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Artículo

El endosimbionte anaeróbico genera energía para el

huésped ciliado mediante desnitrificación

https://doi.org/10.1038/s41586­021­03297­6 Jon S. Graf1 , Sina Schorn1, Katharina Kitzinger1,2, Soeren Ahmerkamp1 , Christian Woehle3 ,
Bruno Huettel3 , Carsten J. Schubert4 , Marcel MM Kuypers1 y Jana Milucka1
Recibido: 10 de diciembre de 2019

Aceptado: 27 de enero de 2021

Las mitocondrias son orgánulos eucariotas especializados que tienen una función dedicada a la
Publicado en línea: 3 de marzo de 2021
respiración de oxígeno y la producción de energía. Evolucionaron hace unos 2 mil millones de años a
Acceso abierto
partir de un ancestro bacteriano de vida libre (probablemente una alfaproteobacteria), en un
Buscar actualizaciones proceso conocido como endosimbiosis1,2 . Desde entonces, muchos eucariotas unicelulares se han
.
adaptado a la vida en hábitats anóxicos y sus mitocondrias han experimentado una mayor evolución reductiva3.
Como resultado, los eucariotas anaeróbicos obligados con restos mitocondriales obtienen su energía
principalmente de la fermentación4. . Aquí describimos 'Candidatus Azoamicus
ciliaticola', que es un endosimbionte obligado de un ciliado anaeróbico y tiene un papel
dedicado en la respiración y el suministro de energía para su huésped eucariota. 'Candidato
A. ciliaticola contiene un genoma muy reducido de 0,29 Mb que codifica genes centrales para el
procesamiento central de información, la cadena de transporte de electrones, un ciclo truncado del
ácido tricarboxílico, la generación de ATP y la biosíntesis de grupos hierro­azufre. El genoma codifica
una vía de desnitrificación respiratoria en lugar de oxidasas terminales aeróbicas, lo que
permite a su huésped respirar nitrato en lugar de oxígeno. 'Candidatus A. ciliaticola' y su huésped
ciliado representan un ejemplo de simbiosis que se basa en la transferencia de energía en forma de
ATP, en lugar de nutrición. Este descubrimiento plantea la posibilidad de que los eucariotas con
restos mitocondriales puedan adquirir secundariamente endosimbiontes que proporcionen energía
para complementar o reemplazar funciones de sus mitocondrias.

La vida eucariota evolucionó hace al menos entre 1 y 1.900 millones de años5,6 , han evolucionado independientemente a partir de mitocondrias en organismos
después de la oxigenación gradual de la atmósfera de la Tierra (que comenzó hace evolutivamente distantes18,19. Algunos ciliados que contienen hidrogenosomas
unos 2.400 millones de años7,8 ). La consiguiente diversificación de los eucariotas también contienen arqueas metanogénicas endosimbióticas que eliminan el H2
se ha atribuido a su capacidad para recolectar grandes cantidades de energía de producido , lo que aumenta el rendimiento energético de la reacción20.
la respiración de oxígeno, un aceptor de electrones abundante y de alto potencial . A diferencia de los anaerobios estrictos que fermentan exclusivamente, algunos
La respiración de oxígeno se realiza en las mitocondrias, que son orgánulos eucariotas anaeróbicos facultativos pueden realizar respiración anaeróbica21.
subcelulares especializados que surgieron de un organismo procariótico de vida La reducción de nitratos y/o nitritos se ha demostrado previamente para
libre a través de endosimbiosis9 . Durante la evolución hacia el orgánulo algunos foraminíferos y Gromiida22–24, hongos25,26 y los ciliados Loxodes27.
contemporáneo, el endosimbionte perdió sus genes o los transfirió al genoma del El mecanismo molecular subyacente de la desnitrificación y la conservación de
huésped; Las mitocondrias han conservado sólo un pequeño subconjunto de energía en eucariotas se desconoce en gran medida. Aquí informamos el
genes10 que pertenecen a la traducción y a la cadena de transporte de descubrimiento de un endosimbionte obligado de un ciliado anaeróbico que
electrones11,12. proporciona a su huésped energía derivada de la desnitrificación.
Algunos eucariotas que habitan en ambientes anóxicos no contienen mitocondrias
aeróbicas. Aunque originalmente se pensaba que eran "ancestrales"13, todos estos
eucariotas amitocondriados evolucionaron secundariamente a partir de predecesores Ciliados anaeróbicos con endosimbiontes bacterianos.
que tenían mitocondrias aeróbicas14; poseen orgánulos relacionados con las Investigamos el lago Zug, un lago de agua dulce permanentemente estratificado y
mitocondrias muy reducidos o al menos contienen genes de origen mitocondrial en de unos 200 m de profundidad situado en Suiza. El lago Zug contiene aguas
sus genomas nucleares15. A lo largo del curso de la evolución, los protistas profundas que permanecen permanentemente anóxicas y repletas de nitrato, lo
unicelulares anaeróbicos han perdido la capacidad de generar ATP mediante cual es una característica característica de muchas aguas dulces y marinas
fosforilación oxidativa (con algunas excepciones16,17). estratificadas sin oxígeno. El espesor del hipolimnión anóxico varió entre 40 y 100
En cambio, estos eucariotas generan ATP a partir de la fermentación m durante un período de 5 años (2016—2020)
mediante la fosforilación a nivel de sustrato, junto con la formación de H2 (ref. 18).
(Datos ampliados Fig. 1). En 2018, el oxígeno era indetectable por debajo de una
Esta reacción tiene lugar en el citoplasma o, más comúnmente, en profundidad de 160 m, y una disminución en la concentración de NOx (principalmente
hidrogenosomas. Los hidrogenosomas son orgánulos especializados, quenitrato) por debajo de la base de la oxiclina indicó una desnitrificación en curso (Datos ampliados, figura

1 2
Instituto Max Planck de Microbiología Marina, Bremen, Alemania. División de Ecología Microbiana, Centro de Microbiología y Ciencia de Sistemas Ambientales, Universidad de Viena, Viena,
Austria. 3
Centro del Genoma Max Planck de Colonia, Instituto Max Planck de Investigación en Mejoramiento Vegetal, Colonia, Alemania. 4 Aguas superficiales: investigación y gestión, Eawag, Kastanienbaum,
Suiza. correo electrónico: jgraf@mpi­bremen.de; jmilucka@mpi­bremen.de

Naturaleza | Volumen 591 | 18 de marzo de 2021 | 445

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Artículo
a b C d
'California. A. ciliaticola'
Cilios DAPI

Cilios

MAC

mi F plagiopílida
Legionellales (83,0–84,6%, n = 12)
Clon redoxclina del Mar Negro (HM749917)
Clon de sedimento HV de la Cuenca de Guaymas (JX268867)
Francisellales (79,6–82,0%, n = 8)
Clon de sedimento HV de la Cuenca de Guaymas (JX268824)
Metaetiqueta de lodos activados. contig (FPLP01004190) Clon de sedimento HV de la Cuenca de Guaymas (JX268902)
Metaetiqueta de lodos activados. contig (FPLP01007300) Clon de sedimento HV de la Cuenca de Guaymas (JX268831)
B Clon de sedimento HV de la Cuenca de Guaymas (JX268891)
Clon de aguas residuales (JF828756)
Clon de estera hipersalina (JN428441) (89,5–92,9%) Clon de sedimento HV de la Cuenca de Guaymas (JX268813)
Clon del sistema de desnitricración marino (AY835674)
Clon de clina redox del Mar Báltico (KC492846)
Clon de sedimento de filtración fría de Hydrate Ridge (KT346312)
Clon de sedimento del Golfo de México (KX172462) Clon de sedimento HV de la Cuenca de Guaymas (JX268912)
Clon del depósito de Feitsui (AB930564) Clon de sedimento HV de la Cuenca de Guaymas (JX268865)

'California.
Azoámico
Clon del depósito de Feitsui (AB930693) Clon de sedimento HV de la Cuenca de Guaymas (JX268913)
'California. Azoamicus ciliaticola' A
Lago Zug ciliado simple S3
Clon del lago Pavin eub62A3 (GQ390243) (98,5–99,1%) Lago Zug, ensamblado con metagenoma Plagiopilea
Metaetiqueta del lago Kivu. contig (Ga0116204_10069046) Lago Zug múltiples ciliados C10
Clon del Océano Pacífico subártico nororiental (HQ674626) Lago Zug múltiples ciliados C5
Lago Zug ciliado único S1
Clon de la Bahía de Delaware (EU800820) NKB5 Lago Zug ciliado simple S4
Clon de sedimento Nankai Trough NKB5 (AB013257) (86,2–86,3%) Clon de película de diatomeas bentónicas (KT201586)
Clon redoxclina del Mar Negro (HM749918)
'California. Berkiella' (84,1–86,5%, n = 5) Clon de estera de sumidero anóxico marino (JF971654)
Lago Zug simple ciliado S2
Coxiellales (82,0–84,4%, n = 10) Clon de sedimento HV de la Cuenca de Guaymas (JX268874)
Clon de sedimento Guaymas HV (JX268870)
Diplorickettsiales (79,5–82,5%, n = 6) 0,05 0,05 Epalxella antiquorum (EF014286)
Clon del fiordo de Framvaren (EF526988) Epalxelidae
Clon de planta depuradora de aguas residuales (AB902303)

Figura 1 | Visualización y afiliación filogenética de 'Ca. A. ciliaticola' y su huésped ciliado. a, Imagen
representativa de microscopía electrónica de barrido de un ciliado del hipolimnio anóxico del lago Zug
(febrero de 2020, profundidad de 186 m). Barra de escala, 5 μm. b – d, Imagen de contraste de
interferencia diferencial (b) e imagen de microscopía de barrido láser confocal (c) de un ciliado después de
la hibridación con un 'Ca. Sonda de oligonucleótido específica de Azoamicus (eub62A3_813) (amarillo) y
contratinción con DAPI (azul). d, Superposición de imágenes de fluorescencia y contraste de interferencia
diferencial. Se delinean el macronúcleo (MAC) con el micronúcleo adherido (punta de flecha) y las
supuestas vacuolas alimenticias del ciliado.
Barras de escala, 5 μm. e, árbol filogenético de máxima probabilidad basado en la secuencia del
gen 16S rRNA de 'Ca. A. ciliaticola' (negrita denota secuencia derivada de genoma ensamblado con
metagenoma circular) y miembros de órdenes gammaproteobacterianas y clados ambientales
relacionados. Subgrupos A y B de
la CA. Están indicados el grupo Azoamicus. Las similitudes de secuencia de los grupos respectivos con la
secuencia del gen 16S rRNA de 'Ca. A. ciliaticola' se muestran entre paréntesis. El árbol completo
se muestra en la Fig. 4 de datos ampliados. Los grupos taxonómicos se asignaron sobre la base de la
taxonomía SILVA45. Metag., metagenoma. f, Árbol filogenético de máxima probabilidad basado en la
secuencia del gen Ciliate 18S rRNA de la clase Plagiopylea basado en la alineación de referencia EukRef­
Ciliophora30. Las secuencias de ciliados del lago Zug (en negrita) se amplificaron a partir de ciliados individuales
(S1­S4) o ciliados combinados (C5 y C10). Las estrellas denotan una identificación positiva de un 'Ca.
Secuencia de ARNr 16S de A. ciliaticola amplificada a partir del mismo ciliado: negro, 'Ca. Secuencia del gen
16S rRNA de A. ciliaticola verificada mediante secuenciación de Sanger; banda gris positiva en gel. Para
ambos árboles, los valores de arranque se muestran como círculos en los nodos respectivos e indican un
soporte de arranque de >70 % (gris) o >90 % (negro) de 100 remuestreos. Barras de escala, 0,05
sustituciones de nucleótidos por sitio.

Observamos una gran abundancia de eucariotas unicelulares móviles en una sonda oligonucleotídica específica de bacterias generales (EUB­I) ( Tabla
toda la capa anóxica (Fig. 1, Datos ampliados, Fig. 1, Video complementario complementaria 3), que identificó los posibles endosimbiontes ciliados como
1). Muchos de estos eucariotas contenían macro y micronúcleos y tenían la bacterias (Datos ampliados, Fig. 2).
morfología típica de los ciliados (Fig. 1, Datos ampliados, Fig. 2). Su
abundancia aumentó de aproximadamente 6.000 células por litro en la base
de la oxiclina (una profundidad de 160 m) a alrededor de 25.000 células por Endosimbionte y filogenia del huésped.
litro dentro del núcleo del hipolimnio anóxico (una profundidad de Para identificar el supuesto endosimbionte, utilizamos ADN extraído del
aproximadamente 180 m) (Tabla complementaria 1). Los ciliados exhibieron agua del lago anóxico para la secuenciación del metagenoma (Tabla
aerotaxis negativos , lo que indica un estilo de vida anaeróbico obligado complementaria 4). Identificamos un genoma pequeño (aproximadamente
(Datos ampliados, Fig. 3). En algunos casos, observamos señales de 4′,6­ 290 kb) ensamblado en metagenoma circular con características
diamidino­2­fenilindol (DAPI) fragmentadas y densamente empaquetadas endosimbióticas típicas (como se describe en 'Genoma bacteriano con
que podrían haber representado presas microbianas en vacuolas alimentarias características endosimbióticas'). La secuencia del gen 16S rRNA
(Fig. 1, Datos ampliados, Fig. 2). Sin embargo, una fracción sustancial de los recuperada del genoma ensamblado en metagenoma circular endosimbionte
ciliados observados en el hipolimnio anóxico también contenía múltiples compartió las identidades más altas (alrededor del 86%) con Legionella
señales DAPI intracelulares que recordaban a los endosimbiontes. Estos clemsonensis y 'Candidatus Berkiella cookevillensis ' C99, que es una
supuestos endosimbiontes no mostraron la autofluorescencia típica del bacteria intranuclear de Acanthamoeba polyphaga. Dado el alto grado de
cofactor F420 que es indicativa de ensamblajes de metanógeno­ divergencia de secuencia entre el endosimbionte y las bacterias
hidrogenosoma (que a menudo se encuentran en ciliados anaeróbicos) ni se relacionadas, llamamos a este organismo ' Candidatus Azoamicus ciliaticola' (ver Mét
hibridaron con una sonda de oligonucleótidos de arqueas general (Datos Nuestro análisis filogenético mostró que 'Ca. A. ciliaticola 'pertenece
ampliados, figura 2). Además, confirmamos la ausencia de arqueas al grupo eub62A3 poco estudiado de las gammaproteobacterias (Fig. 1e,
metanogénicas en los ciliados mediante la secuenciación del transcriptoma de unDatos ampliados,
solo ciliado (TablaFig. 4). El grupo 13,
complementaria eub62A3 (al que
Discusión nos referimos como
complementaria).
En cambio, obtuvimos señales fluorescentes claras después de la hibridación con grupo 'Candidatus Azoamicus') probablemente representa su propio orden.

446 | Naturaleza | Volumen 591 | 18 de marzo de 2021

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a b
(%)
CG
'California. A. ciliaticola'
292,520 pb
24,4% CG
94,0% de densidad codificante de proteínas
349 genes
310 CDS, 3 ARNr,
35 ARNt, 1 ARNt
sesgo de GC
Figura 2 | Características del genoma de 'Ca. A. ciliaticola'. a, Gráfico circular del genoma de
'Ca. A. ciliaticola', que muestra (de adentro hacia afuera) la inclinación de GC (rojo, positivo;
naranja claro, negativo), el contenido de GC, el ARN (negro) y los genes codificadores de
proteínas (gris) codificados en la cadena delantera o inversa del genoma ( en kb). b, Relación
entre el tamaño del genoma y el contenido de GC de genomas procarióticos completos
depositados en GenBank (límite de 2 Mb; consultado en mayo de 2018). Genomas de 'Ca.
Se destacan A. ciliaticola', mitocondrias de Jakoba libera y endosimbiontes de insectos y
ciliados. 1, 'ca. A. ciliaticola'; 2, mitocondria de J. libera ; 3, 'ca.
Carsonella ruddii' PV; 4, Buchnera aphidicola; 5, Caedibacter taeniospiralis.
dentro de las gammaproteobacterias. La CA. El grupo de Azoamicus parece
consistir en al menos dos subgrupos distintos. Las secuencias afiliadas al
subgrupo A están estrechamente relacionadas con 'Ca. A. ciliaticola
'( identidad de secuencia del 98,5 al 99,1%) y se han recuperado de lagos y
embalses de agua dulce anóxicos geográficamente distantes (Fig. 1e). El
subgrupo B contiene secuencias que son más divergentes de 'Ca. A.
ciliaticola '(89,5–92,9% de identidad de secuencia) y que se han recuperado
de hábitats acuáticos más diversos (Fig. 1e).
Usamos un 'Ca' marcado con fluorescencia. Sonda de oligonucleótidos
específica de Azoamicus (eub62A3_813) (Datos ampliados, Fig. 5, Métodos,
Tabla complementaria 3), y encontró que los endosimbiontes estaban ubicados
exclusivamente dentro de pequeños ovoides (25,4 ± 3,2 μm de largo, 19,5 ± 2,0­
μm de ancho (± sd del promedio); n = 9 células) huéspedes ciliados (Fig. 1, Datos
ampliados, Fig. 2). En 2018, todos los ciliados que encontramos a 180 m de
profundidad contenían el 'Ca. Simbionte de A. ciliaticola (Tabla complementaria
1). Extrajimos ADN de ciliados seleccionados individualmente desde la profundidad genoma codifica varias subunidades de la holoenzima ADN polimerasa III
más profunda (189 m, que fue muestreado en 2019) y amplificamos 'Ca. Gen 16S
rRNA de A. ciliaticola utilizando cebadores específicos (Tabla complementaria
2). Recuperamos con éxito secuencias que estaban estrechamente relacionadas
con 'Ca. A. ciliaticola ' (96,5–99,9% de identidad) de los ciliados seleccionados. alrededor del 20% de las transcripciones acumuladas por millón (Datos
Nuestro análisis del gen parcial de ARNr 18S amplificado a partir de los mismos
extractos de ADN utilizando cebadores específicos de ciliados (Figura 1
complementaria) identificó todos los ciliados seleccionados como miembros de la
clase Plagiopylea dentro del filo Ciliophora (Figura 1f). Confirmamos además su
afiliación a Ciliophora mediante análisis de transcripciones de genes ortólogos de
copia única de transcriptomas de un solo ciliado (Datos ampliados, figura 6). Los
plagiopileos son ciliados anaeróbicos o microaeróbicos que normalmente se
encuentran en hábitats anóxicos de agua dulce o marinos. En general, se cree
que dependen de hidrogenosomas y algunas albergan arqueas metanogénicas29.
La clase Plagiopylea se divide filogenéticamente en dos clados30. Un clado
contiene miembros bien descritos del orden Plagiopylida (como Plagiopyla frontata
y Trimyema compressum), y el segundo clado contiene nuestro 'Ca. Ciliato
plagiopileo asociado a A. ciliaticola, así como diversas secuencias del gen 18S
rRNA de hábitats anóxicos marinos y de agua dulce (Fig. 1f). Nuestros análisis
filogenéticos indicaron que 'Ca.
A. ciliaticola 'representa un endosimbionte de un ciliado plagiopiliano anaeróbico
de agua dulce.
C
35
55
Endosimbionte ciliado 30
Endosimbionte de insectos
mitocondria jakobid
25
Otro
45
5
20
15 *
35
2
10
codificadores
Porcentaje
proteínas.
genes
total
del
de
1 5
25
1 4 23 5
4 1 2 3 456 1 2 3 4 5 6 6 123456123456
0
3
'California. A. ciliaticola'
15
Transporte de aminoácidos(E)
y metabolismo
Traducción, ribosomal
Pared celular, membrana y
0,10 0,20 0,40 0,80 2.00 Replicación, recombinación y reparación
biogénesis(L)de la envoltura (M)
estructura y biogénesis (J) Respiración, producción y conversión de energía (C)
Tamaño del genoma (Mb)
Legionella clemsonensis no se muestra en este panel porque el tamaño de su genoma (3,27
Mb) excede el rango representado. c, Comparación del número de genes en categorías de
genes funcionales seleccionadas (como porcentaje del total de genes codificadores de proteínas)
(Tabla complementaria 9) entre 'Ca. A. ciliaticola' (magenta), J. libera
mitocondria (azul), insectos seleccionados y endosimbiontes ciliados (naranja) y Legionella
clemsonensis (gris) como ejemplo de una bacteria de vida libre relacionada.
Los números son los descritos en b; 6 denota L. clemsonensis. El asterisco resalta la
presencia de una cadena respiratoria anaeróbica. Los códigos de una sola letra de las
categorías funcionales del COG se muestran entre paréntesis.
Genoma bacteriano con características endosimbióticas.
El genoma cerrado de 'Ca. A. ciliaticola 'es muy pequeña (292.520 pb) y tiene un
contenido promedio de G + C notablemente bajo (24,4%) y una alta densidad de
codificación de proteínas (94,0%) (Fig. 2a). Ha conservado 310 genes codificadores
de proteínas, 1 operón de ARN ribosómico (16S, 23S y 5S), 35 ARN de
transferencia que decodifican los 20 aminoácidos estándar (código genético 11) y
1 ARN mensajero de transferencia; como tal, es, hasta donde sabemos, el genoma
endosimbionte protista más pequeño reportado hasta la fecha. Hasta ahora, se
han encontrado genomas de tamaño similar y con características generales
similares sólo en endosimbiontes obligados de insectos31,32 (Fig. 2b). Sobre la
base de estas similitudes, concluimos que 'Ca. A. ciliaticola 'es un endosimbionte obligado.
'Candidatus A. ciliaticola' codifica una proporción similar de genes
relacionados con la traducción, replicación y reparación a los codificados por
otros endosimbiontes altamente reducidos de ciliados e insectos (Fig. 2c). El
( dnaE, dnaQ y dnaX), ARN polimerasa dirigida por ADN (rpoA, rpoB, rpoC,
rpoD, rpoH y rpoZ) y un conjunto completo de genes de proteínas ribosómicas
30S y 50S. . Estos genes se transcribieron en gran medida y representaron
ampliados , figura 7). Por lo tanto, 'Ca. A. ciliaticola'—a pesar de su genoma reducido—
parece ser capaz de autorreplicarse dentro de su huésped.
Por el contrario, el 'Ca. El genoma de A. ciliaticola muestra una gran pérdida de
los genes que subyacen a la biogénesis de la pared celular, la membrana y la envoltura.
El repertorio genético para la biosíntesis de vitaminas y aminoácidos también
se reduce notablemente, lo que es notablemente diferente de otros
endosimbiontes de insectos o ciliados (Fig. 2c, Datos ampliados, Fig. 7). Como
muchos endosimbiontes proporcionan aminoácidos o vitaminas esenciales
para complementar las dietas nutricionalmente pobres de sus huéspedes, a
menudo conservan extensas vías biosintéticas para estos compuestos32. La
CA. El genoma de A. ciliaticola codifica sólo tres copias de un transportador
de tirosina y triptófano (tyrP) y un antiportador de glutamato y γ­aminobutirato
(glutamato/γ­aminobutirato) que podría servir para importar aminoácidos
aromáticos y glutamato al interior de la célula. En particular, 'Ca. A. ciliaticola
parece depender de su huésped para la mayoría de los demás componentes
celulares esenciales (por ejemplo, nucleótidos, fosfolípidos y lipopolisacáridos),
ya que en el genoma no hay genes codificados para su biosíntesis. Resulta por tanto des
Naturaleza | Volumen 591 | 18 de marzo de 2021 | 447
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Artículo
a ciliado
Aromático
2­oxoglutarato Tyr, Trp aminoácidos
SecAYEGDF 'California. A. ciliaticola' Fdox
2–
oxalacetato KorAB MoO4 ModABC
Fredd
TatAC SufBCDS­SufU Fe–S NAD+ 2­Oxo­
Mdh Relacionado con TCA Succinilo­
NADH CoA glutarato
Exportación de proteínas MoaACDE­MogA­ YS
cofactor bis­MGD ADP
MoeA­MobA malato malato
QH2 atp SucCD
Q+ Biosíntesis de Fe­S y MGD. Transportadores
NUMERO 3 ­ NO2 – Succinato de fumarato
NarGHI atp ADP
NADH 2H + NAD+ H+ H+ ADP ATP
NarT NarK + H+
NorBC Q+ tlcA
Q+ bc1 sdhABCD
Nuo
cito. C complejo QH2
NO2 – Nirk NO QH2
NUMERO 3 ­
0,5 N2O cito. C atp ADP
cito. C
2H + H+ H+
desnitricación cito. cNosZ H+
Cadena de transporte de electrones Síntesis e intercambio
0,5N2 de ATP.
b C
1.750
100
cobertura
Transcriptoma

metros,
2016)
(160

0 80

5.000

R2 = 0,90
60
cobertura
Transcriptoma

metros,
2018)
(180

producción
0

(nmol
30N2
Tasa
Con ciliados (>10 μm enriquecidos)
soplón qcrABC sdhABCD nosLYFDR korAB 40

d–
de
yfls groESL

1)
l–
nirk

N
1
Con ciliados (agua a granel)
mdh narGHIJ tlcA nuoA–N
nosZ éxito Sin ciliados (fracción <10 μm)
atpA–H narT norBC
0 1.000 2.000 3.000
0 50 100 150 200 250
Número de ciliados por litro
Genoma (kb)

Figura 3 | Potencial metabólico y actividad del 'Ca. A. ciliaticola'.
a, Potencial metabólico inferido por el genoma relacionado con la respiración anaeróbica
mediante desnitrificación, generación e intercambio de ATP, ciclo del ácido tricarboxílico
(TCA), biosíntesis de grupos hierro­azufre (Fe­S) y dinucleótido de bis­
molibdopterina guanina (bis­MGD), proteína exportadores y otros transportistas. La
presencia de una doble membrana se supone por analogía con las
mitocondrias. b, Cobertura del metatranscriptoma de dos conjuntos de datos
metatranscriptómicos, de muestras obtenidas en 2016 y 2018, del 'Ca. Genoma de A.
ciliaticola. Existe un perfil de transcriptoma altamente consistente entre años y una
transcripción excepcionalmente alta de genes relacionados con la conservación de
energía, la producción y el transporte de ATP, las chaperonas (groE, groS y groL) y la
bacterias
desnitrificación (sombras naranja, roja, violeta y azul, respectivamente). La cobertura fue corregida por desnitrificantes que aún están presentes en el agua.
profundidad de secuenciación; la mayor cobertura en la muestra de 2018 se debe a la
mayor abundancia de endosimbiontes en ese año. Se destacan los genes relacionados
con la desnitrificación (azul), la cadena de transporte de electrones (naranja), el ciclo
del ácido tricarboxílico (gris) y la generación y el transporte de ATP (rojo). Los genes
resaltados representan más del 55% de todas las transcripciones. Se proporciona más
información en la Tabla complementaria 5). c, Correlación de la abundancia de ciliados y
las tasas de desnitrificación (producción de 30N2 ) en agua del hipolimnio anóxico (189 m,
mayo de 2019) con y sin ciliados. Cada punto de datos representa una tasa
de desnitrificación volumétrica calculada a partir de la regresión lineal de seis puntos de
tiempo individuales de un experimento. Las barras de error representan se de la regresión lineal.
Las tasas de desnitrificación en incubaciones sin ciliados se deben a la actividad de las

que, al igual que otros endosimbiontes obligados33, el 'Ca. El genoma de A. caso con muchos genes endosimbiontes). Sin embargo, los complejos de la
ciliaticola carece en gran medida de sistemas de transporte para estos metabolitos cadena de transporte de electrones I, II, IV y V se conservan en el genoma del
( Tablas complementarias 5, 6, Discusión complementaria). Otros genes que núcleo mitocondrial en muchos eucariotas, y se espera que los genes que
previamente se ha demostrado que están relacionados con simbiosis nutricionales codifican componentes de la cadena de transporte de electrones se encuentren
entre los que tienen menos probabilidades de transferirse al núcleo11. Tampoco
(por ejemplo, los que codifican pectinasas34) o defensivas conocidas de los ciliados35
También están ausentes en el genoma. encontramos transcripciones de citocromo c oxidasa codificada mitocondrialmente
en el transcriptoma del huésped (Tabla complementaria 10, Discusión complementaria).
Esto confirma la naturaleza anaeróbica obligada del huésped, como ya lo
Respiración anaeróbica y metabolismo energético. indicó su comportamiento aerotáctico negativo (Datos ampliados, Fig. 3).
A diferencia de la mayoría de las otras categorías de genes funcionales, los La CA. El genoma de A. ciliaticola codifica un conjunto completo de genes
genes relacionados con la respiración y la producción y conversión de energía para la desnitrificación respiratoria (Fig. 3a, Tabla complementaria 5). El conjunto
(Figs. 2c, 3a, Tabla complementaria 5) se retienen abundantemente en 'Ca. de genes contiene las cuatro enzimas principales: nitrato reductasa (narG, narH
Genoma de A. ciliaticola . 'Candidatus A. ciliaticola' codifica una cadena completa y narI), nitrito reductasa que contiene cobre (nirK), óxido nítrico reductasa (norB
de transporte de electrones generadora de ATP, que incluye la NADH y norC) y óxido nitroso reductasa (nosZ). Estos genes se complementan con una
deshidrogenasa (nuoA a nuoN), el complejo citocromo bc1 (qcrA, qcrB y qcrC) y amplia variedad de proteínas accesorias, como los citocromos c4 y c5 para el
la ATP sintasa (atpA a atpH). En muchos endosimbiontes, los genes relacionados acoplamiento redox, factores de maduración enzimática (narJ, nosR, nosD, nosF,
con la respiración y la producción y conversión de energía se ven afectados por nosY y nosL) y transportadores de nitratos y nitritos (narK ).
pérdidas marcadas; Incluso se cree que algunos endosimbiontes son parásitos y narT). 'Candidatus A. ciliaticola' codifica un sistema de importación de
del ATP32. En cambio, una fracción sustancial del 'Ca. El genoma de A. ciliaticola molibdato ( modA, modB y modC) y una vía para la biosíntesis de bis­
está dedicado a la producción y conversión de energía, que es una característica molibdopterina guanina dinucleótido, que es un cofactor esencial de la
que comparte con todos los genomas mitocondriales conocidos (Fig. 2c). nitrato reductasa. En los eucariotas, esta vía es, en su mayor parte, un
La CA. El genoma de A. ciliaticola no codifica genes para la respiración aeróbica, proceso citosólico codificado por genes nucleares36. De manera similar,
como las oxidasas terminales (por ejemplo, el citocromo c una vía de biosíntesis de grupos de hierro­azufre (tipo Suf) (sufB, sufC,
oxidasa y citocromo bd oxidasa). En principio, los genes de la oxidasa terminal sufD y sufS) también está codificada en el 'Ca. genoma de A. ciliaticola;
podrían haberse reubicado en el genoma nuclear (como lo es el genoma nuclear). esta fue la única vía que detectamos para la biosíntesis de grupos de hierro­azufre

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NOx O2 H2
atp
N2H2O

2a NOx
H2 O2
O2 H2
atp atp N2 H2O LGT
H2O 1 atp
3
2b
NOx
H2
atp N2
NOx O2
ciliado aeróbico
Ciliado anaeróbico N2H2O Anaeróbico 'Ca. A. ciliaticola'­
NOx O2
Simbiosis de Plagiopylea
N2 H2O

Etapa intermedia putativa

Figura 4 | Evolución hipotética de 'Ca. A. ciliaticola'­simbiosis ciliada.
(1) La adaptación secundaria de un ciliado aeróbico a un ambiente anóxico que contiene
nitratos implicó el deterioro de sus mitocondrias aeróbicas y la
formación de hidrogenosomas. (2) Adquisición de una bacteria desnitrificante anaeróbica
facultativa que entró en el huésped ciliado anaeróbico mediante endocitosis (2a) o como
parásito (2b). En este último caso, el 'Ca. El ancestro de A. ciliaticola podría haber poseído
ya una translocasa ATP/ADP para obtener energía
parasitismo. (3) Alternativamente, la translocasa ATP/ADP se adquirió en un momento
posterior mediante transferencia genética lateral (LGT) de (por ejemplo) un cosimbionte
alfaproteobacteriano en la célula huésped. Las condiciones persistentes de anóxica y rica
en nitratos darían como resultado la pérdida de genes para la respiración de oxígeno que
dieron lugar al actual 'Ca. Simbiosis de A. ciliaticola'­Plagiopylea. La presencia de
hidrogenosomas en el huésped existente se basa en indicaciones de la secuenciación del
transcriptoma de un solo ciliado y aún no se ha confirmado de manera concluyente.

en el huésped ciliado. No detectamos transcripciones que pertenecen a resultados metagenómicos y transcriptómicos, proponemos que 'Ca. A. ciliaticola '
la vía de tipo Isc de biosíntesis de grupos de hierro­azufre (que opera en funciona como un endosimbionte respiratorio que conserva y proporciona energía de
hidrogenosomas, mitocondrias y orgánulos relacionados con mitocondrias) la respiración anaeróbica para su huésped plagiopileo.
en el transcriptoma de un solo ciliado (Tabla complementaria 11).
Aunque el rasgo de desnitrificación respiratoria está muy extendido entre los
procariotas de vida libre37,38, hasta donde sabemos, ningún endosimbionte Evolución de la simbiosis respiratoria.
obligado descrito hasta la fecha codifica una vía de desnitrificación. Confirmamos Los eucariotas unicelulares que se han adaptado secundariamente a un estilo de
la desnitrificación activa por parte de ciliados utilizando incubaciones de vida anaeróbico a menudo poseen orgánulos relacionados con las mitocondrias,
isótopos estables 15N (Fig. 3c, Datos ampliados, Fig. 8, Discusión como los hidrogenosomas. Estos orgánulos han conservado su función de generación
complementaria). Los posibles donantes de electrones para la desnitrificación de energía, aunque a menudo han perdido sus genomas y sus enzimas están
podrían ser dicarboxilatos y/o tricarboxilatos proporcionados por el ciclo del predominantemente codificadas en el núcleo y expresadas por el huésped
ácido tricarboxílico, como el succinato y el malato (discusión complementaria). eucariota40. Al analizar los transcriptomas unicelulares del huésped ciliado,
El malato es utilizado por muchas mitocondrias anaeróbicas productoras de encontramos transcripciones que potencialmente codifican proteínas hidrogenosomales
energía o hidrogenosomas de ciliados u otros protistas4 . La alta transcripción (Tablas complementarias 11, 12, Métodos complementarios, Discusión
de malato deshidrogenasa (mdh) y un supuesto transportador de 2­oxoglutarato complementaria). Esto sugiere que nuestro huésped ciliado, como ocurre con todos
y malato (2­oxoglutarato / malato) (yflS) (Fig. 3b) indica que el malato también los eucariotas conocidos hasta la fecha, puede contener restos de un orgánulo
tiene un papel clave en el metabolismo del 'Ca. A. ciliaticola'. De manera similar, mitocondrial, que probablemente sea capaz de realizar un metabolismo hidrogenosomal
los genes relacionados con la conservación de energía, incluida la ATP sintasa (Fig. 4).
(atpA a atpH) y los genes de desnitrificación (narG, narH, narI, nirK, norB, norC La supuesta presencia de hidrogenosomas en el huésped existente implica que,
y nosZ), se encontraban entre los que mostraban la transcripción más alta (Fig. en algún momento, su antepasado poseyó mitocondrias aeróbicas. Sin embargo ,
3b) y, en conjunto , encontramos que más de la mitad del esfuerzo transcripcional en un huésped que es capaz de realizar respiración aeróbica, es poco probable que
de 'Ca. A. ciliaticola' se dedicó a la producción y conversión de energía (Datos ampliados, figura de
la adquisición 7). un endosimbionte desnitrificante haya aumentado la aptitud del
Fundamentalmente, el 'Ca. El genoma de A. ciliaticola también contiene un huésped lo suficiente como para garantizar una integración estable. Por tanto, es
supuesto gen translocasa (tlcA) de ATP y ADP (en adelante, ATP/ADP) que codifica más probable que el huésped ciliado ya fuera un anaerobio obligado que contenía
una proteína transportadora de nucleótidos de dominio único. Estas proteínas hidrogenosomas antes de la adquisición del predecesor de 'Ca. A. ciliati­ cola' (Fig.
transportadoras de nucleótidos tienen funciones canónicas en la transferencia de 4). Un eucariota en fermentación que poseyera sólo medios rudimentarios de
energía en plastidios y parásitos intracelulares, aunque estas podrían no ser sus generación de energía se habría beneficiado considerablemente de la adquisición de
únicas funciones39. La CA. La proteína transportadora de nucleótidos de A. ciliaticola una bacteria con capacidad de respiración anaeróbica de nitrato y producción
quimiosmótica
tiene varios residuos conservados que son críticos para la función y la especificidad del sustrato del ATP/de ATP. El efecto positivo del ' Ca. El endosimbionte de A. ciliaticola
Translocasas de ADP (Datos ampliados, figura 9, discusión complementaria). sobre la aptitud del huésped ciliado podría explicar nuestra observación de que sólo
Además, el gen tlcA se encontraba entre los diez 'Ca' con mayor transcripción. Genes 'Ca. Se observaron ciliados que contienen A. ciliaticola en las profundas aguas
de A. ciliaticola, junto con otros genes que participan en la conservación de energía anóxicas que contienen nitrato del lago Zug (Tabla complementaria 1).
(Fig. 3b). Sobre esta base, especulamos que el transportador de nucleótidos TlcA
sirve para intercambiar ATP y ADP entre 'Ca. A. ciliaticola ' y su huésped. Como 'Ca. El predecesor de 'Ca. A. ciliaticola' puede haber entrado en su huésped
A. ciliaticola carece de la capacidad de sintetizar nucleótidos de novo; esta proteína como parásito, ya que muchos miembros de los grupos relacionados
transportadora de nucleótidos también podría estar implicada en la absorción de Legionellales y Francisellales son parásitos. Alternativamente, el predecesor
nucleótidos distintos del ATP y el ADP. bacteriano podría haber sido adquirido mediante endocitosis y luego persistir
Como se sabe por otros endosimbiontes obligados, el genoma de 'Ca. intracelularmente después de lograr escapar de la digestión, como se ha
A. ciliaticola' presumiblemente ha conservado rasgos que son beneficiosos sugerido previamente para algunas bacterias41. En cualquier caso, la proteína
para el huésped. Dado que el genoma altamente reducido de 'Ca. A. ciliaticola que probablemente fue fundamental para la integración de la bacteria en su
ha conservado un amplio potencial genético para el metabolismo energético, huésped es el transportador ATP/ADP. Los análisis filogenéticos mostraron que
por lo que la función principal de este endosimbionte parece ser la producción la supuesta translocasa ATP/ADP de 'Ca. A. ciliaticola' agrupaciones con
de ATP para su huésped. A este respecto, la función de 'Ca. A. ciliaticola ' secuencias transportadoras de nucleótidos en su mayoría alfaproteobacterianas
evoca fuertemente las mitocondrias y los hidrogenosomas (es decir, orgánulos de secuencias metagenómicas no caracterizadas relacionadas con Holosporales
proveedores de energía eucarióticos). Sobre la base de nuestra combinación o Caedibacter (Datos ampliados , Fig. 10), que se sabe que son parásitos intracelulares o

Naturaleza | Volumen 591 | 18 de marzo de 2021 | 449

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Artículo
de ciliados42,43. Considerando que el predecesor de vida libre de 'Ca. A. ciliaticola '
era una gammaproteobacteria, especulamos que la translocasa ATP/ADP podría
haberse obtenido mediante transferencia genética lateral de un donante
alfaproteobacteriano (por ejemplo, relacionado con Holospora) ( Discusión
complementaria). En este punto, no está claro si la transferencia lateral del gen ocurrió
antes o después de la absorción del predecesor de 'Ca. A. ciliaticola' por los ciliados
(Fig. 4).
En su forma actual, 'Ca. A. ciliaticola' codifica únicamente la cadena
20. Fenchel, T. y Finlay, BJ en Archaea metanogénica (endo)simbiótica (ed. Hackstein, JHP)
respiratoria de desnitrificación. Esto es digno de mención ya que casi todos los 1–11 (Springer, 2010).
organismos desnitrificantes pro y eucariotas conocidos hasta la fecha poseen 21. Stairs, CW, Leger, MM & Roger, AJ Diversidad y orígenes del metabolismo anaeróbico en mitocondrias y orgánulos
relacionados. Fil. Trans. R. Soc. Londres. B 370, 20140326 (2015).
una cadena respiratoria híbrida que también es capaz de respirar oxígeno38,44. 22. Risgaard­Petersen, N. et al. Evidencia de desnitrificación completa en un foraminífero bentónico.
Sobre esta base, parece probable que el predecesor de 'Ca. A. ciliaticola' Naturaleza 443, 93–96 (2006).
adquirida por el huésped ciliado era una bacteria desnitrificante anaeróbica 23. Woehle, C. et al. Una nueva vía de desnitrificación eucariota en foraminíferos. actual. Biol. 28,
2536–2543.e5 (2018).
facultativa (Fig. 4). Posteriormente, podría haber perdido su capacidad de 24. Glock, N. et al. Preferencia metabólica del nitrato sobre el oxígeno como aceptor de electrones en foraminíferos de
respirar oxígeno al volverse superfluo en un ciliado que habitaba exclusivamente la zona mínima de oxígeno del Perú. Proc. Acad. Nacional. Ciencia. Estados Unidos 116, 2860–2865 (2019).
en aguas anóxicas. Sin embargo, cualquier pérdida de gen en 'Ca. A. ciliaticola
25. Shoun, H. & Tanimoto, T. Desnitrificación por el hongo Fusarium oxysporum y
también podría ser el resultado de la deriva genética, que se sabe que afecta Participación del citocromo P­450 en la reducción de nitritos respiratorios. J. Biol. Química. 266, 11078–11082
a los endosimbiontes obligados con poblaciones pequeñas y flujo genético restringido31. (1991).
A lo largo de su existencia, 'Ca. A. ciliaticola 'ha evolucionado hasta convertirse 26. Kobayashi, M. et al. Desnitrificación, un nuevo tipo de metabolismo respiratorio en hongos
en un endosimbionte obligado con un papel distinto en la respiración y la
generación de energía para su huésped; En los eucariotas, estas funciones están
tradicionalmente reservadas a las mitocondrias y orgánulos relacionados. Aunque
el huésped ciliado podría contener orgánulos relacionados con las mitocondrias
(es decir, supuestos hidrogenosomas), parece que en su huésped se están
llevando a cabo funciones mitocondriales por excelencia relacionadas con la
respiración, la cadena de transporte de electrones, la fosforilación oxidativa y la
biosíntesis de grupos de hierro­azufre. endosimbionte.
Por lo tanto , 'Candidatus A. ciliaticola' representa un ejemplo de endosimbionte
obligado que ha conservado funciones celulares muy similares a las de las
mitocondrias, aunque no se originó en la línea de descendencia mitocondrial. Este
descubrimiento plantea la cuestión de si otros endosimbiontes procarióticos pueden
permitir a los eucariotas aprovechar el amplio conjunto de aceptores de electrones
disponibles en la naturaleza.
Contenido en línea
Cualquier método, referencias adicionales, resúmenes de informes de Nature
Research , datos fuente, datos ampliados, información complementaria,
agradecimientos, información de revisión por pares; detalles de las contribuciones
de los autores y los intereses en competencia; y las declaraciones de
Parasitol. 41, 1421­1434 (2011).
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Financiación Financiación de acceso abierto proporcionada por la Sociedad Max Planck.
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esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
© El autor (es) 2021
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Métodos
No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Los
experimentos no fueron aleatorios y los investigadores no estaban cegados a la asignación
durante los experimentos y la evaluación de resultados.
Etimología
La designación 'Azoamicus' combina el prefijo azo­ (nuevo latín, perteneciente al nitrógeno)
con amicus (latín, sustantivo masculino, amigo); dando así azoamicus ('amigo que pertenece
al nitrógeno'), en alusión a su papel como endosimbionte desnitrificante. 'Ciliáticola' combina
ciliado (refiriéndose a un grupo de protozoos ciliados) con el sufijo ­cola (derivado del
sustantivo masculino latino incola, morador, habitante), lo que significa 'morar dentro de un
ciliado'.
Perfil geoquímico
Llevamos a cabo muestreos para perfiles geoquímicos en septiembre de 2016 y octubre
de 2018 en una sola estación ubicada en la profunda cuenca del sur del lago Zug
(aproximadamente 197 m de profundidad de agua) (47° 06′ 00,8′′ N, 8° 29′ 35,0''E). En
septiembre de 2016 utilizamos una sonda multiparamétrica para medir conductividad,
turbidez, profundidad (presión), temperatura y pH (XRX 620, RBR). El oxígeno disuelto se
monitoreó en línea con microoptodos normales y de trazas (tipos PSt1 y TOS7, Presens)
con límites de detección de 125 y 20 nM, respectivamente, y un tiempo de respuesta de 7
s. En octubre de 2018, utilizamos un CTD (CTD60, Sea&Sun Technology) equipado con
un sensor de oxígeno tipo Clark (precisión ± 3%, resolución 0,1%) para registrar los perfiles
de oxígeno.
Coleccion de muestra
En septiembre de 2016 y octubre de 2018 se recolectó agua para análisis masivos de ADN
y ARN. La recolección de muestras para la extracción de ADN y ARN en septiembre de
2016 se describió anteriormente46. En octubre de 2018 se tomaron muestras de agua con
una botella Niskin (Hydro­Bios) de 160 m, 170 m y 180 m. Para cada profundidad, se
filtraron directamente 2 litros de agua del lago a bordo de nuestro barco en cartuchos de
filtro Sterivex de 0,22 μm (Merck Millipore) utilizando una bomba peristáltica, posteriormente
se purgaron con una solución de conservación RNAlater (Life Technologies) y se
almacenaron a ­20 °C hasta más procesamiento . Para los análisis de hibridación
fluorescente in situ (FISH), se fijó agua de las mismas profundidades a bordo del barco con
formaldehído ( concentración final del 1,5%; Electron Microscopy Sciences) y se incubó en
una caja fría fría durante aproximadamente 6 h antes de la filtración en 3 μm. Filtros de
policarbonato (Merck Millipore). En mayo de 2019 se recolectaron muestras adicionales
de PECES utilizando el mismo enfoque a 189 m de profundidad de agua.
En mayo de 2019 se tomaron muestras de agua para experimentos de incubación y
PCR de un solo ciliado a una profundidad de 189 m utilizando una botella Go­Flo de 10 l
(General Oceanics), se llenó en botellas de vidrio de 2,5 l sin espacio superior, se cerró
con tapones de caucho butílico y se mantuvo. frío (a unos 4 °C) y oscuro hasta su posterior
manipulación. Durante el muestreo, la contaminación por oxígeno se minimizó desbordando
la botella con agua de lago anóxica.
Para análisis combinados de FISH y microscopía de contraste de interferencia
diferencial , se recogieron ciliados vivos individuales del agua del lago (de 186 m de
profundidad, recolectados en febrero de 2020) y se fijaron directamente en portaobjetos
de microscopio. En resumen, los portaobjetos de microscopio se trataron con 0,1 mg ml­1
poli­l­lisina durante 10 min a temperatura ambiente, se lavó con agua MilliQ y se secó.
Los ciliados se enriquecieron previamente mediante flujo por gravedad de agua a
granel del lago a través de un filtro de membrana de 5 μm y se recogieron utilizando
un capilar de vidrio bajo un microscopio binocular. Los ciliados seleccionados se
transfirieron a una gotita de formaldehído (2% en PBS 0,1 ×, pH 7,6) en portaobjetos
de microscopio recubiertos con poli­l­lisina , se incubaron (durante 1 hora a
temperatura ambiente) y se lavaron con agua MilliQ. FISH se realizó como se
describe en 'Microscopía e hibridación in situ de fluorescencia de sonda de oligonucleótidos marcada
rRNA
con coincidencias perfectas con la secuencia de la sonda eub62A3_813 en un
Mediciones de nutrientes
Se recuperaron muestras de agua para mediciones de nutrientes (amonio, gen 16S rRNA de 'Ca. A. ciliaticola'. Las lecturas restantes compartieron >94% de
NOx y nitrito) con un muestreador de jeringa desde 15 profundidades discretas. identidad con 'Ca. A. ciliaticola' y todas compartidas como secuencias de grandes éxitos
en y debajo de la base de la oxiclina. Se inyectaron directamente cuarenta ml de agua en
un tubo Falcon de 50 ml que contenía 10 ml de reactivo OPA para la cuantificación
fluorométrica de amonio47. En 2018, la concentración de amonio se determinó utilizando
el mismo método, excepto que el agua del lago se filtró de forma estéril inmediatamente
después del muestreo y se congeló a ­20 °C hasta su posterior procesamiento. Para la
cuantificación de NOx , se filtraron de forma estéril 10 ml de agua en un tubo Falcon de 15
ml y se determinó la concentración combinada de nitrato y nitrito mediante un analizador
de flujo segmentado QuAAtro comercial (SEAL Analytical).
Construcción de biblioteca de clones y secuenciación de Sanger.
Los cebadores del gen 16S rRNA específicos de 'Candidatus A. ciliaticola' se diseñaron
sobre la base del método 'Ca. Secuencia del genoma ensamblado en metagenoma circular
de A. ciliaticola . Los cebadores se dirigieron a las regiones espaciadoras intergénicas
aproximadamente 50 pb aguas arriba y abajo del gen 16S rRNA, lo que dio como resultado
un producto de PCR de 1.568 pb de longitud. Para la construcción de bibliotecas clonadas, el 'Ca.
El gen 16S rRNA de A. ciliaticola se amplificó mediante un enfoque de PCR anidado a
partir del mismo extracto de ADN utilizado para la secuenciación del metagenoma obtenido
en septiembre de 2016 a 160 m de profundidad de agua utilizando el nuevo diseño 'Ca.
Cebadores específicos de A. ciliaticola (eub62A3_29F y eub62A3_1547R) seguidos de
amplificación por PCR con cebadores del gen 16S rRNA bacteriano general (8F y 1492R)
(Tabla complementaria 2). La clonación y construcción de la biblioteca de clones se
describe con más detalle en Métodos complementarios. Se secuenciaron insertos de
plásmidos purificados de cinco clones mediante secuenciación Sanger utilizando el kit de
secuenciación BigDye Terminator v.3.1 (Thermo Fisher Scientific) y los cebadores M13f o
M13r. La PCR de secuenciación contenía 3 µl de plásmido purificado, 0,5 µl de tampón de
secuenciación 10X, 0,5 µl de cebador (10 µM) y 1 µl de reactivo BigDye. Las reacciones de
PCR se realizaron de la siguiente manera: 99 ciclos (rampa de 1 °C s­1 ) de desnaturalización
(10 s a 96 °C), hibridación (5 s a 60 °C) y elongación (4 min a 60 °C). Los productos de la
PCR se purificaron mediante filtración en gel (Sephadex G­50 Superfine , Amersham
Bioscience) seguido de secuenciación Sanger ( analizador genético 3130xl, Applied
Biosystems). Las secuencias de Sanger se recortaron y ensamblaron con calidad usando
Sequencher v.5.4.6 y configuraciones estándar antes de recortar las secuencias de vector
y cebador.
Diseño de sonda para hibridación fluorescente in situ.
Para visualizar 'Ca. A. ciliaticola' en el medio ambiente, diseñamos una sonda
FISH específica sobre la base del 'Ca. Secuencia del gen del ARNr 16S
ensamblado en metagenoma circular de A. ciliaticola y secuencias
estrechamente relacionadas dentro del clado eub62A3. La CA. La secuencia
del gen 16S rRNA de A. ciliaticola se importó a Arb48 v.6.1 y se alineó con la
base de datos SILVA SSU Ref NR 99 132 utilizando SINA­Aligner49. Una
sonda FISH específica para 'Ca. Se diseñó A. ciliaticola' y la mayoría de los
miembros del clado eub62A3 (sonda eub62A3_813 5' CTAACAGCAAGTTTTTCATCGT
(Tabla complementaria 3) utilizando la herramienta de diseño de sonda
implementada en Arb, y refinada y evaluada manualmente in silico usando
MathFISH50. La sonda de nuevo diseño eub62A3_813 apunta a 'Ca. A.
ciliaticola' y el 78% de la 'Ca. Secuencias de los subgrupos A y B de
Azoamicus incluidas en SILVA SSU Ref NR 99 138 (7 de 9; las 2 secuencias
que no están dirigidas pertenecen al subgrupo B de 'Ca. Azoamicus') y no
muestran aciertos no objetivo. Algunas secuencias en la base de datos
tenían solo 1 o 2 coincidencias débiles (<0,5 coincidencias ponderadas) con
la secuencia de la sonda. Para garantizar la especificidad en nuestros
experimentos FISH y excluir la detección de organismos no objetivo,
diseñamos sondas competidoras sin marcar para estas secuencias con desajustes débile
ACAGCAAGTTTCTCATGTTTA 3′ y competidor 2, 5′ CCAACAGCAAGTT
CTCATCGTTTA 3′) (Tabla complementaria 3). Estas sondas competidoras se incluyeron
en todos los experimentos FISH (excluyendo el clon­FISH). Para garantizar aún más que
no hubiera organismos no objetivo en nuestras muestras, buscamos lecturas del gen 16S
doble '.
metagenoma (Zug 2018, 180 m).
Casi todas las lecturas (82 de 86) tenían >98% de identidad con la secuencia del
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Artículo
perteneciente a 'Ca. El subgrupo A de Azoamicus cuando se compara con la base
de datos NCBI nr (consultada en junio de 2020).
Pez clon
Clone­FISH se realizó como se describió anteriormente51. En resumen, un plásmido
purificado que contiene 'Ca. La secuencia del gen 16S rRNA de A. ciliaticola (como
se describe en 'Construcción de bibliotecas de clones y secuenciación de Sanger')
en la orientación correcta (confirmada por PCR utilizando cebadores M13F y 1492R)
se transformó en células electrocompetentes de Escherichia coli JM109(DE3)
(Promega) mediante electroporación utilizando el sistema Cell Porator and Voltage
Booster (Gibco) con configuraciones de 350 V, capacitancia de 330 μF, baja
10 minutos a temperatura ambiente) y se fijaron durante 1 hora a temperatura ambiente.
impedancia de ohmios, velocidad de carga rápida y resistencia de 4 kΩ (Voltage Booster).
Después de la electroporación, las células se transfirieron a medio SOC (Sigma
Aldrich), se incubaron durante 1 hora a 37 °C y se sembraron en placas LB que
contenían 100 mg l­1 de kanamicina. Después de la incubación durante la noche a
37 °C, se seleccionaron 4 clones y se comprobó la presencia del inserto con PCR
(cebadores M13F y 1492R) como se describe en 'Construcción de bibliotecas de
clones y secuenciación de Sanger', seguido de electroforesis en gel. Se seleccionó
al azar un clon con inserción positiva y se cultivó en medio LB que contenía 100 mg
l­1 de kanamicina a 37 °C hasta que la densidad óptica a 600 nm alcanzó 0,37. La
transcripción del inserto de plásmido se indujo usando isopropil β­d­1­
tiogalactopiranósido (IPTG) (concentración final de 1 mM). Después de la adición de
IPTG, las células se incubaron durante 1 h a 37 °C, seguido de la adición de 170
mg l­1 de cloranfenicol y la posterior incubación durante 4 h.
Las células se recogieron mediante centrifugación, se fijaron en solución de
formaldehído al 2% durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron y almacenaron
a 4 °C en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) que contenía etanol al
50% hasta su posterior procesamiento. Las curvas de fusión de formamida52 se
llevaron a cabo utilizando un equipo de 'Ca. Sonda marcada con HRP, específica de
Azoamicus (eub62A3_813) ( Datos ampliados, figura 5). En resumen, las células
se aplicaron a portaobjetos de vidrio. La permeabilización con lisozima, inactivación
de peroxidasa, hibridación ( formamida al 10%, 30%, 35%, 40%, 45% y 50%) y
amplificación de la señal de tiramida (Oregon Green 488) se realizaron como se describió('Ca. A. ciliaticola ') y 18S rRNA (huésped ciliado) se amplificaron por separado
Para cada concentración de formamida, se registraron imágenes de tres campos de
visión usando el mismo tiempo de exposición para todas las concentraciones de
formamida , que se optimizó al 10% de formamida en todas las mismas
configuraciones usando un microscopio Axio Imager 2 (Zeiss) y se analizó usando
Daime 2.154.
Microscopía e hibridación in situ fluorescente con sonda de oligonucleótidos
doblemente marcada
La hibridación con sondas de oligonucleótidos doblemente marcadas (terminalmente
doblemente marcadas con colorante Atto488; los detalles de la sonda se encuentran
en la Tabla complementaria 3) (Biomers) y la contratinción con DAPI se realizó
como se describió anteriormente55. En resumen, las muestras (ya sean secciones
de filtro cortadas o ciliados recogidos y fijados en un portaobjetos de vidrio, como se
describe en 'Recolección de muestras') se incubaron en un tampón de hibridación
que contenía formamida al 25 % y 5 ng de ADN μl­1 de sonda (se usó la misma
concentración para eub62A3_813 competidor 1 y 2) durante 3 h a 46 °C, y
posteriormente se lavó en tampón de lavado precalentado (EDTA 5 mM, NaCl 159
mM) durante 30 min a 48 °C. Después de un breve lavado con agua MilliQ, las
muestras se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente en una solución
DAPI (1 μg ml­1), se lavaron brevemente en agua MilliQ y se secaron al aire. Las
secciones de filtro se montaron sobre portaobjetos de vidrio. Las muestras se
incluyeron en Prolong Gold Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific) y se dejaron
curar durante 24 h. El escaneo láser confocal y la microscopía de contraste de
interferencia diferencial se realizaron en un Zeiss LSM 780 (Zeiss, objetivo de aceite
de 63 × , apertura numérica de 1,4, con prisma de contraste de interferencia
diferencial). Se obtuvieron imágenes de pila Z para capturar células ciliadas
completas y se proyectaron imágenes de fluorescencia de la sonda FISH y señales
DAPI en 2D para su visualización. El recuento de células se realizó utilizando un
microscopio Axio Imager 2 (Zeiss) en campos de visión seleccionados aleatoriamente
( objetivo de 40 ×, longitud de rejilla = 312,5 μm) en filtros de policarbonato (tamaño
de poro de 3 μm , diámetro de filtro efectivo de 32 mm; Merck Millipore) sobre el que
se filtraron 0,5 l de agua de lago fijada con PFA.
Para la microscopía óptica, se recogieron ciliados vivos del agua del lago Zug
(mayo de 2019, 189 m) y se prepararon para obtener imágenes de ciliados vivos
utilizando microscopía óptica como se describió anteriormente en un microscopio
Axio Imager 2 (Zeiss). Para la adquisición y procesamiento de imágenes se utilizó
Zeiss ZEN (edición azul) 2.3.
Microscopía electrónica de barrido
Los ciliados de los que se tomaron muestras en febrero de 2020 se seleccionaron
individualmente bajo un microscopio binocular y se lavaron con gotitas de agua de lago filtrada esterilizada.
Luego, los ciliados lavados se transfirieron a aproximadamente 200 µl de fijador
encima de una oblea de silicio recubierta de polilisina (0,1 mg ml­1 poli­l­lisina durante
El fijador contenía glutaraldehído al 2,5% (v/v, grado de microscopía electrónica) en
tampón PHEM57 (pH 7,4). Los ciliados fijos adheridos a la oblea de silicio se
deshidrataron en una serie de etanol (30%, 50%, 70%, 80%, 96% y 100%) antes del
secado automatizado en el punto crítico (EM CPD300, Leica).
La microscopía electrónica de barrido se realizó en un Quanta FEG 250 (FEI). Las
imágenes se obtuvieron utilizando FEI xTM v.6.3.6.3123 a un voltaje de aceleración
de 2 kV en condiciones de alto vacío y se capturaron utilizando un detector de
electrones secundario Everhart­Thornley. La imagen representa un conjunto integrado
y con corrección de deriva de 128 imágenes capturadas con un tiempo de
permanencia de 50 ns.
PCR de un solo ciliado
Los ciliados se recogieron del agua del lago Zug (189 m, 2019) bajo el
microscopio binocular con una micropipeta de vidrio y posteriormente se lavaron
dos veces con gotas de agua estéril libre de nucleasas (Ambion) antes de
transferirlos a un tampón de lisis. El ADN se extrajo utilizando el kit de
purificación de ADN Master­Pure (Ambion) siguiendo las instrucciones del
fabricante con una elución final en tampón TE 1x (25 µl). En general, se extrajo
ADN de cuatro ciliados individuales (S1­S4), cinco (C5) y diez ciliados agrupados
(C10), así como de ningún ciliado (control). Las secuencias de los genes 16S
previamente53.
mediante PCR utilizando los pares de cebadores eub62A3_29F/_1547R y
cil_384F/_1147R. Reacciones de PCR (20 µl) con 'Ca. Los cebadores
específicos de A. ciliaticola (eub62A3_29F/_1547R) se realizaron como se
describe en ' Construcción de bibliotecas de clones y secuenciación de Sanger'
con las siguientes modificaciones : plantilla de 5 µl, temperatura de hibridación
de 58 °C y 40 ciclos de amplificación. La PCR con cebadores específicos de
ciliados (cil_384F/_1147R) se realizó de manera análoga con las siguientes
modificaciones: temperatura de hibridación de 55 °C , alargamiento de 50 s y
35 ciclos de amplificación. Las reacciones de PCR con los pares de cebadores
eub62A3_29F/_1547R se amplificaron aún más en una segunda ronda de PCR
(en las mismas condiciones) utilizando 2 µl de reacción de PCR de la primera
ronda. Para cada paso de la PCR, se verificó la amplificación exitosa de los
productos mediante electroforesis en gel como se describe en Métodos
complementarios. Posteriormente, las reacciones de PCR se purificaron
utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante con una elución final en agua estéril libre de
nucleasas (25 µl) (Ambion). Las reacciones de PCR purificadas se secuenciaron
posteriormente usando secuenciación Sanger y se procesaron como se
describe en 'Construcción de bibliotecas de clones y secuenciación Sanger' con
las siguientes modificaciones: cebadores eub62A3_29F, eub62A3_1547R
(temperatura de hibridación 58 °C) o cil_384F, cil_1147R (temperatura de
hibridación 55 °C ). Dos de los extractos de ADN de un solo ciliado amplificados
con los cebadores específicos de endosimbionte mostraron una banda débil (S4) o ningun
Extracción de ácido nucleico del agua del lago.
La extracción masiva de ADN y ARN, así como la secuenciación de
metagenomas y metatranscriptomas de muestras de agua de lago recolectadas
en 2016, se han descrito previamente46. Para las muestras de 2018, los filtros
se purgaron de RNAlater, se enjuagaron brevemente con agua libre de
nucleasas y se retiraron del cartucho Sterivex. Luego se extrajeron el ARN y el
ADN de filtros separados utilizando kits de aislamiento de ADN o ARN
PowerWater (MoBio Laborato­ries) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
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Secuenciación de metagenomas y metatranscriptomas masivos. Análisis metatranscriptómicos de muestras de agua a granel.

Para la secuenciación metagenómica, las bibliotecas de ADN se prepararon El recorte de lecturas metatranscriptómicas de Illumina sin procesar y la eliminación de
según lo recomendado por el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext secuencias de ARNr se realizaron como se describió anteriormente46. Luego , las
Ultra II FS para Illumina (New England Biolabs). La secuenciación por síntesis lecturas que no eran de ARNr se asignaron al genoma de 'Ca. A. ciliaticola' usando Bowtie271
se realizó en el secuenciador Illumina HiSeq2500 (Illumina Inc.) con el modo de v.2.2.1.0 y parámetros estándar. Los archivos BAM ordenados e indexados se generaron
lectura de 2 × 250 pb. Para la secuenciación metatranscriptómica, se eliminó el utilizando samtools72 v.0.1.19 y las transcripciones por función (basadas en la anotación
ARNr (kit de eliminación de ARNr Ribo­Zero para bacterias (Illumina)) y se de Prokka) se cuantificaron utilizando EDGE­pro73 v.1.3.1 y la configuración estándar.
preparó una biblioteca de secuenciación de ARN de acuerdo con el kit de Posteriormente, la transcripción genética se cuantificó como transcripciones por millón74
preparación de biblioteca de ARN direccional NEBNext Ultra II para Illumina (New England Biolabs).la fórmula:
(TPM) utilizando
La secuenciación por síntesis se realizó en el secuenciador Illumina HiSeq3000 (Illumina)
Ci 1 6
con el modo de lectura de 1 × 150 pb. La preparación de la biblioteca y la secuenciación TPM = × yo l ∑ × 10
Ci
fueron realizadas por el Centro del Genoma Max Planck de Colonia (http://mpgc.mipz.mpg.de/ yo i
yo

home/). La información detallada para cada conjunto de datos metagenómicos y

metatranscriptómicos se puede encontrar en la Tabla complementaria 4. para asignar a cada característica (i) un valor de TPM, en el que c = recuento de características,
l = longitud (en kb) y j = todas las características.
La visualización y el trazado de la cobertura de lectura se realizaron utilizando
Ensamblaje y acabado del genoma. pyGenomeTracks75 (cobertura promedio en contenedores de 100 pb) implementado en
El genoma de 'Ca. A. ciliaticola' se reconstruyó a partir de un conjunto de datos deepTools276 v.3.2.0.
metagenómicos muestreados en 2018, de la siguiente manera: las lecturas metagenómicas
(MG_18_C) se recortaron usando Trimmomatic58 v.0.32 como se describió anteriormente46 Análisis filogenéticos
y ensamblado usando metaSPAdes59 v.3.13.0 y longitudes de k­mer de 21, 33, 55, 77, 99 La secuencia del gen 16S rRNA de longitud completa se recuperó del genoma
y 127. A partir de este ensamblaje, se obtuvieron cóntigos con alta similitud con el 'Ca. El ensamblado con metagenoma circular de 'Ca. A. ciliaticola' usando RNAmmer77
genoma de A. ciliaticola de las muestras de metagenoma de 2016 (se proporcionan más v.1.5, alineado usando el alineador incremental SILVA49 (SINA 1.2.11) e importado a la
detalles en Métodos complementarios) se identificó mediante blastn (identidad >95 %) y base de datos SILVA SSU NR9945 (versión 132) usando ARB48
las lecturas metagenómicas se asignaron a los contigs utilizando BBmap60. v.6.1. BLASTN identificó secuencias adicionales del gen 16S rRNA estrechamente
relacionadas en la base de datos de nucleótidos no redundantes del NCBI y JGI IMG/
v.35.43 (mínimo = 0,98). Posteriormente, las lecturas mapeadas se volvieron a M 16S rRNA Public Assembled Metagenomes (consultado en julio de 2018) y también
ensamblar usando SPAdes v.3.13.0 con el corrector de discrepancias y el umbral de las importó a ARB. Se calculó un árbol filogenético de máxima probabilidad de
cobertura habilitado (­­careful ­­cov­cutoff 60), lo que resultó en el ensamblaje de un secuencias del gen 16S rRNA utilizando RAxML78 v.8.2.8 integrado en ARB con el
único contig (292,647 pb) que se circularizó recortando el mismo extremos modelo GAMMA de heterogeneidad de tasa y el modelo de sustitución GTR con 100
superpuestos (127 pb) dando lugar al genoma cerrado (292,520 pb). bootstraps. La alineación no estaba restringida por una máscara o filtro de ponderación.
La posición inicial se estableció en una región espaciadora intergénica cerca del Para el árbol completo que se muestra en la Fig. 4 de datos ampliados, se pueden
máximo de la curva de disparidad de GC generada con oriFinder61 v.1.0. Los dos agregar 'Ca. Las secuencias de A. ciliaticola obtenidas de una biblioteca de clones y
genomas ensamblados con metagenomas circulares ensamblados de forma ciliados individuales individuales se agregaron al árbol utilizando el algoritmo
independiente (de metagenomas de 2016 y 2018 (Métodos complementarios)) Parsimony 'Quick add' implementado en ARB.
compartían una identidad del 99,99%. Para todos los análisis posteriores, se utilizó Para la filogenia de los ciliados, las secuencias obtenidas de la secuenciación de
el genoma reconstruido a partir del conjunto de datos de 2018 debido a una mayor cobertura.
Sanger de ciliados seleccionados se agregaron a la alineación del subgrupo EukRef­
Ciliphora30 Plagiopylea utilizando el servicio en línea MAFFT79 versión 7 (argumento: ­
Anotación del genoma y análisis comparativos. ­agregar fragmentos). Se obtuvo una secuencia del gen 18S rRNA de longitud
La anotación del genoma se realizó utilizando una versión modificada de Prokka62. completa ensamblada en metagenoma adicional asignada a Plagiopylea usando
v.1.13.3 para permitir la anotación de genes que se superponen con genes de ARNt. La phyloFlash80 v.3.0 de uno de los metagenomas de Lake Zug (MG_18_C) y
anotación de genes metabólicos clave se inspeccionó y refinó manualmente mediante también se agregó a la alineación (argumento:­­add). Se calculó un árbol
búsquedas en proteínas no redundantes del NCBI o en una base de datos de dominio filogenético utilizando el servidor web IQ­TREE (http://iqtree.cibiv.univie.
conservado63. Los transportadores transmembrana se predijeron y clasificaron utilizando ac.at) ejecutando IQ­TREE81 1.6.11 con configuración predeterminada y selección
el servicio web Transporter Automatic Annotation Pipeline64 y la Transporter Classification automática del modelo de sustitución (modelo de mejor ajuste: TIM2+F+I+G4). Los
Database65. Los pseudogenes se predijeron utilizando pseudo finder66 v.0.11 y árboles filogenéticos se visualizaron utilizando el servicio web Interactive Tree of Life v.482.
configuraciones estándar. Los mapas circulares del genoma se crearon utilizando Para el árbol filogenético de la translocasa ATP/ADP, las secuencias de aminoácidos
DNAplotter67 v.18.1.0. se recuperaron de NCBI RefSeq (250 resultados principales) y NCBI nr (15 resultados
Para análisis comparativos, se utilizaron CDS codificantes de proteínas codificadas en los principales) (ambos consultados en junio de 2019) utilizando el servicio web NCBI
genomas de insectos endosimbiontes (C. ruddii PV, AP009180.1 y B. aphidicola BCc, blastp83 con la secuencia de aminoácidos de ATP/ Secuencia de translocasa ADP de
CP000263.1), mitocondrias de J. libera (NC_021127) y un pariente de vida libre de 'California. 'Ca. A. ciliaticola' (ESZ_00147) como consulta. También se agregaron secuencias de
A. ciliaticola' (L. clemsonensis, CP016397.1) se descargaron del NCBI GenBank. Además, CDS aminoácidos adicionales de transportadores de nucleótidos caracterizados enumerados
codificante de proteínas del endosimbionte ciliado C. taeniospiralis en la Tabla complementaria 8 . Después de eliminar los duplicados, las secuencias se
agruparon con una identidad del 95 % usando usearch84 v.8.0.1623 y se alinearon usando MUSCLE
(PGGB00000000.1) se obtuvieron utilizando la anotación Prokka. La v.3.8.31. La construcción del árbol filogenético utilizando IQ­TREE (modelo de mejor ajuste:
clasificación de categorías funcionales se realizó utilizando el servicio web LG+F+I+G4) y la visualización se realizó como se describe para el árbol filogenético del
eggNOG­mapper v.168 con el modo de mapeo DIAMOND y configuraciones estándar. gen 18S rRNA.
La clasificación de la categoría funcional C (producción y conversión
de energía) para el 'Ca. A. ciliaticola' se modificó para incluir también norB Experimentos de incubación
y nirK, que fueron agrupados por eggNOG en diferentes categorías Se realizaron experimentos de incubación para proporcionar evidencia
(Q y P, respectivamente). experimental de la actividad desnitrificante vinculada al huésped ciliado. Se
Alineamiento de secuencias múltiples de 'Ca. A. ciliaticola' y otras establecieron tres incubaciones que no contenían (a) ciliados (fracción
filtrada), (b) agua del lago enriquecida en ciliados (fracción enriquecida) y (c)
translocasas de ATP/ADP plastídicas y bacterianas se generaron utilizando MuscleWS69
v.3.8.31 con la configuración predeterminada implementada en Jalview70 v.2.11.1.0. agua del lago a granel. Para estos experimentos, el agua del lago se fraccionó en tamañ
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usando un filtro de policarbonato de 10 μm (Merck Millipore) bajo atmósfera de N2 en una
bolsa con guantes a 12 °C. Las fracciones enriquecidas y filtradas se obtuvieron mediante
filtración por gravedad de 0,5 l de agua hasta que quedaron 0,25 l de sobrenadante. Así, en
la fracción enriquecida se concentraron ciliados de 0,5 l de agua de lago en 0,25 l de agua
de lago. En la fracción filtrada, se filtraron los organismos mayores de 10 μm (incluidos los
ciliados). Tanto el agua enriquecida (más filtro) como el agua filtrada se transfirieron a botellas
de suero separadas (sin espacio de cabeza) y se cerraron con tapones de caucho butílico .
Para incubaciones en masa, se llenó directamente agua sin filtrar en botellas de suero de
250 ml en una atmósfera de N2 .
El potencial de desnitrificación se evaluó midiendo la producción de 30N2 a lo largo del
tiempo en incubaciones modificadas con nitrito 15N y nitrato 15N mediante espectrometría
de masas de relación isotópica (Isoprime Precision con ionOS v.4.04, Elementar). Se
estableció un espacio de cabeza de helio de 30 ml para las botellas de suero de 250 ml y el
agua se desgasificó con helio durante 10 minutos para garantizar condiciones anóxicas y
reducir el fondo de N2 . Se suministró una mezcla de nitrato y nitrito marcada con 15 N
(concentración final de 20 μM y 5 μM, respectivamente; Sigma Aldrich) a un porcentaje de
etiquetado del 99 % y el agua se incubó durante un total de 30 h a 4 °C en el oscuro.
Se tomaron submuestras del espacio de cabeza a intervalos de tiempo regulares durante la
incubación retirando 3 ml del espacio de cabeza gaseoso y reemplazando simultáneamente
el volumen eliminado por helio. Esta muestra de gas se transfirió a Exetainers (LabCo) de 12
ml que se llenaron previamente con agua desgasificada con helio y se almacenaron hasta el
análisis. El 30N2 en las muestras de gas se midió en un espectrómetro de masas de relación
isotópica y las tasas de desnitrificación se calcularon a partir de la pendiente del aumento
lineal de 30N2 en el espacio de cabeza a lo largo del tiempo de los experimentos . La tasa
de producción de 30N2 se corrigió por la dilución del espacio de cabeza introducido mediante
el submuestreo y por el porcentaje de etiquetado total de 15N medido. 'California. La
abundancia de ciliados que contienen A. ciliaticola en las diferentes botellas de incubación
se evaluó mediante recuentos microscópicos después de la fijación celular, hibridación FISH
(eub62A3_813) y tinción DAPI como se describe en 'Microscopía e hibridación in situ de
fluorescencia de sonda de oligonucleótidos con doble etiqueta'.
Estadísticas y reproducibilidad
No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra y los
experimentos no fueron aleatorios. Los investigadores no estaban cegados a la asignación
durante los experimentos y la evaluación de resultados.
En la Fig. 1a, la imagen de microscopía electrónica de barrido es representativa de n = 6
imágenes grabadas que se obtuvieron de 1 experimento. En la figura 1b, la imagen de
contraste de interferencia diferencial es representativa de n = 6 imágenes grabadas que se
obtuvieron de 1 experimento.
En la Fig. 2c, datos ampliados, Fig. 2i. Las imágenes de fluorescencia
de FISH (sonda eub62A3_813) son representativas de n = 33 imágenes
grabadas que se obtuvieron de 5 experimentos independientes de 3
muestras biológicas replicadas.
En la Fig. 2c, datos ampliados Fig. 2f, h, j. Las imágenes de fluorescencia DAPI
son representativas de n = 21 imágenes grabadas que se obtuvieron de 5
experimentos independientes de 3 muestras biológicas replicadas.
En la Fig. 2a de datos ampliados, la imagen de fluorescencia FISH (sonda Arch915) es
representativa de n = 6 imágenes que se obtuvieron de 1 experimento. En los datos
ampliados, Fig. 2b, d, las imágenes de autofluorescencia F420 son representativas de n = 11
imágenes grabadas que se obtuvieron de 3 experimentos independientes de 1 muestra. En
los datos ampliados, Fig. 2c, g, las imágenes de fluorescencia FISH (sonda EUB­I) son
representativas de n = 15 imágenes obtenidas de 3 experimentos independientes de 2
muestras biológicas replicadas . En la Fig. 2e de datos ampliados, la imagen de fluorescencia
FISH (sonda NO338) es representativa de n = 15 imágenes grabadas que se obtuvieron de
3 experimentos independientes de 2 muestras biológicas replicadas.
En la Fig. 5a de datos ampliados, cada una de las 6 imágenes de fluorescencia
FISH (sonda eub62A3_813) es representativa de n = 3 imágenes de 1 experimento.
Para las imágenes de fluorescencia mostradas, el número de células
analizadas fue típicamente mucho mayor (n > 100) que las que finalmente
se registraron.
Resumen de informes
Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de
informes de investigación de la naturaleza vinculado a este documento.
Disponibilidad de datos
El genoma anotado de 'Ca. A. ciliaticola 'ha sido depositada en el Archivo Europeo de
Nucleótidos (ENA) bajo el BioProyecto PRJEB27314
(número de acceso LR794158). Secuencias del gen de ARNr de subunidades pequeñas de
'Ca. A. ciliaticola 'y el huésped plagiopileo se han depositado en ENA bajo el BioProyecto
PRJEB27314 y los números de acceso LR798074­
LR798089. Los datos brutos de secuenciación metagenómica y metatranscriptómica
de muestras de agua a granel, así como de transcriptomas de un solo ciliado, se
han depositado en la ENA en el marco del BioProyecto PRJEB36502 utilizando el
servicio de corretaje de datos de la Federación Alemana de Datos Biológicos (GFBio)85.
Los datos de secuenciación metatranscriptómica obtenidos en el año 2016 se depositaron
previamente en el Sequence Read Archive bajo el Bioproyecto PRJNA401219. Las
secuencias disponibles públicamente utilizadas para árboles filogenéticos están disponibles
bajo sus respectivos códigos de acceso en la base de datos de ARNr SILVA (http://www.arb­
silva.de/) (Fig. 2e, Datos ampliados, Fig. 4), JGI Integrated Microbial Base de datos de
genomas y microbiomas (http://img.jgi.doe.gov/) (Fig. 2e), base de datos EukRef­Ciliophora
(https://
github.com/eukref/curation) (Fig. 2f), orthoDB (http://www.orthodb.
org/) (Datos ampliados, figura 6) y base de datos de proteínas NCBI (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/protein/) (Datos ampliados, figuras 9 y 10). Los genomas
utilizados para análisis comparativos están disponibles bajo sus respectivos
códigos de acceso en NCBI (//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/) (Fig. 2b, c).
La información de clasificación de transportadores (Tabla complementaria 6) se
puede encontrar en la base de datos de clasificación de transportadores (http://www.tcdb.
org/). Los datos originales se proporcionan con este documento.
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EUR. J. Bioquímica. 267, 4098–4105 (2000).
Agradecimientos Agradecemos al Instituto Federal Suizo de Ciencia y Tecnología Acuáticas (Eawag) por el uso de su
barco, alojamiento e instalaciones de investigación; A. Zwyssig, C. Dinkel y K. Beck por su ayuda durante las
excursiones; V. Hübner, D. Tienken, N. Rujanski y G. Lavik por su apoyo técnico; N. Lehnen, A. Gruhl y S.
Littmann por su apoyo con la microscopía; H. Marchant, B. Kartal y B. Barker Jørgensen por sus útiles
debates y comentarios sobre el manuscrito; K. Koren por proporcionar nanopartículas sensibles al oxígeno; y L.
van Niftrik y R.
Mesman por su esfuerzo en la preparación de muestras para TEM. Este estudio contó con el apoyo financiero de
Max Planck Gesellschaft y fondos internos de Eawag.
Contribuciones de los autores JSG reconstruyó el genoma de 'Ca. A. ciliaticola', realizó análisis genómicos,
metagenómicos, transcriptómicos y filogenéticos, análisis de PCR y FISH de ciliados únicos, y preparación e
imágenes de muestras por microscopía electrónica de barrido; JSG y CW analizaron datos del transcriptoma de un
solo ciliado; SS llevó a cabo incubaciones y análisis de datos; KK diseñó cebadores y sondas FISH; JSG y KK
construyeron bibliotecas de clones y realizaron clon­FISH; SS y SA diseñaron y realizaron ensayos de
quimiotaxis; BH construyó y secuenció bibliotecas metagenómicas, metatranscriptómicas de agua en masa y
transcriptomas de ciliados únicos, JSG, SS, CJS, MMMK y JM organizaron y llevaron a cabo muestreos y
caracterizaron muestras ambientales; JSG, MMMK y JM diseñaron el estudio, analizaron los datos y escribieron el
manuscrito con contribuciones de todos los demás autores.
Intereses en competencia Los autores declaran no tener intereses en competencia.
Información adicional
Información complementaria La versión en línea contiene material complementario disponible en https://doi.org/
10.1038/s41586­021­03297­6.
La correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse a JSG o JM.
Información de revisión por pares Nature agradece a Thijs Ettema, Michael Ryan, Andreas Schramm y Marc
Strous por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.
La información sobre reimpresiones y permisos está disponible en http://www.nature.com/reprints.
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Artículo
Datos ampliados Fig. 1 | Perfiles fisicoquímicos del lago Zug y abundancia de ciliados que
contienen 'Ca. A. ciliaticola'. a, b, Perfiles de profundidad de oxígeno y NOx
(nitrato + nitrito) en toda la columna de agua inferior del lago Zug medido en 2016 (a) y
2018 (b). En 2018, la abundancia de ciliados que contienen 'Ca. A. ciliaticola'
(mostrada como barras grises en b) inmediatamente debajo de la base de la
La oxiclina (160 m) fue de 3,2 × 103 células por litro (n = 29 células), lo que corresponde a
aproximadamente la mitad de todos los eucariotas unicelulares a esta profundidad. A
180 m, todos los eucariotas investigados eran ciliados que contenían 'Ca. A. ciliaticola', y
su abundancia había aumentado a 24,5 × 103 células por litro (n = 77 células)
(Tabla complementaria 1).
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Datos ampliados Fig. 2 | Imágenes de fluorescencia de ciliados del lago Zug. Sonda de oligonucleótido específica de Azoamicus (eub62A3_813) (amarillo) y
a–e, g, Imágenes de epifluorescencia de ciliados del lago Zug (2018, 180 m) después contratinción con DAPI (cian). Superposición (k) y canales individuales
de la hibridación con una sonda general para arqueas (a) (Arch915), la mayoría de las (eub62A3_813 (i) y DAPI (j)) desde el mismo campo de visión; Las imágenes de fluorescencia
bacterias (c, g) (EUB­I) y un control negativo (e) (NO338). Las imágenes de de una pila z se proyectaron en 2D para su visualización. Dos morfotipos de 'Ca. A.
autofluorescencia F420 (b, d) (en escala de grises) y de la sonda Arch915 (a) no ciliaticola son visibles en las imágenes: células ovoides distribuidas uniformemente
mostraron señales discretas indicativas de arqueas metanogénicas endosimbióticas. Por (de 1,5 a 2 μm de largo) y grupos de células irregulares y densamente empaquetados (de
el contrario, con la sonda EUB­I (c, g) se ven señales claras de bacterias intracelulares 3 a 10 μm de diámetro). El macronúcleo (MAC) con el micronúcleo adherido (flecha gris)
(endosimbióticas o en vacuolas alimentarias) . Las imágenes f, h, j, DAPI muestran la y las supuestas vacuolas alimenticias (V) del ciliado se delinean en la imagen superpuesta
presencia de macronúcleos y micronúcleos, así como endosimbiontes. i – k, (k). En todas las imágenes, las células ciliadas están delineadas con líneas de puntos grises
imágenes de microscopía de barrido láser confocal de dos ciliados después de la hibridación con(campos
'Ca. de visión correspondientes en a y b; c y d; e y f; g y h; e i y k). Barras de escala, 5 μm.
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Artículo

Datos ampliados Fig. 3 | Comportamiento aerotáctico negativo de huéspedes

ciliados expuestos a concentraciones variables de oxígeno. a, Esquema
de una configuración experimental de dos capilares que permite mediciones
simultáneas de oxígeno y seguimiento de ciliados. b, Experimento de referencia
que muestra el posicionamiento de los ciliados en condiciones anóxicas basándose en
3 mediciones después de 0 s, 300 s y 600 s. El posicionamiento se expresa como
densidad de probabilidad y se define como el porcentaje de ciliados a una distancia
específica de la burbuja anóxica. c, Experimentos de quimiotaxis en los que los ciliados
se expusieron a un gradiente de concentración creciente de oxígeno. Estos datos se
extrajeron del vídeo del vídeo complementario 2 con seguimiento simultáneo de
ciliados y determinación de la concentración de oxígeno.
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Datos ampliados Fig. 4 | Afiliación filogenética de 'Ca. A. ciliaticola' dentro de las (C5 y C10), fueron incluidos en el árbol. Los subgrupos A y B de 'Candidatus Azoamicus'
Gammaproteobacterias. Árbol filogenético de máxima verosimilitud basado en la están resaltados en rojo. Cuatro secuencias pertenecientes a
secuencia del gen 16S rRNA de 'Ca. A. ciliaticola' y otros miembros de las Alphaproteobacteria sirvieron como grupo externo (Rickettsia rickettsia, L36217;
Gammaproteobacterias. Las secuencias del gen 16S rRNA derivadas del genoma Magnetospira thiophila, AB021370; Hyphomicrobium methylovorum, AB680579;
ensamblado en metagenoma circular (cMAG 2016 y cMAG 2018) (los detalles se y Rhodobacter blasticus, D16429). Los valores de Bootstrap >70% (de 100 remuestreos)
proporcionan en la Discusión complementaria), así como 'Ca. Secuencias de A. ciliaticola' se muestran delante de los nodos respectivos, y la barra de escala indica sustituciones de
Sanger recuperadas de una biblioteca de clones (clones 2, 6, 9, 13 y 15; los detalles se nucleótidos por sitio.
proporcionan en Métodos) y amplificadas a partir de ciliados individuales (S1 y S3) o combinados.
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Artículo
Datos ampliados Fig. 5 | eub62A3_813 Optimización de la sonda FISH utilizando
clone­FISH. a, Imágenes de fluorescencia de células de E. coli que transcriben el gen 16S
rRNA de 'Ca. A. ciliaticola' se hibridó a diferentes concentraciones de formamida (10%,
30%, 35%, 40%, 45% y 50%) con 'Ca. Sonda específica de A. ciliaticola eub62A3_813.
Barra de escala, 10 μm. b, curva de fusión de formamida para sonda
eub62A3_813. Los valores centrales muestran la intensidad de fluorescencia promedio y
las barras de error representan se (10%, n = 28 células; 30%, n = 22 células; 35%, n =
26 células; 40%, n = 10 células; 45%, n = 4 células). La intensidad de fluorescencia de las
células hibridadas con formamida al 50 % no se pudo determinar debido a la baja
intensidad y, por lo tanto, no se incluyó en la curva de fusión de formamida.
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Datos ampliados Fig. 6 | Filogenia del huésped ciliado basada en tres ortólogos universales
de copia única de evaluación comparativa diferentes. a – c, el nombre y el identificador del
grupo de ortólogos se muestran en la parte superior de cada árbol filogenético
(10862at33630 (a), 29724at33630 (b) y 33467at33630 (c)). Las accesiones separadas por comas
entre paréntesis en las hojas de los árboles representan 'int_prot_id' y 'pub_
gene_id' proporcionado por orthoDB. El marco de lectura abierto correspondiente.
que representa al huésped ciliado está resaltado en rojo. Los asteriscos resaltan las ramas con
un valor de prueba de índice de probabilidad aproximado similar al de Shimodaira­Hasegawa ≥
80% y un soporte de arranque ultrarrápido ≥ 95%. Las filogenias se basaron en el método de
desviación mínima de los ancestros. Las barras de escala indican sustituciones de
aminoácidos por sitio.
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Artículo

Datos ampliados Fig. 7 | Transcripción total de genes y número de genes por en el análisis. b, Gráfico de barras que muestra el número de genes codificados
categoría funcional. a, Gráfico de barras que muestra la suma de TPM (indicados en el genoma de 'Ca. A. ciliaticola 'asignada a diferentes categorías funcionales sobre la
encima de cada barra) de 'Ca. Genes de A. ciliaticola dentro de diferentes categorías base de análisis de grupos de genes ortólogos. El número de genes dentro de cada
funcionales. Para el cálculo de TPM, se utilizaron los datos del metatranscriptoma categoría funcional se indica encima de cada barra.
de agua a granel del lago Zug (MT_18_C). No se incluyeron genes con varias categorías asignadas.
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Datos ampliados Fig. 8 | Producción lineal de 30N2 a partir de nitrato y nitrito

marcados con 15N. Incubación de agua del lago Zug que contiene ciliados
(muestreada en mayo de 2019 a 189 m) (Métodos) modificada con una mezcla de
nitrato y nitrito marcados con 15N. La producción de 30N2 se siguió durante 25 h.
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Artículo

Datos ampliados Fig. 9 | Alineamiento de secuencias múltiples de 'Ca. Proteína según su posición en Arabidopsis NTT1 (AtNTT1). Todos estos residuos se conservan en
transportadora de nucleótidos de A. ciliaticola con otras proteínas transportadoras de el transportador de nucleótidos de 'Ca. A. ciliaticola'. Los códigos de acceso se
nucleótidos bacterianas y plastídicas. Los residuos conservados que son importantes proporcionan entre paréntesis y en la Tabla complementaria 8 se incluye más
para la eficiencia del transporte, la especificidad del sustrato y las propiedades de información sobre las secuencias alineadas.
contraintercambio de la translocasa ATP/ADP de Arabidopsis thaliana86 están resaltados en azul y numerados.
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Datos ampliados Fig. 10 | Afiliación filogenética de 'Ca. Translocasa ATP y ADP de A.
ciliaticola y transportadores de nucleótidos relacionados. Árbol filogenético de
máxima verosimilitud basado en secuencias de aminoácidos de translocasas ATP/ADP
bacterianas y plastídicas y transportadores de nucleótidos relacionados. 'California.
Agrupaciones de translocasas ATP/ADP (flecha roja) de A. ciliaticola con secuencias
ambientales relacionadas con Holosporales y Caedibacter. Los colores de los grupos
reflejan la afiliación filogenética predominante de los taxones dentro de un grupo.
Las secuencias que se ha demostrado que translocan ATP y ADP están marcadas con
puntos grises (Tabla complementaria 7). Pam, Protochlamydia amoebophila; Ct:
Chlamydia trachomatis; Sn, Simkania negevensis; Li, Lawsonia intracelular; Rp, Rickettsia
prowazekii; La, Liberibacter asiaticus; Ec, Encephalitozoon cuniculi; Cv, Caedimonas
varicaedens; Ho, Holospora obtusa; San Solanum tuberosum; Gs, Galdieria sulfuraria;
En, Arabidopsis thaliana. Las translocasas ATP/ADP de E. cuniculi sirvieron como
grupo externo y se muestran con la longitud de la rama truncada, lo que se indica como
una ruptura.
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