TAREA 2

BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA

MARINA PERAL PÉREZ

ACTIVIDAD 1:
Analiza la composición del siguiente medio de cultivo indicando la función que realizan cada
uno de sus componentes.

• L-Glutamina: es un suplemento de aminoácidos esenciales, además, es el

aminoácido que participa en la formación de purina y nucleótidos de pirimidina, amino
azúcares, glutatión, L-glutamato y otros aminoácidos, así como en la síntesis de proteínas y
la producción de glucosa.

• HEPES: es un tampón no iónico que se utiliza en los sistemas de cultivo cerrados para
compensar los cambios de pH. Es la solución para células de crecimiento rápido por
su elevada capacidad tamponadora en el rango de 7,2 a 7,6 y se emplea en
concentraciones de entre 10 y 20 mM.

• Glucosa: suministra a las células una fuente de carbono y energía. In vitro, es

metabolizada preferentemente vía glucólisis hacia piruvato que puede ser convertido
en lactato o acetoacetato que entra el ciclo de Krebs, y genera CO2.

• Sulfato de magnesio: el sulfato de magnesio es una de las sales inorgánicas que

componen el HBSS y EBSS para satisfacer tanto el requerimiento de magnesio como
el de azufre. Permite controlar el pH y la presión osmótica.

• Penicilina-Estreptomicina: es una combinación antimicrobiana que se suele mezclar

en concentraciones respectivas de 100 U/mL y 100μg/mL. Evita el crecimiento de
contaminantes en el cultivo.

• Anfotericina B: es un antibiótico de acción antifúngica que se suele emplear con

concentración 2,5 μg/ml. Puede tener algunos efectos secundarios sobre el
crecimiento de células de médula ósea humana en cultivo.

• Suero fetal bovino (FBS): aporta hormonas y factores de crecimiento, factores de

adhesión e inhibidores de proteasas, el suero bovino fetal es usado en las líneas
celulares más exigentes. Es un componente que hace que el medio se considere no
definido ya que su composición varía entre lotes y supone inconvenientes a la hora
de estandarizar procedimientos.
 • Rojo fenol: indicador de pH que cambia de color a medida que aparecen catabolitos
ácidos en el medio como resultado del metabolismo celular. (Rojo: pH 7,4 – Naranja:
pH 7,0 – Amarillo: pH 6,5 - Púrpura: pH 7,8).

ACTIVIDAD 2:
Comenta las características de los cultivos que se pueden observar en las imágenes
siguientes:

Para cada cultivo comenta los siguientes aspectos: Tipo de cultivo (suspensión,
monocapa…); morfología de las células; posible origen de las mismas; grado de confluencia
del cultivo (alto, medio, bajo…).

En la primera imagen se
observan células poligonales y
aplanadas, algo redondeadas que
parecen estar asociándose.
Podríamos decir, que son células de tipo
epitelial en un cultivo en
monocapa, con alto grado de
confluencia
En la segunda imagen, las células presentan
una morfología esférica, lo que indicaría
que se trata de un cultivo en suspensión,
posiblemente de células de la sangre
o hematopoyéticas, con un grado de
confluencia medio.

En la tercera imagen las células tienen

morfología aplanada con forma de
fibroblasto, lo que podría ser un cultivo de
células de tejido conjuntivo en monocapa,
con un grado de confluencia medio.

En la cuarta imagen se observan células

alargadas dispuestas en paralelo, lo que
podría indicar que se trata de células tipo
fibroblasto en un cultivo en monocapa con
un alto grado de confluencia.

ACTIVIDAD 3:
Estás realizando la tripsinización de un cultivo y en el paso final añades 5 ml de medio fresco
para inactivar la tripsina y recoger todas las células despegadas. Tienes que preparar los
subcultivos y quieres saber el número de células viables de las que dispones. Para hacer el
recuento realizas una dilución previa de la suspensión obtenida tras la tripsinización
tomando 200 µl de la misma y 400 µl de medio de cultivo. Traspasas 100 µl de esta dilución
a un tubo eppendorf y los mezclas con 100 µl de colorante azul tripán (0,4 %).
Con esta mezcla llenas la cámara de recuento. Esto es lo que ves al microscopio.

Calcula el número de células viables que tienes en tu cultivo.

1. Contamos las células de los cuadrantes exteriores, es decir, de los grises. Como hemos
utilizado azul de tripán, contaremos aquellas blancas ya que, el colorante no ha penetrado
en ellas. Por lo que contamos 12 en cada cuadrante.
2. Tenemos los factores de dilución que serán el primero 3 y el segundo 2.
3. Aplicamos la fórmula para calcular la concentración por mililitro:
12+12+12+12
Nº células/mL = × 3 × 2 × 104 = 7,2 × 105 células/mL
4

ACTIVIDAD 4:
Escribe el protocolo de la técnica de sacrificio celular. En el deben quedar reflejados todos
los pasos que se realizan, así como las condiciones y tiempos de incubación y centrifugación
de cada uno de ellos.
El procedimiento de sacrificio consta de dos partes:
 1. Choque hipotónico.
2. Fijación.
El primer paso es la preparación e identificación tanto del material (tubos y pipetas Pasteur)
que se va a utilizar, como de los reactivos necesarios para llevarlo a cabo:
• La solución de choque hipotónico: KCl a una concentración 0,075 M.
• Los fijadores: Soluciones de metanol y acético a concentraciones diferentes.
❖ El choque hipotónico es una operación crítica. Tiene como objetivo eliminar los
eritrocitos de la muestra. La solución de cloruro de potasio utilizada tiene una
concentración de sales menores que la que hay en el citoplasma de las células, por lo
que el agua de la solución se moverá por ósmosis hacia el interior de éstas. Los
eritrocitos, que tienen una membrana más débil, se romperán y los leucocitos
quedarán con un aspecto semejante a "bolsas" que llevan en su interior los
cromosomas metafásicos (recordemos que la membrana nuclear desaparece al
comienzo de la mitosis).
❖ La fijación tiene como objetivos conservar la morfología de los cromosomas durante
el proceso y facilitar el extendido cromosómico. Se lleva a cabo con metanol y ácido
acético. El ácido acético provocará la lisis de los eritrocitos que no se hayan lisado
con el choque, dando lugar a la aparición de un color marrón en el medio,
consecuencia de la reducción de la hemoglobina. Uno de los fijadores más usados, es
el reactivo de Carnoy, una mezcla de metanol y ácido acético en proporción 3:1.

El proceso de fijación seguido de centrifugación y descarte del sobrenadante se repite varias

veces (entre 4 y 5) hasta conseguir un sedimento de color blanco, donde prácticamente
todo sean leucocitos. Cuando la fijación no ha sido correcta, los cromosomas muestran en
las extensiones lo que se conoce con el nombre de "halo", un material amorfo a su
alrededor que da al conjunto un aspecto como de "huevo frito". Este material se tiñe en los
pasos siguientes y dificulta el proceso de bandeado de los cromosomas.
Una vez realizada la fijación y el lavado de las preparaciones, se pueden guardar las células
en nevera a 4ºC en fijador de Carnoy durante varios días antes de realizar las extensiones.

Procedimiento:
1. Transferir el cultivo a un tubo de centrífuga a 3000 rpm durante 10 min.

• Tras esto, decantar el sobrenadante con una pipeta Pasteur, quedando

aproximadamente la altura de un dedo de contenido en el tubo.
• El contenido restante se succiona con la pipeta y ésta se deja dentro del tubo.

2. Añadir al tubo 5 ml de KCl 0,075M y mezclarlo con la pipeta Pasteur.

3. Incubar los tubos cerrados en estufa a 37ºC durante 8 min.
4. Centrifugar los tubos a 3000 rpm durante 10 min.
5. Retirar y descartar con una pipeta Pasteur el sobrenadante de los tubos en un contenedor
apropiado con cuidado de no distorsionar el botón de sedimento, en ese caso habría que
volver a centrifugar.

• Se observa una capa de leucocitos por encima de los eritrocitos, que son las células
que se van a estudiar.
• Dejar en contenido en las pipetas como en el primer paso.

6. Añadir 3 ml de fijador I (3% metanol y 5% ácido acético).

• Mezclar con la pipeta hasta que el color del líquido sea oscuro. Se formará espuma.

7.Centrifugar los tubos a 3000 rpm durante 10 min.

• Después, retirar el sobrenadante, suspender el botón de nuevo y dejar la pipeta con

la mezcla en el interior.
8. Añadir 3 ml de fijador II (metanol).

• Mezclar con la pipeta hasta que el color del líquido sea más claro.

9. Centrifugar los tubos a 3000 rpm durante 10 min. El color del sobrenadante será más
claro y se apreciará un sedimento blanco.

• Después, retirar el sobrenadante dejando 1mL, suspender el botón de nuevo y dejar

la pipeta con la mezcla en el interior.
10. Añadir 6 ml de fijador III (Carnoy: Metanol: acético (3:1)) mezclar con la pipeta y agitar
en vórtex a velocidad media.

• Centrifugar los tubos a 3000 rpm durante 10 min.

11. Retirar el sobrenadante y suspender el precipitado.

• Volver a añadir fijador y agitar en vórtex.

• Dejar este paso de fijación hasta el día siguiente en frigorífico a 4ºC.

ACTIVIDAD 5:
Analiza las metafases indicando al lado de cada cromosoma el grupo al que pertenece.
Indica también su fórmula y si crees que tiene una alteración indica de cuál pudiera tratarse.
 GRUPO A: 6
GRUPO A: 6 GRUPO B: 4
GRUPO A: 6
GRUPO B: 4 GRUPO C: 15
GRUPO B: 4
GRUPO C: 16 GRUPO D: 6
GRUPO C: 16
GRUPO D: 6 GRUPO E: 6
GRUPO D: 6
GRUPO E: 6 GRUPO F: 4
GRUPO E: 6
GRUPO F: 4 GRUPO G:4
GRUPO F: 4
GRUPO G:4 Resultado: 45, X0 mujer con
GRUPO G:4
Resultado: 46, XX mujer posible síndrome de Turner
Resultado: 46, XX mujer

ACTIVIDAD 6:
La siguiente imagen corresponde a una extensión cromosómica en la que se han realizado
bandas G.
a) Analiza la metafase indicando al lado de cada cromosoma el grupo al que pertenece.

b) Indica su fórmula.
El número total de cromosomas es 47. Podría tratarse de un hombre, ya que hay un
cromosoma que podría corresponder al cromosoma Y además de otros 4 pertenecientes al
grupo G, sin embargo, aparecen 16 cromosomas del grupo C en lugar de los 15 típicos en un
cariotipo normal de un hombre. Esto podría indicar una alteración numérica como la
existencia de dos cromosomas X, en ese caso el resultado sería 47, XXY (Síndrome de
Klinefelter).

c) En el caso de que exista una alteración comenta lo que sepas acerca de ella.
El síndrome de Klinefelter es una alteración numérica que supone la existencia de un
cromosoma X extra. Se presenta en 1 de cada 500 a 1000 varones nacidos. Causa
hipogonadismo, gran altura con forma femenina del cuerpo y ginecomastia, estériles la
mayoría y pueden presentar cierto retraso mental.

ACTIVIDAD 7:
La siguiente imagen corresponde a una extensión cromosómica en la que se han realizado
bandas G.
a) Analiza la siguiente metafase. Coloca al lado de cada cromosoma su número
correspondiente.

b) En este cariotipo existe una alteración estructural. Indica de qué tipo de alteración
se trata.

Podría tratarse de una mujer (XX) con una alteración numérica, además de los 46
cromosomas, aparece un cromosoma extra que podría indicar una trisomía de alguno de los
cromosomas “más pequeños” (13, 19, 20, 22...). Sin embargo, no parece corresponder con
ningún par en concreto, por lo que podría deberse a un error en la duplicación de un
segmento cromosómico que se ha replicado más de una vez.