REPÚBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

UNIVERSIDAD DEL ZULIA

FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS
DIVISIÓN DE ESTUDIOS BÁSICOS SECTORIALES
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

Modelado y análisis biofísico-computacional del transcrito hipotético

Nild CRISPR RNA en Xenorhabdus nematophila asociado con la
colonización de nematodos entomopatógenos.

Proyecto de Trabajo de Investigación presentado ante la División de Estudios Básicos

Sectoriales de la Facultad Experimental de Ciencias como requisito parcial para optar
al Título de Licenciado en Biología

AUTORA
Dayrana Carolina Mora Hernández
C.I.25.924.543

TUTOR
MSc. Lenín A. González P.
C.I.19.016.302

Maracaibo, febrero de 2023

Modelado y análisis biofísico-computacional del transcrito hipotético
Nild CRISPR RNA en Xenorhabdus nematophila asociado con la
colonización de nematodos entomopatógenos.

________________________
Dayrana C. Mora H
C.I.25.924.543

Autora
Maracaibo, Estado Zulia
Teléfono: +58 424-7105536
Correo: dayranacmh@gmail.com

____________________
Dr. Lenín A. González P.
C.I.19.016.302

Tutor
Maracaibo, Estado Zulia
Teléfono: +58 4246201133
Correo: lgonzalezpaz@gmail.com

Maracaibo, febrero de 2023

Este jurado aprueba el Proyecto de Trabajo de Investigación titulado Modelado y
análisis biofísico-computacional del transcrito hipotético Nild CRISPR
RNA en Xenorhabdus nematophila asociado con la colonización de
nematodos entomopatógenos, presentado por la Br. Dayrana Carolina Mora
Hernández, portadora de la cédula de identidad número V-25.924.543 como requisito
parcial para optar al Título de Licenciado en Biología.

Observaciones
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________

__________________________ __________________________
Dr. Ysaias José Alvarado Dr. Aleivi Pérez
C.I 7.263.009 C.I. 9.143.151
alvaradoysaias@gmail.com aleiviciencias@gmail.com

_____________________________
Dr. Lenín A. González P.
C.I.19.016.302
Tutor

En Maracaibo, febrero de 2023

 ÍNDICE DE CONTENIDO

RESUMEN 6
ABSTRACT 7
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 8
JUSTIFICACIÓN 10
MARCO TEÓRICO 12
Antecedentes 12
Bases Teóricas 18
1. Generalidades de los nematodos entomopatógenos (NEPs)18
1.1 Biología y ciclo de vida 19
2. Steinernema carpocapse 22
3. Generalidades de simbiontes bacterianos en NEPs 23
4. Xenorhabdus 25
3.1. Xenorhabdus nematophila 25
5. Sistemas CRISPR 26
5.1 Sistemas CRISPR no convencionales 27
OBJETIVO GENERAL 29
OBJETIVOS ESPECÍFICOS 29

MARCO METODOLÓGICO 30

1. Obtención de secuencias aminoacídicas molde 30

2. Análisis de características físicoquímicas de los péptidos 30
3. Construcción de complejos proteína ligando con acoplamiento molecular 31
4. Simulaciones de dinámica molecular (MD) 31
5. Estudio comparativo de las fluctuaciones conformacionales de los complejos
ligando-proteína. 32
MARCO ADMINISTRATIVO 33

VIABILIDAD 34

RESULTADOS ESPERADOS 35

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES 36

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 37
MORA HERNÁNDEZ, DAYRANA CAROLINA. Modelado y análisis biofísico-
computacional del transcrito hipotético Nild CRISPR RNA en Xenorhabdus
nematophila asociado con la colonización de nematodos entomopatógenos.
Universidad del Zulia, Facultad Experimental de Ciencias, Departamento de Biología.
Maracaibo, Venezuela. 2023. 42p.

RESUMEN

Xenorhabdus nematophila es una bacteria que mantiene una relación simbiótica con el
nematodo entomopatógeno Steinernema carpocapse , y que presenta secuencias
CRISPR involucradas en los mecanismos moleculares que median dicha relación. El
comprender cómo ese sistema CRISPR puede o no modular la simbiosis es clave para
aplicar estrategias con la finalidad de optimizar las interacciones de estos organismos
de interés biotecnológico. Se diseñarán péptidos basados en transcritos hipotéticos de
CRISPR RNA del locus NilD encontrado en X. nematophila. Se crearán complejos entre
estos y targets de interés asociados a la colonización de nemátodos mediante
acoplamiento molecular. Los complejos serán sometidos a dinámicas moleculares para
obtener la estructura de mínima energía, a las cuales se les realizarán estudios de
fluctuaciones conformacionales mediante modelos de redes elásticas. Se espera
obtener el transcritos hipotético de NilD CRISPR RNA en Xenorhabdus nematophila
asociado con la colonización de nematodos entomopatógenos.

Palabras clave: simbiosis, CRISPR-Cas, Xenorhabdus nematophila, Steinernema

carpocapse.

Correo: dayranacmh@gmail.com

6
MORA HERNÁNDEZ, DAYRANA CAROLINA. Modelado y análisis biofísico-
computacional del transcrito hipotético Nild CRISPR RNA en Xenorhabdus
nematophila asociado con la colonización de nematodos entomopatógenos.
Universidad del Zulia, Facultad Experimental de Ciencias, Departamento de Biología.
Maracaibo, Venezuela. 2023. 42p.

ABSTRACT

Xenorhabdus nematophila is a species that maintains a symbiotic relationship with the

entomopathogenic nematode Steinernema carpocapse, and It has been found to have
CRISPR sequences involved in the molecular mechanisms that mediate this
relationship. Understanding how this CRISPR system may or may not modulate
symbiosis is key to implement strategies to optimize the interactions of these organisms
of biotechnological interest. Peptides will be designed based on hypothetical CRISPR
RNA transcripts from the NilD locus found in X. nematophila. Complexes between these
and targets of interest associated with nematode colonization will be created by
molecular docking. The complexes will be subjected to molecular dynamics to obtain the
minimum energy structure, to which conformational fluctuations studies will be
performed by means of elastic network models. It is expected to obtain the hypothetical
transcript of NilD CRISPR RNA in Xenorhabdus nematophila associated with the
colonization of entomopathogenic nematodes.

Keywords: symbiosis, CRISPR-Cas, Xenorhabdus nematophila, Steinernema

carpocapse.

e-mail: dayranacmh@gmail.com

7
 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Xenorahbus nematophila es una especie de bacteria Gram-negativa, que

mantiene una relación mutualista con nematodos entomopatógenos del suelo del

género Steinerma (Forst y col., 1996). En conjunto, infectan, matan y se reproducen

dentro de sus insectos hospedadores, muchos de los cuales son considerados plagas

de cultivos importantes (Lio y col., 2000). Esta simbiosis es un modelo natural y

manejable para comprender la ecología, la evolución y los fundamentos moleculares de

las interacciones bacterianas con huéspedes animales, constituyendo pues, un género

de bacterias con importantes implicaciones a nivel ambiental (Forst y col., 1996).

Recientemente, factores como la simbiosis y aquellos relacionados con ciclos

biológicos en microorganismos, se han asociado la presencia de repeticiones

palindrómicas cortas agrupadas y regularmente inter espaciadas (CRISPR, por sus

siglas en inglés), un sistema biológico descubierto como un mecanismo de defensa

inmune especifico y adaptativo presente en bacterias y arqueas (Lyons y col., 2015;

Rodríguez y col., 2017). Estudios encontraron que en la región SR1 (Simbiosis Region

1) del genoma de X. nematophila se encuentra el locus NilD, cuyo gen se detectó en

una matriz CRISPR, necesaria para la colonización de nematodos (Veesenmeyer y col.,

2014. Debido a que este sistema CRISPR cumple una función que va más allá de su

función original como sistema inmunitario de esta bacteria, se clasifica como un sistema

no convencional (Barrangou et al., 2007; Brouns et al., 2008; Carte et al., 2008).

8
 Las matrices CRISPR se transcriben como moléculas de ARN individuales que

luego son procesadas por componentes de moléculas individuales de ARN CRISPR

(crRNA) (Barrangou et al., 2007; Brouns et al., 2008; Carte et al., 2008). De igual forma,

el locus nilD expresa de manera similar un ARN pequeño. El problema de este

descubrimiento en el genoma de X. nematophila es que no lograron obtener mediante

diferentes herramientas moleculares el producto transcrito, la proteína o el péptido que

debería estar codificado en ese sistema CRISPR, si tiene una función de regulación, o

si realmente se trata de un RNA no codificante (Veesenmeyer y col., 2014).

9
 JUSTIFICACIÓN

Xenorhabdus nematophila es una especie de gran importancia puesto que

comprende capacidades de interés en la agricultura y el medio ambiente. Su

aprovechamiento significa una vía sustentable para el control de insectos plaga. X.

Además, los nematodos entomopatógenos (NEPs) se han convertido en especies de

gran interés, ya que podrían establecerse como un importante agente de control

biológico para tratar las plagas de insectos. Esto es gracias a la interacción entre

NEPS, bacterias simbióticas e insectos huéspedes, por lo que es necesaria la

comprensión de estas interacciones (Lio y col., 2000).

Las interacciones especificas entre esta especie de bacteria y sus huéspedes no

se comprenden bien a nivel molecular o genético. La aparición de nuevos patógenos

para humanos a través del amplio rango de hospedantes que existen, hace que sea

necesario comprender la base genética y molecular de la especificidad de estas

asociaciones bacterianas-animales (Forst y col., 1996).

Obteniendo la secuencia de nucleótidos y posteriormente la secuencia

aminoacídica de X. nematophila, podría ser de gran interés construir, simular y modelar

cómo se vería el hipotético péptido o proteína codificada por el gen NilD y poder

estudiar la interacción de ese péptido con todas las demás proteínas que tiene el

nematodo, entre estos están incluidas las del sistema CRISPR y de esta manera

dilucidar si el complejo proceso de simbiosis se encuentra relacionado con un péptido

10
 La biología molecular y estudios in silico podrían contribuir significativamente a

dilucidar genes específicos que actúan en el proceso de la simbiosis (Lio y col., 2000),

la aclaración de los procesos a través de los cuales los nematodos no colonizados se

vuelven persistentemente colonizados por X. nematophila proporcionará una base útil

para proponer y probar hipótesis sobre los mecanismos moleculares que median en las

interacciones bacteria-nematodo (Martens y col., 2003

El comprender cómo ese sistema CRISPR puede o no modular la simbiosis es

clave para aplicar estrategias moleculares con la finalidad de optimizar las interacciones

de estos organismos de interés biotecnológico. Es por ello que, en este trabajo se

pretende analizar diversas variables con enfoques computacionales que puedan ser

clave para obtener más información sobre los mecanismos moleculares de las

interacciones bacteria-animal

11
 MARCO TEÓRICO

Antecedentes

Vivas y col., en el año 2001 realizaron una de las primeras investigaciones

enfocadas en entender cómo es que la proteobacteria gramnegativa X. nematophila

posee relaciones específicas con dos tipos de huéspedes eucariotas (una relación

mutualista específica de especie con el nematodo S. carpocapsae y una relación

patógena con una amplia gama de especies de insectos). Anteriormente se

consideraba que, en muchas de las bacterias gramnegativas, el factor de transcripción

σs controlaba un gen regulador que puede mediar la resistencia al estrés, la

supervivencia o las interacciones del huésped. Este estudio tuvo como objetivo indagar

la posibilidad de que σs pueda mediar las funciones mutualistas y/o patogénicas de X.

nematophila; por lo que aislaron, secuenciaron e interrumpieron el gen rpoS equivalente

a la codificación de σs en X. nematophila

Los resultados arrojaron que el mutante rpoS de X. nematophila es al menos tan

virulento como su progenitor de tipo salvaje y se reproduce tan bien como el tipo salvaje

en insectos. Se encontraron dos vertientes del mutante rpoS; la primera que no logró

colonizar los intestinos de los nematodos y la segunda que no requiere rpoS para la

virulencia, por lo que no quedó claro si X. nematophila requiere rpoS para colonizar o

sobrevivir. Sin embargo, se podría requerir rpoS para regular la expresión de un factor

de interacción específico del huésped o genes necesarios para la resistencia al estrés.

Este trabajo representó la primera caracterización de un gen que afecta la capacidad de

12
X. nematophila para existir dentro de los intestinos de los nematodos y proporcionó

información sobre los procesos que median esta interacción (Vivas y col., 2001).

Posteriormente, un segundo trabajo realizado por Heungens y col. (2002) estuvo

dirigido a caracterizar la base molecular de abundantes proteínas de la membrana

externa (OMP) de X. nematophila y las señales de detección de quórum difusible,

requerida para la virulencia hacia los insectos. En este estudio se agruparon conjuntos

de 95 mutantes marcados con firma de X. nematophila, derivados de un conjunto

preseleccionado de 95 donantes de transposones de Escherichia coli cultivados

conjuntamente con nematodos de S. carpocapsae y posteriormente fueron analizados

para detectar la pérdida de la capacidad de colonizar la progenie IJ, donde se pudieron

detectar que al menos quince mutantes (0,5%) eran reproduciblemente defectuosos en

su capacidad para colonizar los intestinos de los nematodos.

Realizaron comparaciones de las secuencias obtenidas y mostraron que varios

mutantes tenían transposones en el mismo locus, aunque ninguna de las inserciones

estaba en posiciones idénticas dentro de un locus. Con base en esta información,

encontraron tres loci homólogos a genes que codifican proteínas reguladoras conocidas

(rpoS, rpoE, lrp), dos loci parecen codificar enzimas biosintéticas de aminoácidos (aroA

y serC) y el producto de un locus, denominado nilB (localización intestinal de

nematodos), cuyos genes mostraron similitud con proteínas de otras bacterias, en

cambio los tres loci finales de X. nematophila no mostraron homología con genes

conocidos y se denominaron nilA, nilC y nilD, originando el inicio de una gran

13
investigación centrada en los mutantes Nils en la que por primera vez, tenían una

hipótesis alternativa de que el factor que participa en la colonización es un ARN

mensajero transcrito desde la región nilD en lugar de un producto peptídico (Heungens

y col., 2002).

No fue sino hasta el año 2008 que se publicó el siguiente estudio, realizado por

Cowles y col., referente a los genes Nil A, B y C y su capacidad de conferir la

colonización a S. carpocapsae. En este trabajo, utilizaron el genoma de S. carpocapsae

con al menos ocho diferentes especies de Xenorhabdus para conocer la especificidad

de la especie y obtuvieron que Solo el simbionte nativo, X. nematophila, colonizó

nematodos S. carpocapsae, es decir, de todas las especies de Xenorhabdus

examinadas, solo X. nematophila tiene los genes nilA, nilB y nilC. Finalmente, el análisis

de secuencias apoyó la idea de que los genes nils se adquirieron horizontalmente y que

un solo locus genético determina la especificidad del huésped en este mutualismo

bacteria-animal y que la expansión del rango de huéspedes puede ocurrir a través de la

adquisición de un pequeño elemento genético.

Aunque el locus nil no está presente en ninguna otra especie del género

Xenorhabdus examinada, secuencias similares a nilB se encuentra en varios patógenos

con distintas especificidades de rango de huéspedes, incluidos Moraxella catarrhalis,

Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus spp. y Neisseria spp. Con base en

estos resultados, que demuestran que nilB es un determinante de especificidad de

especie en una relación mutualista entre un animal y una bacteria, construyeron la

14
hipótesis los genes de estos patógenos que son similares a nilB también contribuyen al

rango de hospedantes en una manera homóloga (Cowles y col., 2008).

Aunque ya se tenía una idea de los componentes que mediaban el proceso de

colonización, Herbert y col. (2009) aislaron mutantes de X. nematophila defectuosos

para comprender los productos genéticos y los procesos fisiológicos necesarios para la

colonización de nematodos por esta bacteria. Pudieron encontrar el sistema de

señalización de dos componentes CpxRA, un regulador que ayuda a modular las

transiciones entre los nematodos e insectos. el sistema Cpx en otras bacterias puede

detectar parámetros relacionados con la superficie celular, tal como la proximidad a una

superficie, cambios en las condiciones externas o proteínas mal plegadas en el

periplasma. En respuesta a la activación de la quinasa sensora (CpxA) por estas

señales, el regulador de respuesta es CpxR, quien logra regular la expresión de genes

que funcionan en la integridad de la envoltura celular, la motilidad y la quimiotaxis, la

formación de biopelículas, la adherencia y la invasión de las células huésped.

Observaron que cuando se eliminaba el gen cpxR en X. nematophila, la bacteria

era menos efectiva para matar un insecto huésped modelo de Manduca sexta (o

gusano del tabaco) y que además colonizaba nematodos S. carpocapsae en niveles

más bajos que su progenitor de tipo salvaje. Otros tres miembros de CpxR de X.

nematophila eran los genes nilA, nilB y nilC, descritos anteriormente como genes

necesarios para la colonización de nematodos. nilA, nilB y nilC están codificados en el

15
mismo locus, denominado región de simbiosis 1, todas proteínas de membrana.

(Herbert y col., 2009)

En X. nematophila, el sistema Cpx es necesario para la colonización de

nematodos S. carpocapsae y la virulencia en insectos M. sexta ya que impacta en dos

etapas distintas de la colonización de nematodos cuando el mutante cpxR1 no expresa

niveles de tipo salvaje de genes nils: iniciación y crecimiento. Por lo tanto, los defectos

del mutante cpxR1 tanto en la iniciación como en el crecimiento se deben

potencialmente a la expresión insuficiente de los genes nil. Alternativamente, CpxR

puede ser necesario para la adquisición de nutrientes dentro de la vesícula (Herbert y

col., 2009)

Años más tarde, Veesenmeyer y col (2014) publicaron nuevos análisis

bioinformáticos indicando que el locus nilD codifica un único elemento CRISPR

independiente que comprende un espaciador y dos repeticiones que se interrumpe por

la inserción del transposón en la cepa deficiente en colonización nilD6::Tn5. Estos datos

indican que X. nematophila codifica múltiples loci CRISPR y que la interrupción de uno

de estos, nilD, puede inhibir la colonización por nematodos. A partir de entonces, los

estudios bioinformáticos tomaron cabida en el área de la biología molecular para

conocer los sistemas biológicos CRISPR-Cas presente en X. nematophila.

16
 Para obtener más información sobre el contexto cromosómico de nilD e

identificar otros loci CRISPR, se realizaron comparaciones con los diferentes genomas

que habían sido secuenciado de X, nematophila (XnSc 081 y XnSc 800 ) y detectaron

en ambos genomas seis elementos CRISPR codificados aguas abajo de nilD, también

está el gen gloA previamente secuenciado, así como los genes cas y el locus G de

CRISPR (Veesenmeyer y col., 2014).

Los genes cas de X. nematophila incluyen los genes cas1, cas2 y cas3

ampliamente conservados, así como cse1 (casA), cse2 (casB), cas7 (casC), cas5

(casD) y cas6e (casE). Los investigadores creen que cas3 codifica una proteína con

actividad de nucleasa y helicasa necesaria para mediar la degradación de híbridos

crRNA-DNA, mientras que los otros cinco genes codifican componentes del complejo

cascada de ribonucleoproteína necesario para el procesamiento de ARN CRISPR y la

degradación del ADN objetivo (Veesenmeyer y col., 2014).

Este trabajo demostró que nilD codifica un pequeño ARN y que la expresión de

esta molécula es suficiente para rescatar el defecto de colonización de la cepa

nilD6::Tn5. Las predicciones bioinformáticas indicaron que NilD RNA es miembro de la

familia CRISPR RNAy que de acuerdo con las evidencias experimentales realizadas, la

función de colonización y procesamiento de ARN NilD requiere cas6e, que codifica un

homólogo de la endonucleasa compleja en la cascada de procesamiento de ARN

CRISPR de E. coli (Cas6e). Sin embargo, a diferencia de los sistemas CRISPR-Cas de

otras bacterias, la función de ARN NilD no parece requerir la helicasa-nucleasa Cas3,

17
ya que un mutante cas3 no mostró un defecto de colonización. Esto puede indicar que

la función de NilD RNA diverge de la de otros crRNA, y que su requisito en la

colonización no incluye la degradación del objetivo mediada por Cas3 (Veesenmeyer y

col., 2014).

Bases teóricas

1.- Generalidades de los nematodos entomopatógenos (NEPs).

Los nematodos son organismos en forma de gusanos redondos, no

segmentados que tienen diferentes estilos de vida, incluyendo los de vida libre, los

predadores y los parásitos. La biodiversidad de estos organismos es extensa, existen

cerca de 40 familias asociadas con insectos, sin embargo, los nematodos

entomopatógenos (NEPs) pertenecen exclusivamente a dos familias: la

Steinernematidae y la Heterorhabditidae (Fimbres y Flores-Lara, 2016).

La familia Steinernematidae está compuesta por dos géneros, Steinernema y

Neosteinernema (Gozel y Gozel 2016). Neosteinernema contiene sólo una especie

Neosteinernema longicurvicauda y la familia Heterorhabditidae contiene un solo género,

Heterorhabditis Poinar: Los EPN se asocian mutuamente con bacterias de la familia

Enterobacteriaceae; la bacteria que porta Steinernematidae es una especie del género

18
Xenorhabdus, y la que porta Heterorhabditidae es una especie de Photorhabdus.

(Gozel y Gozel, 2016).

Los NEPs, son insectos parásitos letales que normalmente se encuentran en el

suelo y ubican a su huésped en respuesta al dióxido de carbono, la vibración y otras

señales químicas, reaccionando así a los estímulos químicos o detectando la estructura

física del tegumento del insecto infectando muchas especies que se desarrollan en este

hábitat; no afectan plantas ni animales, ni causan efectos nocivos en el ambiente; pue-

den infectar muchas especies de insectos plagas, especialmente lepidópteros,

hemípteros, coleópteros y dípteros. Los nematodos están asociados a una bacteria

simbiótica especie-especifica y se alimentan, desarrollan y reproducen dentro de los

tejidos degradados por sus simbiontes bacterianos (Bustillo, 2014). El término

entomopatógeno el cual es actualmente utilizado se refiere a nematodos que causan la

muerte del insecto por la liberación de una bacteria simbiótica al hemoceloma del

mismo (causando una toxemia/bacteremia) más que por efecto directo del nematodo

(Fimbres y Flores-Lara, 2016).

1.1 Biología y ciclo de vida

Las familias Steinernematids y Heterorhabditids tienen ciclos de vida similares, y la

única diferencia entre los ciclos de vida ocurre en la primera generación (Gozel y Gozel,

2016). Las especies de Steinernema son anfimícticas; es decir, que para la

reproducción requieren la presencia de machos y hembras, mientras que las especies

19
de Heterorhabditis son hermafroditas y pueden reproducirse en ausencia de

congéneres; en la segunda generación la reproducción de ambos géneros de

nematodos es anfimíctica (Gozel y Gozel., 2016).

Los NEPs comprenden cuatro estadios juveniles hasta convertirse en un adulto

de primera generación, estos estadios se les denomina “Juvenil Infectivo (JI)” Los

nematodos se reproducen hasta que el suministro de alimentos se vuelve limitante,

momento en el que se convierten en JI. Con base en los recursos disponibles, una o

más generaciones pueden ocurrir dentro del cadáver huésped, y una gran cantidad de

IJ se liberan al ambiente para infectar a otros insectos huéspedes y continuar con su

ciclo de vida (Gozel y Gozel, 2016).

La tercera etapa juvenil de los EPNs no se alimenta y son más resistentes a las

condiciones ambientales que otros estadios, estos llevan una bacteria mutualista en el

tracto intestinal y típicamente una vez que el nematodo localiza al hospedero, lo penetra

a través de las aberturas naturales como la boca, ano y/o espiráculos y en algunos

casos a través de la cutícula (Bustillo, 2014). Una vez que está en el hemoceloma del

insecto regurgita o defeca la bacteria simbiótica especie-especifica en la hemolinfa del

insecto, estos mudan y pasan al 4to estadio juvenil y después se desarrolla en un

adulto de primera generación, se producen de 1 a 3 generaciones en el cadáver del

insecto y cuando el alimento escasea, o el espacio es limitante la bacteria simbiótica se

reasocia al infectivo juvenil ubicada en una estructura llamada receptáculo, localizado

20
entre el esófago y la porción anterior del intestino y este emerge del cadáver para

buscar un nuevo hospedero en el suelo y repetir el ciclo (Bustillo, 2014).

La bacteria prolifera en el cuerpo del insecto y alcanza altas densidades, en este

punto produce diversos compuestos antimicrobianos que suprimen el crecimiento de

microorganismos antagónicos creando así un ambiente favorable para la reproducción y

desarrollo del nematodo (Gozel y col., 2016). La bacteria también auxilia en la muerte

del insecto y en proveer nutrientes al nematodo. El insecto infectado muere en las

siguientes 48-72 horas y el nematodo se alimenta de la bacteria simbiótica y de los

tejidos del insecto; conforme la infección progresa el tejido del hospedero es consumido

por los nematodos y sus simbiontes (Gozel y col., 2016).

Los insectos mueren principalmente debido a una septicemia y el color del

cuerpo del hospedero ya infectado es indicativo de los pigmentos producidos por el

monocultivo de la bacteria mutualista que está creciendo dentro del cadáver

(Tofangsazie y col., 2012). Los Steinernematidos provocan cadáveres color ocre,

amarillo café, o negro sin luminiscencia en la oscuridad. Por otro lado, los

heterorhabditidos producen cadáveres color rojo, rojo ladrillo, morado-anaranjado con

luminiscencia en la oscuridad (Tofangsazie y col., 2012)

Un NEP efectivo debe evadir o dañar el mecanismo de defensa del insecto,

después de ser infectado, la hemolinfa del hospedero inicia varios mecanismos de

defensa; Inicialmente las células del hospedero resisten la etapa inicial de la bacteria

21
simbionte por un periodo de 3 a 12 horas, pasadas las 24 horas comienza a

reproducirse en los principales órganos del insecto y a causar daño, la bacteria

simbiótica no puede causar la muerte del hospedero por vía oral, ya que actúa sobre la

hemolinfa (Gozel y col., 2016). Existen diferencias en virulencia de la bacteria simbiotica

ya que las diferentes especies de hospederos tienen diferentes reacciones; Las

bacterias simbióticas pueden producir endotoxinas y exotoxinas durante su periodo de

crecimiento, las endotoxinas son polisacáridos de la pared celular, que pueden

estimular la degradación de la hemolinfa del hospedero (Gozel y Gozel, 2016).

2.- Steinernema carpocapse

Steinernema carpocapsae es un nematodo entomopatógeno de amplio espectro

en cuanto a hospedadores se refiere y miembro de la familia Steinernematidae. Es un

gusano parásito redondo que ha desarrollado una simbiosis que mata insectos con

bacterias y mata a sus huéspedes a los pocos días de la infección. El nematodo usa

una estrategia denominada "de emboscada", por esta razón es muy eficaz contra

insectos móviles, libera su simbionte bacteriano junto con una variedad de proteínas en

el huésped después de la infección y, juntos, la bacteria y el nematodo superan la

inmunidad del huésped y en condiciones óptimas tarda un par de horas y mata las

larvas infectadas al cabo de 1-2 días. (De Liñan, 2015)

22
 Como consecuencia, S. carpocapsae se ha adaptado ampliamente para su uso

como agente de control biológico en agricultura y control de plagas. S. carpocapsae se

considera un parásito generalista y se ha utilizado con eficacia para controlar una

variedad de insectos, entre ellos: gusanos tejedores, gusanos cortadores, gusanos

soldados, anilladores, algunos gorgojos y barrenadores de la madera. Esta especie es

un ejemplo de un recolector de "emboscada", que se para sobre su cola en una

posición vertical cerca de la superficie del suelo y se adhiere a los huéspedes que

pasan, incluso es capaz de saltar. S. carpocapsae puede detectar la producción de

dióxido de carbono, lo que convierte a los espiráculos en una puerta de entrada clave a

sus insectos huéspedes. Es más eficaz a temperaturas que oscilan entre 22 y 28 °C (72

y 82 °F) (Tofangsazie y col., 2012).

3- Generalidades de simbiontes bacterianos en NEPs.

Los nematodos nombrados actualmente como steinernematidos fueron

descubiertos por Gotthold Steiner en 1923 al describir Aplectana kraussei, el cual fue

renombrado rápidamente como Steirnernema spp Por el heimintólogo Lauro Pereira

Travassos y no fue sino el zoólogo Prosper Bovien el primero en asociar a los NEPs

con bacterias simbióticas en el año 1937 ,mientras que La relación nematodo/bacteria

fue aludida por el género Achromobacter posteriormente renombrado por Xenorhabdus

en 1979 (Fimbres y Flores-Lara, 2016).

23
 Los NEPs han entablado una relación simbiótica con bacterias pertenecientes a

la familia Enterobacteriaceae y están estrechamente relacionadas con Escherichia coli.

Además, son inofensivas para el ser humano y mueren a temperaturas superiores a los

35 °C (E-nema. 2021). cada especie de nemátodo tiene una asociación específica con

una especie de bacteria, sin embargo, varias especies de nemátodos pueden estar

asociados con la misma bacteria (Akhurst y Boemare, 1990).

Estudios taxonómicos confirman que cada especie de NEP tiene una asociación

natural especifica con una sola especie de Xenorhabdus o Photorhabdus. La cual opera

a 2 niveles: la suplementación de nutrientes esenciales para el nematodo por la bacteria

y la retención de la bacteria dentro del intestino del IJ. El nematodo provee a la bacteria

de protección contra el medio ambiente externo y también le da protección contra la

respuesta inmunológica del hospedero. La contribución de la bacteria en esta

asociación es la de proveer de nutrientes al nematodo ya que un nematodo axénico no

puede reproducirse en un insecto axénico, es decir se necesita de la presencia de

actividad bacteriana para producir condiciones nutricionales adecuadas (Fimbres y

Flores-Lara, 2016). La bacteria simbiótica no puede causar la muerte del hospedero por

vía oral, ya que actúa sobre la hemolinfa produciendo endotoxinas que pueden

estimular la degradación de la hemolinfa del hospedero. (De-Jun y col. 2001; Smits,

1997).

24
4.- Xenorhabdus

Las especies del género Xenorhabdus son enterobacterias Gram negativas

móviles de la familia de las Morganellaceae que forman asociaciones mutualistas con

nematodos entomopatógenos del suelo del género Steinernema y son patógenas para

una amplia gama de insectos (Lio y col., 2000; Chaston y col., 2011).. En los

nematodos, Xenorhabdus. son transportados en una región especializada del intestino,

el receptáculo, de los juveniles infecciosos (IJs) de tercer estadio. Nunca se han aislado

formas de Xenorhabdus de vida libre fuera del hospedador nematodo (Forst y col.,

1997). Después de que el nematodo infecta al insecto, las bacterias se liberan en el

hemocele, donde producen numerosos factores de virulencia que participan en la

supresión de la inmunidad del insecto y matan al hospedador. Las bacterias proliferan a

altos niveles en el cadáver del insecto y producen una variedad de compuestos

antimicrobianos que suprimen el crecimiento de microorganismos antagonistas

(Chaston y col., 2011).

4.1.- Xenorhabdus nematophila

Esta especie se utiliza como modelo para estudiar las interacciones

microorganismo-huésped y las similitudes y diferencias que subyacen a estas simbiosis.

X. nematophila puede sobrevivir y causar enfermedades dentro de los insectos al

suprimir la inmunidad celular y humoral de estos, así como suprimir la transcripción de

genes de insectos que codifican péptidos antimicrobianos. X. nematophila también mata

las células sanguíneas de los insectos (hemocitos) y tiene una amplia gama de factores

25
de virulencia, incluidas toxinas, hemolisinas, proteasas, lipasas y fimbrias (Herbert y

col., 2007).

5.-Sistemas CRISPR-Cas

Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas

(CRISPR, por sus siglas en inglés) se han descrito en una amplia gama de arqueas y

bacterias. Están compuesta por diversos elementos, entre los que podemos destacar:

los espaciadores, las repeticiones directas, y los genes Cas (CRISPR-associated). Los

espaciadores son secuencias únicas de 20 a 70 pb de longitud, cuyo origen reconocido

es en su mayoría de plásmidos o ADN viral. Los espaciadores se encuentran separados

por secuencias repetidas de 24 a 47 pb de longitud denominadas repeticiones directas.

Los genes Cas se encuentran a menudo en grupos en las proximidades de los genes

CRISPR, y codifican proteínas endonucleasas (Grissa y col., 2007). La importancia de

los sistemas CRISPR-Cas queda ilustrada por la presencia de loci CRISPR en el 46%

de las bacterias y el 84% de las arqueas (Bondy-Denomy y Davidson, 2014).

La función primaria de los sistemas CRISPR-Cas es la de ser un sistema

inmunológico adaptativo. Cuando se reconoce material genético de un agente invasivo

(generalmente un virus), se corta una sección de este y se integra como espaciador en

el locus CRISPR. Al transcribirse el locus CRISPR se genera un transcrito primario que

posteriormente es cortado por endonucleasas en fragmentos que contienen a los

espaciadores y que reciben el nombre de RNA guías. Estos se encuentran formando

26
parte de un complejo proteíco en el cual se encuentran las proteínas Cas. Cuando el

agente invasivo es encontrado de nuevo, el RNA guía correspondiente se une por

complementariedad de bases a la secuencia genética de la cual se originó, sirviéndole

de señalización a la proteína Cas para que corte en el sitio correcto e incapacite al

agente peligroso (Bhaya y col., 2011).

2.4.-Sistemas CRISPR no convencionales

El descubrimiento de los sistemas inmunes adaptativos CRISPR-Cas y su papel

en la protección del huésped contra los elementos genéticos móviles ahora está bien

establecido, pero cada vez hay más pruebas de que estos sistemas modulan otros

procesos, como la regulación genética, virulencia, la reparación del ADN y la evolución

del genoma, la formación de biopelículas en Pseudomonas aeruginosa son

subproductos de la función canónica CRISPR-Cas en defensa, mientras que otras,

como la regulación del desarrollo en Myxococcus xanthus (Viswanathan, 2007) y la

virulencia en Francisella novicida y Listeria monocytogenes, son funciones

seleccionadas (Westra, 2014; Bozic, 2019).

De acuerdo con esto, funciones adicionales de CRISPR-Cas en otros

organismos se consideran implicaciones potenciales desde una perspectiva evolutiva,

ya sea que estas funciones adicionales sean el resultado directo de la selección natural

o si son simplemente subproductos de su papel en la inmunidad adaptativa. Además de

27
su papel en la inmunidad adaptativa, la regulación de la expresión génica es la función

más ampliamente reportada de los sistemas CRISPR-Cas (Westra 2014).

28
 OBJETIVO GENERAL

Modelar y analizar biocomputacionalmente el transcrito hipotético de NilD CRISPR RNA

en Xenorhabdus nematophila asociado con la colonización de nematodos
entomopatógenos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Establecer la secuencia aminoacídica molde para el diseño de péptidos asociados al

transcrito hipotético de NilD CRISPR RNA en Xenorhabdus nematophila

Describir características biofisicoquímicas de los péptidos diseñados a partir del NilD

CRISPR RNA en Xenorhabdus nematophila

Establecer complejos macromoleculares mediante acoplamiento molecular de los

péptidos candidatos dirigidos a targets de interés asociados con la colonización de
nematodos entomopatógenos por Xenorhabdus nematophila

Determinar la estabilidad de los complejos predichos mediante simulaciones de

dinámica (MD)

Determinar las fluctuaciones conformacionales de los complejos mediante modelos de

redes elásticas.

29
 MARCO METODOLÓGICO

1.- Obtención de la secuencia aminoacídica molde.

Se utilizará como molde para el diseño de péptidos una secuencia descrita por

Veesenmeyer y col. (2014) llamada NilD, esta se analizará por la herramienta de ORF

FINDER del NCBI de la cual se obtendrán al menos seis marcos de lectura (Sayers y

col., 2022). Se estudiarán, además, 12 secuencias genómicas de Xenorhabdus

nematophila que corresponden a los targets asociados con la colonización de los

nemátodos: CpxA, CpxP, CpxR, MrfA, NilA, NilB, NilC, Cas5_CasD, Cas5, Cse1_CasA,

Cse2_CasB y Cse3. Las secuencias serán tomadas de la base de datos del NCBI

(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) y tanto los

péptidos diseñados como las proteínas target serán modelados mediante el servidor de

modelaje por homología SWISS-MODEL (Waterhouse y col., 2018).

2.- Análisis de las carácterísticas físico-químicas de los péptidos.

Se analizarán las siguientes características fisicoquímicas de los péptidos

diseñados usando el servidor HLP (Sharma y col., 2014): vida media, estabilidad, pKa,

peso molecular, Punto isoeléctrico y flexibilidad. Para la solubilidad, se utilizará GRAVY

(Fuchs, 2011) Se superpondrán las estructuras tridimensionales de los péptidos

modelados con SuperPose con el objetivo de obtener su desviación cuadrática media

(RMSD), es decir, la distancia media entre la posición de átomos de dos péptidos

(Rajarshi y col., 2004).

30
3. Construcción de complejos proteína-ligando con acoplamiento molecular.

Se construirán complejos proteína-proteína mediante acoplamiento ciego usando

el servidor HDOCK (Yan y col., 2020) y posteriormente se someterán a una función de

puntuación rigurosa en Dockscore (Malhotra y col., 2015) que determinará los

complejos termodinámicamente más favorables. Estos serán analizados con el software

Molegro Molecular Viewer (Bitencourt-Ferreira y de Azevedo, 2019), calculando también

la energía de unión con sus tres funciones de puntuación: moldock score, rerank score

y plant score.

4.- Simulaciones de dinámica molecular (MD).

Los acoplamientos que obtengan termodinámicamente favorables en las tres

funciones mencionadas anteriormente serán sometidos a dinámicas moleculares. en el

software libre MyPresto (Kasahara y col., 2020). Primero, se relajarán las estructuras a

través de procedimientos de minimización. Posteriormente se realizará un muestreo

modificando el número de análisis a 50.000, el resto de las condiciones quedarán como

predeterminados. Las dinámicas moleculares se le realizará tanto a los complejos como

a la proteína y péptidos independientes como punto de comparación. Se evaluará

nuevamente los complejos obtenidos con las tres funciones de puntuación con el

visualizador Molegro.

31
5.- Estudio comparativo de las fluctuaciones conformacionales de los complejos
ligando-proteína.

Se estudiará las fluctuaciones conformacionales utilizando las estructuras

derivadas de las dinámicas moleculares. Se empleará el método de casco convexo del

servidor HullRad para predecir el radio de giro anhidro (Rg) para las proteínas

individuales y los complejos (Fleming y Fleming, 2018). El programa Discovery Studio

Biovia (2020), permitirá calcular el RMSD promedio de las estructuras obtenidas a lo

largo de la dinámica. Adicionalmente, las estructuras finales de mínima energía serán

analizadas mediante FRUSTRATOMETER para localizar zonas frustradas localmente

que podrían representar regiones biológicamente importantes (Parra y col., 2016). Las

configuraciones, condiciones y parámetros ofrecidos por los programas se dejarán

como predeterminado.

Se realizará una tabla de datos con todas las características obtenidas en todos

los servidores y se subirán en Infostat (Di Rienzo y col., 2020) para realizar un análisis

multivariado de conglomerado que permita agrupar los péptidos candidatos según su

parentesco.

32
 MARCO ADMINISTRATIVO

Recursos
Técnicos (Software) GenBank (NCBI) Gratis / Servidor 
MOLEGRO Gratis / Servidor 
HLP 
GRAVY Gratis / Servidor 
Pfeature Gratis / Descarga 
PRODIGY Gratis / Descarga 
SuperPose Gratis / Servidor 
HDOCK Gratis / Servidor 
DockScore Gratis / Servidor 
MyPresto Gratis / Servidor 
Studio Biovia Gratis / Servidor 
Hullraid Gratis / Servidor 
Infostat Gratis / Servidor 
Frustratometer Gratis / Servidor 
SPECTRUS Gratis / Servidor 
Materiales Computadora 
Internet 
Presupuesto
Materiales $ (mensual)
Internet 20
Transporte (cuando sea requerido) 0
Imprevisto (BAM de internet) 5
TOTAL 25

33
 VIABILIDAD

Este trabajo será posible gracias a que se cuenta con herramientas

bioinformáticas gratuitas utilizadas desde el servidor o de forma descargable. Los datos
para su desarrollo serán obtenidos a partir de bases de datos accesibles para todo
público. Además, se cuenta con la tutoría del MSc. Lenín González-Paz, quien tiene a
cargo unidades curriculares como Bioinformática y Biotecnología y una amplia
experiencia en el área, por lo que cuenta con los conocimientos necesarios para que
este proyecto pueda ser ejecutado.

34
 RESULTADOS ESPERADOS

Finalizada la fase in silico se espera poder obtener el transcrito hipotético de NilD

CRISPR RNA en Xenorhabdus nematophila asociado con la colonización de nematodos
entomopatógenos. Esto, con el propósito de comprender estos importantes sistemas
biológicos asociados a simbiosis.

35
 CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Este trabajo está diseñado para ser ejecutado y presentado en 11 semanas

aproximadamente, por medio de las actividades que se muestran a continuación.

Semanas
Actividades 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Revisión bibliográfica X X X X X X X X X X X
Descarga de secuencias X
genómicas
Acoplamientos moleculares X X
Dinámicas moleculares X X
Análisis de fluctuaciones X
conformacionales
Análisis de la información X X
Elaboración del trabajo de X X
investigación
Presentación final X

36
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