Lima, UIGV, Junio 2013

Qumica de los Flavonoides,

Aislamiento y caracterizacin de
Isoflavonas y su Actividad
Biolgica

Q.F Heinz Jungbluth Ganoza

 Introduccin
Pigmentos naturales con una estructura
carbonada C3-C6-C3 o mas, especficamente
con un grupo fenilbenzopirano, dependiendo
de la unin del grupo aromtico con el ncleo
benzopirano (cromano) sern, flavonoides 2-
fenilbenzopirano, isoflavonoides 3-
benzopirano, neoflavonoides 4-benzopirano
2-fenil Benzopirano
Isoflavonoides
Neoflavonoides
Flavonoides Minoritarios
Botnica
 Isoflavonas
Distribucin: Las Isoflavonas se hayan
presentes mayoritariamente en la familia de
las leguminosas (Fabaceae) , preferentemente
en la subfamilia papilionideae, existen grandes
revisiones de investigaciones sobre la
presencia de Isoflavonas en esta subfamilia
como la de Veitch (2007, 2009). Se encuentran
presentes en los frutos de esta familia
(Legumbre) y en las races o rizomas
(mecanismo de fijacion de Nitrogeno)
Qumica
 Isoflavonas
Caractersticas qumicas resaltantes: Las
isoflavonas difieren de sus respectivos
flavonoides por la migracin de un anillo
aromtico de C2 a C3. Mayores cambios en la
estructura dependern de su Hidroxilacion,
metoxilacion, o metilendioxisustitucion,
prenilacion y Glicosilacion.
Isoflavonas
Biosntesis
 Biosntesis
Las Isoflavonas proceden de la ruta de
los Fenilpropanoides, pero el paso
crucial para convertirse en Isoflavonas
esta en la conversin de la respectiva
flavanona en una Isoflavona, la enzima
que realiza este proceso es la 2-
hidroxiisoflavanona sintetasa (2HIS)
luego se produce una dehidratacin
mediante la 2-hidroxiisoflavona
dehidrasa convirtindola en una
Isoflavona( todas estas enzimas ya han
sido caracterizadas convenientemente)
 Biosntesis
Regulacin:
La va del cido shikmico es dependiente de la luz.
La accin de la fenilalanina amonioliasa, que inicia la va biosinttica de los
flavonoides, es fundamental para la vida de las plantas y por ello est
estrictamente regulada. Entre otros factores, la fenilalanina amonioliasa
es activada por la luz, y depende adems de la concentracin de
diferentes hormonas vegetales. La actividad de la fenilalanina amonioliasa
suele aumentar cuando a los vegetales se les somete a situaciones de
estrs, como puede ser la falta de agua ("estrs hdrico"), infecciones
fngicas o bacterianas, radiaciones UV, y el fro (por esto ltimo las plantas
sometidas a bajas temperaturas suelen presentar coloraciones rojizas en
tallos y hojas, y cuando los inviernos son muy fros, las flores desarrollan
colores muy intensos en la primavera siguiente).
Hay isozimas dedicadas a la produccin de flavonoides diferentes en
respuesta a seales ambientales diferentes
Fitoqumica
 SECUENCIA DE
INVESTIGACION

OBTENCION DEL IDENTIFICACION DESECACION

MATERIAL

- Colectar planta completa, - Por un botnico de

flor y fruto.
- Por duplicado.
- Anotar nombre vernculo
y cientfico.
- Hbitat, tamao, aspecto y
color de los rganos
recogidos
- Clima, altitud, abundancia
o escasez de la especie.
- Una foto.
- Para eliminar H2O y
experiencia
evitar alteracin.
- Buen manejo de literatura
- Hacerle gradualmente--
- Guardar muestra
cambios de lugares.
herborizada
- Aire libre, en el sol
sobre papel que se cambia
diariamente.
- Estufa: temperatura
controlada+ aire forzado
 Obtencin del
material vegetal PROCESO DE INVESTIGACION FITOQUIMICA

Desecacin y
conservacin
(estabilizacin)

Identificacin
taxonmica y
sus partes

Tamizaje
fitoquimico

Extraccion P. Formulacin
activos

Aislamiento y
caracterizacin
del P. A
 Aislamiento
Existen muchas vias de aislar y separar una
isoflavonas, lo mas importante es reconocer el
material del cual se esta extrayendo (material
vegetal, muestra biolgica, Alimento), la
presencia de carbohidratos y compuestos
lipofilicos, afectara el desarrollo del metodo.
 Aislamiento
SPE: (Solid Phase Extraction): Para poder
evitar la mayor cantidad de interrupciones en
la matriz, como medio de purificacin
podemos utilizar cartuchos de SPE C1;
eluyendo el extracto en el cartucho y luego
pasando a travs del mismo MeOH con
pequeas concentraciones de Acido actico.
 Aislamiento
Partiendo de una muestra vegetal: La
utilizacin de Material Seco, podra hacer
decrecer la presencia de Isoflavonas, de
preferencia utilizar material fresco.
Flavonoides altamente acilados suelen ser
lbiles a temperaturas muy altas y
frecuentemente son degradados durante el
proceso de secado.
 Aislamiento
Si estamos buscando agliconas en el material vegetal,
podemos realizar un lavado con solventes no polares
como el caso de cloruro de Metileno, ter di etlico,
acetato de etilo. (aunque se encuentra raramente bajo
la forma de agliconas)
Normalmente la extraccin podemos realizarla bajo un
equipo soxhlet a 60 C durante 2 horas y comprobar la
presencia de Agliconas en dicho extracto.
Luego podemos proceder a realizar una extraccin con
mezclas de MeOH: H2O, la eficiencia de la extraccin
puede mejorar con sonificacion del material vegetal
 Aislamiento
Los flavonoides en el material vegetal se
encuentran siempre conjugados con o-glic o c-
glic, raramente se encuentra bajo la forma de
aglicona.
Para casos practico de aislamiento sera
necesario separar estos glucsidos del
esqueleto de los flavonoides, para esto se
propone una hidrolizar acida.
 Aislamiento
Sistemas Cromatogrficos para la extraccin:
existen varios sistemas para la extraccin de las
Isoflavonas mediante columnas
Cromatogrficas.
Fases estacionarias: Poliamida, Sephadex LH20,
C18 RP
Fases Mviles: Migracin y mixturas de
compuestos Polares a Hidrfobicos
 -Hexano
Solventes de
-Tetracloruro de carbono
desarrollo
-Benceno
-Diclorometano
-Cloroformo
-Eter dietilico
-Acetato de etilo Aumenta
-Acetona el poder
Serie -Isopropanol eluyente
eluotropa -Etanol
-Metanol
-Agua

El poder eluyente
aumenta con la
Polaridad del Polaridad
disolvente creciente
 Extraccin de
Flavonoides

Maceracin lixiviacin

Filtracin

Separacin por resina

AMBERLITE XAD2

Recuperar en MeOH

Rotaevaporar a 40C

Disolver en Agua

Aglicona Glicosidos

Someter a Hidrlisis acida a

60C Extraer en BuOH y
redisolver en MeOH
 Caracterizacin
Son molculas difciles de caracterizar,
normalmente se determinan bajo el brillo en
presencia de fluorescencia, de color azul
intenso, que cambia a Marrn intenso en
presencia de vapores de amoniaco.
Caractersticas espectrales
de las Isoflavonas
 Espectroscopia UV

La banda II de absorcin de las Isoflavonas

normalmente ocurre en la regin de 245-270 nm y
generalmente no es afectada por el incremento de
la Hidroxilacion del anillo B, pero si es desplazada
bato crmicamente por Hidroxilacion del anillo A

Caractersticas de las espectroscpicas:

Isoflavonas Polioxigenadas, que tengan la banda II de
absorcin, entre 265 y 270 generalmente son trioxigenadas
en el anillo A.
La metilacin o Glicosilacion de 7 o 4-OH tiene un pequeo o
muy pequeo efecto sobre el espectro UV, Mientras que una
sustitucin en el 5-OH causa un ligero desplazamiento
Hipsocromico.
Espectroscopia uv

Reactivos de Desplazamiento
 Tcnicas Espectromtricas
Los tipos de anlisis mas importantes para el
trabajo con flavonoides, son los relacionados
con la Espectrometra de MS, MS/MS y la
RMN 1H y RMN 13C.
El trabajo con IR no ayuda en gran manera,
debido a la cantidad de seales iguales, que se
solaparan.
Espectrometra de masas
Espectrometra de masas

Es una tcnica instrumental sofisticada que separa y detecta

iones en fase gaseosa. Se basa en ionizar molculas gaseosas
convirtindolas en iones (generalmente cationes), que se
separan al ser acelerados por un analizador de masa: la
separacin se basa en la distinta relacin m/z de los iones.
ESPECTRMETRO DE MASAS

Componentes del instrumento

Introduccin de Fuente de Separador de Detector

la muestra ionizacin masas inico

Procesador
de seal
El acoplamiento entre CG y
HPLC con EM se analizar ms
adelante Registrador
 Fuentes de ionizacin

Ionizacin por impacto electrnico

Ionizacin qumica
Fuente de bombardeo con tomos rpidos
Desorcin con lser
Ionizacin a presin atmosfrica:
- Electronebulizacin asistida con un gas: electrospray
HPLC
- Ionizacin qumica a presin atmosfrica
- Fotoionizacin a presin atmosfrica
Ionizacin por impacto electrnico

molculas neutras

placa de repulsin

filamento de W haz de electrones (70 eV)

placas aceleradoras placas focalizadoras

(4000 V)

iones

M+e M.+ + 2e
ion molecular
Fragmentacin del ion molecular

Molcula hipottica ABCD (A, B, C y D = tomos)

ABCD + e ABCD.+ + 2 e
ABCD.+ A+ + BCD.
A. + BCD+ BC+ + D Fragmentacin del
B + A+ ion molecular
CD. + AB+ A + B+
AB. + CD+ D + C+
C + D+

BC. + AD+ Reordenamiento seguido de

ABCD.+ ADBC.+
AD. + BC+ fragmentacin

Colisin seguida de
ABCD.+ + ABCD (ABCD)2.+ BCD. + ABCDA+ fragmentacin
Ionizacin qumica

Gas reactivo metano, isobutano, amonaco (cmara de

ionizacin de alta presin a 10 torr)

CH4 + e (alta energa) CH4+ y CH3+

CH4+ + CH4 CH5+ + CH3

CH3+ + CH4 C2H5+ + H2

Transferencia protnica entre molcula reactiva y analito

CH5+ + MH MH2+ + CH4

C2H5+ + MH M+ + C2H6
Separador de masas

Espectrmetro de masas de sector magntico

Espectrmetro de masas de cuadrupolo
Espectrmetro de masas de tiempo de vuelo
Espectrmetro de masas de trampa inica
Espectrmetro de masas de sector magntico
 cmo se separan los iones de distinta masa?

m : masa
Ecintica = mv2 = zV v : velocidad de la partcula
m : masa
v = (2zV/m) z : carga
V : diferencia de potencial

FM = Bzv mv2/r = Bzv FM : fuerza centrpeta

FC : fuerza centrfuga
FC = mv2/r v = Bzr/m B : campo magntico
r : radio de curvatura

Bzr/m = (2zV/m)
m/z = B2r2/2V
Espectrmetro de masas de cuadrupolo

= 6 mm
Espectrmetro de masas de cuadrupolo
Relacin de voltajes durante un barrido de masa con un
analizador cuadrupolo

Potencial de radiofrecuencia
Potencial corriente directa

tiempo
masa
EM de tiempo de vuelo (TOF: time of flight)

pulsos de 300 V, 3.000-20.000 veces/s

 Espectrmetro de masas de trampa inica

Vrf

tapa electrodo anular tapa

central
Esquema detector de trampa inica (ITP)
Espectros de masas

Dependen de:

Energa de ionizacin de la molcula

Grupos funcionales de la molcula

Mtodo de ionizacin

Presin y temperatura de trabajo

Diseo instrumental
Espectros de masas obtenidos por impacto electrnico

Etilbenceno
pico base
En este ejemplo el pico
base se forma por prdida
de CH3

ion molecular (ion parent)

molcula con nmero par de N M+ con masa par

M+ fragmento de
mayor masa
molcula con nmero impar de N M+ con masa impar

4 H M-4 F M-19
tomos y grupos CH3 M-15 HF M-20
frecuentemente NH3 M-17 C2H2 M-26
desplazados H2O M-18
Espectros de masas de cloruro de metileno

Impacto electrnico
pico base prdida de Cl

Picos isotpicos
12C1H 35Cl (m= 84)
2 2
13C1H 35Cl (m= 85)
2 2
12C1H 35Cl37Cl (m= 86)
2
13C1H 35Cl37Cl (m= 87)
2
12C1H 37Cl (m= 88)
2 2
Espectros de masas de pentobarbital (sedante)

Impacto electrnico Ionizacin qumica

El ion molecular (m/z = 226) prcticamente no se distingue

Espectros de masas de 1-decanol (PM = 158)

Impacto electrnico

Ionizacin qumica
Cromatografa Gaseosa Espectrometra de Masas

Sistemas de acople
Separador de chorro (columnas rellenas)
Ensamblaje con columnas capilares

hacia la
bomba
cmara de
evacuacin
A cmara
desde el de
CG ionizacin

constriccin tubo de vidrio

constriccin
de entrada poroso
de salida
collarn que se atornilla
en el receptculo de
fuente inica
Cromatografa Lquida Espectrometra de Masas

Sistema de acople

Sistema de ionizacin
Formacin de iones gaseosos a partir de analitos en solucin

Ionizacin a presin atmosfrica

Electronebulizacin asistida con un gas: electrospray (ESI)

Ionizacin qumica a presin atmosfrica (APCI)

Fotoionizacin a presin atmosfrica (APPI)

Electronebulizacin asistida con un gas
Electrospray (ESI)
Electrospray (ESI)

1. La fase mvil y el analito se nebulizan

(dispersados en pequeas gotas)

2. El solvente de la fase mvil se evapora de las

gotas (desolvatacin)

3. La densidad de carga en las gotas aumenta

hasta alcanzar el lmite Raleigh (10e8 V/cm3) y
luego la gota sufre explosiones de Coulomb y
se rompe en gotas ms pequeas.

4. Bajo la influencia de potenciales

electrostticos en la cmara de spray (nube), el
ion analito se desorbe de la gota.
 Electrospray

aerosol

lquido
 Cundo es apropiado trabajar en ESI?

- Solutos ionizables de alto y bajo peso molecular. El analito de inters debe ser
capaz de portar carga en solucin
Ejemplos:
a) Muestras que contienen heterotomos: carbamatos, benzodiacepinas
b) cidos o bases
c) Especies inicas: fosfatos, conjugados con grupos sulfato, aminas, etc
d) Muestras que se multi-cargan en solucin (ej: pptidos, proteinas,
oligonucleotidos)
e) Compuestos que pueden aceptar carga inducida
A evitar: muestras con grupos no polares en los que la induccin de carga no
sea un proceso eficiente
Ionizacin qumica a presin atmosfrica

APCI
Ionizacin qumica a presin atmosfrica (APCI)

1. La fase mvil y el analito se

nebulizan (dispersados en
pequeas gotas)

2. Las gotas se evaporan.

3. Las molculas de fase mvil

se ionizan por electrones
provenientes de una descarga
elctrica.

4. Las molculas de analito se

ionizan por los iones de la fase
mvil.
La muestra y el solvente
vaporizados entran en la regin
corona entre la aguja y el capilar

Las molculas de solvente se

ionizan en la regin corona de
descarga, transformndose en
iones gaseosos reactivos

Estos iones reactivos

reaccionan con las molculas de
muestra, ionizndolas
Ionizacin qumica a presin atmosfrica

H3O+(H2O)16
 Cundo es apropiado trabajar en APCI?
Muestras: Compuestos de peso molecular/polaridad intermedias: PAHs, PCBs,
cidos grasos, ftalatos.
Compuestos que no contienen grupos cidos/bsicos (ej: hidrocarburos,
alcoholes, aldehidos, cetonas y esteres)
Muestras con heterotomos: ureas, benzodiacepinas, carbamatos
Muestras que exhiben un mal comportamiento ESI
Parmetros en solucin
Mucho menos sensible a las condiciones de disolucin que ESI
Tolera mayores flujos que ESI
Acomoda algunos solventes no compatibles normalmente con ESI
Muestras a Evitar
Debido a la evaporacin previa: muestras trmicamente lbiles,
muestras cargadas en solucin, biomolculas (habitualmente no voltiles).
Fotoionizacin a presin atmosfrica

APPI
APPI (modo positivo)

El solvente y la muestra se
nebulizan y son completamente
vaporizados por calefaccin.

La ionizacin del solvente y la

muestra ocurre por bombardeo
con fotones a partir de una
lmpara UV
La molcula de analito M se ioniza a ion molecular (si el potencial
de ionizacin del analito es menor a la energa del fotn).

El ion M.+ puede extraer un hidrgeno del solvente para formar

[M+H]+

Un dopante fotoionizable en exceso y rinde muchos iones

moleculares.
El analito se ioniza por transferencia protnica a partir del
dopante o solvente
El in molecular del dopante ioniza al analito por transferencia
electrnica
 Cundo usar APPI?

Puede ionizar compuestos que no se ionizan bien con ESI

o APCI (ej: PAHs).

Tiene mejor sensibilidad global para algunos compuestos

(THC-tetrahidrocanabinol, cido benzoico, vitaminas no
hidrosolubles).

Tiene mejor sensibilidad a bajas velocidades de flujo que

APCI.

Es robusto y altamente reproducible.

 Seleccin del sistema CL/EM

100.000
ESI
Peso molecular

10.000

APPI
1.000 APCI

No polar Muy polar

Polaridad del analito
Registros grficos CG-EM y CL-EM

Cromatograma de corriente inica total

Cromatograma de in seleccionado

Arreglo tridimensional: seal en funcin del tiempo (informacin

cromatogrfica) y en funcin de la relacin m/z (informacin
espectroscpica)
Sntesis de 1Br-butano a partir de butanol (CG-EM)

CH3(CH2)3OH + Br- CH3(CH2)3Br + OH-

1-butanol
1-bromobutano

cromatograma EM pico 1 EM pico 2

Combustin de tela tratada con producto ignfugo

Cromatograma de
corriente inica
total (TIC)

EM de pico 12
(benceno)
Confirmacin presencia de cocana en orina por CG-masa

Cromatograma de corriente inica total

EM de testigo de cocana (m = 303)

a igual tiempo de elucin
EM del pico a 11.5 min
 Mezcla de 6 herbicidas resuelta por HPLC-masas

Cromatograma
convencional
con deteccin Deteccin de
UV un ion
seleccionado
m/z = 312
(corresponde a
MH+ formado a
partir de
imazaquina de
masa = 311)

Cromatograma de masas de corriente inica total

Representacin de la estructura tridimensional de datos CG-EM en
modo barrido completo (full-scan)

Se obtiene: el cromatograma inico total, el cromatograma inico de un

in seleccionado (a determinada masa) y los espectros de masas (a
determinados tiempos de retencin)
 MS en Flavonoides
Cantidad de muestra necesaria: Menos de un
1mg, esta tcnica junto con el anlisis UV y los
reactivos de desplazamiento.
La tcnica a escoger puede variar dependiendo
de la matriz y tipo de flavonoides a analizar. (FAB,
MALDI, TOF, EI)
El anlisis se debe llevar a cabo siempre con
agliconas, esto debido a que los glucsidos son
altamente termolbiles, incluso existiendo una
gran presin de vaco (3 x10-5 Torr)
 RMN
Esta tecnica es muy usada para el analisis de
flavonoides, especialmente en las isoflavonas, al ser
estructuras altamente metiladas.
Ademas de ser muy solubles en el solvente que se
utiliza para la RMN CDCL3, sin embargo otra vez se
observa que el analisis de los glicosidos, disminuye la
solubilidad en CDCL3
Sin embargo el uso de DMSO d6, facilita de
sobremanera el analisis de glicosidos.
La utilizacion de TMS tambie es apropiada para el
analisis de Flavonoides, ya que generan rapidamente
derivados de estos.
Para la elucidacin de la
estructura tomaremos
en cuenta los siguientes
puntos:
Protones del Anillo A
Protones del Anillo B
Protones del Anillo C
Protones del
Glucsido
Metoxi y Acetoxi
Protones
Protones del
carbono 6 y 8

Nota: Tener en cuenta si

se usa TMS, todos los
OH terminales seran
Trimetilsilil esteres.
Los protones de los carbonos 6 y 8 de las isoflavonas que contengan
sustituciones en los carbonos 5 y 7, presentaran 2 dobletes (J: 2.5cps) en el
rango de 6.0 y 6.5. Los dobletes correspondientes a H-6 ocurren
consistentemente mas altos que los del 8-H, cuando existen azucares en el C-7
la seal se desplaza en el espectro
Otro caso comn es que la isoflavona presente una sustitucin en el C-7 Cuando R=H,
tenemos que los hidrogenos del carbono 5 genera un doblete entre 7.9 y 8.2, El
carbonos 6 generara un cuarteto entre 6.7 y 7.1 y el carbono 8 un doblete entre 6.7 y
7.0, cuando la sustitucin es diferente a la de un H, todos los desplazamientos se ven
reducidos.
Anillo B: para nuestro inters en las isoflavonas, los desplazamientos como
dobletes entre 7.2 y 7.5 y 6.5 y 7.1, nos darn la explicacin de un enlace
=C-C= en la posicin 3, corroborando la presencia de la estructura
correspondiente a las Isoflavonas.
Farmacologa
 Isoflavonas
Las Isoflavonas presentan una gran cantidad de
actividades, aunque cabe resaltar que la mayor
cantidad de Isoflavonas presentar actividad
estrognica, de ah que reciben el nombre de
Fitoestrgenos.
Estos compuestos presentan una estructura
estrica muy similar a la de esteroidal de los
estrgenos, por lo cual se unen fcilmente a los
receptores estrognicos. De ah que produces
una infinidad de efectos estrognicos o anti
estrognicos.
 Absorcin, Metabolismo y excrecin
Las isoflavonas son absorbidas a nivel de la
parte superior del intestino delgado. Pasan la
barrera hematica alrededor de una hora
despus de haber sido ingeridas.
Son absorbidas bajo la forma de aglicona, por
lo que previamente se realizada un hidrolisis
enzimtica, por la B-glicosidasa de la flora
bacteriana o por la enzima instestinal, lactasa-
florizina hidrolasa.
 Absorcin, metabolismo y excrecin
Posteriormente a nivel de la mucosa intestinal
son convertidas a la forma de B-glucoronico por
la enzima UDP-Glucoroniltransferasa , convertida
luego bajo la forma de sulfato catalizado por
PAPS. Estos procesos ocurren a nivel del Hgado.
Luego estos son excretados a nivel biliar, y
reabsorbido en la porcin final del intestino
delgado, creando un ciclo entero-hepatico.
Para ser luego excretado va urinaria, bajo la
forma de DMA (desmethylangolensin).
Mecanismo de Accin
Sntomas Menopasicos:
Las isoflavonas con su
estructura estrica similar
a la del estrgeno, se une
a sitio receptor de
estrgenos, produciendo
efectos vasomotores
importantes, diversos
estudios clnicos, dan
como dosis diaria 135 mg
de Isoflavonas
expresadas como mg de
Genisteina.
 Efectos Benficos
Anticancergeno: Uno de las posibles
explicaciones, o modelos de mecanismo de
accin es tan indicados a que las isoflavonas,
evitan la proliferacin de clulas cancergenas
activando las vas de apoptosis, inhibicin de
la Tirosina Quinasa, y regulacin de los ciclos
hormonales.
 Efectos Benficos
Efectos sobre la cognicin: El hecho de activar
receptores hormonales, da como resultado un
incremento en la produccin de
neurotransmisores, lo cuales van a producir
una mayor actividad cerebral, llegando a
mejorar los procesos cognitivos del cerebro.
 Practica de Laboratorio
Traer:
Mta problema (planta, material vegetal,
materia biologico), que contenga una cantidad
y molecula conocida de Isoflavonas.
Jeringas de 10 ml
Guantes
Guardapolvos
Muchas Ganas de trabajar
FIN

Gracias