Práctica ToxMol #1: Toxicidad causada por nocodazol en células HeLa Page 1

BIOCHEMISTRY

Práctica ToxMol #1: Toxicidad causada por

nocodazol en células HeLa
Profesor: José Lozano (jlozano@uma.es). Dpto. Biología Molecular y Bioquímica. UMA

Day 1
Siembra de las células
Las células HeLa (adenocarcinoma de cérvix) son de origen epitelial y crecen adheridas al
plástico de los frascos o las placas de cultivo. Dos días antes de la práctica se habrán
sembrado 2 frascos F75 con 2,0 x 106 células por frasco, con el objetivo de que los cultivos se
encuentren aprox. al 80% de confluencia el primer día de la práctica. Antes de comenzar, se
comprobará al microscopio la morfología de las células, tomando como referencia las
imágenes que se muestran en la Fig. 1.

Image.png

Fig. 1.-Morfología de las células HeLa

crecidas en placa a densidad baja (izqda) o alta
(dcha). Se trata de células humanas, de origen
epitelial y aisladas de un adenocarcinoma de
cérvix en 1951. El 100% presenta aneuploidia y
positividad para queratina por inmunodetección.
Contienen secuencias de HPV18 y niveles
normales de RB (retinoblastoma). La imagen
pertenece a la American Type Culture Collection
(ATCC), mas info en: http://www.lgcstandards-
atcc.org/Products/All/CCL-2.aspx. Sobre la
historia de estas células: "La vida inmortal de
Henrietta Lacks. Rebecca Skloot. Ed.Temas de
Hoy ISBN 9788484609933)

Para trabajar con células adherentes (por ej. HeLa) es necesario, en primer lugar, bloquear la
adhesión y recuperar las células en forma de suspensión. La técnica habitualmente utilizada
para tal fin se denomina tripsinización y consiste en el tratamiento de las células adheridas
con la serina proteasa tripsina (enzima derivada de su precursor pancreático: el
tripsinógeno). La tripsina tiene un pH óptimo de 7-9 y degrada proteínas de manera
inespecífica, cortando tras residuos Arginina (Arg, R) o Lisina (Lys, K).
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Image.png

Fig. 2.-Mecanismo de acción de la

tripsina: la enzima corta en el extremo
carboxilo de residuos Arg o Lys

Image.png

Fig. 3.-Estructura de la Tripsina. En el centro

activo se indica, en verde, la denominada tríada
catalítica, que incluye los tres residuos catalíticos
implicados en la proteólisis (Ser, His, Asp) y en rojo
los residuos del "bolsillo de especificidad",
implicados en el reconocimiento de los residuos Arg
o Lys en los péptidos diana (en naranja, en la
imagen). Imagen tomada de: Craik, Page &
Madison Biochem J (2011), 435(1) 1-16; DOI
10.1042/BJ20100965

Tripsinización
Con 2 días de antelación, se habrán sembrado células HeLa en un frasco de cultivo F75,
con la intención de que esté aprox. al 80% de confluencia el día de la práctica. Tanto los
medios de cultivo, como el PBS y la solución de tripsina deben estar previamente
atemperados a 37 ºC.

1. Sacar los F75 de la estufa de cultivos (37 ºC, 5% CO2) y colocarlos, manteniéndolos en
horizontal, en la mesa de la cabina de flujo laminar.
2. Retirar el tapón y aspirar el medio de cultivo con un aspirador acoplado a una bomba de
vacío
3. Lavar las células con 10 ml de PBS
4. Añadir 3 ml de una solución Tripsina/EDTA: 0,25% (w/v) tripsina + 0,53 mM EDTA
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5. Cerrar el F75 y devolverlo a la estufa de cultivos durante 1-2 min, o el tiempo suficiente
para que la tripsina actúe sobre las proteínas de adhesión y las células se despeguen del
plástico. Visualmente, se observan las células flotando en el medio.
6. Neutralizar la acción de la tripsina con el doble de volumen (6 ml) de medio DMEM
completo
7. Depositar la suspensión celular (3+6= 9 ml) en un tubo Falcon de 15 ml

Contaje y siembra
1. Colocar un vidrio cubreobjetos cuadrado sobre la región central grabada de una cámara
Neubauer
2. Tomar 20 ul de la suspensión celular (apartado anterior) y mezclarlos con 20 ul de una
solución azul tripano al 0,4% (por tanto, las células se habrán diluido 1:2)
3. Tomar 10 ul de la mezcla células/azul tripano y depositarlos en el espacio que queda
entre el porta y el cubreobjetos, en uno de los dos lados grabados del hemocitómetro
4. Contar las células siguiendo uno de los dos métodos indicados en la Fig. 5.
5. Resuspender las células a una concentración de 100.000 céls/ml en 3 ml de medio
DMEM completo por cada placa p60 (sembrar 1 p60 por cada pareja de prácticas)
[CELS1]

Image.png

Fig. 4.-Cámara de Neubauer, también

denominada hemocitómetro

Image.pdf

Fig. 5.- Método de contaje en un

hemacitómetro. El rango fiable para este tipo
de cámara es de 0,25-2,5 x 106 céls/ml. Método 1
(si hay pocas céls): Se cuentan las células de 2-4
cuadrantes (señalados con el nº 1), se hace la
media y se multiplica por 10.000 (resultado en
céls/ml). Método 2 (si hay muchas céls): se
cuentan las células de 4-8 cuadritos (señalados
con el nº 2), se hace la media y se multiplica por
160.000 (resultado en céls/ml)
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Fig. 6.-Contaje de un cuadrante. Como

norma, se cuentan todas las células que caigan
dentro de un cuadrante (señalados con el nº1 en
la Fig. 5) incluyendo las que tocan las líneas
superior e izqda y excluyendo las que tocan las
líneas inferior y dcha.

Siembra y transfección
En esta parte de la práctica, se sembrarán las células recien tripsinizadas y, simultáneamente,
se transfectarán con un plásmido codificante para la proteína verde fluorescente (EGFP). La
transfección es una técnica que permite introducir ADN en una célula con la intención de
expresar la proteína codificada por el gen incorporado en el plásmido. En concreto,
utilizaremos el plásmido pEGFP-C1 (Fig. 7), lo que nos permitirá identificar, mediante
fluorescencia, las células que han incorporado el plásmido (Fig. 8).

1. Mezclar en un tubo Eppendorf estéril los siguientes reactivos: 300 ul DMEM (sin FBS) +
1 ug pEGFP+ 4 ul PEI (polietilenimina).
2. Vórtex 5 s
3. Incubar 15 min a Tª ambiente
4. Añadir los 300 ul de la mezcla de transfección a los 3 ml de [CELS1] preparados en el
punto 4 de "contaje y siembra"
5. Repartir en una placa p60 e incubar en la estufa (37 ºC, 5% CO2) durante 24 h

pEGFP.png

Fig. 7.- Mapa de restricción del plásmido

pEGFP-C1. En gris se indica la posición de los
genes codificantes para la EGFP y para las
proteínas responsables de resistencia a
antibióticos (Kan/Neo). En la parte inferior se
incluye la secuncia del sitio múltiple de clonaje
MCS (multicloning site, en inglés)
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HeLaEGFP.png

Fig. 8.- Células HeLa transfectadas con

pEGFP observadas al microscopio de
fluorescencia. Obsérvese que, en este caso,
únicamente son visibles las células que emiten
fluorescencia verde, es decir que expresan la
proteína EGFP

Day 2
Tratamiento con Nocodazol
El nocodazol (Fig. 9) es un tóxico del grupo de los inhibidores de microtúbulos, algunos de
los cuales tienen interés terapéutico debido a su acción antimitótica (otros son el taxol,
vincristina y colchicina). Se une a la beta-tubulina, afectando a su polimerización e
impidiendo la formación del huso mitótico. Como resultado, las células expuestas a este
tóxico permenacen bloqueadas en la fase G2/M del ciclo celular, sin poder completar la
mitosis.

1. Por la mañana, temprano, añadir 100 ng/mL nocodazol a una de las 2 placas p60 de
células HeLa sembradas el día anterior
2. Incubar durante 6-8 h en la estufa de cultivos (37 ºC, 5% CO2)
3. Tras el tratamiento con nocodazol, observar la morfología de las células al microscopio
(la mayoría se habrán redondeado y muchas estarán a punto de despegarse de la placa o
directamente, flotando en el medio de cultivo). Esta morfología es debida al bloqueo en
G2/M que impide que las células se dividan.
4. Si el nº de células flotantes es bajo (5-10%), retirar el sobrenadante y añadir 1 ml de PBS,
tanto a la placa no tratada como a la tratada con nocodazol. Si el nº de flotantes fuera
elevado, habría que recogerlas en un tubo de 15 ml y juntarlas con las células raspadas
en el paso 5.
5. Con una espátula de cultivos, raspar con cuidado las células de la placa (CUIDADO: en
general, las células se desprenden con facilidad y no es necesario ejercer una presión
excesiva que dañaría las células. Sin embargo, algunas líneas celulares pueden adherirse
con más fuerza, en cuyo caso, habrá que ejercer mayor presión).
6. Pasar la suspensión celular a un tubo Eppendorf y centrifugar a 600xg durante 3 min.
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7. Retirar el sobrenadante (PBS) y resuspender las células en 200 ul de tampón de lisis

NP40.
8. Incubar en hielo durante 10 min.
9. Centrifugar a 14.000xg durante 8 min
10. Transferir el sobrenadante (extracto celular) a un tubo Eppendorf limpio.
11. Tomar una alícuota de 50 ul, pasarla a un tubo Eppendorf limpio y añadirle 17 ul de
tampón de carga SB 4X
12. Calentar las muestras a 95-98 ºC durante 5 min
13. Procesar mediante SDS-PAGE

Nocodazole.png

Fig. 9.- Estructura molecular del

nocodazol (Methyl (5-[2-thienylcarbonyl]-1H-
benzimidazol-2-yl)

SDS-PAGE y transferencia
Las muestras de proteínas desnaturalizadas con SB 4X y hervidas, se cargarán en pocillos de
geles (previemente preparados por el profesor) de poliacrilamida al 10%. Se utilizarán geles
de 1 mm de grosor y peines de 15 pocillos.
1. Cargar 15 ul de cada muestra/pocillo. Por tanto, cada grupo utilizará 3 pocillos: Control,
Nocodazol, EGFP
2. En la 1ª o última calle de cada gel se cargarán también 5 ul de marcadores de peso
molecular preteñidos, como referencia de tamaño.
3. Montar los geles (2/cubeta) en la cubeta de electroforesis, añadir suficiente Running
Buffer y correr la electroforesis a 290 volt. durante 30-45 min (Fig. 9).
4. Desmontar los geles y colocarlos sobre una membrana de nitrocelulosa precortada o, en
nuestro caso, un TransBlot Turbo Nitrocellulose Transfer Pack
5. Transferir en una fuente TransBlot Turbo (Bio-Rad) durante 7 min a 25 V, 2,5 A (Fig. 10)
6. Desmontar el sistema de transferencia, retirar el gel de poliacrilamida, comprobar que
los marcadores coloreados se han transferido bien y recortar el exceso de membrana
(aquellas regiones que no hayan estado en contacto con el gel)
7. Incubar la membrana en solución de bloqueo (Blocking Buffer) durante 30 min a Tª
ambiente o toda la noche a 4 ºC
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Image.png

Fig. 10.- SDS-PAGE. Las condiciones

desnaturalizantes se consiguen al incluir el
detergente SDS (sodium dodecyl sulfate) tanto en
el tampón de electroforesis (running buffer)
como en el tampón de carga SB 4X (sample
buffer 4X) y el agente reductor mercaptoetanol
(alternativamente, puede usarse DTT) en el SB
4X. Todas las proteínas resultan con carga
negativa neta, por su interacción con el SDS y,
por tanto, se separan exclusivamente en función
de su tamaño. Un buen manual sobre los
fundamentos de la electroforesis de proteínas se
puede encontrar en: http://www.bio-rad.com/
webroot/web/pdf/lsr/literature/
Bulletin_6040.pdf

Image.png

Fig. 11.- Transferencia de proteínas separadas

en gel desnaturalizante (SDS-PAGE) a una
membrana de nitrocelulosa. Debido a la carga
negativa neta del SDS, las proteínas migrarán
hacia el cátodo. En el siguiente enlace se muestra
un resumen de la técnica de transferencia por el
sistema Trans-Blot Turbo, que utilizaremos en
esta práctica: https://www.youtube.com/watch?
v=Ys4iU9UopaQ

Day 3
Western blot
1. Eliminar la solución de bloqueo y enjuagar la membrana con TBST
2. Incubar la membrana con el anticuerpo primario anti-cliclina B1 diluido 1:500 en TBST.
La incubación puede realizarse en una bolsita sellada (10 ml) o en una cubeta (25 ml): 45
min a Tª ambiente.
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3. Retirar el anticuerpo primario (se recupera en un tubo para su reutilización) y lavar con
TBST durante 5 min (x3 veces)
4. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario unido a peroxidasa anti-rabbit-IgG-
HRP diluido 1:5000 en TBST. El anticuerpo secundario reconoce específicamente las
inmunoglobulinas G producidas en conejo (es decir, el anticuerpo primario): 30 min a
Tª ambiente.
5. Retirar el anticuerpo secundario (no se recupera) y lavar con TBST durante 5 min (x3
veces)
6. Revelar con cualquier reactivo comercial basado en la reacción de la peroxidasa sobre el
sustrato luminol. En nuestro caso, utilizaremos el sistema Clarify Western ECL
substrate: mezclar 1 ml reactivo A con 1 ml reactivo B e incubar durante 5 min.
7. Retirar el reactivo de revelado, secar levemente la membrana con papel secante y
procesar la imagen mediante un sistema documentador de geles como, por ej. el
ChemiDoc MP system (Bio-Rad).

MATERIAL
PBS (Phosphate-buffered saline) solución salina: 137 mM NaCl + 2,7 mM KCl + 4,3 mM
Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4 (pH 7,4)
DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium): es el medio estándar de cultivo de
células de mamífero. La composición detallada puede consultarse en
http://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/30-2002.aspx?
geo_country=es#documentation. Antes de utilizarse, el medio DMEM debe completarse con
antibióticos (streptomicina+penicilina) y 2 mM glutamina (concentración final)
DMEM completo: DMEM suplementado con 10% FBS (suero fetal bovino)
Tripsina/EDTA: solución de 0,25% Tripsina y 0,53 mM EDTA
Trypan blue (azul tripano): (Sigma-Aldrich Ref. T8154) solución al 0,4% en 0,81% NaCl,
0,06% K2HPO4
PEI (polietilenimina): polímero catiónico que se utiliza para acomplejar el DNA e
introducirlo en las células.
Nocodazol: tóxico antimitótico. Actúa inhibiendo la polimerización de los microtúbulos.
Tampón de lisis NP40: 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 137 mM NaCl, 10% glicerol, 1% NP40, 1
mM EDTA, 1 mM DTT + inhibidores proteasas.
Tampón de carga (Laemmli Sample Buffer) 4X: 277.8 mM Tris-HCl, pH 6.8, 4.4%
SDS, 44.4% (w/v) glycerol, 0.02% azul de bromofenol
Tampón de electroforesis (Running buffer): 25 mM Tris base, 192 mM glicina, 0,1%
SDS
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TBST (Tris-buffered saline + Tween 20): 20 mM Tris pH 7.6, 137 mM NaCl, 0,1%
Tween 20
Tampón de bloqueo (Blocking Buffer): 5% de leche en polvo disuelta en TBST
Trans-Blot® Turbo™ Midi Nitrocellulose Transfer Packs: obtenidas
comercialmente de Bio-Rad ref. #1704159 (https://www.youtube.com/watch?
v=Ys4iU9UopaQ)
Anticuerpo primario anti-cliclina B1: obtenido comercialmente de Santa Cruz Biotech
ref. #sc-594
Anticuerpo secundario anti-rabbit-IgG-HRP: obtenido comercialmente de G.E.
Amersham ref. #NA934
Clarify Western ECL Substrate: obtenido comercialmente de Bio-Rad ref. #1705062)

ProteinMarkerVI_Applichem.jpg

Marcadores de peso molecular preteñidos: En esta práctica

utilizaremos los Protein Marker VI de la casa comercial Applichem (ref.
A8889). Hay mucho otros en el mercado, igualmente válidos.

Protocolo actualizado el: 30 nov 2016