Universidad Mariano Gálvez de Guatemala

Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud Medicina

Veterinaria
Microbiología I

PRÁCTICA No. 8
PRUEBAS BIOQUÍMICAS GRAM NEGATIVOS

COMPETENCIA

Conoce las características bioquímicas de las bacterias Gram negativas y las relaciona con
el diagnóstico a nivel de laboratorio.

INTRODUCCIÓN

El estudio de las reacciones bioquímicas de las bacterias es sumamente importante ya que

permiten identificar a los grupos bacterianos a través de su actividad metabólica. Las
pruebas bioquímicas ponen de manifiesto las reacciones metabólicas de los
microorganismos, incluyendo: su acción fermentativa sobre diferentes azúcares, las
propiedades proteolíticas y amilolíticas, reducción de colorantes, la utilización de ciertas
sales y la hidrolisis de la urea; también se puede evaluar la capacidad de crecimiento en
presencia de oxígeno y su motilidad.

A través de las pruebas bioquímicas se puede llegar de forma rápida y sencilla a un

diagnóstico certero del género y la especie de los organismos que se estudian en el
laboratorio.

Las Enterobacterias son bacterias que se recuperan con mayor frecuencia de muestras
clínicas y están implicadas en casi cualquier tipo de enfermedad infecciosa; y pueden
recuperarse de cualquier muestra recibida en el laboratorio. Son bacilos gramnegativos, que
se caracterizan por fermentar la glucosa, la citocromo oxidasa es negativa y reducen los
nitratos a nitritos. Crecen muy bien en medios de cultivos simples y en agar sangre forman
colonias relativamente grandes, gris-mate, secas o mucoides. La hemólisis en agar sangre
es variable y no es característica. Deben utilizarse medios de cultivo selectivo para aislar las
especies más importantes. Los medios diferenciales selectivos para la recuperación de
enterobacterias son el agar Mac Conkey y Agar Eosina Azul de Metileno (EMB). Son medios
capaces de seleccionar ciertos grupos de bacterias gramnegativas y además permiten la
identificación preliminar de ciertas características metabólicas y bioquímicas. Son solamente
moderadamente inhibidores, inhiben el desarrollo de casi todas las especies de
microorganismos Grampositivos y permiten el desarrollo de casi todas las Enterobacterias y
otros bacilos Gramnegativos. Tiene la capacidad de diferenciar microorganismos que utilizan
la lactosa de los que no la utilizan.

La identificación de las especies requiere la determinación de características metabólicas

que reflejan el código genético y la identidad única del organismo en estudio. Se dispone de
una gran variedad de pruebas diferenciales y de numerosos esquemas para la identificación
final de especies de enterobacterias.

Las pruebas utilizadas ampliamente en los laboratorios clínicos incluyen la siguiente serie:
 • Utilización de hidratos de carbono
• Actividad de o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG)
• Producción de indol
• Rojo de metilo
• Producción de acetoína ( Voges Proskauer )
• Utilización de citrato
• Producción de ureasa
• Descarboxilación de la lisina, ornitina y arginina
• Producción de fenilalanina desaminasa
• Producción de gas sulfuro de hidrógeno
• Movilidad

Para la determinación de estas pruebas bioquímicas se pueden utilizar medios únicos o

simples (demuestran una determinada característica del microorganismo), medios múltiples o
combinados (destacan varias características en forma simultánea). En la práctica se utilizan
preferentemente medios combinados, los más utilizados para la identificación de
Enterobacterias son: agar hierro triple azúcar (TSI), Agar hierro lisina (LIA), Agar citrato de
Simmons, Medio MIO (movilidad-indol-ornitina), Caldo Urea.

MATERIALES

• Cepa bacteriana Gram negativa

• Tubos con hierro triple azúcar (TSI), hierro lisina (LIA), movilidad-ornitina-indol (MIO),
citrato y urea
• Asa de nicromo en punta
• Incubadora microbiológica

PROCEDIMIENTO

Inoculación de la batería de pruebas bioquímicas:

• Con un asa en punta tomar una de las colonias a identificar, únicamente tocando su
superficie.
• Tomar el tubo identificado como TSI y pinchar el medio en el centro y hasta el fondo,
a manera de tocar exactamente el centro del fondo del tubo, retirar el asa sin salir del
tubo y hacer un estriado rápido y parejo en la superficie inclinada.
• Sin flamear y con la misma asa tomar el tubo identificado como LIA. Inocularlo
pinchando tres veces hasta el fondo y luego estriar su superficie.
• Sin flamear y con la misma asa tomar el tubo identificado como MIO. Inocularlo
pinchando una vez al medio del medio sin tocar el fondo del tubo. Se puede cargar
nuevamente el asa con la misma colonia.
• Sin flamear y con la misma asa tomar el tubo identificado como CITRATO. Inocularlo
estriando la superficie del mismo.
• Sin flamear y con la misma asa tomar el tubo identificado como UREA. Inocularlo
estriando la superficie del mismo.
• Incubar a 37°C durante 18 a 24 horas. Dejar los tapones ligeramente flojos para
permitir la entrada de oxígeno.
 Interpretar la batería de acuerdo con las siguientes tablas:

Medio A Ácido K Alcalino R Rojo N Neutro Gas + a +++ H2S + a +++

Burbujas o
TSI Rojo Amarillo Rojo No aplica No aplica ruptura del Negro
agar
Burbujas o
Superficie Entre amarillo
LIA Morado Amarillo Violeta ruptura del Negro
roja y violeta
agar

Medio Resultado
MIO Lila Movilidad positiva: Crecimiento difuso en el medio.
Movilidad negativa: Crecimiento únicamente en la picadura del agar.
Indol positivo: Halo rojo-rosado después de agregar el reactivo de Kovacs.
Ornitina positiva: Permanece el color original del medio.

UREA Rosado-fucsia: Positivo

Naranja
claro
CITRATO Azul: Positivo
Verde
CUESTIONARIO

1. Explique por qué es importante el medio de cultivo agar MacConkey en el diagnóstico

de bacterias Gram negativas.
2. ¿Por qué se utiliza una sola colonia para realizar la batería de pruebas bioquímicas?
3. Investigue sobre otros tipos de pruebas bioquímicas que completen información para
la identificación de enterobacterias.
4. ¿Cuáles son los principios de las pruebas incluidas dentro de la batería para la
identificación de enterobacterias?
5. ¿De qué forma se puede diferenciar entre las cepas patógenas de Escherichia coli y
las no patógenas?

REFERENCIAS

Cortés, J. A. 2001. “Prueba del citrato.” Recursos didácticos de Biología.

Últimamodificación: 29 de octubre 2002. Accedido el 8 de noviembre del 2005.Disponible
en:http://www.joseacortes.com/microbiologia/pruebasbioq/citrato.htm
Medline Plus. Biblioteca Nacional de medicina EE:UU. y los Institutos Nacionales en
Salud Irritación de Garganta. 10 de oct 2005.
Rohde Paúl (editor). 1,974. Manual de procedimientos de laboratorio. BBL
5ta.Edición. Editores Asociados. S.A. México D.F.
Soria F. 1,978 Manual de bacteriología. Disco. Novena Edición. Gráficas MIRASA.S.
L. Valdemoro, Madrid.
Torres, Miguel. 1999. Manual práctica de bacteriología Médica. 1ra
Edición.Serviprensa C.A. Guatemala, Guatemala.
Universidad de Salamanca. 2004. Aislamiento e identificación de Shigella sp.
Laboratorio de tecnología educativa. Departamento de Microbiología y Genética.