2.

Materiales y mtodos

2,1. Material vegetal Las aceitunas (Olea europaea L.) recogidas de Seferihisar, Izmir Productos Qumicos Sepharose-4B, L-tirosina, 1 napthylamine-, p-NPG,NPG-O, reactivos de ensayo y productos qumicos para electroforesis Sigma-Aldrich (Alemania) sales inorgnicas fueron Merck. EXTRACCION DE LA ENZIMA Lavar aceitunas y retirar semillas

Extraer pulpa 100g

Moler 2 min a -20C

Filtrar con papel Whatmann y extraer 3 veces

Transferir a placas petri

Secar al aire T ambiente /5 h

Almacenar polvo obtenido (rojo purpura) a 20C

Preparar extractos enzimaticos

Centrifugar 15300 rpm/30 min 4C

EC

PURIFICACION PROTEINA

EC

Realizar fraccion de saturacion 050%

Centrifugar 15000rpm /30 min

Recuperar precipitado y disolver

Ajustar concentracion salina

La determinacin de actividad se realizo usando

Ensayo de glucosidasa y determinacin

Determinar actividad con pNPG y o-NPG Diluir 70L Sol. enzima en acetato sodco 50 mM ph 5.5 y 70L como sustrato Mezclaren pocillos Incubar 37C 30 min

Adicionar 70L de Na2CO3

Medir abs 410nm

Realizar ensayo de zimografia bajo condiciones no desnaturalizantes, adicionar (4-MUg)

Determinar concentracion de proteina con (BSA)

Electroforesis en SDS-PAG 12% Sistema minigel

Agregar azul de coomassie

Cargar en gel a 6% para deteccion de actividad en PAGE no desnaturalizante

Calibrar con cinticos Estudios de inhibicin in vitro y determinacin de parmetros acetatp sodico 50mM pH=5.5 , 15 min

Relizar ensayos a concentracion de pNPg y o-NPG(0.78-20mM) y diferentes concentraciones gluconalactona

Realizar lo mismo pero ahora con inhibidor glucosa y iones metalicos

Determinar Vmax y Km por metodo Lineweaver-Bruk

Mediante una tcnica de purificacin por cromatografa recientemente desarrollada se busco caracterizar a la B-Galactosidasa, una enzima importante dentro del grupo de hidrolasas y con una amplia aplicacin en procesos biotecnolgicos y fisiolgicos asi como industria aslimentaria por su influencia en la calidadde alimentos y sabor. Dicha enzima fue extraido de frutos de olivo (aceitunos) mediante salting-out seguido de una purificacin por cromatografa de interaccion hidrfoba sefarosa-4B-L-tirosina1-naftalamina recuperando un 72% para la primera etapa y reduciendo la cantidad de contaminante de la protena. Para la cromatografa se purifco la enzima de los contaminante restantes conservando ahora un 75% por lo que no se realizaron mas etapas de purificacin, pues se logro en un 154.9 x con un rendimiento de la enzima de 53.9% y una AE de 254.9 U/mg En comparacin con otras estudios de purificacin donde lograban un rendimiento de la decima parte al logrado en esta nueva tcnica y una purificacin de 47.7 x a partir de fuentes vegetales, y otras en ninguna los resultados son ni similares ni superiores Esto fue logrado gracias a las interacciones hidrfobas y armoaticas con ligandos arilo y alquilo. Se determino el peso moleclar de la enzima como 65 KDa muy similar a las glucosidasas vegetales ya reportadas a condiciones de ph entre 4 y 5.7 a 42C por un tiempo de incubacin muy corto manteniendo un 50% de su actividad. El estudio de parmetros cinticos mostro unaafinidad alta para para-NPG y una inhibicin competitiva para gluconolactona , sin mostrar mayor efecto para la glucosa.