMA-7
MMA-10
Cultivar Machete (MA)
MMA-8

LOCAL
MMA-2
MMA-13
MMA-6
MMA-17
MMA-24
MMA-11
MMA-19
MMA-22
MMA-12
MMA-3
MMA-4
MMA-20

Similaridad con la cepa UMR1632 (R. etli).

MI-15
MI-20
MI-13
MI-10
MI-5
MI-3
Cultivar
Ningun aislamiento se agrupo con otras
MI-16
MI-25
MI-19
Imbabello (I)
cepas “referencia”. MI-7
MI-17
MI-22
MI-14
MI-6
MI-23
MI-2
MI-4
MI-18
MI-8
MI-12
MI-11
MI-9
MI-24
MI-21
MMA-23
1632
MMA-9
6815
1899
Aislamientos de los Andes:

- La mayoría perteneció a R. etli

- Rango hospedero limitado

- Característica de la reiteración del “gene nifH”

Bernal, 1993
Hemos demostrado:

1) Separacion fenotipica y filogenetica

significante.

2) Cultivar puede influenciar la diversidad

genetic de las cepas.

3) Otros rhizobios a mas de R. etli pueden jugar

un rol en la nodulacion del frejol en
Mesoamerica.
- Co-evolucion Frejol-Rhizobium

- Especificidad

- Factores que contribuyen con las

diferencias en la respuesta simbiotica
(Andes).

- Implicaciones en el campo.

- El frejol: deficiente en nodulacion y

fijacion del N2
Filogenia del Rhizobium asociado con frejol en Minnesota
como una region secundaria de produccion .
Restos de semillas de fréjol:

* Mogollons (New Mexico) 300 BC

* Hohokam ( Sur de Arizona) 500 AD
* Anasazi (Norte de Arizona) 500 AD
* Gran Planicies (1070 AD)
* Norte-Noreste (1300 A D)
- Minnesota: 5th en la produccion de frejol en los U.S.

- 80000 ha son cultivadas anualmente en MN.

- Simbiosis podria haber resultado del Rhizobium:

* contaminante de la semilla
* Rhizobium de pradera: Dalea spp.

- Dalea y otras leguminosas de pradera han

existido en Minnesota por casi 7000 anos.

- Desde 1800’s han sido restringidas a

pequenas areas rodeadas por campos
agricolas.
Fréjol en Minnesota es raramente inoculado

- R. etli ?
- Rhizobium (Dalea spp.) ?

Objetivos:

- Examinar el Rhizobium asociado con fréjol en

Minnesota.

- Determinar si efectos “founder” en R. etli o la

introgresion de otros micro-symbionts de leguminosas

de pradera podrian estar afectando la nodulacion y la

fijacion del N en frejol.
Materiales y Métodos

Suelos:
- Staples (S)
- Verndale (V)
- Park Rapids (PR)
Areno-arcillosos (Udic-
Argiborolls)
77.3%, 92.7% and 89.4%
arena, respectivamente.
Cepas “ referencia ”:

UMR 1632 ( R. etli )

UMR 1899 ( R. tropici )
UMR 6917 ( R. giardini )
UMR 6918 ( R. gallicum )
UMR 6815 ( Dalea Rhizobium )
Cepas “referencia” adicionales:

Simbiontes de:

- Oxytropis, Astragalus (Laguerre et al., 1997)

- Medicago (Eardly et al., 1992)

Representantes de:

- R. etli
- R. spp. (Dalea)
- R. gallicum
- R. giardinii
- R. leguminosarum
- Número Más Probable (cells/g soil):
Bean cultivar : Montcalm

- Análisis de “fingerprints”
BOX A1R-PCR
(Nodules from plants used in MPN)

- Análisis cuantitativo (Bio-Numerics)

- Diversidad Genética (DG)

 Cepas representativas:

S34, S20, S3, V34, V33, PR30, PR7.

Fatty Acid-methyl ester (FAME)

(Jarvis and Tighe, 1994). Analytical Service Laboratory (VT-USA)

Análisis del gene 16S RNA

(van Berkum and Fuhrmann, 2000, USDA-Beltsville )
 Comparison fenotípica

Crecimiento en medio BYMA con:

- Nalidixate de sodio (40 ugmL-1)
- Streptomicina (3-5-10-25-50-100 ugmL-1)
- Spectinomicina (5 ugmL-1)
- Rifamicina (10 ugmL-1)

- LB
- PY-Ca
- TY-Ca
- Medio TY pH 4.5 y 8.5
- Eritritol como fuente de C
- Produccion de melanina
 Rango hospedero

Phaseolus vulgaris (cv Montcalm)

Dalea leporina
Onobrychis viciifolia (sanfoin)
Medicago sativa (cv Saranac)
Macroptilium atropurpureum (siratro)
Coronilla varia (crownvetch)
Leucaena leucocephala
 Zona de pelos
radiculares
maduros

Zona de pelos
radiculares en
desarrollo

Zona sin pelos

radiculares
(celulasinfectibles)

Marca del apice

radicular
Source: Bhuvaneswari et al., 1981
Resultados
Relación filogenética entre aislamientos del nódulo.
Sitios: Staples, Verndale, y Park Rapids (MN).
Pearson correlation (Opt:1.00%) [0.0%-100.0%]
BOXA1

100
50

55

60

65

70

75

80

85

90

95
PR13
PR12
PR17
PR7
PR9
PR18
PR22
PR29
PR35
6815 (Dalea)
S25
Rhizobium sp.(Dalea)
V24
PR32.
V25
V36
V32
V23
V33
V26
6917(H152)R.giardinii
PR30
PR31
R. giardinii
V27
S14
V35
V30
S21
S6
S16
S3
S7
S29
S31
S11
S27
S2
S20

R. leguminosarum
S33
S1
6002Rleguminosarum
6918(R602)R.gallicum
PR3
PR19
V34
R. gallicum
V21
V19
V28
V20

R. etli
V31.
1632 (R.etli)
1899(R.tropici)
S34
S24. R. tropici
 Relación filogenética entre rizobios del nódulo.
Representativos de Staples, Verndale, y Park Rapids,
Pearson correlation (Opt:1.00%) [0.0%-100.0%]
BOXA1

y cepas de referencia adicionales.

100
50

55

60

65

70

75

80

85

90

95
3121(O.riparia)
USDA1002(S.meliloti)
6815 (Dalea)
6871(Dalea)
PhF29 (R.gallicum)
PhP222 (R. gallicum)
PhI21(R. gallicum)
6918(R602)R.gallicum

Siete clusters mayores

6002Rleguminosarum
PR30

1
PR31
V27

fueron generados.
S14
V35
V30
S21
S6
S16
S3
S7
2
V23, V32, V26 (Verndale)
S29
S31
S11

se agruparon con las cepas

S27
S2

3
S20
S33

de R. etli UMR1057 y
S1
V25
V36
V40

4
UMR1580.
V32
V23
V33
1580 R.etli (M)
V26
1057 R. etli (M)
PhF28 (R. giardinii)

El resto de cepas (42) no

Ro17 (R. giardinii)
H241(R. giardinii)
6917(H152)R.giardinii
Ro68 (R. giardinii)

fueron similares a cualquier

S25
V24
PR3
PR19

otra especie de Rhizobium

V34
V21
V19
5
usadas como referencias.
V28
V20
1577 R. etli (M)
1632 R. etli (M)
PR13
PR12
PR17

6
PR7
PR9
PR18
PR22
PR29
PR35
1899(R.tropici)
3135(A.sinicus)

7
3119 (O. riparia)
S34
3348(A.alpinus)
6803(Dalea)
 Cepas

Fatty acid PR30 S3 S20 V33 V34 PR7 S34

(acidos grasos) (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)

15:0 2OH 0.98 1.05 1.17 1.02 1.08 nd 1.07

16:0 2.22 2.10 2.68 2.69 2.55 6.49 4.86
16:0 3OH 0.85 1.09 0.97 0.88 1.06 3.57 0.80
17:0 0.44 0.36 0.81 1.23 0.81 1.44 nd
18:0 9.53 9.09 10.20 7.87 8.03 3.61 11.47
19:0 cyclo w8c 6.79 11.04 13.72 6.90 10.79 34.94 7.25
20:3 w6,9,12c 0.95 1.73 1.44 1.31 1.37 1.45 1.18
Unknown 14.952 0.83 nd 0.64 1.06 0.61 0.45 0.91
Unknown 18.080 1.88 1.95 5.83 nd 4.81 0.62 5.14
Sum. feature 3 5.97 5.73 5.51 6.29 5.37 1.25 6.67
Sum. feature 4 0.57 0.44 0.45 nd 0.59 0.31 0.83
Sum. feature 7 68.97 64.84 54.97 70.09 62.56 39.42 59.83

Sum. feat.3: 12:0 ALDE and unknown 10.928

Sum. feat.4: 16:1w7c/15 iso 2OH and 15:0 ISO 2OH/16:1w7c
Sum. feat.7: 18:1 w7c/w9t/w12t and 18:1 w9c/w12t/w7c
 46.230 S34
S20
V34 PR30 FAME
41.100
S3 (ácidos grasos)
V33

35.969
Principal Component 2

30.839
PR7

25.708
R. gallicum
R. leguminosarum
18
13
20.578 *
R. etli 17
* * *
21
24
11 * *
R. giardinii 16* 19
22 *
10
* * 20

15.448
**12
ici
7 *
9
25
26
*27
* **8 *
p 6 23
tr o 3 15
R.
4
* *
* * 14**
2
10.317
1
* **5
-11.759 3.471 18.701 33.930 49.160 64.390

Principal Component 1
Cepa BOX-PCR N0 Cepa de refer. FAME 16S rRNA
Grupo cepas mas similar

PR30 1 3 Ninguna R. gallicum R.

leguminosarum

S3 2 11 Ninguna R. etli R.
leguminosarum

S20 3 3 Ninguna R. leguminosarum R.

leguminosarum

V33 4 4 Ninguna R. gallicum R. etli

V34 5 7 R. etli R. etli R.

leguminosarum

PR7 6 6 Ninguna R. rhizogenes R. tropici

S34 7 1 Rhizobium sp. R. leguminosarum R. leguminosarum

(Dalea)
Un numero significante de “rizobios” de
Staples, Verndale y Park Rapids presentan un
considerable “overlap”.

R. leguminosarum
R. etli
R. gallicum

Se justifica un analisis mas detallado de sus

diferencias y semejanzas.
Suelo / Hospedero NMP D.G
(cells/g soil)

Staples / Montcalm 2.30 x 105 2.96

Verndale / Montcalm 3.59 x 105 2.99NS

Park Rapids / Montcalm 6.13 x 104 2.98

Mexico: 3.39
Ecuador: 3.01
 Ni

R. etli

ni

Rhizobium (Dalea)

son contribuyentes mayores a la

diversidad de Rhizobium en
Staples, Verndale y Park Rapids en
Minnesota
 65

PR9 Velocidadad de
PR29
60 Nodulación.
V33

6918 1899
55
PR30 PR7
S20
V34 S34
1632
50
P R N ( %)

S25

45

R. giardinii
S3
6917
40

6815
Rhizobium sp. (Dalea)
35

30
3 3.2 3.4 3.6 3.8 4 4.2 4.4 4.6 4.8 5
U M N ( mm )
 Baja población de R. etli ?

- Uso persistente de streptomicina en la semilla.

- Las cepas PR30, S20, PR7, S34 fueron tolerantes

a 5 –10 ug/mL streptomicina.
[Ninguna cepa “referencia” creció en 5 ug/mL,
excepto Ro17 (R. giardini) and UMR1899 (R. tropici)].

- Analogía a la tolerancia de metales en suelos

contaminados. (Giller,1998)
Actividades actuales:

- Fincas comerciales de frejol (adicionales)

- Areas “virgenes” en “villas” de Nativos

Americanos.

- Fincas “organicas”.

Origen de la semilla en la region?

 Conclusiones

Significante separación fenotípica y filogenética.

Efecto del cultivar local o introducido (implicaciones en el

campo).

Otros “rizobios” diferentes a R. etli pueden jugar un rol en

la nodulación del fréjol en Mesoamerica.

Diferencias marcadas de las cepas de MN comparadas con

las cepas de Mesoamerica y Andes.

“Overlap” : R. etli, R. leguminosarum, R. gallicum.

Ni Rhizobium. giardinii ni R. de Dalea son competitivos

in nodular fréjol.

Efecto de las prácticas agrícolas en la diversidad

 Agradecimientos

Peter Graham (Advisor)

Iris Charvat (Thesis reviewer)

Michaell Russellee (Thesis reviewer)

Terry Cooper

Carroll Vance

Christopher Bingham
 Rhizobium Research Lab.

Peter
Irene
Becky
Julie

Phillippe Seguin Catherine Brown Johanna Keyes

- Microbial Ecology Lab.

- E. coli Lab.

- Crop Physiology Lab.

- FUNDACYT (Ecuador)

- NSF Biocomplexity

- CRSP
Amazon Region-Ecuador