Centro Andaluz de Biología del Desarrollo
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS
Universidad Pablo de Olavide
Sevilla
ELECTROFORESIS:
CONCEPTOS BÁSICOS
DEFINICIÓN: 1. MIGRACIÓN DE SUSTANCIAS POR LA ACCIÓN
DE UN CAMPO ELÉCTRICO.
2. TÉCNICA QUE APLICA ESTE FENÓMENO.
ELECTROFORESIS
Reglilla Mnemotécnica:
-
CÁTODO
+
ÁNODO
NEGro – NEGativo
BLACK CAT (Gato Negro)
Negro - Cátodo
CELDA/PILA ELECTROLÍTICA
ELECTROFORESIS:
CONCEPTOS BÁSICOS
¡OJO, NO CONFUDIR!
ELECTROFORESIS GALVANOMETRÍA
-
CÁTODO
+ÁNODO
-
ÁNODO
+
CÁTODO
Hacia donde se desplazan los Donde tiene lugar una reacción de
CATIONES ANIONES OXIDACIÓN REDUCCIÓN
CELDA/PILA ELECTROLÍTICA CELDA/PILA GALVÁNICA
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS:
MÉTODOS ELECTROFORÉTICOS
• ELECTROFORESIS CAPILAR
• ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
• NO DESNATURALIZANTE
• SDS-PAGE (Desnaturalizante)
• ISOELECTROENFOQUE
• 2D-ELECTROFORESIS
• ELECTROFORESIS EN PAPEL
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
• La acrilamida polimeriza
Metilen-bis-acrilamida
por la acción del TEMED
(catalizador) y el persulfato
amónico (PSA - iniciador)
Acrilamida
• La metilen-bis-acrilamida
forma enlaces cruzados
Polimerización entre los polímeros de
Neurotóxica (TEMED, PSA) acrilamida
• En conjunto se forma una
Poliacrilamida especie de malla cuyo
(NO neurotóxica) diámetro de poro viene
determinado por la
Enlace bis-acrilamida concentración de acrila-
mida/bis-acrilamida
Tamaño del Poro del Gel de Acrilamida
A mayor %T, menor tamaño
de poro, y viceversa
20% T A+B=20 B/20=0.05 B=1
B/(A+B)=0.05 A=19
5% C
Acrilamida:Bis-acrilamida=19:1
Se ha observado que para cualquier %T, el 5% C, es el que da
lugar a los tamaños de poro más pequeños.
Valores de %C mayores o menores originan poros más grandes
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
Gel “Stacking” (Empaquetador)
Gel “Stacking” • Menor concentración de acrilamida
• Tamaño de poro mayor
• pH ácido-neutro
Gel “Separating” Función: acumular las proteínas a la entra-
da del gel separador para que
salgan al mismo tiempo
(“Salida Neutralizada”)
Gel “Separating” (Separador)
• Mayor concentración de acrilamida
• Tamaño de poro menor
• pH alcalino
Función: separar las proteínas
Polimerización del Gel de Acrilamida
CH3 CH3
N CH2 CH2 N (NH4)2S2O8
CH3 CH3
TEMED PSA
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine Persulfato Amónico
TEMED Inicia la reacción de
S2O82– + e– SO42– + SO42–•
Polimerización
Polimerización del Gel de Acrilamida
También se puede utilizar la RIBOFLAVINA y luz UV de onda larga
(lámpara fluorescente) para iniciar la reacción de polimerización.
Este procedimiento se utiliza cuando:
• Se requiere una fuerza iónica del gel muy baja
• Nuestra muestra es sensible al PSA o a productos derivados de
la polimerización iniciada por peróxido
• Necesitamos más tiempo para cargar el gel, por ejemplo si
queremos hacer un gradiente continuo de acrilamida, evitando
así que polimerice el gel antes de tiempo o que lo haga
irregularmente
Polimerización del Gel de Acrilamida
• Es sensible al oxígeno, se inhibe
Cubrir el “gel” con agua o
n-butanol durante la
polimerización previene el
contacto con el oxígeno, así
como la formación de menisco
• Es un proceso exotérmico. Puede dar lugar a corrientes de
convección durante la polimerización y crear irregularidades
en el tamaño de los poros del gel, sobretodo a altas
concentraciones de acrilamida (no suele ser un problema para
geles con <15% T)
Se debe ajustar la cantidad de TEMED y PSA para que la
polimerización no tenga lugar demasiado deprisa, generando así
demasiado calor
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
EMPAQUETAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS
Tampón Tris-Glicina, pH 8.3
+ proteínas
Gel “Stacking” Tampón Tris-HCl, pH 6.7-6.8
Gel “Separating” Tampón Tris-HCl, pH 8.8-8.9
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
EMPAQUETAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS
A pH 6.7-6.8:
La glicina está parcialmente
disociada. Se crea una zona
de baja conductividad y, por
Gly- Gly- Gly- Gly- tanto, de elevado voltaje
Se origina una gran dife-
rencia de potencial en un
Cl- Cl- Cl- Cl- espacio muy reducido
Los iones cloruro se desplazan
a mayor velocidad y crean una
Gel “Separating” zona de alta conductividad y,
por tanto, de bajo voltaje
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA
EMPAQUETAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS
A pH 6.7-6.8:
La glicina está parcialmente
disociada. Se crea una zona
de baja conductividad y, por
Gly- Gly- Gly- Gly- tanto, de elevado voltaje
Las proteínas se mueven a
mayor velocidad que la glicina
pero a menor que los iones
cloruro, quedando así empa-
Cl- Cl- Cl- Cl- quetadas entre ambos iones
Los iones cloruro se desplazan
a mayor velocidad y crean una
Gel “Separating” zona de alta conductividad y,
por tanto, de bajo voltaje
ELECTROFORESIS: PARÁMETROS ELÉCTRICOS
Ley de Ohm
1 L
V=I R V=I
k A
L 1 L
R=r R=
A k A
1
r=
k
V, voltaje (Voltio, V)
I, intensidad de corriente (Amperio, A)
R, resistencia (Ohmio, W)
L, longitud (m)
A, área de la sección (m2)
r, resistividad (W m) – característica de un determinado material
k, conductividad (W-1 m-1) – característica de un determinado material
ELECTROFORESIS: PARÁMETROS ELÉCTRICOS
Potencia
Relacionada con el calor generado en un circuito eléctrico
P=V I
V2
P = I2 R ó P=
R
V=I R
P, potencia (Watio, W) – también denominado “Julio-Calor” (Joule heat)
q
P=
s
q, calor (Julio, J)
s, tiempo (segundo)
En los equipos de electroforesis podemos fijar constante uno de los
siguientes parámetros: intensidad de corriente, voltaje o potencia
La Resistencia, sin embargo, varía en el transcurso de la misma,
generándose más o menos calor
V=I R
P=V I
La elección de un determinado modo operativo dependerá de:
• el tiempo que durará la electroforesis
• la necesidad de minimizar la difusión lateral y la pérdida de
actividad de la muestra debido al calor o al tiempo transcurrido
• la necesidad de mantener una temperatura determinada
La generación de calor puede crear deformidades en el gel.
Típicamente el gel se comba, es decir, las muestras del centro
se desplazan más que la de los laterales ya que en éstos
la temperatura es menor debido a una mayor disipación de calor
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA:
NO DESNATURALIZANTE
LAS PROTEÍNAS SE SEPARAN POR:
Puesto que utilizamos unas
• CARGA ELÉCTRICA
condiciones de pH alcalinas,
la mayoría de las proteínas
• TAMAÑO y FORMA van a estar
CARGADAS NEGATIVAMENTE
pI
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA:
NO DESNATURALIZANTE
AL APLICAR UN CAMPO ELÉCTRICO LAS PROTEÍNAS MIGRARÁN
-
CÁTODO
+
ÁNODO
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA:
NO DESNATURALIZANTE
AL APLICAR UN CAMPO ELÉCTRICO LAS PROTEÍNAS MIGRARÁN
-
CÁTODO
CUIDADO
NO CONFUNDIR CON
ELECTROFORESIS CAPILAR
+
QUE EL SENTIDO DE MIGRACIÓN
ES EL CONTRARIO
ÁNODO
MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA
v q
m= =
E 6prh
m movilidad electroforética
v velocidad del ión A mayor carga, mayor movilidad
E campo eléctrico
A mayor tamaño, menor movilidad
q carga del ión
r radio del ión
h viscosidad del medio
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA:
NO DESNATURALIZANTE
¿QUIÉN LLEGARÁ ANTES A LA META?
-
PREPARADOS..., LISTOS..., ¡YA!
– = =
CÁTODO
=
+
ÁNODO
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA:
NO DESNATURALIZANTE
*A IGUAL TAMAÑO *AIGUAL CARGA
MIGRA MÁS MIGRA MÁS
-
LA MÁS CARGADA LA DE MENOR TAMAÑO
CÁTODO
–
=
+
= =
*NOTA: A igualdad de forma, ya que las proteínas
globulares migran más que las filamentosas,
ÁNODO a igualdad de tamaño y carga
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA NO DESNATURALIZANTE
A2
PROTEÍNA A:
S
• DIMÉRICA
S • DÍMEROS (A1, A2) UNIDOS
POR PUENTES DISULFURO (–S–S–)
A1 • A1 60 kDa
• A2 20 kDa
B
PROTEÍNA B:
• MONOMÉRICA 40 kDa
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA NO DESNATURALIZANTE
LAS PROTEÍNAS MULTIMÉRICAS
MIGRAN FORMANDO UNA UNIDAD
-
CÁTODO A B
80 kDa
+
40 kDa
ÁNODO
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS EN GEL DE
POLIACRILAMIDA NO DESNATURALIZANTE
VENTAJAS
• SEPARA PROTEÍNAS EN ESTADO NATIVO
• LAS PROTEÍNAS SIGUEN SIENDO FUNCIONALES
• PERMITE SEPARAR COMPLEJOS PROTEICOS
O PROTEÍNAS MULTIMÉRICAS COMO UNA UNIDAD
INCONVENIENTES
• MUCHAS PROTEÍNAS NO MIGRAN POR NO TENER CARGA NETA O
SE PIERDEN POR POSEER CARGA NETA POSITIVA
• EL PROCESO DE SEPARACIÓN ES MUY LENTO DEBIDO A LA
DEBILIDAD DE LA CARGA NETA DE LAS PROTEÍNAS
• EL PROCESO DE SEPARACIÓN NO SÓLO ESTÁ AFECTADO POR EL
TAMAÑO SINO TAMBIÉN POR LA FORMA DE LA PROTEÍNA
SDS-PAGE
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
SE LLEVA A CABO EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES:
1. SE EMPLEA UN AGENTE REDUCTOR DE PUENTES –S–S–
generalmente DTT (DiTioTreitol) o b-mercaptoetanol
2. SE EMPLEA EL DETERGENTE ANIÓNICO SDS
(Sodium Dodecyl Sulfate)
3. GENERALMENTE TAMBIÉN SE CALIENTA LA MUESTRA
SDS-PAGE
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
SE LLEVA A CABO EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES:
1. SE EMPLEA UN AGENTE REDUCTOR DE PUENTES –S–S–
generalmente DTT (DiTioTreitol) o b-mercaptoetanol
2. SE EMPLEA EL DETERGENTE ANIÓNICO SDS
(Sodium Dodecyl Sulfate)
3. GENERALMENTE TAMBIÉN SE CALIENTA LA MUESTRA
SDS-PAGE
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
El b-mercaptoetanol va a “romper” los enlaces –S–S– tanto
inter- como intramoleculares mediante una reacción redox
(El DTT reduce los puentes disulfuro)
A2
DTT HS
S
S +
SH
A1
A1 A2
El b-mercaptoetanol actúa de forma similar que el DTT
SDS-PAGE
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
El SDS se va unir a las proteínas dotándolas de una alta carga
eléctrica negativa, la cual por repulsión va a provocar el
desplegamiento de las mismas
SDS O
HS O-
H3C S Na+
O O
+
10
SH
A1 A2
A1 A2
HS
– – – – – – – – – – – – – – – –– – – –– –– – – – –
– ––
– – – –– – – –– – – –
– – ––– – – – – – – – – –SH
La cantidad de SDS unido a la proteína es proporcional a su
tamaño, de tal forma que la relación carga/tamaño de todas las
proteínas va a ser aproximadamente la misma
SDS-PAGE
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
LAS PROTEÍNAS SE SEPARAN POR:
• TAMAÑO
LAS PROTEÍNAS MULTIMÉRICAS
MIGRAN SEPARÁNDOSE EN SUS
-
RESPECTIVOS MONÓMEROS
A B
CÁTODO
A1 60 kDa
+
40 kDa
A2 20 kDa
ÁNODO
SDS-PAGE
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
Las proteínas de menor tamaño
-
migran mayor distancia en el gel
YA QUE OFRECEN MENOR RESISTENCIA
AL PASO POR EL MISMO
CÁTODO
Esta relación, sin embargo, no es lineal
El tamaño de poro creado en el gel
determina que a partir de cierto tamaño
+
de proteína éstas no avance o lo hagan
con mucha dificultad
ÁNODO
SDS-PAGE
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
Si dejamos más tiempo transcurrir
la electroforesis también migrarán
más las proteínas que se desplazan
por el gel
También en un mismo gel unas “calles”
pueden “correr” más que otras
Recordad el fenómeno de combamiento
¿CÓMO PODREMOS DETERMINAR
EL TAMAÑO DE UNA PROTEÍNA
INDEPENDIENTEMENTE DEL
TIEMPO TRANSCURRIDO
O DEL COMBAMIENTO DEL GEL?
LA MISMA
MUESTRA
SDS-PAGE
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
¿CÓMO PODREMOS DETERMINAR EL TAMAÑO DE UNA
PROTEÍNA INDEPENDIENTEMENTE DEL TIEMPO
TRANSCURRIDO O DEL COMBAMIENTO DEL GEL?
NECESITAMOS:
1. UN SISTEMA DE REFERENCIA
(Marcadores de Peso Molecular)
2. UN SISTEMA DE NORMALIZACIÓN
(Movilidad Relativa, Rf)
Distancia migrada por la proteína
Rf=
Distancia migrada por el frente
SDS-PAGE
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
Distancia migrada por la proteína
Rf=
Distancia migrada por el frente
Distancia migrada Distancia migrada por el frente
por la proteína (alternativamente, también se puede
utilizar un estándar interno de bajo
peso molecular, o incluso el final del gel)
0 Rf 1
Actualmente estos cálculos
se incluyen en los modernos
analizadores de imágenes
para geles de electroforesis
SDS-PAGE
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR
-
CÁTODO
4%
+
ÁNODO
14%
Para que se separen las proteínas de alto peso
molecular, debemos prolongar el tiempo de electroforesis.
Pero en ese caso se perderían aquellas de menor tamaño
El uso de gradientes de concentración de poliacrilamida
permite una mayor resolución en un
rango de peso moleculares más amplio
En un gradiente de % de
-
acrilamida podemos
prolongar la electroforesis
4% para separar las de mayor
8% tamaño.
CÁTODO Las de menor tamaño no se
pierden ya que cada vez
encuentran mayor
resistencia a su paso
+
ÁNODO
14%
20%
Para que se separen las proteínas de alto peso
molecular, debemos prolongar el tiempo de electroforesis.
Pero en ese caso se perderían aquellas de menor tamaño
SDS-PAGE
PolyAcrylamide Gel Electrophoresis
VENTAJAS
• SEPARACIÓN RÁPIDA DE LAS PROTEÍNAS
• LA SEPARACIÓN NO DEPENDE DE LA FORMA DE LA PROTEÍNA
NATIVA
• SE PUEDE ESTIMAR EL PESO MOLECULAR DE LAS PROTEÍNAS
• AUNQUE DESNATURALIZADAS, LAS PROTEÍNAS PUEDEN USARSE
PARA LA FABRICACIÓN DE ANTICUERPOS (en la mayoría de los casos)
INCONVENIENTES
• LAS PROTEÍNAS SEPARADAS ESTÁN DESNATURALIZADAS
• NO SON FUNCIONALES
SDS-PAGE
NO DESNATURALIZANTE (DESNATURALIZANTE)
-
vs.
CÁTODO
80 kDa
A1 60 kDa
A = A1+A2
+
40 kDa B 40 kDa B
A2 20 kDa
ÁNODO
Bibliografía:
• Protein Electroforesis. Technical Manual. Ed. Amersham Biosciences
• Electrophoresis in Practice (3ª edición)
Reiner Westermeier. Ed. Wiley-VCH (2001)
• Molecular Biology of the Cell (4ª edición)
Alberts et al. Ed. Garland Science.
