Proteoma mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae

PNAS, 23: 13207-13212 (2003)

Mitocondria

Orgnulos celulares presentes en casi todas las clulas eucariotas. La mitocondria desempea un papel principal en mltiples funciones celulares: Bioenergtica Apoptosis Metabolismo de cidos grasos, lpidos, hierro Muchas enfermedades se atribuyen a defectos mitocondriales. El conocimiento de las funciones fisiolgicas de la mitocondria es limitado, y muchas enfermedades mitocondriales no pueden ser analizadas a nivel molecular.

Mitocondria

IM - membrana interna IMS- espacio intermembrana OM- membrana externa

Saccharomyces cerevisiae

Hongo ascomiceto unicelular que se utiliza ampliamente en la elaboracin de vino, cerveza, pan y otros alimentos. Muchos genes humanos implicados en enfermedades tienen homlogos en levaduras. Excelente accesibilidad de las levaduras al anlisis gentico y bioqumico. Principal organismo modelo para la identificacin y caracterizacin de funciones proteicas y rutas celulares en eucariotas. Primer genoma eucariota completamente secuenciado: 12 Mb, organizado en 16 cromosomas.

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae
Foury F et al., "The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.", FEBS Lett, 1998 Dec 4;440(3):325-31 Bussey H et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XVI.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):103-5 Jacq C et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome IV.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):75-8 Dietrich FS et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome V.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):78-81 Tettelin H et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome VII.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):81-4 Dujon B et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XV.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):98-102 Churcher C et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome IX.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):84-7 Philippsen P et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XIV and its evolutionary implications.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):93-8 Johnston M et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XII.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):87-90 Bowman S et al., "The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XIII.", Nature, 1997 May 29;387(6632 Suppl):90-3 Goffeau A et al., "Life with 6000 genes.", Science, 1996 Oct 25;274(5287):546, 563-7 Galibert F et al., "Complete nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome X.", EMBO J, 1996 May 1;15(9):2031-49 Vassarotti A et al., "Structure and organization of the European Yeast Genome Sequencing Network.", J Biotechnol, 1995 Jul 31;41(2-3):131-7 Murakami Y et al., "Analysis of the nucleotide sequence of chromosome VI from Saccharomyces cerevisiae.", Nat Genet, 1995 Jul;10(3):261-8 Bussey H et al., "The nucleotide sequence of chromosome I from Saccharomyces cerevisiae.", Proc Natl Acad Sci U S A, 1995 Apr 25;92(9):3809-13 Feldmann H et al., "Complete DNA sequence of yeast chromosome II.", EMBO J, 1994 Dec 15;13(24):5795-809 Johnston M et al., "Complete nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome VIII.", Science, 1994 Sep 30;265(5181):2077-82 Dujon B et al., "Complete DNA sequence of yeast chromosome XI.", Nature, 1994 Jun 2;369(6479):371-8 Oliver SG et al., "The complete DNA sequence of yeast chromosome III.", Nature, 1992 May 7;357(6373):38-46 Hartley JL, Donelson JE, "Nucleotide sequence of the yeast plasmid.", Nature, 1980 Aug 28;286(5776):860-5

Objetivo Identificacin de protenas mitocondriales de S. cerevisiae

El anlisis del proteoma mitocondrial proporcionar una importante base de datos para: Anlisis de funciones asociadas a la mitocondria Anlisis de nuevas funciones mitocondriales Caracterizacin de enfermedades mitocondriales

Purificacin de mitocondrias

Aislamiento de mitocondrias a partir de lisados celulares de S. cerevisiae mediante: Centrifugacin diferencial Dos gradientes de sacarosa consecutivos Utilizacin de cuatro mtodos de separacin de protenas en paralelo, para minimizar el problema de que una fraccin significativa de protenas pueda escapar a la deteccin: 1D-PAGE 2D-PAGE Digestin con 4 proteasas seguida de cromatografa lquida multidimensional (MDLC, multidimensional liquid cromatography) Generacin de fracciones asociadas a mitocondrias mediante tratamiento con sales o tripsina.

Separacin de protenas y anlisis MS

Mitocondrias purificadas: a. 2D-PAGE y MALDI-TOF-MS o n-LC-MS/MS (nano liquid chromatography-MS/MS). b. Cromatografa lquida multidimensional y ESI-MS. c. 1D-PAGE y n-LC-MS/MS. Fracciones asociadas a mitocondrias generadas mediante tratamiento con sales o tripsina: a. 1D-PAGE y n-LC-MS/MS. b. 1D-HPLC y n-LC-MS/MS. En total, se obtuvieron de ms de 20 millones de espectros de masas que se analizaron posteriormente en las bases de datos.

Separacin de protenas y anlisis MS

Separacin de protenas y anlisis MS

Busqueda automtica en la base de datos completa de S. cerevisiae utilizando el algoritmo SEQUEST. Identificacin de un total de 750 protenas mitocondriales diferentes en S. cerevisiae (aprox. 90% del total): indica la implicacin de la mitocondria en mltiples procesos celulares. Anlisis con el programa MitoProt: prediccin de una presecuencia mitocondrial clsica en 320 protenas (43%). Anlisis con el programa TMHMM: prediccin de al menos un segmento -hlice transmembrana en 255 protenas (34%).

Separacin de protenas y anlisis MS

Separacin de protenas y anlisis MS

Mediante 2D-PAGE se identificaron 209 spots, que permitieron la identificacin de 109 protenas diferentes: 13 protenas tenan funcin desconocida. De las 750 proteinas mitocondriales identificadas: 436 protenas (58%) mitocondriales conocidas 208 protenas de funcin desconocida 106 protenas previamente descritas como localizadas en otros compartimentos celulares. Se ha descrito una localizacin doble (mitocondria y otro compartimento celular) para al menos 30 protenas mitocondriales conocidas.

Cobertura del proteoma

Identificacin de todas las subunidades conocidas del complejo piruvato deshidrogenasa. Identificacin de los complejos de la membrana interna de la maquinaria de fosforilacin oxidativa. El estudio no est sesgado hacia protenas de membrana. Tampoco est sesgado hacia protenas pequeas o grandes: distribucin de los MWs de las protenas identificadas. Las protenas mitocondriales identificadas representan aprox. el 92% de las proteinas mitocondriales conocidas de S. cerevisiae en la base de datos MITOP.

Cobertura del proteoma

Difcil identificar el 100% de las protenas de un organulo celular mediante un anlisis protemico. Algunas protenas slo se expresan en condiciones de crecimiento particulares, por lo que no existe una nica condicin de crecimiento en la que se expresen todas la protenas simultaneamente. Adems, algunas protenas escapan a la deteccin mediante los mtodos de separacin e identificacin disponibles. La identificacin de protenas mitocondriales en S. cerevisiae mediante la combinacin de mltiples aproximaciones est prxima a la saturacin.

Cobertura del proteoma

Ms de 650 protenas mitocondriales identificadas con los primeros 5 millones de espectros. La mayor parte de las protenas restantes identificadas en los siguientes 10 millones de espectros.

Clasificacin funcional

En base a las funciones conocidas o predichas de las proteinas mitocondriales, diferentes clases funcionales:

Slo un 14% de las protenas actuan directamente en el metabolismo energtico: Maquinaria de fosforilacin oxidativa Ciclo del cido tricarboxlico Piruvato deshidrogenasa Un 25% de las protenas implicadas en el mantenimiento y la expresin del genoma mitocondrial. El 25% de la protenas identificadas tiene una funcin desconocida.

Clasificacin funcional

Perspectivas
La base de datos del proteoma mitocondrial de S. cerevisiae representa una fuente global para estudios de: Caracterizacin de nuevas funciones mitocondriales. Caracterizacin de nuevas funciones asociadas a la mitocondria. Rutas de sealizacin. Sistemas proteolticos. Identificacin molecular de las bases de las enfermedades mitocondriales.