Está en la página 1de 10

C A P Í T U L O

Cultivo de microorganismos
El cultivo es el proceso de proliferación de microorganismos al
5
su vez puede utilizarse para desplazar la célula y conservar los
proporcionarles un entorno apropiado. Los microorganismos gradientes químicos.
en proliferación producen réplicas de sí mismos y necesitan los Para su desarrollo, un microorganismo requiere todos los
elementos presentes en su composición química. Los nutrien- elementos en su materia orgánica y cantidades adecuadas de
tes deben proporcionar estos elementos en una forma que iones para la producción de energía y reacciones catalíticas.
sea accesible desde el punto de vista metabólico. Además, los Además, debe haber una fuente de energía para establecer la
microorganismos requieren energía metabólica para sintetizar fuerza motriz protónica y permitir la síntesis de macromo-
macromoléculas y mantener gradientes químicos esenciales a léculas. Los microorganismos varían de manera amplia en sus
través de sus membranas. Los factores que deben controlarse demandas nutricionales y sus fuentes de energía metabólica.
durante la proliferación incluyen nutrientes, pH, temperatura,
aireación, concentración de sales y fuerza iónica del medio.
FUENTES DE ENERGÍA METABÓLICA
NECESIDADES PARA EL CRECIMIENTO Los tres mecanismos principales para la generación de energía
metabólica son fermentación, respiración y fotosíntesis. Para
La mayor parte del peso seco de los microorganismos es mate- el desarrollo del microorganismo debe utilizarse al menos uno
ria orgánica que contiene elementos como carbono, hidrógeno, de estos mecanismos.
nitrógeno, oxígeno, fósforo y azufre. Además, se necesitan iones
inorgánicos como potasio, sodio, hierro, magnesio, calcio y clo-
ruro para facilitar los procesos enzimáticos y mantener los gra- Fermentación
dientes químicos a través de la membrana celular. La formación de ATP en la fermentación no se acopla con la
En su mayor parte, la materia orgánica consiste en macro- transferencia de electrones. La fermentación se caracteriza por
moléculas formadas por enlaces anhidro entre los bloques de la fosforilación del sustrato, un proceso enzimático en el cual
construcción. La síntesis de enlaces anhidro requiere energía los enlaces de pirofosfato se donan directamente al difosfato de
química, que es proporcionada por dos enlaces fosfodiéster adenosina (ADP, adenosine diphosphate) por un intermediario
contenidos en el trifosfato de adenosina (ATP, adenosine tri- metabólico fosforilado. El intermediario fosforilado se forma
phosphate [capítulo 6]). La energía adicional necesaria para por procesos metabólicos de sustrato susceptibles de fermenta-
mantener la composición citoplásmica relativamente constante ción como la glucosa, lactosa o arginina. La fermentación no se
durante la proliferación se deriva de la fuerza motriz protó- acompaña de cambios en el estado general de oxidación-reduc-
nica, que consiste en energía potencial que puede derivarse del ción del sustrato fermentable y por lo tanto la composición ele-
paso de protones a través de una membrana. En células euca- mental de los productos de fermentación debe ser idéntica a la de
riotas, la membrana puede ser parte de las mitocondrias o de los sustratos. Por ejemplo, la fermentación de una molécula
los cloroplastos. En células procariotas, la membrana corres- de glucosa (C6H12O6) por la vía de Embden-Meyerhof (capítu-
ponde a la membrana citoplásmica de la célula. lo 6) produce una ganancia neta de dos enlaces de pirofosfato
La fuerza motriz protónica es un gradiente electroquímico en el ATP y produce dos moléculas de ácido láctico (C3H6O3).
con dos componentes: una diferencia en pH (concentración
de iones de hidrógeno) y diferencia en la carga iónica. La
carga en el exterior de la membrana bacteriana es más positiva Respiración
que en el interior, y la diferencia en las cargas contribuye a La respiración es análoga a los procesos de acoplamiento
la liberación de energía libre cuando un protón entra al cito- dependientes de energía para descargar una batería. La reduc-
plasma desde fuera de la membrana. El proceso metabólico ción química de un oxidante (aceptor de electrones) a través
que genera la fuerza motriz protónica se revisa en el capítulo de una serie específica de transportadores de electrones en la
6. La energía libre puede utilizarse para el desplazamiento de membrana establece la fuerza motriz protónica a través de
la célula, para mantener los gradientes iónicos o moleculares la membrana bacteriana. El reductor (donador de electrones)
a través de la membrana, para sintetizar enlaces anhidro en puede ser un compuesto orgánico o inorgánico (p. ej., el ácido
el ATP o para diversos propósitos combinados. Asimismo, la láctico actúa como reductor en algunos microorganismos, en
célula puede utilizar una fuente de ATP con sus enlaces anhi- tanto que el gas hidrógeno es reductor para otros). A menudo
dro de energía para crear una fuerza motriz protónica que a se utiliza oxígeno gaseoso (O2) como oxidante, pero algunos
69

apter 05_Carroll_4R.indd 69 14/04/16


70 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología

microorganismos pueden utilizar oxidantes alternativos como Fuentes de nitrógeno


dióxido de carbono (CO2), sulfato (SO42−) y nitrato (NO3−).
El nitrógeno es un constituyente importante de las proteí-
nas, ácidos nucleicos y otros compuestos, y constituye casi 5%
Fotosíntesis del peso seco de una bacteria típica. El nitrógeno inorgánico
molecular (N2), es muy prevalente pues constituye casi 80% de
La fotosíntesis es similar a la respiración en el sentido de que
la atmósfera terrestre. Es un compuesto muy estable, princi-
la reducción de un oxidante a través de una serie específica de
palmente porque se requieren altas cantidades de energía de
transportadores de electrones establece una fuerza motriz pro-
activación para romper su triple enlace entre ambos átomos
tónica. La diferencia en los dos procesos consiste en que en la
de nitrógeno. Sin embargo, éste puede proporcionarse en diver-
fotosíntesis se crean el reductor y el oxidante por técnicas foto-
sas formas y los microorganismos varían en cuanto a su capaci-
químicas por medio de energía luminosa absorbida por los pig-
dad para asimilarlo (cuadro 5-1). El producto terminal de todas
mentos en la membrana; así, la fotosíntesis continúa en tanto
las vías para la asimilación de nitrógeno es la forma más redu-
exista una fuente de energía luminosa. Las plantas y algunas
cida del elemento, el amoniaco (NH3). Cuando se cuenta con
bacterias son capaces de invertir cantidades sustanciales de
NH3, se difunde hacia el interior de la mayor parte de las bac-
energía luminosa para hacer del agua un reductor para el dió-
terias a través de conductos transmembrana como gas disuelto
xido de carbono. El oxígeno participa en este proceso y se pro-
NH3+ en lugar de formar ion amonio (NH4+).
duce materia orgánica. La respiración, la oxidación favorable
La capacidad de asimilar N2 en forma reducida como NH3,
desde el punto de vista energético de la materia orgánica por
proceso denominado fijación de nitrógeno, es una propiedad
un aceptor de electrones como el oxígeno, puede proporcionar
singular de las células procariotas y muy pocas bacterias son
a los microorganismos con capacidad de fotosíntesis energía en
capaces de desdoblar el triple enlace entre ambos átomos de
ausencia de una fuente luminosa.
nitrógeno. Este proceso (capítulo 6) necesita grandes cantida-
des de energía metabólica y se desactiva con facilidad por el
oxígeno. La capacidad de fijación de nitrógeno se encuentra en
NUTRICIÓN bacterias muy divergentes que han evolucionado con estrate-
gias bioquímicas bastante diferentes para proteger sus enzimas
La nutrición en medios de cultivo debe contener todos los
fijadoras de nitrógeno de la exposición con el oxígeno.
elementos necesarios para la síntesis biológica de un nuevo
La mayor parte de los microorganismos pueden utilizar
microorganismo. En los siguientes párrafos, se muestra una
NH3 como única fuente de nitrógeno; muchos microorganis-
clasificación de los nutrientes con base en los elementos que
mos poseen la capacidad de producir NH3 a partir de aminas
proporcionan.
(R—NH2) o a partir de aminoácidos (RCHNH2COOH), por lo
común en el interior de la célula. La producción de NH3 por
Fuentes de carbono desaminación de aminoácidos se denomina amonificación.
El amoniaco se introduce en la materia orgánica por vías bio-
Como se mencionó antes, las plantas y algunas bacterias son
químicas que incluyen al glutamato y glutamina. Estas vías se
capaces de utilizar energía de fotosíntesis para reducir el dió-
revisan en el capítulo 6.
xido de carbono a expensas del agua. Estos microorganismos
Muchos microorganismos poseen la capacidad de asimilar
pertenecen al grupo de microorganismos autótrofos, seres
nitrato (NO3−) y nitrito (NO2−) mediante la conversión de estos
vivos que no necesitan nutrientes orgánicos para su desarrollo.
iones en NH3. Tales procesos se conocen como reducción de
Otros microorganismos autótrofos son los quimiolitótrofos,
nitratos por asimilación y reducción de nitritos por asimila-
que utilizan sustratos inorgánicos como hidrógeno y tiosulfato
ción, de manera respectiva. Estas vías para la asimilación difie-
como reductor y dióxido de carbono como fuente de carbono.
ren de las vías utilizadas para catabolizar nitratos y nitritos. Las
Los microorganismos heterótrofos requieren carbono
vías catabólicas utilizadas por microorganismos emplean estos
orgánico para su desarrollo; éste debe encontrarse en una
iones como aceptores terminales de electrones en la respiración.
forma que puedan asimilar. Por ejemplo, el naftaleno propor-
Algunas bacterias autótrofas (p. ej., Nitrosomonas, Nitrobac-
ciona todo el carbón y energía necesarios para el desarrollo
ter) son capaces de convertir NH3 a N2 gaseoso bajo condicio-
de microorganismos heterótrofos respiratorios, pero muy pocos
nes anaerobias; este proceso se conoce como desnitrificación.
microorganismos poseen la vía metabólica necesaria para
la asimilación de naftaleno. Por otra parte, la glucosa puede
sustentar el desarrollo mediante procesos de respiración o fer-
mentación en muchos microorganismos. Es importante que CUADRO 51 Fuentes de nitrógeno en la nutrición
los sustratos de crecimiento se suministren a niveles apropia- microbiana
dos para la cepa microbiana que se está cultivando: las con- Compuesto Valencia del nitrógeno
centraciones que sostienen el desarrollo del microorganismo NO3− +5
pueden inhibir el desarrollo de otro. NO2 −
+3
El dióxido de carbono es necesario para varias reacciones
N2 0
biosintéticas. Muchos microorganismos respiratorios produ- +
NH4 −3
cen más del dióxido de carbono necesario para satisfacer sus
necesidades, en tanto que otros requieren fuentes de dióxido R-NH2a −3
de carbono en su medio de cultivo. a
R, radical orgánico.

apter 05_Carroll_4R.indd 70 14/04/16


CAPÍTULO 5 Cultivo de microorganismos 71

Continúa en evolución la comprensión del ciclo del nitrógeno. plásmidos desempeñan una función importante en la capacidad
A mediados del decenio de 1990 se descubrió la reacción de oxi- de invasión de algunos patógenos bacterianos (capítulo 7). Los
dación anaerobia del ion amonio (anammox). La reacción mecanismos de captación de hierro dependientes de sideróforos
y de no sideróforos por las bacterias se revisan en el capítulo 9.
NH4 + + NO2 − → N2 + 2H2 O

en la cual un nitrito oxida al amoniaco, es un proceso micro- Factores de crecimiento


biano que ocurre en aguas anóxicas en el océano y es la princi- Un factor de crecimiento es un compuesto orgánico que debe
pal vía por la cual regresa el nitrógeno hacia la atmósfera. contener la célula a fin de desarrollarse, pero que es incapaz de
sintetizar. Muchos microorganismos que reciben los nutrien-
Fuentes de azufre tes mencionados antes son capaces de sintetizar todos los
bloques para la construcción de macromoléculas (figura 5-1);
Al igual que el nitrógeno, el azufre es un componente de muchas
estos nutrientes incluyen aminoácidos, purinas, pirimidinas
sustancias orgánicas de las células. Forma parte de la estructura
y pentosas (precursores metabólicos de ácidos nucleicos); car-
de varias coenzimas y se encuentra en las cadenas laterales de
bohidratos adicionales (precursores de polisacáridos) y ácidos
cisteinil y metionil de las proteínas. Las plantas o animales no
grasos y compuestos isoprenoides. Además, los microorganis-
pueden utilizar el azufre en su forma elemental. Sin embargo,
mos de vida libre deben ser capaces de sintetizar complejos
algunas bacterias autótrofas pueden oxidarse a su forma de
vitamínicos que actúan como precursores de coenzimas.
sulfato (SO42−). La mayor parte de los microorganismos pue-
Cada uno de estos compuestos esenciales se sintetiza por
den utilizar sulfato como fuente de azufre, al reducir el sulfato
una secuencia de reacciones enzimáticas; cada enzima se pro-
al nivel de ácido sulfhídrico (H2S). Algunos microorganismos
duce bajo el control de un gen específico. Cuando un microor-
pueden asimilar H2S de manera directa del medio de cultivo,
ganismo sufre una mutación genética que da origen a la falla en
pero este compuesto puede ser tóxico para muchos de ellos.
una de estas funciones enzimáticas, la cadena se rompe y ya no
se elabora el producto terminal. El microorganismo debe obte-
Fuentes de fósforo ner el compuesto de su entorno: el compuesto se transforma en
El fosfato (PO43-) es necesario como componente del ATP, un factor de crecimiento para el microorganismo. Este tipo de
ácidos nucleicos y coenzimas como NAD, NADP y flavinas. mutación puede inducirse con facilidad en el laboratorio.
Además, muchos metabolitos, lípidos (fosfolípidos, lípido A), Diferentes especies microbianas varían de forma amplia
componentes de las paredes celulares (ácido teicoico), algunos en cuanto a sus necesidades de factores de crecimiento. Los
polisacáridos capsulares y algunas proteínas sufren fosforila- compuestos involucrados se encuentran y son esenciales en
ción. El fosfato siempre se asimila en forma de fosfato inorgá- todos los microorganismos; las diferencias en cuanto a nece-
nico libre (Pi). sidades reflejan las distintas capacidades de síntesis. Algunas
especies no requieren factores de crecimiento, en tanto que
otras (p. ej., los lactobacilos) perdieron durante su evolución la
Fuentes de minerales capacidad de sintetizar hasta 30 a 40 compuestos esenciales y
Se necesitan numerosos minerales para la función de las enzi- por tanto necesitan obtenerlos de su medio ambiente.
mas. El magnesio (Mg2+) y el ion ferroso (Fe2+) también se
encuentran en derivados de porfirina: el magnesio en las mo-
léculas de clorofi la, el hierro como parte de las coenzimas de FACTORES AMBIENTALES
los citocromos y peroxidasas. Mg2+ y K+ son esenciales para la QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO
función e integridad de los ribosomas. El calcio es necesario
como constituyente de las paredes celulares de bacterias gram- Un medio de cultivo adecuado debe contener todos los nutrien-
positivas, aunque es indispensable para las bacterias gramne- tes necesarios para el microorganismo que se cultivará; tales
gativas. Muchos microorganismos marinos requieren Na+ para factores incluyen pH, temperatura y aireación, que deben ser
su desarrollo. Durante la elaboración de un medio para el cul- controlados con gran cuidado. Se utiliza un medio de cultivo
tivo de la mayor parte de los microorganismos, es necesario líquido; al medio de cultivo puede añadirse agar o gel de sílice
proporcionar fuentes de potasio, magnesio, calcio y hierro, por para que adquiera consistencia de gel para situaciones especia-
lo general en sus formas iónicas (K+, Mg2+, Ca2+ y Fe2+). Son les. El agar es un polisacárido extraído de algas marinas que
necesarios muchos otros minerales (p. ej., Mn2+, Mo2+, Co2+, es singular para el cultivo microbiano por su resistencia a la
Cu2+ y Zn2+); éstos con frecuencia pueden suministrarse en acción microbiana y porque se disuelve a 100 °C pero no forma
agua corriente o como contaminantes de otros ingredientes de placas de gel hasta que se encuentra por debajo de 45 °C; las
los medios de cultivo. células pueden suspenderse en el medio de cultivo a 45 °C; éste
La captación de hierro, que forma hidróxidos insolubles a debe enfriarse con rapidez hasta que adquiera la consistencia
pH neutro, es facilitada en muchas bacterias y hongos por la de gel, sin lesionar a las células.
producción de sideróforos, compuestos que tienen la capa-
cidad de generar y favorecer su transporte en forma de com-
plejo soluble. Esto incluye a los hidroxamatos (−CONH2OH) Nutrientes
conocidos como sideraminas y derivados de catecoles (p. ej., En páginas previas, se describe cada tipo de nutriente, ade-
2,3-dihidroxibenzoilserina). Los sideróforos determinados por más se presenta una lista de sustancias apropiadas. En general,

apter 05_Carroll_4R.indd 71 14/04/16


72 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología

H2O
Porcentaje de peso seco
Bloques de construcción Macromoléculas en la célula típica

H2O
Aminoácidos Proteínas 50
H2O
Mononucleótidos Ácidos nucleicos 20
H2O
Monosacáridos Polisacáridos 10

H2O Precursores
de isoprenoides

Acetato Lípidos 10

D H2 D
Aceptores H2O
H2O Ácidos grasos

FIGURA 51 Síntesis de macromoléculas. La polimerización de los bloques de construcción en macromoléculas se logra en gran medida
mediante la introducción de enlaces anhídrido. La formación de ácidos grasos a partir de acetato requiere varias etapas de reducción bioquímica
utilizando donadores de hidrógeno orgánico (D • H2).

debe suministrarse lo siguiente: 1) donadores y aceptores de Los microorganismos regulan su pH interno pese a la
hidrógeno: casi 2 g/L; 2) fuente de carbono: casi 1 g/L; 3) fuente amplia gama de cifras de pH externo mediante el bombeo de
de nitrógeno: casi 1 g/L; 4) minerales: azufre, fósforo, casi 50 protones hacia el interior o al exterior de la célula. Los microor-
mg/L de cada uno y oligoelementos, 0.1 a 1 mg/L de cada uno; ganismos acidófilos mantienen su pH interno en casi 6.5 sobre
y 5) factores de crecimiento: aminoácidos, purinas y pirimi- un pH externo de 1 a 5; los microorganismos neutrolófilos
dinas, casi 50 mg/L de cada uno y vitaminas, 0.1 a 1 mg/L de mantienen un pH interno cercano a 7.5 con intervalos exter-
cada uno. nos de pH de 5.5 a 8.5; los microorganismos alcalófi los man-
Para estudios del metabolismo microbiano, por lo general tienen un pH interno de casi 9.5 sobre intervalos externos de
es necesario preparar un medio completamente sintético en el 9 a 11. El pH interno está regulado por un grupo de sistemas
cual se conozcan las características y concentraciones exactas de transporte de protones en la membrana citoplásmica, lo
de cada uno de los ingredientes. Es mucho menos costoso y que incluye una bomba de protones controlada por ATP y un
más simple utilizar materiales naturales como extractos de intercambiador de Na+/H+. El sistema de intercambio de K+/H+
levaduras, proteínas ingeridas o sustancias similares. La mayor parece contribuir a la regulación del pH interno en microorga-
parte de los microbios de vida libre se desarrollan bien en nismos neutrolófi los.
extractos de levaduras; las formas parasitarias pueden necesi-
tar sustancias especiales que se encuentran sólo en la sangre o Temperatura
en extractos de tejidos de animales. Sin embargo, hay micro-
bios parasitarios (p. ej., Treponema pallidum) que no pueden La temperatura óptima para el cultivo de las distintas especies
cultivarse in vitro o que crecen en el interior de células eucario- microbianas varía (figura 5-2): los psicrófilos crecen mejor a
tas (p. ej., Chlamydia trachomatis). temperaturas bajas (−5 a −15 °C) y por lo general se encuen-
Para muchos microorganismos, un compuesto simple tran en ambientes de este tipo como las regiones del Ártico y
(como un aminoácido) puede actuar como fuente de energía, la Antártida; para los psicrótrofos, la temperatura óptima es
de carbono y nitrógeno; otras requieren compuestos separa- entre 20 y 30 °C, pero incluso crecen bien a temperaturas más
dos para cada uno de estos elementos. Si los materiales natu- bajas. Constituyen una causa importante de desperdicio ali-
rales para medios no sintéticos tienen deficiencias de algún mentario. Los mesófi los crecen mejor entre 30 a 37 °C; la mayor
nutriente particular, deben complementarse. parte de los termófilos crecen mejor entre 50 a 60 °C. Algunos
microorganismos son hipertermófilos y pueden desarrollarse
a temperatura de ebullición, la cual existe en sitios con alta pre-
Concentración de iones hidrógeno (pH) sión como en las profundidades del océano. La mayor parte
La mayor parte de los microorganismos tienen un pH óptimo de los microorganismos son mesófi los; 30 °C es la temperatura
muy estrecho. El pH óptimo debe determinarse de manera óptima para muchas formas de vida libre y la temperatura cor-
empírica para cada especie. La mayor parte de los microorganis- poral del hospedador es óptima para simbiontes homeotermos.
mos (neutrolófilos) proliferan mejor en un pH de 6 a 8, aunque El extremo superior de las temperaturas toleradas por
algunas formas (acidófilos) encuentran su cifra óptima con pH cualquier especie dada se correlaciona bien con la estabilidad
de 3; otros (alcalófilos) tienen un pH óptimo de hasta 10.5. térmica general de las proteínas de dicha especie, medidas en

apter 05_Carroll_4R.indd 72 14/04/16


CAPÍTULO 5 Cultivo de microorganismos 73

Óptimo
Índice de crecimiento

Hipertermófilos
Mesófilos Termófilos

Psicrótrofos

Log k
Psicrófilos

Máximo

Mínimo
–10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Temperatura (°C)

FIGURA 52 Necesidades de temperatura para el crecimiento.


Las células procariotas por lo general se dividen en cinco grupos Temperatura Temperatura Temperatura
con base en su temperatura óptima de crecimiento. Obsérvese que elevada normal baja
la temperatura óptima, que es el punto donde el crecimiento es
mayor, es cercana al límite superior del espectro. (Reproducida con 1/T (K)
autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT [eds]:
Microbiology: A Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 91. © FIGURA 53 Forma general del gráfico de Arrhenius de la
The McGraw-Hill Companies, Inc.) proliferación bacteriana. (Reproducida con autorización de Ingraham
JL: Growth of psychrophilic bacteria. J Bacteriol 1958; 76(1):75-80.)

extractos celulares. Los microorganismos comparten con las


plantas y animales la respuesta al golpe de calor, que consiste Aireación
en la síntesis transitoria de un grupo de “proteínas de golpe de
En el capítulo 6 se revisa la función del oxígeno como aceptor
calor” cuando se exponen a incrementos súbitos en la tempe-
de hidrógeno. Muchos microorganismos son aerobios estric-
ratura por arriba de la temperatura óptima de proliferación.
tos, esto es, necesitan oxígeno como aceptor de hidrógeno;
Tales proteínas parecen ser inusualmente resistentes a la tem-
otros son anaerobios facultativos, es decir, tienen la capaci-
peratura y estabilizan a proteínas celulares sensibles al incre-
dad de vivir en forma aerobia o anaerobia; otros son anaero-
mento térmico.
bios estrictos, pues necesitan una sustancia distinta al oxígeno
La relación de la tasa de proliferación con la temperatura
como aceptor de hidrógeno y son sensibles a la inhibición de
para cualquier microorganismo dado se observa en el gráfico
oxígeno; otros más son microaerófilos, que necesitan peque-
típico de Arrhenius (figura 5-3). Arrhenius demostró que el
ñas cantidades de oxígeno (2 a 10%) para la respiración aerobia
logaritmo de la velocidad de cualquier reacción química (log
(la concentración más elevada es inhibidora); otros son anae-
k) es una función lineal del recíproco de la temperatura (1/T);
robios aerotolerantes, pues son indiferentes al oxígeno. Éstos
como el crecimiento celular es consecuencia de un grupo de
pueden crecer en su presencia pero no lo utilizan como aceptor
reacciones químicas, cabría esperar que se observe esta rela-
de hidrógeno (figura 5-4).
ción. En la figura 5-3 se muestra el caso de temperaturas por
Los productos secundarios naturales del metabolismo
arriba de intervalos normales para una especie dada; el log k
aerobio son compuestos reactivos de peróxido de hidrógeno
disminuye linealmente con 1/T. Sin embargo, por arriba y por
(H2O2) y superóxido (O2−). En presencia de hierro, estas sus-
abajo del intervalo normal, log k disminuye con rapidez, de
tancias generan radicales hidroxilo (•OH) que pueden dañar
forma que se definen las temperaturas máxima y mínima.
cualquier macromolécula biológica:
Además de sus efectos sobre la tasa de proliferación, las
temperaturas extremas matan a los microorganismos. La tem- Fe3 /Fe 2+
O2− + H2O2 → O2 + OH2− + •OH
peratura muy elevada se utiliza para esterilizar preparaciones
(capítulo 4); el frío extremo también destruye microorganis-
mos, aunque no puede utilizarse con seguridad con fines de Muchos microorganismos aerobios y anaerobios toleran-
esterilización. Las bacterias también muestran el fenómeno tes al aire se protegen de estos productos por la presencia de
conocido como choque de enfriamiento; en éste, las células superóxido dismutasa, una enzima que cataliza la reacción
mueren con el enfriamiento rápido (a diferencia de lo que ocu-
rre con el enfriamiento lento). Por ejemplo, el enfriamiento 2O−2 + 2H + → O2 + H2O2
rápido de Escherichia coli de 37 a 5 °C puede destruir 90% de
las células. Varios compuestos protegen a éstas del choque y por la presencia de una catalasa, una enzima que cataliza la
de calor o de congelamiento; a menudo se utilizan glicerol y reacción
dimetil sulfóxido. 2H2O2 → 2H2O + O2

apter 05_Carroll_4R.indd 73 14/04/16


74 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología

Aerobio estricto Anerobio Anaerobio estricto Microaerófilo Aerotolerante


facultativo
Bacterias
Bacterias

Enzimas en las células


para la destoxificación de O2
Catalasa: 2H2O2 2H2O + O2 Catalasa, Ni catalasa Pequeñas cantidades Superóxido
Superóxido dismutasa: superóxido ni superóxido dismutasa de catalasa dismutasa
dismutasa en la mayor parte y superóxido dismutasa
2O2– + 2H+ O2 + H2O2

FIGURA 54 Requisitos de oxígeno (O2) de las células procariotas. (Reproducida con autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE,
Nester MT [editores]: Microbiology: A Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 92. © The Mc Graw-Hill Companies, Inc.)

Algunos microorganismos fermentados (p. ej., Lactobaci- ordinarios son satisfactorias; sin embargo, para formas mari-
llus plantarum) son tolerantes al aire pero no contienen catalasa nas y microorganismos adaptados para crecer en soluciones
o superóxido dismutasa. No hay reducción del oxígeno y por hipertónicas de azúcar, por ejemplo, deben tomarse en con-
tanto no se producen H2O2 y O2−. Todos los anaerobios estrictos sideración tales factores. Los microorganismos que requieren
carecen de superóxido dismutasa y catalasa. Algunos microor- concentraciones elevadas de sales se denominan halófilos;
ganismos anaerobios (p. ej., Peptococcus anaerobius) tienen aquellos que requieren presiones osmóticas elevadas se deno-
tolerancia considerable al oxígeno como consecuencia de su minan osmófi los.
capacidad para producir cifras elevadas de la enzima (NADH La mayor parte de las bacterias son capaces de tolerar
oxidasa) que reduce oxígeno a agua con base en la reacción amplias variaciones de presión osmótica externa y de fuerza
iónica, debido a su capacidad para regular la osmolaridad
NADH + H+ +1/ 2 O2 → NAD+ + H2O interna y la concentración iónica. La osmolalidad está regu-
El peróxido de hidrógeno debe gran parte de su toxicidad lada por transporte activo de iones de K+ hacia el interior de la
al daño que causa al DNA. Los mutantes con reparación defi- célula; la concentración iónica interna se mantiene constante
ciente del DNA son excepcionalmente sensibles al peróxido de por excreción compensadora de putresceína, una poliamina
hidrógeno; el producto génico recA participa en la recombina- orgánica con carga positiva. Como la putresceína transporta
ción genética y en la reparación, y ha mostrado ser más impor- varias cargas positivas por molécula, una gran reducción en la
tante que la catalasa o la superóxido dismutasa para proteger concentración iónica se lleva a cabo con un pequeño costo en
células de E. coli contra la toxicidad por peróxido de hidrógeno. la concentración osmótica.
El proporcionar aire a los cultivos de bacterias aerobias es
un problema técnico mayor. Por lo común se lleva a cabo un MÉTODOS DE CULTIVO
mezclado mecánico para introducir oxígeno al medio de cul-
tivo o bien se fuerza el paso de aire a través del medio de Deben considerarse dos problemas: elección del medio de cul-
cultivo por medio de presión. La difusión de oxígeno a menudo tivo apropiado y aislamiento de un microorganismo bacteriano.
se vuelve un factor limitante en la proliferación de bacterias
aerobias; cuando se alcanza una concentración de 4 a 5 × 109/ Medios de cultivo
ml de células, la tasa de difusión de oxígeno limita la tasa de
La técnica y medio de cultivo utilizados dependen de la natura-
proliferación de las células en gran medida.
leza de la investigación. En términos generales, pueden encon-
Por otra parte, los anaerobios estrictos presentan el pro-
trarse tres situaciones: 1) tal vez sea necesario cultivar un grupo
blema de la eliminación del oxígeno. Se dispone de muchos
de células de una especie en particular que se encuentran a la
métodos para lograr esto: pueden añadirse agentes reductores
mano; 2) puede ser necesario establecer el número y tipo de
como el tioglicolato de sodio a los cultivos líquidos; los tubos
microorganismos presentes en un material dado; o 3) podría
de agar pueden sellarse con una capa de vaselina y parafina;
desearse el aislamiento de un tipo particular de microorga-
las placas de cultivo deben colocarse en un contenedor al cual
nismo a partir de una fuente natural.
se le retira el oxígeno por medio de vacío o por agentes quími-
cos, o bien el microorganismo puede manipularse en una caja A. Desarrollo celular de una especie dada
cerrada en un medio anaerobio.
Los microorganismos observados en el microscopio pueden
proliferar en su ambiente natural y pueden ser extremadamente
Concentración iónica y presión osmótica difíciles de hacer crecer en un medio de cultivo artificial puro.
En menor grado, deben controlarse factores como la presión Ciertas formas parasitarias nunca han sido cultivadas fuera del
osmótica y concentración de sales. Para la mayor parte de los hospedador. Sin embargo, en términos generales puede dise-
microorganismos, las propiedades de los medios de cultivo ñarse un medio de cultivo apropiado para reproducir de forma

apter 05_Carroll_4R.indd 74 14/04/16


CAPÍTULO 5 Cultivo de microorganismos 75

cuidadosa las condiciones encontradas en el entorno natural células en la población de millones. Pueden obtenerse ventajas
del microorganismo. El pH, temperatura y aireación son fáciles del “enriquecimiento natural”. Por ejemplo, al observar oxidan-
de duplicar; los nutrientes presentes constituyen el mayor pro- tes de queroseno, se elige tierra contaminada con aceite, porque
blema. La contribución por el entorno en que se desarrolla el éste es un medio ya enriquecido para tales formas bacterianas.
microorganismo es importante y difícil de analizar; un pará- El enriquecimiento de cultivos es un procedimiento
sito podría necesitar un extracto de tejido del hospedador; una mediante el cual se prepara el medio de cultivo para duplicar el
forma de vida libre podría necesitar una sustancia excretada ambiente natural (“nicho”) del microorganismo deseado, por
por un microorganismo y con la cual se encuentra asociada. lo que se permite su selección (figura 5-5). Un principio impor-
Podría ser necesaria una gran cantidad de experimentación tante involucrado en tal selección es el siguiente: el microorga-
para establecer las necesidades del microorganismo y el éxito nismo seleccionado será del tipo del cual se han satisfecho sus
depende de proporcionar una fuente apropiada de cada uno de necesidades nutricionales. Por ejemplo, las azobacterias crecen
los nutrientes mencionados al inicio de este capítulo. El cultivo en un medio de cultivo que contiene nitrógeno orgánico, pero
de parásitos estrictos como clamidias se revisa en el capítulo 27. sus necesidades mínimas consisten en la presencia de N2; por
tanto, se elige un medio de cultivo que contenga N2 como la
B. Estudio microbiológico de materiales naturales única fuente de nitrógeno. Si se añade nitrógeno orgánico al
medio de cultivo, las condiciones ya no serán selectivas para
Un material dado puede contener muchos microambientes
azobacterias, sino más bien para las formas en las que el nitró-
diferentes y cada uno proporciona un nicho para diferentes
geno orgánico es una necesidad mínima.
especies. El cultivo de una muestra de material bajo cierto
Cuando se busca un tipo específico de microorganismo
grupo de condiciones permitirá que un grupo selecto de for-
que forma parte de una población mixta, se utilizan medios de
mas produzca colonias, pero podría ocasionar que se pasen por
cultivo selectivos o diferenciales. Los medios selectivos inhi-
alto muchos otros tipos. Por tal razón, se acostumbra cultivar
ben el crecimiento de microorganismos distintos del que se
las muestras utilizando diversos medios de cultivo con diferen-
está buscando. Por ejemplo, el agar de Thayer-Martin se utiliza
tes condiciones de incubación, según sea posible en condicio-
para aislar a Neisseria gonorrhoeae, causa de la gonorrea, de las
nes prácticas. No es irracional utilizar seis u ocho medios de
muestras clínicas. Los medios diferenciales contienen sustan-
cultivo y condiciones de cultivo diferentes si se van a identifi-
cias que ciertas bacterias cambian de determinada manera. Por
car la mayor parte de las formas presentes.
ejemplo, las colonias de E. coli tienen un color verdoso iridis-
Cada tipo de microorganismo debe tener la posibilidad
cente característico al cultivarse en agar que contiene eosina y
de proliferar, por ello se utilizan medios sólidos para evitar el
azul de metileno (agar EMB). El agar EMB contiene altas con-
aglomeramiento de colonias. Por otra parte, la competencia
centraciones de un carbohidrato que ocasiona que los microor-
evitará que se formen algunos tipos de colonias.
ganismos que fermentan azúcar formen colonias de color
rojizo. Los medios de cultivo diferenciales se utilizan para pro-
C. Aislamiento de un microorganismo en particular pósitos como la identificación de bacterias entéricas en agua o
Una pequeña muestra de tierra, si se manipula de manera leche y la presencia de ciertos patógenos en muestras clínicas.
apropiada, permite el cultivo de diferentes tipos de microor- En el cuadro 5-2 se presentan las características de los medios
ganismos en cada microentorno presente. Para la tierra fértil representativos que se utilizan para cultivar bacterias.
(húmeda, aireada, rica en minerales y material orgánico) esto
significa que pueden aislarse cientos o incluso miles de tipos
bacterianos, lo cual se lleva a cabo al seleccionar el tipo deseado. Aislamiento de microorganismos
Por ejemplo, 1 g de tierra se inocula en un frasco de medio de en cultivos puros
cultivo líquido que se elaboró con el fin de favorecer el creci-
A fin de estudiar las propiedades de un microorganismo dado,
miento de un tipo de microorganismo, como bacterias aerobias
es necesario manipularlo en cultivos puros sin otros tipos de
fijadoras de nitrógeno (azobacterias). En este caso, el medio no
microorganismos. Para llevar a cabo esto, debe aislarse una
contiene nitrógeno combinado y se incuba en un medio anae-
sola célula de todas las demás y cultivarse de forma tal que su
robio. Si las azobacterias están presentes en la tierra, prolife-
progenie permanezca aislada. Se dispone de varios métodos.
ran bien en este medio de cultivo; las formas incapaces de fijar
nitrógeno crecerán sólo en la medida que la tierra tenga conta-
minantes que fijen nitrógeno en el medio. Cuando el cultivo se A. Cultivo en placa
ha desarrollado por completo, el porcentaje de azobacterias en A diferencia de las células en medio líquido, las células en un
la población total se habrá incrementado en gran medida; este medio de gel se encuentran inmobilizadas. Por lo tanto, si se
método se denomina cultivo enriquecido. La transferencia de colocan pocas células en un medio de gel, cada célula prolifera
una muestra de este cultivo a un medio fresco dará origen a en una colonia aislada. El agente ideal para la formación de gel
un enriquecimiento adicional de las azobacterias; después de para la mayor parte de los medios de cultivo microbiológico es el
varias transferencias seriadas el cultivo puede colocarse en un agar, un polisacárido ácido extraído de ciertas algas rojas. Una
medio de cultivo sólido enriquecido, lo que permite el aisla- suspensión al 1.5 a 2% en agua se disuelve a 100 °C, dando ori-
miento de colonias de azobacterias. gen a una solución clara que se gelifica a 45 °C. Una solución de
El medio líquido se utiliza para permitir la competencia y agar estéril puede enfriarse a 50 °C; así, se añaden bacterias u
por lo tanto la selección óptima, incluso cuando el tipo deseado otro microorganismo y más tarde la solución se enfría con rapi-
es representado en la tierra por sólo una pequeña cantidad de dez por debajo de 45 °C para formar un gel. (Aunque la mayor

apter 05_Carroll_4R.indd 75 14/04/16


76 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología

Traslado
a la caja
de Petri

El medio contiene fuentes Se agrega al medio El microorganismo La muestra enriquecida


de nutriente selectas la muestra que contiene en estudio puede es sembrada en la placa de Petri
escogidas dado que pocas una variedad amplia multiplicarse, con medio de agar apropiado.
bacterias, diferentes de microorganismos, pero no la mayor parte Se obtiene un cultivo puro
del microorganismo en estudio, incluida la especie de los demás al seleccionar una colonia única
las pueden utilizar. en estudio. del microorganismo de interés.

FIGURA 55 Cultivo enriquecido. El medio y las condiciones de incubación favorecen el crecimiento de las especies escogidas sobre otras
bacterias de la misma muestra. (Reproducido con autorización de Nester EW, Anderson DG. Roberts CE, Nester MT: Microbiology: A human
perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 99 © The McGraw-Hill Companies, Inc.)

parte de las células microbianas se destruyen a 50 °C, el proceso (figura 5-6). Sin embargo, para tener la certeza es necesario
de destrucción es lo suficientemente lento a esta temperatura tomar una colonia del tipo deseado, suspenderla en agua y
para permitir que se lleve a cabo el procedimiento; figura 4-3). repetir el procedimiento. La repetición de este procedimiento
Una vez formado el gel, el agar no vuelve a tornarse líquido hasta en varias ocasiones asegura que se obtenga un cultivo puro.
que se calienta por arriba de 80 °C, de manera que cualquier Otro método consiste en crear estrías de la suspensión ori-
temperatura es apropiada para la incubación de un medio de ginal sobre una placa de agar con un asa de alambre (técnica de
cultivo microbiano. En el método de vertido en placa se mezcla estriado en placa). Conforme se continúa con la creación
una suspensión de células con agar líquido a 50 °C y se vierte de estrías, cada vez queda un menor número de células en el
en una caja de Petri. Cuando el agar se torna sólido, las célu- asa y por último el asa depositará una sola célula en el agar
las permanecen inmóviles en éste y proliferan dando origen a (figura 5-7). La placa se incuba y cualquier colonia bien aislada
colonias. Si la suspensión celular está lo suficientemente diluida, se retira; se vuelve a suspender en agua y se repite el procedi-
las colonias se encontrarán bien separadas, de forma que cada miento en agar. Si la suspensión se vuelve a someter al método
una tiene una alta probabilidad de derivarse de una sola célula de estriado en placa (y no sólo una parte de la colonia), este

CUADRO 52 Carácterísticas de los medios representativos utilizados para cultivar bacterias
Medio Característica
Agar de sangre Medio complejo de uso cotidiano en laboratorios clínicos. Es diferencial dado que las colonias de microorganismos
hemolíticos están rodeadas por una zona de limpieza de los eritrocitos. No es selectivo.
Agar de chocolate Medio complejo utilizado para cultivar bacterias de cultivo exigente, particularmente las encontradas en muestras clínicas. No
es selectivo o diferencial.
Sales de glucosa Medio definido químicamente. Se utiliza en experimentos de laboratorio para estudiar necesidades nutricionales de bacterias.
No es selectivo o diferencial.
Agar de MacConkey Medio complejo utilizado para aislar bacilos gramnegativos que habitan de manera típica en el intestino. Es selectivo debido a
que las sales biliares y colorantes inhiben a microorganismos grampositivos y cocos gramnegativos. Es diferencial debido a
que el indicador de pH se convierte en rojo rosado cuando el azúcar del medio, la lactosa, se fermenta.
Agar de nutriente Medio complejo utilizado para trabajo de laboratorio cotidiano. Favorece el crecimiento de una variedad de bacterias de
cultivo no difícil. No es selectivo ni diferencial.
Thayer-Martin Medio complejo utilizado para aislar especies de Neisseria, que son de cultivo difícil. Es selectivo por contener antibióticos que
inhiben a la mayor parte de microorganismos, excepto especies de Neisseria. No es diferencial.
(Reproducido con autorización de Nester EW, Anderson DG, Roberts CE, Nester MT: Microbiology: A Human Perspective, 6a. ed. McGraw-Hill, 2009, p. 96. © The McGraw-Hill
Companies, Inc.)

apter 05_Carroll_4R.indd 76 14/04/16


CAPÍTULO 5 Cultivo de microorganismos 77

1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml 1.0 ml

Muestra 9 ml de H2O 9 ml de H2O 9 ml de H2O 9 ml de H2O


original (dilución 10–1) (dilución 10–2) (dilución 10–3) (dilución 10–4)

Mezcla con agar tibio, 1.0 ml 1.0 ml


la cual se vierte

FIGURA 56 Técnica de vertido en placa. La muestra original se diluye varias veces para reducir lo suficiente la población. Las muestras más
diluidas se mezclan con agar tibio y se vierten en cajas de Petri. Las células aisladas proliferan en colonias y se utilizan para establecer cultivos
puros. La superficie de las colonias es circular; por debajo de la superficie adquieren forma lenticular. (Reproducida con autorización de Willey JM,
Sherwood LM, Woolverton CJ: Prescott, Harley, & Klein’s Microbiology, 7a. ed., McGraw-Hill, 2008. The McGraw-Hill Companies, Inc.)

método es tan fiable y mucho más rápido que el método de ver- de extensión en placa puede utilizarse para contar la población
tido en placa. microbiana.
En la técnica de extensión en placa, un pequeño volumen
de suspensión microbiana diluida que contiene 30 a 300 células
se transfiere hacia el centro de la placa de agar y se extiende en B. Dilución
forma uniforme sobre la superficie con una varilla de cristal Un método mucho menos fiable es el de la dilución hasta la
estéril, doblada. Las células dispersadas dan origen a colonias extinción. Se realizan diluciones seriadas de la suspensión
aisladas. El número de colonias debe ser similar al número de y las muestras de cada dilución se cultivan en placa. Si sólo
microorganismos viables en la muestra, por tanto la técnica unas cuantas muestras de una dilución en particular muestran

Nota: este método sólo funciona si la herramienta para la extensión


de la muestra (por lo común un asa de inoculación) se reesteriliza
después de cada uno de los pasos del 1 a 4.

1 2 3 4 5
Pasos en la formación de estrías en la placa B
A

FIGURA 57 Técnica de estriado en placa. A: Patrón típico de estriación. (Reproducida con autorización de Willey JM, Sherwood LM,
Woolverton CJ: Prescott, Harley, & Klein’s Microbiology, 7a. ed., McGraw-Hill, 2008. © The McGraw-Hill Companies, Inc.) B: Un ejemplo de la placa
estriada. (Reproducida con autorización de Kathy Park Talaro.)

apter 05_Carroll_4R.indd 77 14/04/16


78 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología

crecimiento, se supone, entonces, que algunas de las colonias (D) Fosforilación del sustrato
iniciaron a partir de una sola célula. Este método no se utiliza (E) Respiración anaerobia
a menos que sea imposible el cultivo en placa por alguna razón. 3. El efecto principal de la temperatura de 60 ºC sobre el crecimiento
Una característica indeseable de este método es que sólo puede de un mesófi lo como la Escherichia coli es para:
utilizarse para aislar el tipo predominante de microorganismo (A) Destruir la pared celular
en una población mixta. (B) Desnaturalizar proteínas
(C) Destruir ácidos nucleicos
(D) Solubilizar la membrana citoplasmática
(E) Causar formación de endosporas
RESUMEN DEL CAPÍTULO
4. La polimerización de bloques de construcción (p. ej., aminoá-
• Un microorganismo necesita todos los elementos en su cidos) en macromoléculas (p. ej., proteínas) se logra en gran
materia orgánica y el complemento total de iones nece- medida por:
sarios para su actividad con el fin de crecer. Los nutrien- (A) Deshidratación
tes se clasifican según los elementos que proporcionan, (B) Reducción
incluidos una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, (C) Oxidación
una fuente de azufre, una fuente de fósforo y fuentes de (D) Asimilación
(E) Hidrólisis
minerales.
• Los factores de crecimiento son compuestos orgánicos que 5. Una cepa de E. coli no requiere vitaminas cuando crece en un
medio definido que contiene glucosa, sales minerales y cloruro
deben poseer una célula para crecer pero que no puede
de amonio. Esto se debe a que E. coli:
sintetizar.
(A) No utiliza vitaminas para su crecimiento
• También es fundamental una fuente de energía para
(B) Obtiene vitaminas de su hospedador humano
establecer una fuerza protomotriz y permitir la síntesis
(C) Es un quimioheterótrofo
macromolecular. Los tres principales mecanismos para (D) Puede sintetizar vitaminas a partir de compuestos simples
generar energía metabólica son fermentación, respiración proporcionados en el medio
y fotosíntesis. (E) El cloruro de amonio y las sales minerales contienen oligo-
• Ciertos factores ambientales como el pH, la temperatura cantidades de vitaminas
y la aireación son importantes para el crecimiento. La 6. ¿Cuál de los siguientes NO es un mecanismo de los microorga-
mayor parte de los microorganismos patógenos para el ser nismos para generar energía metabólica?
humano son neutrolófi los (crecen mejor a un pH de 6 a 8) (A) Fermentación
y mesófi los (crecen mejor de 30 a 37 °C). (B) Síntesis de proteínas
• La capacidad de los microorganismos para utilizar oxí- (C) Respiración
geno como aceptor de hidrógeno y para desactivar los (D) Fotosíntesis
productos intermedios nocivos del metabolismo aerobio, (E) C y D
varían mucho entre los microorganismos. Se pueden divi- 7. ¿Cuál de los siguientes términos describe mejor al microorga-
dir en aerobios estrictos, anaerobios facultativos, anaero- nismo que crece a 20 °C?
bios estrictos, microaerófilos y anaerobios aerotolerantes. (A) Neutrolófi lo
• Es posible preparar medios microbiológicos para permitir (B) Psicrótrofo
el crecimiento de determinado tipo de microorganismo (C) Mesófi lo
cuyo número es reducido (medio de cultivo enriquecido), (D) Osmófi lo
(E) Termófi lo
identificar tipos específicos de microorganismos (medio
de cultivo diferencial) o aislar a un microorganismo espe- 8. La capacidad de asimilar N2 en forma reductiva a través de NH3
se denomina:
cífico en una población mixta (medio de cultivo selectivo).
(A) Amonificación
(B) Anamox
(C) Reducción asimilatoria de nitratos
PREGUNTAS DE REVISIÓN (D) Desaminación
1. La mayor parte de los microorganismos patógenos para seres (E) Fijación de nitrógeno
humanos se desarrollan mejor en el laboratorio cuando los culti- 9. ¿Cuál de los siguientes NO es asimilado por las células eucariotas?
vos se incuban de: (A) Glucosa
(A) 15 a 20 °C (B) Lactato
(B) 20 a 30 °C (C) Sulfato (SO42−)
(C) 30 a 37 °C (D) Nitrógeno (N2)
(D) 38 a 50 °C (E) Fosfato ((PO43−)
(E) 50 a 55 °C 10. Las bacterias que son patógenos intracelulares estrictos para el
2. El proceso por el cual un microorganismo produce ATP durante ser humano (p. ej., Chlamydia trachomatis) se consideran:
la fermentación de glucosa se caracteriza por: (A) Autótrofos
(A) Acoplamiento de la producción de ATP con la transferencia (B) Fotosintéticos
de electrones (C) Quimiolitótrofos
(B) Desnitrificación (D) Hipertermófi los
(C) Reducción de oxígeno (E) Heterótrofos

apter 05_Carroll_4R.indd 78 14/04/16

También podría gustarte