UNIVERSIDAD POLITECNICA SALESIANA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Y AMBIENTALES PROGRAMA DE TECNOLOGA EN PROCESAMIENTO DE RECURSOS BIOLGICOS AMAZNICOS CARRERA DE BIOTECNOLOGIA

CENTRO DE INVESTIGACION Y VALORACION DE LA BIODIVERSIDAD

ELABORACION DE BIOFERTILIZANTE A BASE DE MICROORGANISMOS EFICIENTES AMAZONICAS (MEA), CAPTURADOS DE CUATRO ESPECIES DE FABACEAE, MACUMA, CANTON TAISHA, PROVINCIA MORONA SANTIAGO.

AUTOR: Tlgo. Lee Mayacu T.

Macuma, Enero 2009.

Contenido RESUMEN..................................................................................................... 4 1.INTRODUCCIN. ..................................................................................... 5 2.PLANTEAMIENTO DEL TEMA .............................................................. 6 2.1.Contexto ............................................................................................... 6 2.2.Problema ............................................................................................... 6 2.3.Justificacin .......................................................................................... 6 3.OBJETIVOS ............................................................................................... 7 3.1.General ................................................................................................. 7 3.2.Especifico ............................................................................................. 7 4.MARCO TEORICO. ................................................................................... 8 4.1.Las bacterias Nitrificantes. ................................................................... 8 4.2.La Nitrificacin: ................................................................................... 9 4.3.Bacterias responsables de la nitrificacin........................................... 10 4.4.Microorganismos Fijadores de Nitrgeno: Familia Rhizobiaceae ..... 11 4.4.1.Descripcin general de la simbiosis de Rhizobium ..................... 13 4.4.2.La simbiosis ................................................................................. 13 4.5.Nodulacin en leguminosas................................................................ 14 4.5.1.Reconocimiento entre planta y Rhizobium.................................. 15 4.5.2.Invasin ........................................................................................ 15 4.5.3.Nitrogenasa .................................................................................. 16 4.6.Hongo formador de ndulos. .............................................................. 16 4.6.1.Micorrizas .................................................................................... 16 5.LOS BIOFERTILIZANTES ..................................................................... 17 6.MECANISMOS DE ACCIN DE LOS BIOFERTILIZANTES ............ 18

6.1.Fijacin de nitrgeno atmosfrico ...................................................... 18 6.2.Bacterias solubilizadoras de fsforo del suelo ................................. 18 6.3.Microorganismos que transforman el azufre ...................................... 18 6.4.Microorganismos que movilizan potasio ........................................ 19 7.CARACTERSTICAS, FUNCIONES Y RECOMENDACIONES DEL BIOFERTILIZANTE ELABORADO A BASE DE DIFERENTES BACTERIAS. .............................................................................................. 19 8.LAS BACTERIAS FIJADORAS DE NITRGENO ............................... 20 9.METODOLOGIA. .................................................................................... 21 9.1.FASE DE CAMPO. ............................................................................ 21 9.1.1.Preparacin de medios (trampas) para atrapar bacterias del campo. 21 9.1.2.Recoleccin de ndulos de las leguminosas. ............................... 23 9.2.FASE DE LABORATORIO. ............................................................. 24 9.2.1.Aislamiento de las bacterias de las trampas y de los Ndulos..... 24 9.3.RESULTADOS .................................................................................. 25 10.CONCLUSIONES .................................................................................. 26 11.BIBLIOGRAFIA. ................................................................................... 26

UNIVERSIDAD POLITECNICA SALESIANA SEDE QUITO FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Y AMBIENTALES INGENIERA EN BIOTECNOLOGIA ELABORACION DE BIOFERTILIZANTE A BASE DE MICROORGANISMOS EFICIENTES AMAZONICAS (MEA), CAPTURADOS DE CUATRO ESPECIES DE FABACEAE; MACUMA, CANTON TAISHA, PROVINCIA MORONA SANTIAGO Autor: Tlgo. Lee Mayacu. Fecha: Enero, 2009. RESUMEN

Descriptores:

1. INTRODUCCIN. Los biofertilizantes son sustancias o mezclas qumicas naturales o sintticas utilizadas para enriquecer el suelo y favorecer la estimulacin del crecimiento vegetal por la induccin de las hormonas que estas contienen. Las plantas no necesitan compuestos complejos, del tipo de las vitaminas o los aminocidos, esenciales en la nutricin humana, pues sintetizan todos los que precisan. Slo exigen una docena de elementos qumicos, que deben presentarse en una forma que la planta pueda absorber. Dentro de esta limitacin, el nitrgeno, por ejemplo, puede administrarse con igual eficacia en forma de urea, nitratos, compuestos de amonio o amonaco puro, y las plantas tienen la capacidad de fijar y sintetizar los compuestos que el suelo necesita y la planta tambin lo requiere.(Encarta estudiantil, 2009). Por tal razn se vio la necesidad de hacer una captura y ensayo con los microorganismos que se encuentran en simbiosis con las plantas, que se pueden encontrar en distintas leguminosas que en la amazonia son abundantes y no son aprovechadas de ninguna manera estos microorganismos que se encuentran junto con ellos y documentar la nueva metodologa de experimentacin y aprovechamiento de las cepas de dichos microorganismos que las plantas generan en sus races y as aportar a los agricultores de la zona a fertilizar sus suelos y cultivos orgnicamente.

2. PLANTEAMIENTO DEL TEMA 2.1. Contexto

El presente trabajo de investigacin se realizo en el laboratorio de Microbiologa de la Universidad Politcnica Salesiana, ubicada en Sevilla Don Bosco, que est ubicado a 20km del rio upano y 1 hora aproximadamente al pie del bosque protector Kutuk de la parroquia Sevilla, dentro del marco de seleccin del rea de estudio se hizo por la cercana del bosque primario disponible y por la gran necesidad de los agricultores de la provincia en aportar a sus cultivos de sus fincas, dependiendo estrictamente con el uso y manejo que ellos dan a los suelos de la provincia; sta investigacin tuvo tres fases de trabajo, lo que uno consto de campo, la segunda de laboratorio y la tercera de experimentacin. Este trabajo tuvo una duracin de 5 meses dividido en 2 meses de campo para la captura microorganismos y 4 meses para el aislamiento y ensayo de los Microorganismos eficientes amaznicos (MEAs) obtenidos del campo y la preparacin del informe final. Para esta investigacin se usar los siguientes mtodos y tcnicas: Tcnica de captura con tarrinas, Tcnica de obtencin de cultivos axenicos de bacterias, y Ensayo de biorreactores para confirmar su efectividad de accin en el suelo y los cultivos hortcolas. 2.2. Problema

Dentro de la provincia no se han hecho estudios de este tipo, por lo tanto los agricultores de todas las zonas de la provincia sienten la necesidad de fertilizar sus suelos con el propsito de sacar buenos productos dentro del mercado local y nacional, y no hay ni un organismo que se preocupe de la agricultura local y as apoye a estos productores. Por lo tanto el propsito de esta investigacin ha sido de enfrentar tal problema con la elaboracin de un biofertilizante de microorganismos que estn presentes en nuestros bosques y aplicar a dichos cultivos de los productores para as mejorar el rendimiento de los suelos de la provincia. 2.3. Justificacin

El bosque primario maduro alberga cientos y millones de microorganismos que ayudan en la descomposicin de los restos vegetales y animales en nutrientes esenciales para las plantas que frecuentemente el hombre cultiva para el sustento diario y para las plantas que crecen libremente en el bosque. Como nos damos de en cuenta que por el esfuerzo que los

agricultores lo hacen al suelo por cultivar sus productos, los suelos actuales y especialmente amaznicos pierden con facilidad su capa de materia orgnica y se han vuelto infrtiles. Por lo tanto es verdad que nos urge investigar y documentar esa informacin que guarda el bosque en interaccin con los microorganismos y elaborar un producto a base de ellos que el resultado seria el biofertilizante que esta cargado de cientos de aquellos microorganismos que da a da se matan con la agricultura sedentaria que es la quema del bosque cortado y la agricultura actual que es la aplicacin de pesticidas, herbicidas y abonos qumicos que sustituyen a aquellas que son naturales que en este caso son los microorganismos que activan y mantienen en equilibrio a las plantas y el suelo. Con este proyecto se pretende apoyar a los agricultores de la provincia a enfrentar los problemas de la infertilidad del suelo amaznico y ensear a utilizar los medios alternativos de agricultura sostenible y sustentable.

3. OBJETIVOS 3.1. General Elaborar un biofertilizante a base de microorganismos obtenidos del bosque, para as apoyar a los agricultores de la provincia a enfrentar los problemas de la infertilidad del suelo amaznico. 3.2. Especifico Capturar los microorganismos que estn en simbiosis con las leguminosas y los suelos amaznicos. Identificar qu tipo de microorganismos actan en simbiosis con las leguminosas amaznicas y el suelo. Aprender cmo se realiza la fijacin biolgica del nitrgeno a travs de la simbiosis Microorganismos- leguminosas. Conocer a obtener cultivos puros de cada especie por la morfologa de crecimiento y color de las bacterias en el laboratorio. Elaborar un biofertilizante orgnico fitoestimulante del follaje de las plantas y reactor de los suelos infrtiles de la provincia y dar a conocer de los beneficios

que brinda este producto elaborado con microorganismos obtenidos de los bosques y leguminosas amaznicas. Conocer la importancia ecolgica del uso de este producto orgnico.

4. MARCO TEORICO. 4.1. Las bacterias Nitrificantes.

Son las bacterias benficas en el acuario y el suelo, llamadas Nitrosomas y Nitrobacter encargadas de transformar el nitrgeno atmosfrico y el amonio en nitritos y nitratos. Son los auttrofos que realizan cambios importantes en los suelos al fijar en ellos el nitrgeno atmosfrico.

En general: Las bacterias del hidrgeno son: Pseudomonas, Paracoccus, Alcaligenes, etc. Muchas son quimiolittrofos facultativos. Pueden crecer tambin como quimiorgantrofos usando compuestos orgnicos. Todas las bacterias poseen una enzima clave ligada a membrana que es la Hidrogenasa, escinde el H2 y cede a la cadena de transporte de e- los electrones. Se crea el gradiente de H+ para formar ATP. Estn asociados a la membrana plasmtica y componentes de la cadena de transporte de electrones. Las bacterias nitrificantes (BN) o bien realizan la oxidacin de amoniaco a nitrito (NH3 a NO2-) como el Geobacter nitrosomonas; o bien la oxidacin de nitrito a nitrato (NO2- a NO3-) como el Geobacter nitrobacter.(monografas.com/trabajos

10/clorofa/clorofa.schtml) Cuadro 1.1. Bacterias oxidadoras de amoniaco y nitritos.

4.2.

La Nitrificacin:

Proceso ampliamente distribuido en la naturaleza y supone la accin secuencial de estos dos tipos de bacterias. En el caso de las bacterias que utilizan la oxidacin de NH3 a NO2- : Se produce mediante un paso intermedio en que el NH3 pasa a hidroxilamina (NH2O), el enzima que interviene es una monooxigenasa que produce la oxidacin del NH3. En el segundo paso la NH2O es oxidada a NO2- mediante una hidroxilamina-xidoreductasa.

La primera es una enzima constitutiva ligada a la membrana celular, la segunda acta a nivel del periplasma. La e- necesaria para que el NH3 se reduzca proceden de la cesin directa de la hidroxilamina-xidoreductasa al citocromo "c" por la cadena transportadora de e- hasta el oxgeno generando una fuerza motriz de protones que generar ATP. En bacterias en que realiza la oxidacin del NO2- a NO3- : Se realiza por una enzima nitrooxidasa, en este caso los e- se incorporan sobre los citocromos, la cadena es muy corta y el rendimiento de generacin de ATP no es muy alto. El metabolismo es tpicamente quimiolittrofo, viven en aerobiosis. En ocasiones el NH3 se puede oxidar en anoxia por accin del nitrato, aceptor de e-, para la formacin del H2. Reaccin muy exotrmica con alta liberacin de energa. En BN se emplea el ciclo de Calvin para fijar CO2, algunas utilizan compuestos orgnicos porque en la fijacin del CO2 se utilizan mucha energa. 4.3. Bacterias responsables de la nitrificacin

4.4.

Microorganismos Fijadores de Nitrgeno: Familia Rhizobiaceae

La revolucin verde de los aos sesenta trajo un notable incremento de la produccin agrcola, gracias, sobre todo, al empleo generalizado de abonos qumicos y semillas mejoradas. Pero el fertilizante nitrogenado, el ms utilizado en agricultura, se lleva buena parte de la inversin en el campo. Para la fabricacin de fertilizantes nitrogenados se requiere en general energa derivada del petrleo. Por otro lado, su uso indiscriminado ha ocasionado graves problemas de contaminacin, ya que no todo el fertilizante que se aplica lo aprovecha la planta; en una cuanta importante acaba en lagos y lagunas. (Ministerio del ambiente, 2005)

La fijacin biolgica de nitrgeno es la opcin alternativa y natural de la fertilizacin qumica. De todos los seres vivos, slo un centenar de gneros de bacterias estn capacitados para fijar nitrgeno del aire, donde este elemento constituye alrededor del 70%, y convertirlo en compuestos asimilables por todos los organismos.

Entre las especies fijadoras de nitrgeno hay cianobacterias (Anabena y Nostoc, arqueobacterias (Methanococcus), bacterias grampositivas (Frankia y Clostridium), enterobacterias (Klebsiella) y otras proteobacterias (Rhizobium, Azospirillum y Acetobacter, entre varias).

En la fijacin biolgica de nitrgeno el mundo orgnico halla su fuente principal de abastecimiento en dicho elemento. Si se suspendiera el proceso de fijacin, todo el nitrgeno retenido en la biomasa regresara a la atmsfera en 100 aos. De poder fijar nitrgeno, el hombre no necesitara ingerir protenas. Pero la ambicin de los cientficos no es que el hombre fije nitrgeno, sino que los cultivos altamente extractivos de nutrientes del suelo puedan prescindir del uso de fertilizantes mediante la fijacin biolgica de nitrgeno.

En la naturaleza ya existen plantas que aprovechan la fijacin de nitrgeno realizada por bacterias que se asocian con los vegetales. Ocho familias de plantas emparentadas entre s gozan de la capacidad para asociarse en simbiosis con bacterias fijadoras de nitrgeno. Las

plantas en cuestin alojan a las bacterias en estructuras especiales que se forman en sus races; en los ndulos, nombre de esas estructuras, las bacterias fijan el nitrgeno.

Individuos de los gneros Rhizobium. Bradyrhizobium y Azorhizobium penetran en las races y a veces en los tallos de las leguminosas, mientras que Frankia y otros actinomicetos son las responsables de la fijacin de nitrgeno en Casuarina y otras especies.

Las leguminosas se cuentan entre las familias ms numerosas, con unas 19.000 especies distribuidas por ambientes muy dispares. Se admite que deben tamao xito adaptativo a su capacidad para fijar nitrgeno, lo que les permite colonizar suelos pobres en nutrientes. Pero no todas las especies estn capacitadas para formar ndulos; tampoco se sabe cuntas establecen simbiosis. Las ms conocidas son las que tienen valor comercial y alimentario para el ser humano o para el ganado, como el frjol, la soja, la arveja, la lenteja, el haba y la alfalfa. Todas ellas fijan nitrgeno atmosfrico al establecer simbiosis con Rhizobium y otros gneros emparentados.

En comparacin con el gran nmero de leguminosas, slo se han identificado unas 15 especies de Rhizobium, tres de Bradyrhizobium y una de Azorhizobium, Por eso se sospecha que debe de haber una cifra elevada de especies de estas bacterias por describir. Los individuos de los gneros citados moran en el suelo y habitan en las zonas geogrficas donde existe la planta con la que establecen simbiosis. Actualmente se ha hallado Rhizobium effl en las semillas de frjol, lo que induce a suponer la existencia de un posible mecanismo de dispersin geogrfica del Rhizobium conjuntamente con frjol en tiempos histricos.

Dentro de una misma especie de Rhizobium observamos un grado de diversidad amplsimo. Proporcionalmente, la disparidad entre bacterias pudiera compararse con la distancia que separa al hombre de la gallina.

Gracias a la diversidad intraespecfica que ofrecen Rhizobium y Bradyrhizobium se ha

dispuesto de un acervo valioso para seleccionar las mejores cepas. Se han logrado as linajes ptimos para la fijacin del nitrgeno, en cuanto han colonizado campos de cultivo.

4.4.1. Descripcin general de la simbiosis de Rhizobium Los Rhizobium son bacterias Gram negativas y aerobias obligadas que pertenecen a la familia Rhizobiaceae. Entre ellos se encuentran los gneros Rhizobium, Bradyrhizbium y Azorhizobium. Estos microorganismos del suelo forman una asociacin simbitica con distintas especies de plantas y durante la simbiosis son capaces de llevar a cabo la fijacin de nitrgeno molecular. En la simbiosis las bacterias se encuentran en las races de las plantas dentro de estructuras llamadas ndulos. Ni la plantas ni estas bacterias aisladamente fijan el nitrgeno diatomico (N2) para convertirlo en amonio. La simbiosis es inhibida si existe un exceso de nitrato o amonio en el suelo. Dentro de los ndulos las bacterias se convierten en bacteroides que son clulas ms grandes que los Rhizobium que se encuentran en el suelo y que llevan a cabo la fijacin de nitrgeno porque son capaces de formar la enzima nitrogenasa que es responsable de la conversin del nitrgeno molecular en amonio. Debido a esta simbiosis, la planta recibe nitrgeno que puede utilizar para s misma, mientras que las bacterias utilizan molculas que les proporciona la planta. 4.4.2. La simbiosis Solamente las leguminosas son capaces de utilizar el nitrgeno en forma de nitrato o amonio para la sntesis de compuestos nitrogenados como los aminocidos. En la simbiosis con los Rhizobium se forman ndulos rizoidales, en los cuales las bacterias simbiticas fijan el nitrgeno atmosfrico que proporcionan a la planta. Por eso, en presencia de estas bacterias simbiticas las leguminosas pueden crecer en suelos que no tienen suficiente nitrato o amonio para un desarrollo normal de la planta. Por esta razn los Rhizobium pueden ser utilizados como inoculantes para mejorar el crecimiento de leguminosas en lugar de abonos. Por otro lado, las bacterias utiliza molculas de la planta y de esta forma, ambos "socios" tienen una ventaja de la simbiosis.

4.5.

Nodulacin en leguminosas

Todos los organismos vivos necesitan de una fuente nitrogenada para poder crecer, dado que muchos de los principales compuestos celulares, como las protenas y cidos nucleicos, contienen en su estructura nitrgeno. Dada la gran variedad de seres vivos que existen en la naturaleza, existen diferentes compuestos nitrogenados que los diferentes organismos son capaces de asimilar, para el caso de las plantas la fuente de nitrgeno que pueden utilizar es el amonio (NH4+) y el nitrato (NO3-), o sea compuestos nitrogenados inorgnicos. Para el caso de los animales superiores adems de requerir amonio, requieren de compuestos nitrogenados orgnicos, como aminocidos o bases nitrogenadas. Es importante decir que todos los compuestos nitrogenados provienen del nitrgeno molecular (N2), que representa el 80% de los gases que forman la atmsfera terrestre. Solo existen unos organismos capaces de asimilar el N2, estos organismos son bacterias que se conocen con el nombre de bacterias nitrificantes o fijadoras de nitrgeno. Los dems organismos de la naturaleza no pueden asimilar el N2 de la atmsfera y por lo tanto para adquirir el nitrgeno que necesitan dependen del metabolismo de las bacterias nitrificantes para tener una fuente nitrogenada. Las plantas y dems organismos son incapaces de asimilar el nitrgeno en forma molecular, excepto por las bacterias nitrificantes que por medio de su metabolismo toman el N2 de la atmsfera y lo convierten en amonio por medio de la enzima nitrogenasa y la hidrolizas del ATP. Ya estando en forma de amonio o nitrato el nitrgeno puede ser utilizado por las plantas. Las bacterias nitrificantes o fijadoras de nitrgeno se acoplan con un nmero significativo de especies vegetales en una relacin que llaman simbiosis (relacin entre dos especies donde ambas reciben un beneficio, pero no es absolutamente indispensable para la sobrevivencia de alguna de las especies), o sea que algunas especies de plantas se asocian en relacin simbitica con las bacterias nitrificantes. Las plantas que se asocian con las bacterias nitrificantes son las llamadas leguminosas y las bacterias fijadoras de nitrgeno son del genero Rhizobium. Las bacterias del genero Rhizobium son habitantes naturales del suelo que infectan las races de ciertas leguminosas. Al Llevar a cabo esta infeccin, se desarrollan unas estructuras en el sistema radicular de las plantas llamadas ndulos, donde viven las bacterias y fijan nitrgeno.

La especie a la que pertenece un cierto Rhizobium se define por la especie de la planta que nodula y en la que es capaz de fijar nitrgeno. El ndulo es una estructura situada en el sistema radicular de la planta, formada por tejido de la planta. Algunas de las clulas que lo constituyen contiene bacterias englobadas en membranas dentro de su citoplasma, estas bacterias atraviesan un proceso de diferenciacin y es precisamente la forma diferenciada (bacteroide) la que fija nitrgeno. El bacteroide es mayor que la bacteria, posee una forma irregular y se muestra ms sensible a cambios de presin osmtica. El ndulo viene a ser un rgano de la leguminosa encargado de fijar y asimilar nitrgeno para la planta, y la planta le proporciona al ndulo (al ndulo y a las bacterias que estn en su interior) carbohidratos producto de la fotosntesis. A cada especie de leguminosa le corresponde un Rhizobium especifico, Por ejemplo al trbol lo nodula el Rhizobium trifolii. La especificidad del Rhizobium que nodula una leguminosa esta determinado en el cdigo gentico y se dice que por la presencia de un plasmidio en el ADN, plasmidio que se trasmite a la bacteria o por conjugacin del Rhizobium especifico. En resumen se puede decir que el Rhizobium promueve la realizacin de la simbiosis con la planta, pegndose a su sistema radicular con el objeto de conseguir energa para metabolizar, pero se encuentra con que la planta hospedera le da la contra orden al Rhizobium de que si este me da nitrgeno en forma de amonio yo le dono su energa para metabolizar. 4.5.1. Reconocimiento entre planta y Rhizobium Las races de plantas forman exudados que inducen la expresin de genes rhizobiales que son caractersticos para el comienzo de la simbiosis. Uno de esos factores son flavonoides que producen una interaccin con la protena codificada por el gen nodD. La protena NodD y las substancias flavonoides forman parte del reconocimiento hospedadorespecfico debido a que no todos los flavonoides pueden interactuar con una NodD de una especie bacteriana dada. 4.5.2. Invasin La invasin de las plantas se lleva a cabo por los pelos radiculares. Las bacterias inducen una curvacin de esos pelos mediante el contacto con la planta y la produccin de metabolitos nod. Las bacterias invaden las plantas mediante el desarrollo de canales de

infeccin, por lo que se forman tneles transcelulares. Durante la penetracin, y la simbiosis, las bacterias no quedan alojadas directamente dentro del citoplasma de las clulas de la planta hospedadora, sino que permanecen alojadas en "vesculas" rodeadas por una membrana derivada de la membrana citoplasmtica de la clula de la planta. 4.5.3. Nitrogenasa La nitrogenasa es el enzima responsable de la reduccin de nitrgeno atmosfrico a amonio en la simbiosis entre Rhizobium y leguminosa. Se compone de las protenas NifH, NifD y NifK. La nitrogenasa contiene dos protenas NifD y dos protenas NifK. Esas cuatro protenas forman la dinitrogenasa. Adems, la nitrogenasa contiene dos proteinas NifH. Esas sirven como reductasa de la dinitrogenasa. La mayora de las nitrogenasas contienen un cofactor con Fe y Mo. Sin embargo, hay tambin nitrogenasas que carecen de Mo y contienen Fe o V por ejemplo. Para la reduccin del nitrgeno, se transportan electrones de la reductasa de la dinitrogenasa a la dinitrogenasa y finalmente al nitrgeno. El amonio formado durante la fijacin del nitrgeno es proporcionado a la planta en forma de aminocidos. 4.6. Hongo formador de ndulos.

4.6.1. Micorrizas Son las asociaciones, que los hongos del suelo establecen con las races o rizoides de plantas terrestres. El trmino fue introducido en 1885 por A. B. Frank y significa hongoraz. Hoy en da, se sabe que forman parte de casi todas las plantas terrestres y aparecen sobre Briofitos(los musgos), muchos Pteridofitos (Helechos), en todos los grupos de Gimnospermas (conferas) y la mayora de Angiospermas (plantas con flor que son ms evolucionadas que las anteriores). Solo algunas familias como Ciperceas, Juncceas, Cariofilceas o Crucferas han desarrollado mecanismos de resistencia frente a la colonizacin por hongos micorrcicos. Los taxones fngicos que establecen micorrizas incluyen hongos Zygomicetes, Ascomycetes, Basidiomycetes y Deuteromycetes. Este hecho sugiere que la evolucin de las asociaciones micorrcicas, podra haber sido decisiva en la colonizacin vegetal de la tierra firme, lo que indicara que el micotrofismo (este tipo de asociacin nutricional entre un hongo y una planta) fue decisivo en la evolucin de las plantas y su adaptacin al medio terrestre. De hecho, las micorrizas son una de las

asociaciones ms frecuentes en la Biosfera y se ha demostrado sobradamente que las races con micorrizas son ms eficaces como rganos absorbentes de agua y nutrientes, que las races de plantas no afectadas; en consecuencia, las plantas micorrizadas tienen ms posibilidades de colonizar suelos ms pobres.

4.6.2.Cmo

se

produce

la

infeccin?

La infeccin fngica se establece en periodos de crecimiento activo de la raz, tras la penetracin de las hifas del hongo, del micelio externo, en las races secundarias de la planta, (las hifas del hongo, digamos para entendernos, que son como las races del hongo, y ese conjunto de hifas del hongo recibe el nombre de micelio), cambia la anatoma de la raz de la planta y forma una estructura nueva: la micorriza. Las hifas del hongo son atradas por exudados de la raz (las plantas no solo absorben nutrientes a travs de las races, sino que tambin excretan ciertos productos que sirven de alimento y contribuyen a formar la microbiota radicular o el conjunto de microorganismos que viven asociados a las races de nuestras plantas). En el proceso de infeccin el hongo solo invade la epidermis de la raz y el crtex radicular, sin entrar nunca en el cilindro vascular (la parte de la raz comunicada con el sistema vascular de la planta, con el fin de repartir a todas las clulas de la planta los nutrientes absorbidos por la raz)ni en el tejido meristemtico( el tejido que tiene el potencial de formar nuevas races), ambos protegidos por una capa que se llama cofia. 5. LOS BIOFERTILIZANTES. Son todos los preparados que contienen clulas vivas o latentes de cepas microbianas con capacidad para fijar nitrgeno, solubilizar fsforo, transformar el azufre, movilizar el potasio, potencializar diferentes nutrimentos o producir sustancias bioactivas (vitaminas, aminocidos, fitohormonas). Los Biofertilizantes se utilizan para aplicar a las semillas o inocular en el suelo con el propsito de mejorar la produccin de cultivos. (Huayamis J, 2007)

6. MECANISMOS DE ACCIN DE LOS BIOFERTILIZANTES 6.1. Fijacin de nitrgeno atmosfrico La fijacin biolgica de Nitrgeno puede ser realizada por distintos organismos: Fijadores de vida libre, (asimbiticos) que son capaces de fijar nitrgeno sin la cooperacin de otras formas vivas, ejemplo: las bacterias pertenecientes a la familia Azotobacteriaceae, muchos de los Clostridea anaerobios y varias especies de algas Verdi azules. Otros grupos se convierten en fijadores cuando viven en asociaciones simbiticas con formas superiores o inferiores de vida. El ejemplo ms corriente son las bacterias del gnero Rhizobium que viven en simbiosis con las leguminosas. Los organismos pertenecientes a la familia Actinomycetaceae que viven en los ndulos radicales de varias especies de plantas no leguminosas y las asociaciones formadoras de ndulos en las hojas, establecidas entre bacterias y algunas especies tropicales de las plantas pertenecientes a los gneros: Ardisis, Pavetta y Psichotria. 6.2. Bacterias solubilizadoras de fsforo del suelo

Estas bacterias se conocen tambin como fosforinas y su uso an no muy extendido, se presenta como promisorio en la solubilizacin de formas insolubles de fsforo tanto orgnico como inorgnico. La solubilizacin por va biolgica de los fosfatos minerales de calcio, hierro y aluminio es una tecnologa que ya se encuentra disponible en biopreparados a base de bacterias (Pseudomonas, Bacillus, Penicillum, Aspergillus, etc.) a partir de las cuales se preparan inculos con los que se bacterizan las semillas o el suelo 6.3. Microorganismos que transforman el azufre

El azufre es un elemento esencial en la nutricin de las plantas pues participa en la formacin de aminocidos y vitaminas. Las bacterias de los gneros Bacillus, Pseudomonas spp, Arthrobacter spp. Convierten el azufre elemental y el tiosulfato a sulfato. Los hongos del gnero Aspergillus oxidan el azufre en polvo.

6.4.

Microorganismos que movilizan potasio

Bacterias de los gneros Bacillus, Pseudomonas, Clostridium y hongos como Aspergillus, Penicillum y Mucor, solubilizan el potasio mediante la liberacin de cidos orgnicos e inorgnicos que reaccionan con los minerales. 7. CARACTERSTICAS, BIOFERTILIZANTE BACTERIAS. MICROORGANISMOS CARACTERSTICAS FUNCIONES RECOMEDACIONES Rhizobium sp. Bacteria fijadora de Sustituye N2 en Aplicar en frjol, FUNCIONES ELABORADO Y A RECOMENDACIONES BASE DE DEL

DIFERENTES

forma entre el 75 y man, haba, lenteja y con de las 80 % de la abonos verdes. las fertilizacin nitrogenada Inoculacin semillas. Dosis: 2-3 g/ litro de agua, cada 15 das de

simbitica, races

leguminosas.

Azotobacter sp.

Bacteria fijadora de Produce N2 en forma sustancias promotoras gram decrecimiento: una

Aplicar en cereales, banano, caa de azcar, hortalizas

asimbitica. Aerbica negativa Utiliza

frutales y tubrculos Dosis: 2-3 g/ litro de

gran vitaminas del agua, cada 15 das B,

cantidad de fuentes de grupo Carbono y ciertos cidos:

polisacridos y cidos indolactico y orgnicos giberlico. Control biolgico por supresin

poblacional de algunos

agentes patgenos (Fusarium Aspergillus) Azoospirillum sp. Bacteria fijadora de Tiene N2 en forma ingerencia sobre gram incrementos Aplicar en cereales, banano, caa de azcar, hortalizas y

asimbitica. Aerbica negativa (microaerbica) Como Carbono fuentes

frutales, tubrculos especies

en la solucin y del

suelo, ornamentales, y como de

de desarrollo de Inoculante races, leguminosas.

utiliza: las

cidos orgnicos y ciertos polisacridos

crecimiento vegetativo

DOSIS: Dosis: 2-3 g/ y litro de agua,

aumento de la cada 15 das productividad (15-30 %)

8. LAS BACTERIAS FIJADORAS DE NITRGENO En forma asociativa (Azotobacter y Azoospirillum) y las solubilizadoras de fsforo sintetizan sustancias biolgicamente activas (hormonas, aminocidos, vitaminas) que son tomadas por las plantas y actan en determinados estadios de su desarrollo. Pueden estimular la floracin o reducir el aborto floral, adelantar la fructificacin y la maduracin, incrementar el vigor de las plantas y lograr productos con mayor tamao y peso. Las cepas de Azotobacter son capaces de producir: 13 aminocidos 6 citoquininas Mayores concentraciones de auxinas y Giberelinas.

Lo que va a producir mayores rendimientos en los cultivos Clasificacin de microorganismos fijadores de nitrgeno de inters agrcola y forestal (municipio Morona, 2007) El autor acierta que la fijacin biolgica del nitrgeno es una biotecnologa agrcola respetuosa con el medio ambiente y representa una alternativa a la fertilizacin nitrogenada, evitando la contaminacin de suelos y aguas por nitratos qumicos que se producen hoy en da en el mercado mundial y nacional. 9. METODOLOGIA. 9.1. FASE DE CAMPO.

9.1.1. Preparacin de medios (trampas) para atrapar bacterias del campo. MATERIALES: 1 tarro de plstico (tarina) 1 pedazo de tela nylon (media de mujer) 1 liga 4 onzas de arroz cocinado con sal (sin manteca) 2 cucharadas de melaza o miel de panela 2 cucharadas de harina de pescado o caldo de carne.

PROCEDIMIENTO: 1. Poner 4 onzas de arroz cocinado con sal. 2. Agregue 2 cucharadas de melaza. 3. Agregue 2 cucharadas de harina de pescado o caldo de carne. 4. Tapar la boca del tarro con un pedazo de tela nylon y asegurarlo bien Se recomienda preparar entre 20 capturadores o ms a fin de asegurar una elevada diversidad microorgnica.

PROCEDIMIENTO DE CAMPO: 5. Se eligi los sitios donde realizar las capturas: a. Parque botnico del instituto: Un lugar hmedo y cubierto de vegetacin, b. Un sector prximo a la laguna del instituto

c. Arboles y arbustos sanos y robustos del parque. 6. Se procedi a enterrar los tarros o tarrinas en las reas elegidas, dejando el borde de las mismas a 10 centmetros de profundidad. 7. Se coloc materia orgnica en proceso de descomposicin recogida en los sectores circundantes, sobre el nylon que tapa la boca del tarro. 8. Se identifico el sitio donde enterr las tarrinas colocando una baliza.

COSECHA DE LOS MICROORGANISMOS a. Despus de 2 semanas se procedi a desenterrar las tarrinas y se saco el arroz que fue impregnado de Microorganismos (MEAs). b. Luego de la cosecha se procedi a mezclar en un balde el arroz de todas las tarrinas cosechadas. OBTENCIN DE LA SOLUCIN MADRE a. Se agrego 1 litro de agua limpia cocinada pero fresca a la cosecha de arroz con microorganismos. b. Se agrego 1 litro de melaza o miel de panela y se procedi a batir o licuar la mezcla por el espacio de 5 a 10 minutos. c. Se dejo fermentar la mezcla durante 30 das.

9.1.2. Recoleccin de ndulos de las leguminosas. MATERIALES: Fundas ziploc. Guantes de caucho. Papel aluminio. Tijera de podar.

PROCEDIMIENTO: 1. Se eligi cuatro leguminosas: a. Kanumar(Mimosa pdica) b. Shuk(Erithrina poeppigiana) c. Leguminosa de flores amarillas. d. Sampi (Inga sp.) 2. Con la ayuda de los guantes de saco las plantas del suelo 3. Se recogieron los ndulos de las races de las 4 plantas. 4. Se coloco en las fundas ziploc envueltas en papel aluminio( se hace con el objetivo de que no se contaminen con otros microorganismos del ambiente) 5. Se procedi a refrigerar con el objeto de que no se mueran los microorganismos que se encuentran en los ndulos.

9.2.

FASE DE LABORATORIO.

9.2.1. Aislamiento de las bacterias de las trampas y de los Ndulos. MATERIALES: Tubos de ensayo de 10mL. Solucin madre de Microorganismos(2 galones) Esterilizador Asas Ndulos de las plantas. Cajas petri 500 mL Caldo peptonado Cmara de flujo laminar. Bistur. Papel aluminio. Cmara de incubacin PROCEDIMIENTO. Obtencin de Bacterias: 1. Se procedi a desinfectar los ndulos con una solucin de cloro al 1%. 2. S e cort en pedazos pequeos los ndulos de cada especie de planta (separar en papel aluminio) y guardar en el refrigerador por 30 min. 3. Se preparo 500ml de caldo peptonado, con los siguientes clculos: 12.75g en 500ml de agua destilada. 4. Se disolvi bien y calent en el microondas por 5 min.

5. Se dej en el esterilizador por 30 min y se procedi a dejar enfriar por 20 min, 6. Una vez frio se coloco 10 ml de caldo peptonado en los tubos de ensayo y se etiquet los tubos segn la especie de la planta 7. Luego se procedi a colocar los ndulos con la esptula en los tubos respectivos y se dej incubar por 24 horas a 35c, en la cmara de incubacin. Obtencin de cultivo puro (Axenicos): 1. Se procedi a preparar el medio de cultivo (Agar) con tres repeticiones de cada uno de los ndulos de las plantas y de los dos envases de plstico (microorganismos del campo) con un total de 450 ml para 18 cajas petri (con 25 ml de Agar cada una). 2. Se esterilizo por 30min junto con los materiales a utilizar, se repartieron en las 18 cajas y se dejo enfriar en la cmara de flujo laminar. 3. Una vez gelificadas los medios con la ayuda del asa se procedi a picar las muestras y a estriarlas en las cajas con los medios. 4. Luego se coloco en la cmara de incubacin por 24horas a 35c. 5. Luego de las 24 horas se sacaron las cajas y se obtuvieron las cepas segn la forma y el color en otras 14 cajas con Agar. 6. Despus de las 24 horas se obtuvieron solo las bacterias de una sola forma, un solo color y forma de crecimiento. 7. Estas bacterias axenicos (puro) se estri de nuevo en los viales de 20ml para conservar como muestras para estudios posteriores mas profundos de cada especie de bacterias que albergan cada especie de leguminosas amaznicas. 9.3. RESULTADOS.

De las 18 cepas que se listaron al inicio, 15 cepas mejores se escogieron por su rapidez en crecimiento y resistencia a las condiciones de manejo de cada una de ellas. Se llego a obtener 14 bacterias nitrificantes y 1 levadura que transforman los azucares en aminocidos que estimulan en diversos procesos de desarrollo de las plantas.

10. CONCLUSIONES Se determin que las bacterias que forman ndulos con las leguminosas : fijan nitrgeno atmosfrico en nitrgeno aprovechable para las plantas. Los ndulos son estructuras que se forman en las races de las leguminosas, alojan a las bacterias en su interior. En estas estructuras las bacterias se trasforman en bacteroides, que son los encargados de fijar el nitrgeno atmosfrico. Adems los bacteroides llevan a cabo la fijacin de nitrgeno porque son capaces de formar la enzima nitrogenasa que es responsable de la conversin del nitrgeno molecular en amonio. No todas las especies de leguminosas forman simbiosis con un solo tipo de bacteria, hongo o levadura. Las ms conocidas son las que tienen valor comercial y alimentario para el ser humano o para el ganado, como el frjol, la soja, la arveja, la lenteja, el haba y la alfalfa. Entre las amaznicas ya determinadas estn la erithrina sp, mimosa sp y inga sp 11. BIBLIOGRAFIA.

Huayamis J,2007.Las bacterias nitrificantes.Monografias.com juanhuazu@hotmail.com http/monografas.com/trabajos 10/clorofa/clorofa.schtml Todo Micorrizas.2008.Wikipedia.com