INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería

campus Guanajuato
Synthesis and Production of Sweet-Tasting
Protein in
E. coli and Purification by Amylose Resin

Mansouri, F., Modarressi, M., Abolhassani,

M. & Parivar, K. (2011).

7BM1
Diana Estefanía Torres Domínguez
Docente: Silvia Díaz Sandoval
 Introducción
La mayoría de peptidos y Estas proteínas naturales Las proteínas dulces
proteínas son insaboras, han sido encontradas en la tienen el potencial de
mientras que algunas selva tropical y los indígenas reemplazar los
proteínas tienen sabor la usan para endulzar sus saborizantes artificiales.
dulce. alimentos.

Entre las proteínas brazzein no tiene La extracción de esta

naturales brazzein se carbohidratos ni similitud a proteína a partir de la
compone de una única la sacarosa, pero es 2000 fuente natural es
cadena de 54 veces más dulce que esta. compleja y prolongada,
aminoácidos, lo que la Debido a que brazzein es por lo que se pretende
convierte en la proteína derivada de una proteína y producirla en E. coli y
natural más pequeña no incrementa el azúcar en aislar cantidades
conocida hasta ahora. la sangre, se cataloga como suficientes.
segura para diabéticos.
 Materiales y métodos
Síntesis y amplificación del gen de brazzein

1. El gen de brazzein se sintetizó ligando dos diferentes oligonucleotidos por

hebra, el fragmento fue diseñado en base a la secuencia de aminoacidos de
brazzein para su expresión.
2. Se le añadió un codon de inicio antes de la primera secuncia.
3. Se amplificó por PCR usando ADN polimerasa pfu conteniendo el sitio para la
enzima BamH1.
4. El producto de PCR fue digerido con la enzima BamH1 y se extrajo del gel.
5. El producto purificado del PCR se insertó en un vector pBlueScript/sk y se
transformó en la cepa E. coli Xl-blue.
 Materiales y métodos
Expresión de brazzein

1. El fragmento digerido se extrajo con un kit de extracción en gel. El gel extirpado

fue subclonado en los vectores de expresión.
2. La reacción de ligado fue transformada en la cepa E. coli Top10F y se colocó en
placas de agar LB.
3. Las colonias bacterianas se examinaron en una placa de agar que contenía X-
gal para discriminar entre plásmido recombinante y no recombinante.
4. Los plásmidos que contenían el inserto se seleccionaron e identificaron por
PCR y fueron secuenciados.
5. Los plásmidos recombinantes fueron transformados a BL21DE3plysS y crecidos
a una densidad óptica de 0.5-600 nm.
6. Se recolectaron las células por centrifugación. Los pellets se recolectaron y
guardaron hasta ser usados, la expresión se analizó en SDS-PAGE.
7. Las muestras de proteína fueron diluidas en buffer de carga SDS para
resuspender las células. Las proteínas se detectaron con gel y solución de
coomasie.
 Materiales y métodos
Purificación

1. Las células totales se recolectaron por centrifugación. El pellet obtenido se

resuspendió en buffer Tris frío.
2. Las células se congelaron y después se sonicaron con pulsos cortos.
3. Las células se centrifugaron, el sobrenadante se transfirió a la resina de
amilosa.
4. Las proteínas fueron purificadas con un kit de acuerdo al protocolo del
mismo.
5. Las proteínas de fusión se eluyeron con maltosa.
6. La producción de proteínas de fusión se midió usando el método de
Bradford y se analizó en SDS-PAGE.
 Resultados y discusión
Síntesis del gen y Expresión de genes Purificación de la proteína
clonación recombinante
El gen sintetizado de brazzein fue
El gen se clonó primero Para la purificación de
subclonado en dos plásmidos
en pBlueScript||ks/sk y MBP-Br se empleó una
distintos y se le añadió un
se identificó por un promotor fuerte. Dentro de los columna de resina de
análisis de restricción y amilosa y la proteína de
vectores se colocó el fragmento
se confirmó con la del gen de brazzein en el sitio fusión se eluyó con
secuenciación de ADN. maltosa. La producción
BamH1. Estas construcciones se
El resultado reveló el final fue de 860 μg/ml de
probaron a diferentes periodos de
fragmento sintético tiempo, pero el rendimiento no MBP-Br y 480 μg/ml de
eliminado comparado MBP.
tuvo gran diferencia. Al probar con
con la secuencia las proteínas de fusión, GST-Br
original. produjo 60 mg/l mientras que
MBP-Br 180 mg/l.
Resultados y discusión
Brazzein existe de dos formas, la forma mayor aislada de la fuente natural que
contiene ácido piroglutámico y la menor que no lo contiene. La forma menor es
cerca de dos veces más dulce que la forma mayor.
Se usó la secuencia de la forma menor como base del diseño del gen sintético para
la producción de proteínas en E. coli.
Se sintetizó el gen para brazzein pero como se mencionó anteriormente los
rendimientos fueron muy bajos en E. coli, por lo que la expresión de brazzein
en E. coli resulta factible para propósitos de investigación, sin embargo, es
difícil obtener altos rendimientos por lo que se emplearon proteínas de fusión
donde la que mejor resultado dio fue MBP, ya que promueve el correcto
plegamiento de la proteína, lo que genera un mejor rendimiento ya que es
importante para la purificación de la proteína y ayuda a su estabilización.
Aun así, en otros experimentos, hay mayores niveles de expresión en sistemas
eucariotas, debido a que están más relacionados con el gen de la especie de
origen.
Resultados y discusión
Para lograr alcanzar el mercado, la proteína expresada debe tener el mismo
fenotipo que el producto natural.
Por lo tanto, para lograr una mejor aproximación con biotecnología deben
lograrse ciertos rendimientos además de que se requerirán estudios
toxicológicos.
 Conclusión

Se diseñó un gen de brazzein y se sintetizó usando oligonucleótidos,

posteriormente se clonó en un vector pBlueScript. El fragmento sintético se ligó a
dos proteínas para su expresión. La proteína de fusión se purifico con una
columna de resina de amilosa y se detectó con SDS-PAGE. Los mejores
rendimientos se lograron produciendo brazzein como fusión con la proteína MBP.
Aprendiendo más acerca del mecanismo de acción y desarrollando brazzein más
potente, será una mejor situación para evaluar brazzein como un potencial
sustituto del azúcar, así como una ventaja respecto a los endulzantes artificiales.
Referencias
Mansouri, F., Modarressi, M., Abolhassani, M. & Parivar, K. (2011). Synthesis and
Production of Sweet-Tasting Protein in E. coli and Purification by Amylose Resin. Journal
of Sciences. University of Tehran. 22(2): 105-110.