Detección Molecular de Fusarium solani

en Suelo y Plantas de Fresa

1. Introducción.

2. Objetivos.

3. Materiales y Métodos.

4. Resultados.

5. Discusión.
Detección Molecular de Fusarium solani en Suelo y Plantas de Fresa / [De la Lastra, E., Basallote-
Ureba, M. J., De los Santos, B., Miranda, L., Vela-Delgado M. D. y Capote, N.]. – Sevilla. Consejería de
Agricultura, Ganadería, Pesca y Desarrollo Sostenible, Instituto de Investigación y Formación Agraria y
Pesquera, 2020. 1-17 p. Formato digital (e-book) – (Protección Vegetal Sostenible)

Palabras clave: Fresa – Fusarium solani – qPCR – densidad de inóculo - biosolarización

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Reconocimiento-No comercial-Sin obra derivada.

Detección Molecular de Fusarium solani en Suelo y Plantas de Fresa

© Edita JUNTA DE ANDALUCÍA. Instituto de Investigación y Formación Agraria y Pesquera.
Consejería de Agricultura, Ganadería, Pesca y Desarrollo Sostenible.
Sevilla, Diciembre de 2020.

Autoría:
Eduardo de la Lastra
M.ª José Basallote-Ureba
Berta De los Santos
Luis Miranda
M.ª Dolores Vela-Delgado
Nieves Capote

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IFAPA, Centro Las Torres

Este trabajo se ha desarrollado en el ámbito del proyecto RTA2013-00062-C05-02, financiado por INIA
y cofinanciado por la Unión Europea a través de fondos FEDER 2014-2020 “Programa Operativo de
Crecimiento Inteligente”
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1.- Introducción.

España es el cuarto productor mundial de fruto de fresa y el primero de Europa. En nuestro país, el ciclo del
cultivo tiene lugar en dos etapas y en dos zonas geográficas diferentes. Las plantas de fresa se producen en viveros
de altura de las provincias de Segovia, Ávila y Valladolid (Castilla y León) entre los meses de abril y septiembre.
Una vez recolectadas, se trasplantan a fincas de producción de fruto de la provincia de Huelva donde tiene lugar
su desarrollo vegetativo, floración y fructificación entre los meses de octubre y junio.

En la provincia de Huelva, el cultivo se establece en fincas de suelos arenosos donde se practica el monocultivo. La
producción se lleva a cabo en un 90% de la superficie bajo grandes túneles con cubierta plástica o macrotúneles
(Figura 1), o microtúneles (Figura 2), aunque cerca del 3% de la producción se realiza en cultivo sin suelo o
hidroponia (Figura 3).

IMAGEN
La superficie de cultivo dedicada a la fresa ha ido aumentado progresivamente en los últimos años y con ello la
producción de fruto. Los cultivares de fresa utilizados han pasado de explotar una única variedad predominante,
Camarosa, a cultivar principalmente entre 9-10 variedades diferentes.

Figura 1. Cultivo bajo macrotúnel Figura 2. Cultivo bajo microtúnel Figura 3. Cultivo sin suelo

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1.- Introducción.

La producción de fresa en España ha sido altamente dependiente de la utilización de fumigantes

químicos para la desinfestación de suelo en viveros y campos de producción de fruto. Debido a su
potencial efecto nocivo sobre la salud y el medioambiente, la entrada en vigor de la Directiva
91/414/CEE, y su renovación por el Reglamento (CE) 540 de 25 mayo 2011, ha supuesto la desaparición
de aproximadamente el 70% de las sustancias activas utilizadas para el control de enfermedades y plagas
que afectan al cultivo de la fresa.
Este hecho, unido a la condición de monocultivo de la fresa, se apunta como la principal causa de la
emergencia de nuevos patógenos de suelo en el cultivo de la fresa, como Macrophomina phaseolina
(Figura 4A), Fusarium oxysporum (Figura 4B) y Phytophthora cactorum (Figura 4C).

A B C

Figura 4. Cultivo in vitro de Macrophomina phaseolina (A), Fusarium oxysporum f. sp. fragariae (B)
y Phytophthora cactorum (C) en medio de cultivo PDA

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1.- Introducción.

Durante las años 2010-2013, se detectaron plantas con síntomas de marchitez (Figura 5A), enanismo
(Figura 5B), producción escasa de raíces (Figura 5C) en campos de producción de fruto de fresa de la
provincia de Huelva. Ocasionalmente, las coronas de las plantas afectadas presentaban una coloración
marrón oscuro o necrosis (Figura 5D).

A B

C D
Figura 5. Síntomas de
Fusarium solani en
plantas de fresa:
marchitez (A); enanismo
(B); escasa producción
de raíces nuevas (C) y
necrosis en corona (D)

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1.- Introducción.

El agente causal de estos síntomas se identificó como el hongo de suelo Fusarium solani (Figura 6A), bien adaptado a
la supervivencia en el suelo y capaz de formar estructuras de resistencia llamadas clamidosporas (Figura 6B). Este
hongo se ha reportado anteriormente como patógeno de otros cultivos hortícolas como calabaza1, guisante2, judía3,
espárrago4 y ajo5.

A B

Figura 6. Cultivo in vitro de Fusarium solani en medio PDA (A);

Macroconidias y clamidosporas de F. solani (B)

1García-Jiménez, J.; Armengol, J.; Moya, M.J.; Sales, R. (1997). First report of Fusarium solani f. sp. cucurbitae Race 1 in Spain. Plant Disease. 81, 1216.
2Tello, J. C., Lacasa, A.; Navas, A. (1988). Prospección de micosis en el cultivo del guisante (Pisum sativum L.) en Murcia. Phytoma España 1,46-53.
3Tello, J. C., Lacasa, A., Molina, R. (1985). Una nota fitopatológica sobre el complejo parasitario del pie de la judía (Phaseolus vulgaris). ITEA 61,57-69.

4Corpas-Hervias, C.; Melero-Vara, J.M.; Molinero-Ruíz, M.L.; Zurera-Muñoz, C.; Basallote-Ureba, M.J. (2006). Characterization of isolates of Fusarium spp.

obtained from asparagus in Spain. Plant Dis. 90 (11), 1441-1451

5Basallote, M. J., Zurera, C., Melero, J. M., Prados, A. M. (2011). Nueva enfermedad en el cultivo del ajo ocasionada por Fusarium spp. Phytoma España.

229, 56-58.

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1.- Introducción.

Tradicionalmente, la detección de este tipo de hongos patógenos se realiza mediante la observación de síntomas en
las plantas afectadas y el cultivo en placa de los tejidos sintomáticos. Este método requiere de un ojo experto y, aún
así, la detección y posterior identificación a veces resulta errónea.

Por ello, el uso de técnicas moleculares en el laboratorio ayudan a realizar una detección rápida y fiable del hongo.
Para ello, se extrae el ADN de una muestra de la planta afectada o del suelo donde éstas se cultivan y, si F. solani
está presente, se detecta específicamente su ADN de forma muy sensible, mediante una técnica denominada PCR
(amplificación de un fragmento específico del ADN del hongo). En el presente estudio se ha utilizado la PCR
cuantitativa en tiempo real o qPCR que permite detectar y cuantificar ADN de F. solani presente en la planta o en el
suelo mediante fluorescencia (Figura 7).

A Densidad de inóculo F. solani

Fluorescencia

Figura 7. A partir de ADN extraído de planta o suelo se detecta el ADN de Fusarium solani mediante fluorescencia
(PCR en tiempo real)

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2.- Objetivos.

1. Diseñar una herramienta molecular para la detección y cuantificación rápida, fiable y específica
de F. solani en plantas y en muestras de suelo.

2. Validar este método en muestras de plantas de fresa y suelo de cultivo.

3. Aplicar este método en un escenario de campo para evaluar el efecto de la biosolarización en la

disminución de la densidad de inóculo de F. solani en el suelo y el aumento de la producción de
fruto de fresa.

4. Ofrecer un servicio de detección de F. solani y el diagnóstico de la enfermedad producida por el

hongo a agricultores, técnicos y cooperativas.

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3.- Materiales y Métodos.

Muestreos
Se hicieron prospecciones en campos de producción de fruto de la
provincia de Huelva y se colectaron plantas con síntomas y muestras de
suelo a lo largo de las campañas 2014, 2015 y 2016 (Figura 8). Cada
muestra se analizó en paralelo por el método de detección tradicional
(aislamiento en medio de cultivo) y por el método molecular diseñado
(qPCR).

 Plantas sintomáticas: Más de 90 plantas sintomáticas fueron recolectadas

y analizadas a lo largo de las 3 campañas.

 Suelo: Se tomaron muestras de suelo antes de la plantación, recogidas en

zig-zag (20cm de profundidad) por cada lomo y, a lo largo de la campaña,
se tomaron muestras de suelo de debajo de las plantas infectadas.

Figura 8. Muestreos en campos

de producción de fruto de fresa

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3.- Materiales y Métodos.
Figura 9. Plantas de fresa trasplantadas en
lomos biosolarizados con gallinaza
Biosolarización
Se plantaron plantas de fresa procedentes de vivero en
la finca experimental El Cebollar (Moguer, Huelva) en
octubre en dos campañas consecutivas (2015/16 y
2016/17). Las plantas se cultivaron en dos parcelas: una
con suelo desinfestado mediante biosolarización con
gallinaza (2.500 g/m² y posterior cubierta con plástico)
y la otra no biosolarizada. En cada parcela se
establecieron 4 lomos con 38 plantas / lomo (Figura 9).
En ambas parcelas se determinó a lo largo de las dos
campañas:
●
la densidad de inóculo de F. solani previa al
tratamiento, mediante detección molecular y detección
tradicional en placa
●
la incidencia de la enfermedad como porcentaje de
plantas muertas a lo largo de la campaña
●
la producción acumulada como gramos de fruto de
fresa producidos por planta.
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4.- Resultados.

Validación de la detección molecular en plantas

De 93 plantas muestreadas, en 25 se detectó F. solani y 55 fueron negativas por ambos métodos (qPCR y cultivo en
placa). Hubo 12 plantas que fueron positivas por qPCR pero negativas por cultivo en placa*. Finalmente, una
planta se detectó por cultivo en placa pero no por qPCR (Figura 10).

*Esto indica una mayor

sensibilidad de la detección
molecular.

Figura 10. Concordancia entre los métodos de detección de F. solani en plantas: tradicional (cultivo en
placa) y molecular (qPCR)

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4.- Resultados.

Validación de la detección molecular en suelo

De 21 muestras de suelo analizadas, en 14 se detectó F. solani y 3 fueron negativas por ambos métodos (qPCR y
cultivo en placa). Hubo 3 plantas que fueron positivas por qPCR pero negativas por cultivo en placa*.
Finalmente, una planta se detectó por cultivo en placa pero no por qPCR (Figura 11).

*Esto indica una mayor

sensibilidad de la detección
molecular.

Figura 11. Concordancia entre los métodos de detección de F. solani en suelo: tradicional (cultivo en
placa) y molecular (qPCR)

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4.- Resultados.

Eficiencia de la Biosolarización

La densidad de Fusarium solani fue significativamente menor en suelos biosolarizados que en no biosolarizados,
tanto si se midió mediante qPCR (picogramos de ADN por gramo de suelo, pg/g suelo) como por cultivo en placa
(unidades formadoras de colonias por gramo de suelo, ufc/g suelo). Murieron más plantas a causa de F. solani en el
suelo no biosolarizado aunque no hubo diferencias significativas en el número de plantas muertas entre las
parcelas biosolarizadas y el control. La producción acumulada de fruto de fresa fue significativamente mayor en el
suelo biosolarizado (Figura 12).

Figura 12. Densidad de inóculo de F. solani en suelos pre-plantación biosolarizados y no biosolarizados

medida como ufc/g suelo (método tradicional) y pg ADN /g suelo (qPCR), porcentaje de plantas muertas y
producción acumulada de fruto de fresa (gramos / planta). Los datos son el promedio y error estándar de 4
lomos por tratamiento en dos campañas consecutivas (2015/16 y 2016/2017).

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4.- Discusión.

En este trabajo se ha desarrollado un método molecular basado en qPCR para la detección rápida, fiable y
específica del hongo patógeno de fresa Fusarium solani en plantas enfermas y muestras de suelo.

La alta sensibilidad y especificidad de este método permiten usarlo para el análisis de plantas de vivero y suelos de
plantación antes del cultivo como método preventivo de control y evaluación de riesgos. El uso de técnicas
moleculares para detección de F. solani permite obviar los análisis tradicionales de cultivo en placa, que requieren
un mayor esfuerzo y tiempo.

Además, este método molecular se puede aplicar, entre otros, para el estudio de susceptibilidad de variedades y
la eficacia de tratamientos de desinfesción de suelo. En este caso, se ha demostrado que tratamientos de
biosolarización con gallinaza disminuyeron la densidad de inóculo de F. solani en el suelo y la incidencia de la
enfermedad, y aumentaron el rendimiento de producción de fruto.

La técnica molecular utilizada representa una herramienta muy útil para el manejo de la fusariosis provocada por
F. solani en fresa y para llevar a cabo análisis de riesgos antes de la plantación. El IFAPA Las Torres pone esta
técnica a disposición de agricultores, técnicos y cooperativas.

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Fusarium solani en Suelo y
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Este trabajo ha sido cofinanciado al 80% por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional, dentro del Programa Operativo FEDER de Andalucía 2014-2020