MÉTODOS DE SEPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN

DE MACROMOLÉCULAS

Clase Teórica

PARÁMETROS HIDRODINÁMICOS

Difusión, Fricción, Radio de Stokes

2020
• Parámetros hidrodinámicos
Modelos conformacionales.
Coeficiente de difusión y coeficiente de fricción.
Radio de Stockes.
Coeficiente de sedimentación

• Sedimentación en la ultracentrífuga
Métodos de velocidad de sedimentación y
equilibrio de sedimentación.
 Los métodos y parámetros hidrodinámicos:
Difusión (D), fricción (f) y Radio de Stokes (Rs)
● Los métodos hidrodinámicos de separación y caracterización son
aquellos en los que la macromolécula se desplaza en medios fluidos,
debido a distintos tipos de fuerzas, ya sea fuerzas generadas por
gradientes propios o fuerzas externas aplicadas.

● Ese movimiento en todos los casos va a depender de parámetros

moleculares como la forma, el volumen o tamaño (y además de otros
parámetros, según el método), la flexibilidad, y la hidratación.

● Entre los parámetros dependientes de la forma, tamaño y flexibilidad

de las macromoléculas desarrollaremos los siguientes:

Coeficiente de difusión (D) – Coeficiente de fricción (f)

 Radio hidrodinámico o Radio equivalente de Stokes (RS)

De estos parámetros hidrodinámicos dependen:

● El volumen de elusión en la cromatografía de filtración

por geles (Ve)

● La movilidad electroforética (μel)

● El coeficiente de sedimentación (s) en centrifugación

El conocimiento de los parámetros hidrodinámicos ayuda a predecir el

comportamiento de las macromoléculas en esos procesos y viceversa, el
resultado de aplicar algunos de esos procesos aporta información acerca
de los parámetros. Y hay otros parámetros como la viscosidad intrínseca
[η] que en algunos casos se determina explícitamente con la finalidad de
evaluar los cambios de forma de una macromolécula.
 Las macromoléculas adoptan distintas formas

Colágeno

Moléculas T4DNA (L aprox. 55 um),

moviéndose libremente en solución ,
observadas con microscopía de fluorescencia

Polímeros sintéticos: random coil

Folding of Elongated Proteins: Conventional or

Anomalous? Tzachi Hagai, and Yaakov Levy.
J. Am. Chem. Soc., 2008.
El conocimiento preciso de la estructura tridimensional lo
brinda la cristalografía de rayos X.
Dependiendo del tamaño, se puede conocer con menor
precisión la forma y el tamaño por microscopía electrónica.

Pero más allá de que se conozca la verdadera forma y tamaño,

resulta imposible, para analizar los distintos fenómenos que se
producen, y que dependen de ellos, generar ecuaciones que
contemplen la estructura particular de cada una.

Por eso se recurre a modelos de partículas que se

aproximen a las distintas formas reales
 MODELOS CONFORMACIONALES
GLOBULARES
proteínas
Elipsoides de revolución

Prolato
ESFERA Oblato

OVILLO ESTADÍSTICO
(RANDOM COIL)
ELONGADAS

Barra, filamento
ADN, polisacáridos, proteínas
Polímeros sintéticos, polisacáridos,
proteínas y ADN desnaturalizados
 El coeficiente de difusión – fricción
● Las moléculas se mueven constantemente debido a la
energía de agitación térmica con un movimiento azaroso (en
todas las direcciones).
● Si la distribución del conjunto de moléculas es homogénea,
los distintos movimientos se compensan y no hay movimiento
neto.
● Si existe una diferencia de concentración (gradiente de
potencial químico) se va a producir un movimiento neto
desde la zona de mayor concentración a la zona de menor
concentración.
Si solo tenemos en cuenta la difusión térmica y en una dirección:

El flujo J : número de moléculas que por unidad de área y tiempo

atraviesan el plano en la dirección x:
J = 1/A. dni/dt
Ji = civi ; Fimp = f vi ; NA f= 1/ Ui ; Ui= movilidad
Fimp = -grad μ = -d μ/dx
Ji= - ui ci d μ/dx = - uiRT dci/dx = -D dci/dx.

Ji= -D dci/dx
Primera ley de Fick
El coeficiente de difusión y el coeficiente de fricción:

D= Ui RT ; D= RT/NA f
Coeficiente de Difusión (D):

RT
D Unidades en las que se
expresa generalmente
NA f [cm2/s]

Coeficiente de Fricción (f):

RT Unidades en las que se
f  expresa generalmente

NA D [g/s]
 ¿Cómo depende el coeficiente de fricción (f) de
las dimensiones y la forma de la partícula?

Para una esfera, de acuerdo a la ley de Stokes:

f=6πηR
● Para otras formas geométricas, también existen fórmulas
que permiten el cálculo de f (elipsoides de revolución,
polímeros flexibles, etc.)

● Queda claro que f (o D) dependen de la forma y tamaño.

● La forma que da el menor coeficiente de fricción es la que

posee, para una determinada masa, la menor superficie, o
sea la esfera.
 ¿ Se puede conocer o predecir el comportamiento
hidrodinámico de una macromolécula conociendo la
masa , el volumen y la hidratación?

● Conociendo la masa, el coeficiente de hidratación y el

volumen específico parcial, se puede calcular el volumen
de la molécula, pero no la forma y por ende solo
excepcionalmente se puede predecir el comportamiento
hidrodinámico.
● Por lo tanto, es necesario plantear algún modelo y realizar
ciertas simplificaciones.
 Relación entre la masa, el volumen y la
hidratación de la partícula macromolecular
Si asumimos un modelo de macromolécula compacta e hidratada

Solvente libre
Volumen específico: v10

Macromolécula anhidra:
Masa de la partícula anhidra: M/NA
Volumen específico: v2

Solvente asociado:
v1 : volumen específico del solvente
δ : gramos de solvente/gramo de proteína anhidra
(coeficiente de hidratación)
Masa de solvente asociado: δ M/NA
 En base a ese modelo, la masa y el
volumen de la partícula hidratada resultan:

MP 
M
1    VP 
M
v2  v1 
NA NA

Como el Vp queda en función del volumen específico del solvente asociado, y

este valor no se conoce, si primero se define el volumen específico parcial de la
macromolécula  V 
v2   
 g 2  PTg1
Donde g2: gramos de soluto
Se puede demostrar que es posible reemplazar la suma entre paréntesis en la
expresión anterior de Vp por otra equivalente y obtener la expresión del volumen
de la partícula hidratada en función del volumen específico parcial de la
macromolécula y el del solvente puro :

VP 
M
NA

v2  v10 
 El coeficiente de fricción mínimo
Conociendo la masa y el volumen específico parcial (generalmente la hidratación no se
conoce) solo se podrá calcular su coeficiente de fricción si asumimos que tiene una
determinada forma geométrica, por ejemplo si es una esfera:
Vesfera = 4 ( π R3) /3
se puede despejar el radio y luego calcular f con la ecuación de Stokes.
Pero este radio y coeficiente solo serán los reales si la macromolécula es una esfera y no
está hidratada
De lo contrario, lo que podemos decir es que es el mínimo coeficiente de fricción fmin que
podría tener, de acuerdo a su masa y volumen específico parcial.

1/ 3
 3M v2 
f min  6 

 4N A 

En general, f/ fmín>1 y esto ocurre, porque la macromolécula no es esférica, o porque está

hidratada, o ambas causas.
En general, un valor aproximado para proteínas nativas es un coeficiente de hidratación
δ= 0,2 - 0,3 y el volumen específico parcial adopta un valor promedio de 0.73 cm3/g
Así sabemos que para partículas esféricas, de igual densidad o volumen específico e
hidratación, el radio crecerá con la raíz cúbica de la masa y también lo hará f.
De lo contrario, debe quedar claro que si las formas son diferentes, la relación entre el radio y
la masa ya no posee una dependencia predecible.
 El radio equivalente
Para las formas reales que adoptan las macromoléculas en general la relación
entre el radio y la masa no posee una dependencia predecible. Salvo en casos
en que se pueda aproximar a otras formas geométricas definidas (ej. prolato,
oblato) pero la relación es más compleja.

● O sea no se puede inferir un radio, una masa o un volumen exactos a partir de

un comportamiento hidrodinámico que depende de la forma y el tamaño y
viceversa, debido a que se desconoce la ecuación que los relaciona y por
simplicidad, lo que se hace es trabajar con el radio equivalente.

● El radio equivalente para cualquier propiedad hidrodinámica es el

radio de la esfera equivalente que posee el mismo valor de una
determinada propiedad en solución, que la de la macromolécula
bajo consideración.

● Como muchos fenómenos de interés dependen del coeficiente de

fricción (o difusión), definiremos el radio equivalente en relación a esta
propiedad. Pero también podría definirse el radio de la esfera
equivalente en función de la viscosidad intrínseca, radio de giro, etc.
 El radio de la esfera equivalente
o radio de Stokes
● Se define como el radio de la esfera que tiene el mismo
coeficiente de fricción que la partícula.

● Si se conoce el valor del coeficiente de fricción real, el radio

de Stokes se calcula despejando de la ecuación de Stokes,

f real  6RStokes
● En general, las otras propiedades hidrodinámicas aparecen
dependiendo del radio de Stokes (la movilidad electroforética,
el volumen de elusión en cromatografía de exclusión
molecular, etc.)
Un ejemplo para comprender el concepto de Rs y Rmin (fmin)
Para la lisozima se conoce el coeficiente de fricción real, freal= 3,925 10-8 g/seg, el v2=0,688
cm3/g y la masa molecular 14.100 g/mol.

A partir de freal = 6 π η RS se puede despejar Rs= 20.8 10-8 cm = 20.8 Å

Por otro lado , el fmin lo calculamos suponiendo que la lisozima es una esfera y no está
hidratada. Entonces igualando su volumen al de una esfera no hidratada, se puede obtener
el valor del Rmin :
Vp= M (v2 )/NA y Vesfera= 4 (πR3)/3
Si igualamos el volumen de la partícula al volumen de la esfera se puede despejar el
Rmin= 15,68 10-8 cm = 15,68 Aº
e introduciéndolo en la ecuación de Stokes , se calcula fmin = 2,956 10 -8 g/seg
Entonces la relación f/fmin=1,32
Por lo que vemos no es una esfera, o está hidratada, o ambas cosas.

Si por otro lado, con el valor del radio de Stokes, calculamos el volumen de la esfera
equivalente Vesfera eq = 3,769 10 -20 cm3, y si con este volumen calculamos la hidratación
correspondiente despejando de
Vp = M/ NA ( v2 + δv01) , con los datos reales de M y de v2 ,
se calcula un δ= 0.91 (91 % de hidratación)

Valor muy alto como es lógico de esperar, ya que en realidad la proteína no es esférica,
es menos simétrica y su esfera equivalente tendría que tener un radio mayor que el
mínimo. Como el volumen específico y la masa molar son los reales, para lograr esa
esfera, debería tener una gran cantidad de agua asociada.
 Aplicación del concepto de Rs en los
métodos hidrodinámicos
● La movilidad electroforética depende del coeficiente de
fricción real, o sea de lo que llamamos el radio de Stokes:

Qp  f KRS 
 ef 
6 RS  1  KR S 
● Muchas veces utilizamos este método con la finalidad de
conocer la masa. Si asumimos formas semejantes, no
necesariamente esféricas, podemos establecer una relación
cuantitativa experimental entre la movilidad y la masa (radio
de Stokes), utilizando patrones que posean formas
parecidas, o bien induciendo en todas las macromoléculas
una misma forma.
 El volumen de elusión en cromatografía de
filtración por geles depende del radio de Stokes

Use of Fast Protein Size-Exclusion Liquid

Chromatography To Study the Unfolding
of Proteins Which Denature through the
Molten Globule. Vladimir N. Uversky
Biochemistry 1993,32, 13288-298
 El radio de Stokes aumenta al
desnaturalizarse una proteína

● A medida que una proteína se

desnaturaliza aumenta el radio de Stokes y
disminuye el Ve en una columna de filtración
por geles.

En la figura se observa cómo va decreciendo

Ve para la lisozima a medida que aumenta
progresivamente la concentración del agente
desnaturalizante (cloruro de guanidinio)
desde 0 M (1) hasta 6.2 M (7).
Como el Ve de elusión en una
columna de filtración por geles va
a depender del radio de Stokes,
si utilizamos esta propiedad para
conocer la masa, debemos utilizar
patrones de forma semejante. En
la gráfica y ecuaciones abajo
descriptas se observa que la
dependencia entre Rs y MM es
diferente para las mismas
proteínas si se encuentran
nativas (Ec. 1) o desnaturalizadas
(Ec.2)
Macromolécula Masa molecular Volumen especifico D (H2O)
parcial v2
(g/mol) (cm2/s)
(cm3/g)

Catalasa 250.000 0.73 4.1 10-7

Hemoglobina 68.000 0.749 6.9 10-7
Albúmina 65.000 0.734 5.9 10-7
Ovoalbúmina 45.000 0.748 7.7 10-7
Ribonucleasa 16.683 0.728 11.9 10-7
Tropomiosina 95.000 0.71 2.24 10-7
Fibrinógeno 330.000 0.79 2 10-7
Colágeno 345.000 0.69 0.69 10-7
 Bibliografía sugerida
● Physical chemistry of macromolecules. C. Tanford. John
Wiley & Sons 1961.
● Ortega A., García de la Torre, J. Equivalent Radii and
Ratios of Radii from Solution Properties as Indicators of
Macromolecular Conformation, Shape, and Flexibility.
Biomacromolecules 2007, 8, 2464-2475.
● Bioquímica Física, Van Holde
● Macromoléculas: estructura y funciones, Finn Wold
● Fisicoquímica con aplicaciones a sistemas biológicos,
Raymond Chang
Continuamos con el siguiente tema …..
 CLASE TEÓRICA

Tema: Electroforesis

2020
Contenidos a desarrollar:

● Fenómenos electrocinéticos
● Ecuación de velocidad y movilidad electroforética:
dependencia funcional
● Flujo electroosmótico
● Fundamentos y métodos de los distintos tipos de
electroforesis: papel, acetato de celulosa, agarosa, geles de
poliacrilamida
● Electroforesis en condiciones nativa y desnaturalizante
● Isoelectroenfoque
● Electroforesis bidimensional
● Inmunoblotting
 Conceptos previos:

● Las proteínas como macroiones. Carga.

Punto isoeléctrico. Radio de Stokes.
● Estructura de proteínas.
● Desnaturalización
 Las macromoléculas como macroiones

Las proteínas, los ácidos nucleicos y algunos polisacáridos se pueden considerar

macroiones con forma, carga y distribución de cargas particulares para cada uno.
Las cargas en las macromoléculas:

● En las proteínas, la carga se origina en los grupos R y en

los grupos amino y carboxilo terminales.
● En los ácidos nucleicos los fosfatos son los portadores de
las cargas.
● En los polisacáridos, generalmente heteropolisacáridos,
proviene de los residuos azúcar oxidados o sustituidos y
pueden ser grupos ácidos (carboxilatos, sulfatos) o
básicos (aminas).
El macroión, su nube iónica o doble
capa eléctrica y el potencial zeta
Los iones, además de estar
hidratados se rodean de una
nube iónica de carga opuesta
y densidad decreciente hacia
el seno de la solución.
 La carga origina un potencial eléctrico
• Este potencial eléctrico, debido al ión central y su nube
iónica, disminuye exponencialmente con la distancia r
(Teoría de Debye-Hückel).
• La expresión, para iones pequeños:
z
r
Ψ= Q ( e - k(r-a)) / Dr (1+ kr)

a y
x
• También para las macromoléculas, el potencial
eléctrico va a depender no solo de su carga sino de la
fuerza iónica de la solución y varía exponencialmente
con la distancia
Para un macroión

R
I a
I

II
III
El potencial eléctrico en la superficie de
corte (separación, cizalla) se denomina
Potencial zeta : ζ
 El potencial zeta disminuye al aumentar la fuerza iónica
• Cuando la macromolécula se mueve, lo hace junto con la capa de hidratación y
iones firmemente adheridos.
• Para un macroión compacto, con distribución simétrica de cargas en su
superficie, en la región III, la expresión del potencial eléctrico, es igual que la de
Debye-Hückel.

Ψ= Q ( e - k(r-a)) / Dr (1+ kr)

• El potencial eléctrico Ψ en la superficie de corte ( que separa lo que está fijo de

lo que se mueve) se denomina potencial zeta, y se puede expresar como:
(ζ =Ψ , para r ≈ a ≈ R)
ζ = Q / DR ( 1+κR)

Q = carga; D = constante dieléctrica,

R = radio del macroión
κ = B I cte de Debye-Hückel
I = fuerza iónica
I = 1/2 ∑zi2ci
● En general, la doble capa eléctrica y el potencial eléctrico
aparecen en superficies sólidas cargadas en contacto
con líquidos.

● Influyen en muchos fenómenos dinámicos en que

participan las macromoléculas: electroforesis,
interacción con otras macromoléculas, sedimentación,
etc.

● También el fenómeno de la doble capa eléctrica y el

potencial zeta, en superficies sólido-líquido , originan la
electroósmosis, que se desarrollará mas adelante .
 ELECTROFORESIS
● La mayoría de los polímeros biológicos (biopolímeros)
poseen carga eléctrica y, por lo tanto, son capaces de
migrar bajo la influencia de un campo eléctrico. El
transporte de partículas a través de un disolvente mediante
un campo eléctrico recibe el nombre de electroforesis.

● Una forma usual de caracterizar una macromolécula es la

determinación de la velocidad con que se mueve al
someterla a un campo eléctrico. Esta propiedad puede ser
utilizada para calcular la masa molecular de una proteína,
para distinguir moléculas por su carga neta o su forma,
para detectar cambios de aminoácidos, de restos polares o
no polares y para separar distintas especies moleculares.

● Vamos a ver entonces estos procesos y sus aplicaciones.

Breve descripción de los principios de la electroforesis:

● Si una partícula con carga q suspendida en un medio

aislante se encuentra en una campo eléctrico E, la partícula
se moverá a una velocidad constante v, determinada por el
balance entre la fuerza eléctrica Eq, y la resultante del
rozamiento con el medio fv, donde f es el coeficiente de
fricción, esto es,
Eq  fv
● La movilidad μ, se define como la velocidad que toma la
partícula por unidad de campo,

v q
 
E f
 La electroforesis es un método
esencialmente analítico
De acuerdo a la variante técnica que se utilice
permite la separación y el análisis en función de:

 Carga/radio hidrodinámico: Q/Rs (libre)

 Q/Rs y Rs absoluto (PAGE-nativo)
 Rs → masa molecular (PAGE-SDS)
 pI (isoelectroenfoque)
 El medio de migración:
1. Electroforesis libre
2. Electroforesis sobre soportes:
* Papel
* Acetato de celulosa
* Agar-agarosa.
* Acrilamida (no hay flujo electroosmótico)
3. Electroforesis capilar (el flujo electroosmótico es
muy importante)
ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS
LIBRE EN SOPORTES CAPILAR

1937-Tiselius En la actualidad
(Premio Nobel-1948)

AUMENTO EN RESOLUCION Y SENSIBILIDAD

 Electroforesis libre

vef   ef E
La velocidad aumenta si aumentan la movilidad y el campo eléctrico aplicado.

V IR 1 L I I i
E  R i E 
L L X S S XS X

El campo eléctrico aumenta con la intensidad (I) o densidad de corriente

(i) y disminuye con el aumento de la conductividad X (función de la
concentración, carga y movilidad del electrolito). Conviene que la
conductividad no sea alta.
La velocidad y movilidad electroforética libre
Si un ión pequeño de carga q se somete a un campo eléctrico en un medio
salino diluido, se genera una fuerza eléctrica que lo desplaza hacia el polo
de carga opuesta y aparece una fuerza de fricción en sentido contrario
proporcional a la velocidad v
Polo positivo Polo negativo

+ _

Fuerza Fuerza
friccional: Ff
+ eléctrica: Fe

Fe  q E Ff  6 Rv
Cuando se igualan ambas fuerzas, el ión se desplaza con una velocidad :
Ecuación de Hückel:
qE v q
v  
6R E 6R
Para iones pequeños en medios salinos muy diluidos
 La movilidad electroforética libre de
una macromolécula
Para iones macromoleculares y en medios salinos no tan diluidos
de acuerdo a Henry:

D Qp
 ef  f (R)  
6 D R(1   R)

Qp es la carga del macroión (Qp = Zp.e)

(Zp es la valencia neta promedio y e es la carga elemental)

 es la viscosidad del medio

f(κR) es el factor de Henry. Depende del tamaño del macroión y de la fuerza iónica
R es el radio del macroión. En la práctica se considera el radio de Stokes (RS)
κ es la constante de Debye-Hückel, que depende de la fuerza iónica
ζ es el potencial zeta del macroión.
Reemplazando ζ en la expresión de la movilidad:

Q p f (R)
ef 
Ecuación de Henry
(para macromoléculas en
6  R (1   R) medios salinos no muy
diluidos)

La movilidad electroforética libre depende de:

● Relación Qp/Rs (Q → pH)

Partículas con igual relación Q/Rs no se pueden separar por electroforesis libre

● I (fuerza iónica) a través de   B I

●  (viscosidad del medio)

 f(κR) es función del radio de Stokes y de la fuerza iónica

1.5

1.4

1.3

f(KR)
1.2

1.1

1.0

-1 0 1 2 3

log KR

● f(κR) varía entre 1 y 1,5 con κR

● Si κR es pequeño, menor que 1, la ecuación de movilidad
se simplifica a la ecuación de Hückel
● Si κR es mucho mayor que 1 , corresponde a la ecuación
de Smoluchowsky (igual a la expresión de la velocidad
electroosmótica).
 Sobre soporte aparecen otros
fenómenos adicionales

● Adsorción
● Tortuosidad
● Evaporación del solvente
● Electroósmosis Los más importantes
● Efecto de tamiz
 Electroósmosis

● La electroforesis puede definirse como la

migración de un sólido respecto del líquido
por la acción de un campo eléctrico.
● La electroósmosis implica la migración del
líquido respecto del sólido por la acción de un
campo eléctrico.
En ambos fenómenos interviene la doble capa
eléctrica y el potencial zeta.
 Electroósmosis
● Si un sólido se pone en contacto con un líquido y el
sólido adquiere cargas fijas, se genera un potencial
eléctrico sólido-líquido y se forma la doble capa
eléctrica.
● Al aplicar un campo eléctrico el líquido se desplaza
con una velocidad que depende del potencial zeta
del sólido.
● Este fenómeno puede estar presente cuando se
realiza una electroforesis sobre soporte, e influir en la
magnitud y sentido de la migración de las moléculas
a separar.
● Depende de las características del soporte y es
importante solo en alguno de ellos.
El líquido se desplaza cuando se aplica un campo eléctrico

De acuerdo a la característica
del sólido, el flujo electroosmótico
depende del pH
 La velocidad y movilidad electroosmótica
μ= v / E

D 4 1
eosm  
4 D 

ς = Potencial zeta del sólido (soporte)

D: constante dieléctrica
η: viscosidad del medio
σ = Q/superficie
κ: constante de Debye-Hückel

El flujo elecroosmótico depende del pH y la fuerza iónica

 Electroósmosis
● Es relativamente importante en
soportes de acetato de celulosa y
agarosa.
● No se produce en geles de
poliacrilamida.
● Es muy importante en
electroforesis capilar, en capilares
de sílica no revestidos. A pH
neutro o alcalino, el soporte
posee cargas fijas negativas: el
flujo electroosmótico se dirige + - + -
hacia el cátodo (polo negativo) y
arrastra tanto a los compuestos
neutros como a los cargados
positiva o negativamente. Dirección de la Velocidad
electroosmótica (soporte con
● Velneta = vel ef + vel eos cargas fijas negativas)
Desarrollo del flujo electroosmótico: (a) Superficie del capilar de sílice fundida
cargada negativamente ( SiO- ). (b) Cationes hidratados acumulados cerca de
la superficie. (c) Flujo de líquido en dirección al polo negativo al aplicar un
campo eléctrico (Heiger, 1992).
Migración diferencial de los solutos superpuesta
al flujo electroosmótico en la electroforesis
capilar por zona. (Heiger, 1992).
 Electroforesis sobre soporte
● La función del medio soporte es, principalmente, evitar las perturbaciones mecánicas y las
corrientes de convección que pueden producirse por cambios de temperatura o por la
elevada densidad de las disoluciones que contienen la muestra.
● De todos modos, el medio soporte algunas veces adsorbe varias de las especies
moleculares o actúa como un tamiz molecular que puede contribuir en cierto grado a la
separación.

● La electroforesis en papel a bajo voltaje (20 V/cm) ha sido utilizada para el análisis de
mezclas proteicas. Hoy en día ha sido superada por la electroforesis en gel.
● La electroforesis a bajo voltaje es ineficaz para moléculas pequeñas (aminoácidos y
nucleótidos) porque poseen una carga demasiado reducida para proporcionar una movilidad
suficiente (la separación es muy lenta) y, por otra parte, su pequeño tamaño les confiere una
considerable difusión.
● En la electroforesis de alto voltaje (200 V/cm) la velocidad de separación aumenta, pero se
produce una intensidad de corriente alta por lo que es necesario sistemas de refrigeración.
● La electroforesis de alto voltaje en papel fue de gran valor para la separación de
aminoácidos y péptidos.
● Electroforesis en tiras de acetato de celulosa: la utilización de membranas de
acetato de celulosa en vez del clásico papel evita el efecto de adsorción, puesto
que la mayor parte de los grupos hidroxilos de la celulosa están esterificados con
residuos de acetato, que no adsorben, por lo general, las muestras a tratar.
● La resolución es mayor y la separación a bajo voltaje se realiza de modo más
rápido.
● Asimismo se reduce la tinción del fondo por lo que aumenta la sensibilidad del
método.

Aplicación clínica: proteinograma del suero

Imagen electroforética normal

Gammapatía monoclonal a IgG

 Imagen de la separación de las proteínas del
suero en acetato de celulosa en la que no se
evidencia la condición de aloalbuminemia que
se observa en el electroferograma de la
electroforesis capilar.

Electroferograma de electroforesis capilar que muestra el doble pico de albúmina

característico de la condición de aloalbuminemia y ausencia de la fracción
gamaglobulina.
La letra AU en la ordenada indica absorbancia mientras que el tiempo de migración se reporta en minutos en la abscisa.
 Electroforesis en geles de poliacrilamida
(PAGE)
Efecto de tamiz molecular
● Las moléculas migran a través de los poros del medio que
ejercen un efecto de tamiz. Si bien este efecto está presente en
todos los medios gelosados, para proteínas es muy importante
en geles de poliacrilamida, cuya porosidad está controlada.
● A medida que aumenta la concentración de acrilamida
disminuye el tamaño del poro y aumenta el efecto de tamiz
molecular.

● Las moléculas sufren un retraso adicional, que depende de su
radio de Stokes y del tamaño del poro (% de acrilamida).
 Log gel = Log libre – Kr [gel]

Kr depende del radio de Stokes (aumenta al aumentar RS)

A mayor RS , mayor pendiente

Loggel Log libre

Tangente = -Kr

[gel] %
Log gel = Log libre – Kr [gel]
 METODOLOGÍA GENERAL
• 1- Gelificación del medio (si no está disponible)
• 2- Conexión a cubas
• 3- Siembra y separación por aplicación
de diferencia de potencial con fuente de
poder
• 4- Revelado

Revelado por
Electroelusión tinción
Transferencia y
Revelado revelado
funcional inmunoquímico
Si se debe gelificar el gel, los componentes son:
•Monómero: acrilamida
•Entrecruzante: bis-acrilamida
•Catalizadores : TEMED (tetraetiletilendiamina),
e iniciador de radicales libres, persulfato de
amonio
•Se debe polimerizar en ausencia de Oxígeno
Aumentando el % de acrilamida disminuye el
tamaño del poro
En general se mantiene constante la relación
monómero / dímero
Esquema de PAGE
 Sin bis-acrilamida
Polímero lineal

Acrilamida

Acrilamida + bisacrilamida

Polímero
entrecruzado
Efecto del % de acrilamida y bis-acrilamida en el
tamaño del poro del gel

% bis(acrilamida) 1% 5% 15% 25%

% total de acrilamida Radio (Å)
6.5 24 19 28 --
8.0 23 16 24 36
10.0 19 14 20 30
12.0 17 9 - -
15.0 14 7 - -

El radio corresponde a moléculas para las cuales es accesible el 50 % del gel.

(Terrance Cooper. The Tools of the Biochemistry)
 Electroforesis en gel de poliacrilamida
(PAGE)
Variantes técnicas (cada una posee una particularidad en
relación al principio de separación

● PAGE-nativo (continua-discontinua)
● PAGE desnaturalizante (SDS, urea) (continua-discontinua ;
en medio reductor o no reductor)
● Isoelectroenfoque
● Electroforesis Bidimensional
● Combinadas con reacciones específicas: inmunoquímicas
(western blotting), o revelado funcional.
 Discontinua
El medio posee dos geles: el gel apilamiento y el
gel de separación; la relación de movilidades de las
especies aniónicas, que en las distintas zonas
conducen la corriente y los cambios de pH
producen el efecto de apilamiento y luego permiten
la separación con mayor resolución.
Electroforesis discontinua: el gel de apilamiento
y el aumento de resolución por concentración
Hay una discontinuidad del pH y composición de especies iónicas
entre las distintas zonas: los reservorios (1), el gel de apilamiento (2) y
el gel de separación (3):
El catión es común en las tres zonas : Tris
El anión A1 es el glicinato, cuya carga depende del pH
El anión A2 es la (las) proteína
El anión A3 es el Cl-
El pH en el gel de apilamiento es menor que en el gel de separación
La relación de movilidades es A1<A2<A3 y mientras se
mantenga, los componentes no se mezclan.
Se forma un frente iónico

I es la misma en todas las zonas

I = XE ; X= F∑ci mi zi
En el gel de apilamiento, el campo eléctrico es diferente en ambas
capas y las proteínas quedan atrapadas entre la Gly y el Cl

En el gel de separación, al aumentar el pH, la movilidad de la glicina

pasa a ser mayor que la de las proteínas. El frente se mueve delante de
las proteínas, estas se mueven en un medio de conductividad constante
y se separan en función de su movilidad.
 PAGE NATIVO
● Separación en base a la relación Q/Rs y Rs absoluto

● Dos proteínas que tengan igual relación Q/Rs, si poseen

distinto Rs se pueden separar por PAGE-nativo.

(Recordar que: en electroforesis libre dos proteínas con igual relación Q/Rs no se
pueden separar)
 PAGE SDS
● Si posee estructura cuaternaria el SDS disocia las subunidades y les
confiere una relación Q/M cte. y una forma semejante. Por lo tanto, a
diferencia de lo que ocurre en condiciones nativas, todas poseen una
relación Q/Rs semejante. De este modo, la movilidad será en función
del Rs absoluto. Y como la forma es similar, se puede decir que será
función de la masa molecular. O sea se puede en este caso asumir
que la separación depende fundamentalmente de la masa. Esto
ocurre, si no tiene puentes disulfuro, o si se usa además reductor.
Si es un oligómero el SDS lo disocia en subunidades

En este ejemplo la molécula es un homodímero

Si las subunidades son iguales, en PAGE-SDS se

visualiza una única banda que corresponde a la
masa molecular de la subunidad.
 PAGE-SDS en condiciones
reductoras o no reductoras
● Si no existen puentes disulfuro intra e intercatenarios, en
general la adición de reductores (beta-mercaptoetanol,
ditiotreitol, etc) no cambia el resultado.
● Pero si existen puentes disulfuro, con la adición de
compuestos reductores se rompen estos enlaces, y el
resultado puede ser distinto en cada caso.
● El cambio es más dramático cuando los puentes son
intercatenarios ya que dan lugar a la formación de multímeros
(dímeros, trímeros, etc.)
 PAGE-SDS
● Con patrones de masa molecular adecuados se puede
determinar la masa molecular de la banda correspondiente a
la subunidad de la proteína.
● Si es monomérica será su masa molecular.
● Pero si es oligomérica lo que se determina es la masa
molecular de cada subunidad.

También se puede graficar Log de la masa

molecular de proteínas patrones versus Rf
distancia migrada por la proteína
Rf 
distancia migrada por el frente
Equipo necesario para PAGE
Imagen PAGE-SDS
 PAGE desnaturalizante con urea
● Si la proteína se desnaturaliza con urea, su carga
no cambia sustancialmente.
● Si es oligomérica, se disocia en subunidades, se
despliega, y la banda observada corresponde a cada
subunidad.
● Al desplegarse aumenta su Rs
● Si la proteína es monomérica, se observa una
disminución de la movilidad de la proteína
desnaturalizada respecto de la proteína nativa.
 En gradiente de urea

• La banda superior en el gel contiene una forma mutante de lisozima (con Ala
160 sustituida por Thr), y la banda inferior discontinua corresponde a la proteína
wild-type. La proteína wild-type se aplicó al gel primero, y migró durante 10 min,
y luego se aplicó la proteína mutante y continúo la electroforesis por 20 min
más. El gel se coloreo con Coomassie blue.
• El gel revela dos importantes diferencias en el proceso de desnaturalización de
la proteína mutante y la wild-type:
• La proteína mutante desnaturaliza a menor concentración de urea que la
proteína wild-type.
• La interconversión entre las formas nativa y desnaturalizada de la proteína wild-
type es relativamente lento (comparado con el tiempo de la electroforesis),
dando lugar a la discontinuidad, mientras que para la proteína mutante es más
rápido, produciendo una banda uniforme.
Electroforesis Capilar
 Electroforesis Capilar

Electroferograma experimental (absorbancia versus tiempo) de una mezcla artificial

de teofilina, ácido benzoico y ácido salicílico, a pH=10 y fuerza iónica 88.2 mM.
 Electroforesis Capilar

Electroferograma experimental (absorbancia versus tiempo) de una mezcla de Phe y Tyr

(patrones) en suero. Buffer borato 25 mM, pH =11, el voltaje aplicado es 15 KV y la
temperatura 20 ºC.
 ISOELECTROENFOQUE
● Las proteínas son anfolitos, es decir contienen grupos cargados positiva y
negativamente. Todos los anfolitos presentan la propiedad de que su carga neta
depende del pH. Existe un valor de pH al cual presentan carga neta nula y se
denomina punto isoeléctrico. En el punto isoeléctrico el anfolito no se moverá si
se lo somete a un campo eléctrico.
● Si se coloca una proteína en un gradiente de pH, las moléculas se moverán hasta
llegar a un punto en el gradiente en el que presenten carga neta nula, entonces
cesará su movimiento.
● En una mezcla de proteínas cada una de ellas se situará en aquel punto del
gradiente donde el pH sea igual a su punto isoeléctrico.
● El método empleado para producir un gradiente estable de pH consiste en
distribuir polianfolitos sintéticos de bajo peso molecular (300-600) que cubran un
amplio margen de puntos isoeléctricos. Estos polianfolitos son usualmente
mezclas de polímeros de ácidos carboxílicos y aminas alifáticas.
● El método de isoelectroenfoque tiene dos grandes ventajas: (1) se pueden
separar mezclas que por otros métodos resultaría imposible y (2) las proteínas
quedan significativamente concentradas.
 ISOELECTROENFOQUE
La separación es función del punto isoeléctrico (pI)

Es un método de equilibrio, en el que las proteínas migran en

un medio de pH variable y quedan enfocadas (detenidas) en la
zona en la cual el pH=pI
Isoelectroenfoque (IEF)
 Electroforesis en dos dimensiones:
permite separar por dos principios distintos
Lo más común es separar primero por Punto Isoeléctrico (pI) y luego por
masa. De este modo, componentes que poseen el mismo pI y aparecen en
la misma banda en la primera dimensión, en la segunda dimensión se
separan en función de sus masas.
 Electroforesis Bidimensional
● Las proteínas se separan en la primera dimensión por diferencias en
punto isoeléctrico.
● A continuación el gel se gira en otra dimensión y se añade SDS al buffer.
Las proteínas se separan en la segunda dimensión por diferencias de
masa molecular.
● Finalmente se tiñe el gel y se mide la intensidad de cada una de los
millares de manchas de proteína.
● Determinar la identidad de cada una de las manchas de proteínas de un
gel bidimensional no es tarea fácil. El patrón del gel 2-D, si se realiza en
condiciones estándar, puede compararse con los patrones obtenidos por
laboratorios de referencia que hayan determinado la identidad de la
mayoría de los componentes del patrón de 2-D de un determinado tipo
celular.
● Para la identificación experimental se pueden extraer las manchas del gel
e hidrolizar la proteína para obtener pequeños péptidos por digestión
enzimática proteolítica (por ejemplo con tripsina o quimotripsina) que
pueden ser analizados por espectrometría de masas.
Electroforesis Bidimensional
Electroforesis
bidimensional
 Combinada con otras reacciones

Transferencia y reacción inmunoquímica

(Inmunoblotting)

Etapas:
1- Separación electroforética
2- Transferencia a medio adsorbente (nitrocelulosa
3- Bloqueo
4- Reacción inmunoquímica (Anticuerpo primario
marcado o Anticuerpo secundario marcado)
Luego de la separación electroforética, las bandas
son transferidas a membranas de nitrocelulosa por
electroforesis

La membrana con las bandas proteicas transferidas,

se somete a la reacción inmunoquímica, previo
bloqueo de sitios residuales
La reacción inmunoquímica se desarrolla utilizando
uno o más anticuerpos , de los cuales uno debe
estar marcado (enzima, fluorófobo, etc)

Comparison of IgG antibody profiles by

immunoblotting in patients with acute and
previous Toxoplasma gondii infection.J. Clin
Pathol 1991;44:569-572.
 Tanto los ácidos nucleicos (AN) como los
polisacáridos se pueden separar por
electroforesis
● Los principios son los mismos que para proteínas, pero dada la estructura
molecular , presentan particularidades en la separación y tinción.

● Los AN poseen una relación q/pb semejante. Los ADN doble hebra de
gran tamaño pueden considerarse como ovillos cuya carga es
proporcional a la longitud y a su vez al coeficiente friccional. Por lo tanto,
en electroforesis libre presentan una movilidad que es independiente de
su longitud (poseen relación q/Rs semejante) y no se separan.

● En medios gelosados, la movilidad depende no solo de la relación q/Rs

sino también, debido al efecto tamiz de la masa (pb) y la forma (Rs). Si
se asume que la forma es semejante para todos, y se usan patrones
adecuados, se puede determinar la masa molecular (o el número de pb).
En caso de poseer diferente forma, si se desnaturaliza, la movilidad
depende esencialmente de la masa y se puede utilizar este método para
calcularla.
● Para el ADN se emplean geles de agarosa (200-
50.000 pb) o acrilamida (menos de 500 pb), siendo
estos últimos de mayor resolución
● La cubas de agarosa son en general horizontales y
el gel se encuentra sumergido en el buffer de
corrida.
 Para que exista una relación lineal entre el log. de la
masa (o pb) y la movilidad, el ADN debe estar
linealizado o mejor aún desnaturalizado.

marcadores Plásmido Plásmido

cerrrado linalizado

GARY K. MCMASTER AND GORDON G. CARMICHAEL. Analysis of single- and double-stranded

nucleic acids on polyacrylamide and agarose gels by using glyoxal and acridine orange. Proc. Natl.
Acad. 1977 : 74pp. 4835-38, Biochemistry
Linea 1: marcadores

Linea 2: Circular no enrollado (corte en una sola

hebra) migra menos que circular super enrollado

Linea 3: Lineal . Migra más que circular no

enrollado y menos que circular super enrollado.
 La visualización de realiza en trans-
iluminador a partir de la unión a colorantes
fluorescentes como el bromuro de etidio
Se han desarrollado múltiples estrategias para
analizar y visualizar polisacáridos cargados o
aún neutros por electroforesis.

● Alcian blue fixation allows silver staining of the isolated polysaccharide

component of bacterial lipopolysaccharides in polyacrylamide gels.
Electrophoresis [1991, 12(6): 439-441] Corzo J, Pérez-Galdona R, León-
Barrios M, Gutiérrez-Navarro AM

● Polysaccharide Analysis Using Carbohydrate Gel Electrophoresis: A

Method to Study Plant Cell Wall Polysaccharides and Polysaccharide
Hydrolases. Florence Goubet, Peter Jackson, Michael J. Deery, and
Paul Dupree. Analytical Biochemistry 300, 53–68 (2002)
 Bibliografía sugerida:
• Donald Voet y Judith Voet. Bioquímica. Buenos Aires: Ed. Médica
Panamericana. 3ra. Ed. 2006.
• Lubert Stryer. Bioquímica. Tomos 1 y 2. Cuarta edición.1995. Editorial
Reverté, S.A. España.
• Lehninger AL, Nelson DL, Cox MM. Principios de Bioquímica. 3era.
Ed. 2001. Ed. Omega.
• Robert Scopes. Protein Purification. Principles and practice. 1982.
Springer-Verlag New York Inc.
• Hames BD and Rickwood D. Gel electrophoresis of proteins . A
practical Approach. Primera impresión:1990. Reimpreso en 1994. IRL
Press. Oxford. Inglaterra.
• Protein purification. Principles and high resolution methods. Edited by
Jan-Christer Janson Lars Rydén. Second edition.1998. Wiley & Sons
Inc. publication NY. USA.
• Willard HH, Merrit LL Jr, Dean JA, Settle FA Jr. Métodos
instrumentales de análisis1991. Grupo Editorial Iberoamericana.
• David Freifelder. Técnicas de Bioquímica y Biología Molecular. 1979
Ed. Reverté S.A
 Páginas a consultar:
• https://www.youtube.com/watch?v=_8xftsCI
wYo
• Esta direccion corresponde a un vídeo
tutorial que muestra con detalle como se
realiza la electroforesis en gel de
polialcrilamida en el laboratorio.
• Por favor, no dejen de verlo !!!
Y para terminar vamos a ver ….
 Métodos de separación y
caracterización

Sedimentación por centrifugación

2020
 Método analítico y preparativo
Aplicaciones
Analítico (solo la ultracentrífuga analítica):
 Determinar la (MM) de una proteína en estado nativo; establecer el
estado oligomérico (monómero, dímero, etc).
 Verificar si una muestra es homogénea en masa y conformación.
 Detectar agregados en muestras de proteínas y cuantificar la extensión
de los mismos.
 Detectar cambios conformacionales (por desnaturalización, mutación,
etc).
 Estudiar la formación y estequiometria de complejos fuertes entre
macromoléculas(receptor–ligando, antígeno anticuerpo)
 Determinar el coeficiente de difusión-fricción.

Preparativo:
 Separación de fracciones celulares y subcelulares.
 La fuerza centrífuga y la fuerza
gravitatoria
La utilización de la fuerza centrífuga permite aumentar
hasta cinco órdenes de magnitud la fuerza de gravedad
para sedimentar partículas y macromoléculas.

Fc = m ω2r ω= velocidad angular

r = distancia al eje de giro
ω=2π RPM/60
La fuerza centrífuga relativa : FCR = g
FCR = Fc/Fg = ω2r /g = ω2r /980 cm/seg2

FCR = ω2r /980 cm/seg2

La fuerza depende de las RPM y del radio del rotor

 Equipamiento

• Centrífugas comunes: hasta aprox . 10.000 g

(10.000 -15.000 RPM)

• Supercentrífugas: hasta 50.000 g

• Ultracentrífugas: hasta 100.000-800.000 g

(100.000 RPM)
 EQUIPAMIENTO
PREPARATIVAS ANALÍTICAS
Some examples of different AUC centerpieces: A two mono-sector centerpieces (12 and
3mm) made from aluminum, used for velocity runs applying Schlieren or turbidity optics; B
two double-sector centerpieces (12 and 3 mm) made from aluminum, used for velocity and
equilibrium runs applying interference, absorption or Schlieren optics;
Análisis de la concentración en función del radio :
formas de medirla
Las fuerzas que intervienen: r = a; meniscus

r = b; bottom

Fb

Fd

Fc

Fc = m ω2r (m=masa partícula, ω=aceleración angular; r=distancia al eje de giro)

Fflot(Fb) = ω2rVpsolv (Vp= volumen de partícula; solv = densidad del
solvente)
Ffricc(Fd) = f v (f= coeficiente de fricción de la partícula; v= velocidad angular )
 La velocidad y el coeficiente de
sedimentación
Que sedimente o flote dependerá de
  
 rM 1  v 2  
2 la densidad (o su inversa, el volumen
específico) de la partícula en relación
v   a la del solvente
Na f

  
M 1  v 2  
S: coeficiente de sedimentación,
depende de la masa y forma (f)
v
S 2   
S se mide en Svedverg = 10 -13 s
 r Na f
 Clasificación de los métodos

1-Velocidad de sedimentación
 De frente (preparativo, analítico)
De zona (preparativo)

2- Equilibrio de sedimentación
Sin gradiente de densidad (analítico)
Con gradiente de densidad o isopícnico
(preparativo).
 Velocidad de sedimentación de frente
Se parte de una solución homogénea y los componentes
se desplazan como un frente hacia el fondo .
Si se efectúa en forma analítica, y se observa el
desplazamiento en el tiempo, en la figura se
t=0 esquematiza cómo varía la concentración desde el
t
menisco (Xm) al fondo del tubo. A t=0, la línea de
puntos indica que la concentración es constante e igual
desde el menisco al fondo. Si hay dos componentes
con distintos S, al tiempo t se observarán dos frentes,
C como lo indica la línea de trazo grueso. A la distancia
t=0
X1 aparece el frente del componente de menor S. A la
distancia X2 aparece el segundo componente y la
concentración se mantiene aproximadamente igual a la
inicial en un tramo , donde ambos componentes están
mezclados ; en el fondo se acumulan ambos, con
d mayor concentración del componente de mayor S. La
Xm X1 X2 figura es un esquema en el que los frentes aparecen
idealmente como escalones.
Velocidad de sedimentación de frente analítico

Si hay un solo
componente
En la figura se observa
cómo varía la
concentración en
función del radio para
un solo componente a
distintos tiempos de
centrifugación.
Se observa que el frente
no es recto sino
sigmoidal.
 2.0 50,000 RPM
o
T=20.2 C
1.5 Times in s, in order: 1409, 2663, 3908, 5197,
6473, 7757, 9104, 10538

1.0
En la figura superior se observa
Absorbance

0.5
nuevamente el desplazamiento
del frente hacia el fondo a
0.0 medida que aumenta el tiempo
de centrifugación. En la figura
-0.5 Meniscus
real data from Igor & Bricker
inferior se muestra la variación
-1.0 de la absorbancia y su derivada
5.5 6.0 6.5 7.0
(concentración), en función de la
7.5

r/cm distancia, para un dado tiempo.

Combined absorbance (FFT smoothed) and derivative
0.8 plot for one concentration profile. The boundary can be
identified from the maximum of the derivative. This is
not strictly correct, but close enough for us.
En el punto en el que Abs pasa
por un punto de inflexión, su
Absorbance (FFT Smoothed)

0.6
2
derivada (dAbs/dr) pasa por el
dA/dr

0.4 máximo y ese punto

corresponde al radio del
0.2

0
frente.
0.0

6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8

r/cm
 El conocimiento de la posición del frente a
distintos tiempos permite calcular
el coeficiente de sedimentación

v = dr/dt v = ω2r S
∫ dr/r = ω2 S ∫dt
lnr
ln r = lnrm + ω2S t

Recíprocamente, si se conoce S, se Tg = ω2S

puede estimar el tiempo necesario para
sedimentar la partícula a una determinada
velocidad, etc.
t
 Se debe corregir por temperatura y viscosidad

T , solvent 1   20, water v~2

o o

20, water
S 20 S
, water T , solvent  20, water 1  T , solvent v~2
T , solvent

Actualmente se utilizan programas computacionales para el

análisis, determinación de los frentes a distintos tiempos,
cálculo de S y representación de datos de la distribución de
valores de S, semejante a un cromatograma
Velocidad de sedimentación de frente
diferencial: separación de fracciones
subcelulares
Para fines preparativos, la velocidad de sedimentación
diferencial de frente permite el fraccionamiento
subcelular:

Los componentes se separan por

sus coeficientes de sedimentación,
pero solo se obtienen fracciones
enriquecidas
 Velocidad de sedimentación zonal :
Preparativo

Las partículas o moléculas se separan de acuerdo a

su coeficiente de sedimentación. La densidad del gradiente no
supera a la de la macromolécula o partícula
 Equilibrio de sedimentación
en gradiente de densidad (isopícnica)

La densidad del gradiente supera

a la de la macromolécula en algún
punto hacia el fondo del tubo.
La separación es en función de la
densidad.
Se utiliza más para células y
fracciones subcelulares.
----------------------------------
Organelle diameter Density
(µm) (g/cm3)
----------------------------------
Nuclei 5-10 1.4
Mitochondria 1-2 1.1
Ribosomes 0.02 1.6
Lysosomes 1-2 1.1
----------------------------------

 Algunas sales que se utilizan: CsCl,

Cs2SO4, NaBr.
Velocidades: en el orden de 30.000
rpm tiempos largos (días).
 Equilibrio de sedimentación (analítico):
cálculo de Masa Molecular
Se establece un equilibrio entre la difusión y la
sedimentación

M (1  v~2 ) RT dc dc
J   rc
2
   rcS  D
2
Na f N a f dr dr
1 dc  2 rM
En el equilibrio:  (1  v~2 )
c dr RT
Integrando:
 2 M (1  v~2 )(r 2  a 2 )
ln[c(r )]  ln[c(a)] 
2 RT
Si se evalúa la concentración a diferentes radios, una vez alcanzado el
equilibrio, de la pendiente de la gráfica de ln c versus r2, se calcula la
Masa Molecular (M) sin necesidad de conocer D.
 2

Igor-Bricker sample
o
T=20.0 C
24,000 RPM v2=0.73 mL/g
Absorbance
1

40 45 50
2 2
r /cm

~
 M (1  v2 )(r  a )
2 2 2
c(r )  c(a) exp( )
2 RT
En el equilibrio la concentración de la macromolécula presenta una
distribución exponencial con el radio cuadrado.
 Resumen de las características y aplicaciones
de los distintos métodos
Método Aplicaciones Velocidad Tiempo de
Angular medición
Equilibrio de Analítica. Cálculo de la Relativamente Varios días
sedimentación sin MM. baja
gradiente
Equilibrio de Preparativa. .Separación Alta
sedimentación en de fracciones subcelulares
gradiente de de distinta densidad
densidad
Analítica.Determinación Alta Varias horas
Velocidad de del coeficiente de
sedimentación de Sedimentación y Cálculo
frente de MM conociendo el
coeficiente de Difusión

Preparativa.Separación
de fracciones subcelulares Media-alta
con distintos S.