TEMA 4 DE INMUNODIAGNÓSTICO
1.Las técnicas basadas en reacciones antígeno anticuerpo primarias. Clasificación de
inmunoensayos.
Las reacciones antígeno anticuerpo primarias no producen manifestaciones
visibles que permitan evidenciar sus resultados positivos, por lo que se necesitan sistemas
adicionales de revelado.
Se necesitan marcadores, moléculas que actúan uniéndose al antígeno o al
anticuerpo complementario al que se desea determinar, sin alterar su capacidad
de unirse al anticuerpo o al antígeno de la muestra.
Estos marcadores tienen que poderse detectar y medir con
facilidad.
Para ello se utilizan sistemas de amplificación de señales que muestran los resultados de la
reacción.
Según las características de la molécula acoplada se aplican distintos tipos de
técnicas: enzimoinmunoensayos, inmunocromatografía, radioinmunoensayos,
fluoroinmunoensayos…
En los enzimoinmunoensayos el marcador es una enzima. Para detectarla y
medirla se adiciona un sustrato sensible a ella; la reacción que se producirá
tendrá efectos detectables y medibles.
Estas enzimas generalmente son colorimétricas, cambian el color del
sustrato cuando se produce el inmunocomplejo.
En la inmunocromatografía, el marcador son nanopartículas coloreadas, principalmente
metales pesados. Se consiguen test en soporte sólido, de fácil manejo y donde se observan
líneas coloreadas de precipitación.
En los fluoroinmunoensayos los marcadores son moléculas de un fluorocromo, se utiliza la
propiedad que tienen algunas sustancias para emitir fluorescencia si son excitadas con luz
radiante.
Cada fluorocromo tiene un espectro de emisión y de excitación característico,
por lo que se puede medir.
En los radioinmunoensayos, el marcador es un isótopo radiactivo.
Se utiliza una cantidad concreta de un Ag marcado con un isótopo radiactivo para
determinar éste en la reacción con el Ac.
Estas técnicas son peligrosas, por el empleo de isótopos, y se necesitan instalaciones
adecuadas para su uso.
Clasificación de inmunoensayos: Competivos y no competitivos.
COMPETITIVO:
para determinar un Ag en una muestra problema, se añade el Ac correspondiente, y una
cantidad determinada del mismo Ag marcado (patrón).
Después se mide la cantidad de Ag marcado que no se ha conjugado, A menor cantidad de
Ag marcado no conjugado medido, mayor cantidad de Ag marcado se habrá conjugado y
menor cantidad de Ag presente en la muestra problema.
También se puede hacer si queremos conocer la concentración de Ac.
El Ag de la muestra y el Ag marcado competirán por los anticuerpos.
NO COMPETITIVO:
para determinar un Ag en una muestra problema, se añade una Ac marcado. Cuanto mayor
sea la cantidad de Ag presente, más anticuerpos marcados se unirán a él.
La cantidad de Ac marcado que ha formado inmunocomplejos es directamente proporcional
a la concentración de Ag presente en la muestra problema.
También se puede aplicar el mismo principio para determinar un Ac.
HETEROGENEO:
requieren la separación de los inmunocomplejos y las moléculas no conjugadas.
Normalmente el reactivo es de fase sólida y a él se fijan los complejos; la separación de las
moléculas no conjugadas se suele realizar mediante lavados.
Permiten determinar sustancias de alto peso molecular.
HOMOGENEO:
No requieren la separación de las moléculas sobrantes.
Son técnicas más rápidas y fáciles de realizar.
No necesitan una fase sólida. Se basan en la inhibición o activación de una reacción
enzimática por parte del complejo Ag – Ac.
Utilizadas para determinar sustancias de bajo peso molecular y de concentración
relativamente elevada (drogas).
Los resultados de los inmunoensayos se pueden obtener por dos medios:
1. EXPRESANDO EL VALOR MEDIO MEDIANTE UN FORMATO NORMALIZADO
Son ensayos protocolizados donde están establecidos los criterios de obtención e
interpretación de resultados.
2. OBTENIENDO EL RESULTADO POR EXTRAPOLACIÓN EN 1 CURVA PATRON
Se elabora una curva patrón de referencia utilizando sueros control (calibradores); el
resultado de la muestra se obtiene por extrapolación del resultado obtenido en la curva.
Representación de datos y obtención de resultados:
Los inmunoensayos comerciales incluyen calibradores preparados (soluciones con valores
conocidos que establecen la relación entre la cantidad de señal producida en el ensayo y la
concentración de analito.)
En sistemas automatizados, el software genera una curva de calibración, a partir de datos
captados directamente por el sistema o a partir de datos introducidos manualmente.
Los resultados de cada laboratorio deben ser comparables a los de otros para que se
puedan compartir resultados o elaborar estudios conjuntos.
Es necesaria una normalización
ENZIMOINMUNOENSAYOS
EMIT (homogeneo) ¿AG? DIBUJO DE PILAR
Utilizan una enzima conjugada como marcador en una reacción enzima – sustrato.
Se puede determinar la cantidad de interacción entre el analito (lo que buscamso) y el
anticuerpo o el antígeno complementario utilizando un marcador enzimático.
Existen analizadores espectrofotométricos para la determinación de drogas de abuso
drogas terapéuticas o inmunosupresores y de ciertas proteínas en el suero y en la orina.
El analito suele ser un antígeno. La reacción inmunológica se da en un medio líquido y es
un ensayo homogéneo.
Es una reacción de enlace competitivo entre el Ag de la muestra y el mismo Ag marcado
con una enzima:
▪ Cuando el Ag marcado forma un inmunocomplejo, la enzima que lleva unida se inactiva
debido al cambio de configuración.
▪ Cuando el Ag marcado no se combina, la enzima se mantiene activa y reacciona con su
sustrato, generando un producto coloreado.
Si en la muestra hay poca cantidad de analito, muchos Ag marcados podrán formar
inmunocomplejos, lo que inactivará las moléculas de enzima.
Y a la inversa, si hay mucha cantidad de analito en la muestra, serán pocos los antígenos
marcados.
PROCEDIMIENTO BÁSICO DEL EMIT:
1. Se mezcla una muestra sospechosa de contener la sustancia de interés (Ag) con una
solución que contiene una concentración conocida de anticuerpo y el sustrato de la enzima.
2. Dejarlo el tiempo que corresponda para permitir la formación de los inmunocomplejos.
3. Añadir el Ag marcado con la enzima en una concentración conocida.
4. Medir la velocidad de aparición de color.
5. Determinar la concentración de Ag problema mediante la comparación de la tasa
observada con las tasas producidas por concentraciones conocidas de antígeno patrón.
ELISAS ESTÁN EN LOS DIBUJOS DE PILAR
FLUOROINMUNOENSAYOS
TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA
En ellas el conjugado fluorescente son sustancias fluorescentes acopladas a un Ag o a un
anti-anticuerpo.
Los Ag utilizados son formes o particulados (cortes de tejidos, bacterias, parásitos o partes
de los mismos).
2 modalidades:
-Inmunofluorescencia directa (FID)
-Inmunofluorescencia indirecta (IFI)
LA INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (FID)
Se añade la solución de Ac fluoresceinado sobre el Ag, que se ha fijado previamente sobre
un portaobjetos o placa, se incuba y se lava y se leen
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
El Ac o suero problema se aplica sobre el Ag, se lava y luego se añade un anti-anticuerpo
fluoresceinado contra las inmunoglobulinas
TECNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA
Se necesita:
▪ una iluminación intensa y de longitud de onda corta (lámpara de luz ultravioleta) y,
▪ filtros que permitan el paso de luz de una determinada longitud de onda (rango y color
necesario para excitar el fluorocromo), y que bloqueen las longitudes no deseadas.
A través de los oculares se observa el campo oscuro, mientras que las áreas con Acs
fijados presentan fluorescencia verde.
El patrón de fluorescencia es específico para cada Ag, por lo que permite su identificación.
TECNICAS DE FLUOROENZIMOINMUNOENSAYOS (FEIA)
-Detectada por un fluorimetro
-Hay dos tipos
RADIOINMUNOENSAYOS
Se puede determinar la concentración del Ag en muestras complejas de fluidos biológicos
con suficiente sensibilidad y especificidad si el trazador es altamente radiactivo
(concentraciones infinitesimales).
Esta técnica clásica se usa para la detección de hormonas.
Se siguen utilizando en la actualidad para la detección de analitos de muy baja
concentración.
Las complicaciones mismas de la técnica y el problema para desechar los materiales
radiactivos hace que se dejen de utilizar frente a los enzimoinmunoensayos.
INMUNOCROMATOGRAFIAS
es una prueba de un solo paso o test rápido en la que se usa como marcador
nanopartículas coloreadas que pueden ser metales pesados (oro genera bandas rosas y
selenio color azul)
La reacción sirve para detectar antígenos o anticuerpos en una muestra problema y se lleva
a cabo sobre una tira de nitrocelulosa. Estas técnicas inmunocromatográficas se usan con
frecuencia porque es sencillo manejarlas e interpretar sus resultados.
En la tira de nitrocelulosa hay cinco zonas:
1. Zona de siembra de la muestra.
2. Zona del conjugado.
3. Zona de detección.
4. Zona de control.
5. Región absorbente
Procedimiento:
1. Colocar la muestra con el Ag o Ac a analizar en la zona de siembra de la tira.
2. Dejar que la muestra fluya por capilaridad:
-Llega a la zona de conjugado: se encuentra inmovilizado el conjugado (Ac específico
marcado si se busca Ag, o Ag específico marcado si se busca Ac). Se formarán
inmunocomplejos si en la muestra hay el analito que se busca.
-Los inmunocomplejos formados siguen migrando por la tira de nitrocelulosa hasta la zona
de detección: se hallan fijados Ac específicos contra otro epítopo del Ag en estudio, o con
un Ac antiinmunoglobulinas de los Ac que se buscan.
-Los inmunocomplejos quedan fijados a estos complejos triples formando una banda
coloreada, rosa o azul, dependiendo del conjugado
3. La muestra sigue fluyendo por capilaridad hasta la zona de control.
4. El exceso de conjugado será capturado por un Ac anticonjugado o por un Ag marcado y
se formará una banda coloreada indicando que la prueba se ha realizado correctamente.
