Resumen para Segundo Parcial Ia

Fundamentos físicos la espectroscopia de RMN
DESCRIPCION: La Resonancia Magnética Nuclear es una Técnica de análisis no destructivo que

permite el estudio de la estructura molecular por medio de la interacción entre la radiación de radio
circunferencia y un conjunto de núcleos inmersos en un campo magnético. Estos núcleos forman
parte de átomos los que a su vez, se encuentran ensamblados dentro de moléculas. Un estudio de
RMN puede presentar información detallada acerca de la estructura molecular
La espectroscopia de RMN fue desarrollada a finales de los años cuarenta para estudiar los núcleos
atómicos. En 1951, los químicos descubrieron que la espectroscopia de resonancia magnética
nuclear podía ser utilizada para determinar las estructuras de los compuestos orgánicos. Esta técnica
espectroscópica puede utilizarse sólo para estudiar núcleos atómicos con un número impar de
protones o neutrones (o de ambos). Esta situación se da en los átomos de 1H, 13C, 19F y 31P. Este
tipo de núcleos son magnéticamente activos, es decir poseen espín, igual que los electrones, ya que
los núcleos poseen carga positiva y poseen un movimiento de rotación sobre un eje que hace que se
comporten como si fueran pequeños imanes.
En ausencia de campo magnético, los espines nucleares se orientan al azar. Sin embargo cuando
una muestra se coloca en un campo magnético, tal y como se muestra en la siguiente figura,
Los núcleos con espín positivo se orientan en la misma dirección del campo, en un estado de mínima
energía denominado estado de espín  mientras que los núcleos con espín negativo se orientan en
dirección opuesta a la del campo magnético, en un estado de mayor energía denominado estado de
espín 
Existen más núcleos en el estado de espín que en el pero aunque la diferencia de población no
es enorme sí que es suficiente para establecer las bases de la espectroscopia de RMN. La
diferencia de energía entre los dos estados de espín y , depende de la fuerza del campo
magnético aplicado H0. Cuanto mayor sea el campo magnético, mayor diferencia energética habrá
entre los dos estados de espín.
En la siguiente gráfica se representa el aumento de la diferencia energética entre los estados de

espín con el aumento de la fuerza del campo magnético.
GRAFICA ESTADO DE SPIN Cuando una muestra que contiene un compuesto orgánico es irradiada
brevemente por un pulso intenso de radiación, los núcleos en el estado de espín son promovidos al
estado de espín . Esta radiación se encuentra en la región de las radiofrecuencias (rf) del espectro
electromagnético por eso se le denomina radiación rf.
Cuando los núcleos vuelven a su estado inicial emiten señales cuya frecuencia depende de la
diferencia de energía (E) entre los estados de espín y . El espectrómetro de RMN detecta estas
señales y las registra como una gráfica de frecuencias frente a intensidad, que es el llamado
espectro de RMN. El término resonancia magnética nuclear procede del hecho de que los núcleos
están en resonancia con la radiofrecuencia o la radiación rf. Es decir, los núcleos pasan de un
estado de espín a otro como respuesta a la radiación rf a la que son sometidos.
COMO SE OBTIENE UN ESPECTRO RMN?

El espectrómetro de RMN consta de cuatro partes:
1. Un imán estable, con un controlador que produce un campo magnético preciso.
2. Un transmisor de radiofrecuencias, capaz de emitir frecuencias precisas.
3. Un detector para medir la absorción de energía de radiofrecuencia de la muestra.
4. Un ordenador y un registrador para realizar las gráficas que constituyen el espectro de

RMN.
PARA OBTENER UN ESPECTRO DE RMN: Se coloca una pequeña cantidad del

compuesto orgánico disuelto en medio mililitro de disolvente en un tubo de vidrio largo que se
sitúa dentro del campo magnético del aparato. El tubo con la muestra se hace girar alrededor
de su eje vertical.
En los aparatos modernos, el campo magnético se mantiene constante mientras un breve

pulso de radiación rf excita a todos los núcleos simultáneamente. Como elcorto pulso de
radiofrecuencia cubre un amplio rango de frecuencias los protones individualmente absorben
la radiación de frecuencia necesaria para entrar en resonancia. Un ordenador recoge la
intensidad respecto al tiempo y convierte dichos datos en intensidad respecto a frecuencia,
esto es lo que se conoce con el nombre de transformada de Fourier (FT-RMN). Un espectro
FT-RMN puede registrarse en 2 segundos utilizando menos de 5 mg de muestra.
¿Que es el deuterio y cual es su utilidad en la RMN?
Disolventes de mayor uso
Cloroformo-d
CDCl3 Metanol-d4
CD3OD Acetona-d6
(CD3)2CO Benceno-d6
C6D6 Acetonitrilo-d3
CD3CN Piridina-d5
C5D5N Dimetilsulfóxido-d6
(CD3)2SO Cloruro de metileno-d2
CD2Cl2 Oxido de deuterio-d2 D2O
Hasta ahora se ha descrito el concepto de resonancia de un núcleo aislado dentro de un

campo magnético, pero en realidad los núcleos, como pueden ser los protones o los
carbonos que forman las moléculas orgánicas, no se encuentran aislados sino que están
rodeados de electrones que los protegen parcialmente del campo magnético externo al que
se ven sometidos. Los electrones se mueven generando un pequeño campo magnético
inducido que se opone al campo magnético externo.
En cualquier molécula la nube electrónica que existe alrededor de cada núcleo actúa como
una corriente eléctrica en movimiento que, como respuesta al campo magnético externo,
genera una pequeña corriente inducida que se opone a dicho campo. El resultado de este
hecho es que el campo magnético que realmente llega al núcleo es más débil que el campo
externo, por tanto, se dice que el núcleo está protegido o apantallado.
Este apantallamiento es muy importante desde el punto de vista experimental ya que el

campo magnético efectivo (Hef) que siente un protón dentro de una molécula es siempre
menor que el campo externo.
Si todos los protones (1H) de una molécula orgánica estuvieran apantallados de igual forma,
todos entrarían en resonancia con la misma combinación de frecuencia y campo magnético.
Sin embargo, los protones se hallan dentro de entornos electrónicos diferentes y, por tanto,
se encuentran diferentemente protegidos o apantallados.
Por ejemplo, en el metanol el átomo de oxígeno retira densidad electrónica del entorno
electrónico que rodea al protón del grupo hidroxilo, quedando este átomo de hidrógeno
menos protegido que los protones del grupo metilo. La consecuencia es que el protón del
grupo hidroxilo resuena a un campo magnético menor que los protones del grupo metilo.
Por lo general, los efectos de protección, o apantallamiento, de las nubes electrónicas que
rodean a cada protón son diferentes, lo que provoca diferentes frecuencias de emisión. El
resultado es un espectro de diversas frecuencias donde cada conjunto de núcleos
específicos da origen a una señal única de RMN.
En la práctica es difícil medir el campo magnético al que un protón absorbe con suficiente
exactitud para distinguir protones individuales ya que las absorciones sólo varían en unas
pocas milésimas. Un método más exacto para expresar desplazamientos químicos es
determinar el valor respecto a un compuesto de referencia que se añade a la muestra.
El compuesto de referencia más común en resonancia magnética nuclear es el

tetrametilsilano (TMS, (CH3)4Si). Como el silicio es menos electronegativo que el carbono,
los grupos metilo del TMS son relativamente ricos en electrones, es decir, sus protones
están fuertemente apantallados.
Como consecuencia de este apantallamiento, estos protones absorben a una intensidad de

campo mayor que el resto de protones enlazados al carbono o a otros elementos, de
manera que casi todas las señales de resonancia magnética nuclear aparecen a campos
más bajos (hacia la izquierda de la señal del TMS).
Además todos los protones del TMS absorben con el mismo desplazamiento químico dando
una única absorción intensa. Como el desplazamiento químico de un protón está
determinado por su entorno se han construido tablas con valores representativos:
TABLA DE DESPLAZAMIENTOS QUIMICOS MAS COMUNES

PARTES Y FUNCIONAMIENTO DE UN EQUIPO DE RMN
COMPONENTES
Imán
Los imanes son los encargados de someter a la muestra al campo magnético permanente
responsable de la alineación de los núcleos. Hay que tener en cuenta, que cuanto mayor sean
la intensidad del campo magnético, la homogeneidad y la estabilidad, mejores serán la
sensibilidad y resolución del espectrómetro. No se puede usar cualquier tipo de imán, sino
uno especial para el equipo de RMN. En la actualidad el imán por excelencia para este tipo
de equipos se le conoce como imán superconductor, que es un tipo de electroimán cuya
bobina está hecha a base de hilo superconductor. Este hilo es producto de una aleación
especial (por ejemplo niobio-titanio), y pues este llega a medir varios Km, solo que va
enrollado en múltiples capas. Sin embargo, este tipo de imanes es que para que el hilo que
forma la bobina se comporte como tal, es necesario que se encuentre a una temperatura
cercana al cero absoluto (0ºK). Y pues esta temperatura se consigue sumergiendo la bobina
en helio líquido, que es un gas noble que en estado líquido soporta temperaturas
extremadamente bajas, y pues siempre que la bobina se mantenga a la temperatura del helio
líquido, la corriente que se introduzca fluirá por ella de forma permanente sin apenas
resistencia Para que el helio permanezca en estado líquido y así mantener la temperatura de
la bobina, se debe que evitar el intercambio de calor con el entorno. Esto se logra
introduciendo la bobina y el helio en una cámara tipo Dewar, que a su vez se encuentra dentro
de otra cámara Dewar llena de nitrógeno líquido a 77ºK si bien recuerdo, y que está dentro
de una cámara de vacío a temperatura ambiente.
El problema con este es que tanto el helio como el nitrógeno se van evaporando lentamente
con el tiempo, por lo que se hace necesario rellenar periódicamente las cámaras y es un costo
extra por mantenimiento. La ventaja de los imanes superconductores es que, al ser
electroimanes, son capaces de crear campos muy intensos que no cualquier imán logra.
Sonda
La sonda contiene una de las partes más importantes del espectrómetro: las
Antenas, además de ser aquí donde se coloca la muestra.
Está formada por un conjunto de elementos mecánicos, que mantienen las antenas en su sitio,
y que hacen posible que la muestra que se va a analizar se introduzca en el campo magnético
que crean los imanes.
Antenas
A diferencia de lo que sucede en la mayoría de sistemas de comunicaciones, las antenas del
espectrómetro trabajaran bajo las condiciones de campo próximo. La forma de antena que se
utiliza es la bobina, por su simplicidad, por la fácil disposición teniendo en cuenta la
geometría del resto de elementos, y por la sencilla relación con los campos magnéticos dada
por la ley de Faraday, la cual nos ayuda a relacionar relaciona la electricidad con el
magnetismo, mediante una fórmula que justo ahora no tengo a la mano. Gracias a la ley de
Faraday podemos deducir que una bobina actuando como antena es capaz de emitir o captar
la componente paralela de una variación de campo magnético.
La bobina transmisora que es la que tiene que emitir pulsos de RF, que a su vez crean un
campo magnético en una de las dos direcciones del plano sobre el que precesan los núcleos,
para que éstos puedan entrar en resonancia.
Por otra parte, una vez cesa la señal de RF hay que obtener la evolución del campo magnético
que crean los mismos protones en una de las direcciones en las que precesan. Igual que en el
caso anterior, como los protones están precesando sobre el plano xy, es esta componente la
que hay que detectar, por eso, el eje de nuestra otra bobina, que recibe el nombre de bobina
receptora va a situarse sobre el mismo plano.
En conclusión, tanto en transmisión como en recepción, se podría utilizar cualquier bobina
que su única condición sea tener su eje sobre el plano xy.
Transmisor y Receptor
El transmisor es la parte del espectrómetro encargada de generar los pulsos de
Radiofrecuencia que excitan el sistema. El transmisor consta básicamente de una fuente de
radiofrecuencias y un amplificador de potencia.
La secuencia de pulsos generada por la fuente de RF es recogida por un amplificador de alta
potencia que aporta la energía necesaria y la transfiere a la muestra.
Y pues el receptor de un espectrómetro de RMN es muy parecido a un receptor de radio
doméstico en el cual la señal de RF es detectada por una antena, y desmodulada utilizando
un proceso de conversión de frecuencias.
Sistema de control
El sistema de control se encarga de controlar y sincronizar todo el sistema. El núcleo de este
sistema es una matriz de puertas lógicas programable en campo, que es un dispositivo
programable que puede ser configurada en el momento, mediante un lenguaje de descripción
especializado. La FPGA genera las señales de control de los DDS y del CAD, y procesa los
datos que le entrega este último. El sistema de control es también la parte que interacciona
con la estación de trabajo que maneja el usuario.
FUNCIONAMIENTO
Lo primero es realizar una calibración, colocando la muestra que se quiere analizar dentro de
la sonda. Al realizar esto logramos obtener dos parámetros importantes: La frecuencia central
del pulso de RF y La correspondencia entre el ángulo de rotación del vector de magnetización
total y la duración del pulso de RF. A continuación, desde la estación de trabajo el usuario
define la secuencia de pulsos para un tipo de experimento concreto. Esta información se envía
al sistema de control, que se encarga de la sincronización de todo el sistema.
Cuando efectivamente empieza el experimento, en primer lugar, el sistema de control
configura las fuentes de RF con los valores adecuados de frecuencia y fase a través de las
líneas de control.
Inmediatamente comienza la excitación del sistema. La secuencia de pulsos de excitación es
generada por el sistema de control, que actúa sobre la línea de habilitación de la fuente de RF
del transmisor. Y debido a que los pulsos tienen una duración extremadamente corta y les
estoy hablando de nanosegundos, el sistema de control trabaja a altas velocidades. Pues a
través del amplificador del transmisor, los pulsos llegan a la bobina transmisora, de manera
que estos alcanzan a la muestra. En el camino de vuelta, la señal es recogida por la bobina
receptora y llega al receptor. En el receptor, la señal se amplifica, se filtra, y se traslada a una
frecuencia más baja.
Después de este acondicionamiento en el receptor, la señal se digitaliza durante los tiempos
de adquisición de la FID, determinados también por el sistema de control, que actúa sobre la
señal de disparo del CAD. Una vez que se ha hecho esto la información se almacena en el
sistema de control, y una vez que termina la secuencia de pulsos, se promedian cada una de
las distintas adquisiciones, y se lleva a cabo el procesado digital.
Por último, la información ya procesada se envía a la estación de trabajo, donde se presenta
por pantalla en forma de espectro de RMN. Que se ve como el que se observa en la imagen
que les adjunté en la diapositiva.
CUESTIONARIO BASICO ESPECTROMETRIA DE MASAS.
1.- Describa el origen histórico de la espectrometría de masas
La espectrometría de masas tiene su origen en los experimentos desarrollados en la Universidad
de Cambridge en Inglaterra en 1897 por Joseph John Thomson, él descubrió que descargas
eléctricas en gases producían iones y que estos rayos de iones podían adoptar diferentes
trayectorias parabólicas de acuerdo a su masa cuando pasaban a través de campos
electromagnéticos.
En la década de los 40´s se construyeron los primeros espectrómetros de masas disponibles
comercialmente por medio de diferentes compañías de Europa y Estados Unidos.
En los 60´s la espectrometría de masas se estableció como una técnica para caracterizar
compuestos orgánicos. En esta década tambien se acopló la cromatografía de gases (GC) a la
espectrometría de masas, esta conexión permite separar compuestos ya en fase gaseosa para su
entrada al espectrómetro al entrar las diferentes fracciones en diferentes tiempos en forma
continua permite un análisis secuencial de las muestras. Recientemente, equipos de cromatografía
de líquidos (LC), cromatografía de fluidos supercríticos, HPLC y electroforesis capilar, utilizados
para separar compuestos, se pueden acoplar a espectrómetros de masas para análisis de
muestras complejas
2.- Que es y Cual es el fundamento de la espectrometría de masas?

La espectrometría de masas es una técnica microanalítica de gran potencial que permite elucidar
estructuras químicas, se basa en la medición de la relación masa/carga de especies moleculares.
Las determinaciones requieren de la generación de especies cargadas eléctricamente, lo cual se
logra por diferentes metodologías como pueden ser el impacto electrónico, el bombardeo de
átomos rápidos (FAB), el análisis directo en tiempo real (DART) y la generación de iones
enlazados. La medición de la relación masa/carga nos permite también saber el peso molecular
exacto de la molécula.
3.- Cuales son las aplicaciones principales de la Espectrometría de masas?

Elucidación estructura y análisis cuantitativo de compuestos orgánicos y organometálicos,
biopolímeros y macromoléculas orgánicas. Determinación de masa exacta.
4.- Cuales son los campos de aplicación de la espectrometría de masa?

Los campos de aplicación son desde estudios astronómicos del sistema solar, geofísica y
geoquímica, hasta análisis químicos y en forma fundamental en investigaciones de química,
toxicología, ciencias ambientales, y en forma creciente en ciencias biológicas y biomédicas.
5.- Cual es el fenómeno molecular en que se basa la Espectrometría de masas?

La Ionización y el rompimiento de la molécula en fragmentos de iones.
6.- Que es el espectrómetro de masas?
Un espectrómetro de masas es un equipo que produce partículas cargadas eléctricamente,
constituidas por iones complejos e iones fragmentarios procedentes de una molécula original,
capaz de separarlos de acuerdo a su relación de masa a carga. no mide la masa molecular
directamente, pero mide la relación masa/carga de los iones formados de las moléculas.
7.- Cuanto y cuales son los componentes principales del espectrómetro de masas?
Tienen siete componentes mayores: 1.- Sistema de entrada, 2.- Fuente de iones, 3.- Analizador de
masas, 4.-Detector estos por lo genral dentro de 5.- Un sistema de vacío, 6.- Sistema de control y
7 Sistema de datos. (o procesador de señal y dispositivo de lectura)
8.- Que es un espectro de masas?

Un espectro de masas es una gráfica de intensidad relativa del ion como función de la relación
masa/carga (m/z). El espectro de masas es frecuentemente representado como un histograma
simple. Esta forma de registro de iones y sus intensidades sirven para establecer el peso
molecular y estructura del compuesto a ser analizado. En Resumen:
El aspecto de los espectros de masas para una especie molecular dada depende en gran parte del
método utilizado para la formación de los iones. Los complejos espectros de masas que se
obtienen en la ionización por impacto de electrones son útiles para la identificación de compuestos.
Además, para cierto tipo de moléculas, la fragmentación es tan efectiva que no queda ningún ion
molecular y por tanto la información más importante para la determinación del peso molecular del
analito se pierde.
9.- Cuales son las Ventajas de la Espectrometría de Masa en el análisis Cualitativo?

1. Se puede obtener mucha información
2. Peso molecular preciso,
3. Masas abundantes de partes integrantes de la molécula,
4. Muy alta sensibilidad, capacidad de identificación inequívoca
5. Detección de impurezas.
6. También proporciona información estructural, de energía de enlaces, cinéticas y
fisicoquímicas.
7. Es una técnica rápida, análisis en línea de tiempos reales, control de procesos enzimáticos
y metabólicos.
10.- Cuales son las desventajas del método?

1. Es un análisis destructivo anque se emplea muy poca muestra esta se destruye.
2. No siempre puede diferenciar entre estructuras.
3. Costo del instrumento elevado.
11.- Mencione algunas aplicaciones específicas de la espectrometría de masas.

Detectar e identificar uso de fármacos, Monitoreo de gases de la respiración en cirugía. Detrminar
composición de materiales del espacio exterior. Adulteración de miel de abeja, Monitoreo de
fermentaciones, Detectar contaminantes orgánicos del suelo, agua y alimentos.
ESPECTRÓMETRO DE MASAS
Es el equipo de laboratorio que analiza con gran precisión la composición de diferentes
elementos químicos, generando múltiples iones a partir de la muestra investigada, para
así obtener información de la masa molecular del elemento analizado, separando los
núcleos atómicos en función de su relación entre masa y carga, y registrando la
abundancia relativa de cada tipo de ión.
PROCESO DEL ESPECTRÓMETRO DE MASAS

Esencialmente, el espectrómetro de masas debe cumplir las siguientes funciones:
 Ionización de la muestra.
 Aceleración de los iones por un campo eléctrico.
 Dispersión de los iones según su masa/carga.
 Detección de los iones y producción de la correspondiente señal eléctrica.
Como primera función un espectrómetro de masas debe ser capaz de originar iones a
partir de las moléculas neutras en fase gaseosa. Siguiente a la generación de iones, estos
serán acelerados sometiéndose a la acción de un campo magnético. Después, el
espectrómetro de debe ser capaz de separar los iones en función de su relación
masa/carga. Finalmente al ser separados, este será capaz de detectar los iones formados
y registrar la información adecuadamente
2
PARTES
Básicamente un espectrómetro de masas costa esencialmente de las siguientes partes:
 Sistema de entrada de muestras
 Cámara de ionización
 Acelerador
 Analizador
 Detector
Sistema de entrada de muestras

Su objetivo es introducir una pequeña cantidad de muestra en el espectrómetro de
masas. A menudo el sistema de entrada contiene un medio que permite la volatilización
de muestras sólidas o líquidas.
En el sistema de entrada de muestras, un micromol o menos de muestra se convierte al
estado gaseoso por calentamiento a unos 400ºC y se introduce lentamente en la cámara
de ionización. La finalidad del sistema de entrada es permitir la introducción de una
muestra representativa en la fuente de iones con la mínima perdida de vacío.
En los espectrómetros de masas más modernos encontramos diferentes tipos de

sistemas de entrada:
 Sistema indirecto de entrada: este es el sistema más clásico y el más simple, en
el cual la vaporización de la muestra se realiza en un recipiente externo al
Facultad de Bioanálisis Ana Karen Ramírez Ortigoza

espectrómetro; un balón de vidrio o de metal esmaltado interiormente que se
mantiene a temperatura elevada.
 Sistema directo de entrada: los líquidos y los sólidos no volátiles se pueden
introducir en la región de ionización mediante una varilla en el cual se inserta a
través de un cierre de vacío. El sistema de cierre se utiliza para controlar la
cantidad de aire que entra después de la inserción de la varilla en la región de
ionización.
 Entrada cromatográfica: es un tipo de sistema de entrada especial, su uso está
indicado únicamente cuando al espectrómetro de masa va acoplado un sistema
de cromatografía de gases o de líquidos de alta eficacia, que permiten la
separación y determinación de los componentes de mezclas complejas.
Cámara de ionización
Convierte los componentes de la muestra en iones. Esto puede conseguirse por
bombardeo con electrones, moléculas o fotones. Alternativamente también puede
lograrse la ionización mediante energía térmica o eléctrica.
La formación de iones del analito es el punto de arranque de un análisis por
espectrometría de masas. El aspecto de los espectros de masas para distintas especies
moleculares, depende en gran medida del método utilizado para la formación de los
iones. Estos métodos se pueden dividir en dos categorías: Si se emplean fuentes de fase
gas la muestra es primero volatilizada y después ionizada, si se emplean fuentes de
desorción la energía se transmite directamente a la fase sólida o líquida, produciéndose 3
la ionización y la transferencia de los iones al estado gaseoso.
Acelerador
Se encarga de atravesar las partículas ionizadas producidas por el impacto de los
electrones por tres ranuras aceleradoras con una pequeña diferencia de potencial. Las
partículas ionizadas producidas por el impacto de los electrones son obligados a
atravesar una primera ranura aceleradora por una pequeña diferencia de potencial.
Entre esta primera y una segunda ranura existe una diferencia de potencial muy elevada
que imprime a las partículas su velocidad final. Una tercera ranura actúa como colimador
del haz de partículas.
Analizador
La función del analizador de masas es la separación de los iones en función de su relación
masa/carga (m/z). La capacidad de un espectrómetro de masas para distinguir entre
masas próximas se expresa normalmente en términos de resolución (R), que se define
como:
R = m/z
Los analizadores más utilizados, son el de campo magnético, el analizador cuadrupolar,

muy utilizado en equipos combinados con un cromatografo de gases, y el analizador de
trampa de iones.

 Analizador de campo magnético: utiliza un electroimán para dispersar
simultáneamente todos los iones en función de su relación m/z. El analizador de
sector magnético utiliza un imán permanente o un electroimán para hacer que el
haz procedente de la fuente de iones se desplace con una trayectoria circular de
180, 90 o 60º. Estos analizadores también son llamados de enfoque simple.
 Analizador cuadrupolar: no utiliza campos magnéticos para la dispersión, este

está formado por cuatro barras metálicas de sección circular o hiperbólica, con
gran precisión sobre una circunferencia, de tal forma que el haz de iones
procedente de la fuente incida sobre el centro del dispositivo y así es
perfectamente utilizable para realizar barridos con gran rapidez. Además este
analizador es más simple, robusto y rápido que el antes mencionado.
 Analizador de trampa de iones: es un dispositivo en el que los cationes o aniones

gaseosos pueden formarse y quedar confinados durante largos periodos de
tiempo por la acción de campos eléctricos y/o magnéticos. Este analizador es más
robusto, compacto y económico que los anteriores.
Hata el momento, ha sido utilizado únicamente como detector cromatográfico
más que en sistemas reales de acoplamiento cromatografía de
gases/espectrometría de masas para análisis estructural. Este tipo de analizador
es una modificación del analizador cuadrupolar, y está basado en la utilización de
una zona de confinamiento electromagnética generada por medio de dos señales 4
de radiofrecuencia.
El analizador de trampa de iones está formado por tres electrodos de superficie
hiperbólica; de ellos, el electrodo central es anular, mientras que los electrodos
superior e inferior forman el cierre de los extremos del anillo. Los tres electrodos
forman una cavidad en la que se producen la ionización, la fragmentación y el
análisis de masas.
Detector
Convierte el haz de iones en una señal eléctrica que puede ser procesada, almacenada
en la memoria de un ordenador y mostrada o registrada de varias maneras.
Los iones procedentes del sistema acelerador llegan al detector el cual generalmente
está constituido por un cátodo emisor que al recibir el impacto producido por las
partículas cargadas emite electrones. Estos electrones son acelerados hacia un dínodo
el cual emite varios electrones más al recibir el impacto de cada electrón. Este proceso
se repite varias veces hasta obtenerse una cascada de electrones que llega al colector
lográndose una corriente fuertemente amplificada, por un procedimiento muy similar al
que se utiliza en los tubos fotomultiplicadores. La corriente obtenida puede amplificarse
de nuevo por procedimientos electrónicos y se lleva a un sistema registrador.

CONCLUSIONES
Los espectros de masas proporcionan mucha información sobre la estructura de los
compuestos analizados. Además de las posibilidades de identificación por comparación
de los espectros obtenidos con los contenidos en una base de datos, el espectro de
masas es susceptible a ser interpretado. La información que ofrece el espectro de masas
proviene de las reacciones químicas que experimentan las moléculas de la muestra en
estado excitado; en consecuencia, la interpretación de un espectro de masas requerirá
de un conocimiento de las reacciones que pueden originarse en el espectrómetro, así
como de los iones que estas reacciones pueden generar.
CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la función principal del espectrómetro de masas?
2. ¿Qué sistema de entrada utiliza un recipiente externo al espectrómetro?
3. ¿Qué parte del espectrómetro convierte los componentes de la muestra en iones?
4. ¿Cuáles son los tres tipos de analizadores de masas más utilizados?
5. ¿Qué función cumple el detector en el espectrómetro?
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
 Grupobiomaster.com [Internet]. España: Grupo Biomaster; 2020 [citado 3
noviembre 2020]. Disponible en: https://grupobiomaster.com/espectrometria-
de-masas/
 Introducción a la espectrometría de masas y sus aplicaciones en análisis 5
ambientales [Internet; citado 3 noviembre 2020]. Disponible en:
http://www4.ujaen.es/~mjayora/docencia_archivos/Quimica%20analitica%20ambi
ental/Tema7.pdf
 Fundamentos y funciones de la espectrometría de masas [Internet; citado 3
noviembre 2020]. Disponible en:
http://mural.uv.es/caloan/#Instrumentacion_en_EM

UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOANALISIS
ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION ATOMICA

Introducción
Los principios teóricos de la absorción atómica fueron establecidos en 1840 por Kirchhoff y
Bunsen en sus estudios del fenómeno de autoabsorción en el espectro de los metales
alcalinos y alcalino térreos.1
La base de la espectroscopia de absorción atómica (EAA) la entregó Kirchhoff al formular su

ley general: «cualquier materia que pueda emitir luz a una cierta longitud de onda también
absorberá luz a esa longitud de onda». El significado práctico de esto fue recién desarrollado
en 1955 por el australiano Walsh, apareciendo los primeros instrumentos comerciales a
principios de 1960. 1
La forma moderna de la espectroscopia de absorción atómica fue desarrollada en gran parte

durante la década de 1950 por un equipo de químicos australianos. Fueron dirigidos
por sir Alan Walsh en la Commonwealth Scientific and Industrial Research
Organization (CSIRO), División de Química Física, en Melbourne, Australia. 2
Es un método instrumental de la química analítica que permite medir las concentraciones

específicas de un material en una mezcla y determinar una gran variedad de elementos.
Esta técnica se utiliza para determinar la concentración de un elemento particular
(el analito) en una muestra y puede determinar más de 70 elementos diferentes en solución
o directamente en muestras sólidas utilizadas en farmacología, biofísica o investigación
toxicológica. 2
INSTRUMENTACION AVANZADA RUIZ GONZALEZ ARMANDO

Fundamento
La espectroscopia de absorción atómica (AAS por sus siglas en inglés Atomic Absorption
Spectroscopy), es una técnica extremadamente sensible, y especifica debido a que las líneas
de absorción atómica son considerablemente estrechas (de 0,002 a 0,005 nm) y las energías
de transición electrónica son únicas para cada elemento. 3
La instrumentación básica para la AA se presenta en la Figura 1, y está constituida de una

fuente de radiación monocromática (específica para cada elemento a analizar), o
policromática, un atomizador para producir los átomos excitados de la sustancia a analizar;
un monocromador para seleccionar la longitud de onda de la radiación característica de
cada elemento a analizar; un detector sensible a la radiación emitida y un procesador de la
señal y de la lectura de salida. 3
Figura 1. Esquema básico de un EAA
En términos generales, el funcionamiento es el siguiente: el haz emitido por la fuente

atraviesa el sistema de atomización que contiene la muestra en estado de gas atómico, esta
llega al monocromador que elimina la radiación que no interesa para el estudio, pasando
así al revelador o detector de la radiación absorbida, que luego es procesada y amplificada,
dando como resultado una lectura de salida. 3
Los componentes básicos de un equipo de absorción atómica son: 1

Componentes de un espectrofotómetro de absorción atómica 4
1) Una fuente de radiación que emita una línea específica correspondiente a la necesaria
para efectuar una transición en los átomos del elemento analizado.
2) Un nebulizador, que por aspiración de la muestra líquida, forme pequeñas gotas para una
atomización más eficiente.
3) Un Quemador, en el cual por efecto de la temperatura alcanzada en la combustión y por
la reacción de combustión misma, se favorezca la formación de átomos a partir de los
componentes en solución.
4) Un sistema óptico que separe la radiación de longitud de onda de interés, de todas las
demás radiaciones que entran a dicho sistema.
5) Un detector o transductor, que sea capaz de transformar, en relación proporcional, las
señales de intensidad de radiación electromagnética, en señales eléctricas o de intensidad
de corriente.
6) Un amplificador o sistema electrónico, que como su nombre lo indica amplifica la señal
eléctrica producida, para que en el siguiente paso pueda ser procesada con circuitos y
sistemas electrónicos comunes.
7) Por último, se requiere de un sistema de lectura en el cual la señal de intensidad de
corriente, sea convertida a una señal que el operario pueda interpretar (ejemplo:
transmitancia o absorbancia). Este sistema de lectura, puede ser una escala de aguja, una
escala de dígitos, un graficador, una serie de datos que pueden ser procesados a su vez por
una computadora, etc.
Aplicaciones
La EAA constituye una de las técnicas más empleadas para la determinación de más de 70
elementos, principalmente en el rango de μg/ml-ng/ml en una gran variedad de muestras.
Entre algunas de sus múltiples aplicaciones tenemos el análisis de: aguas, muestras
geológicas, muestras orgánicas, metales y aleaciones, petróleo y sus subproductos; y de
amplia gama de muestras de industrias químicas y farmacéuticas. 1

Bibliografía
1. Razmilic B. Espectroscopia de Absorción Atómica.

http://www.fao.org/3/ab482s/AB482S04.htm
2. https://es.wikipedia.org/wiki/Espectroscopia_de_absorci%C3%B3n_at%C3%B3mica_(
AA)
3. Gallegos W, Vega M, Noriega P. Espectroscopia de absorción atómica con llama y su
aplicación para la determinación de plomo y control de productos cosméticos. La
granja, revista de ciencias de la vida. 2012; 15: 19-26.
https://dspace.ups.edu.ec/bitstream/123456789/8824/1/Espectroscopia%20de%20a
bsorcion%20atomica%20con%20llama%20y%20su%20aplicacion%20para%20la%20de
terminacion%20de%20plomo%20y%20control%20de%20productos%20cosmeticos.pd
f
4. Rocha-Castro E. principios básicos de espectroscopia. Editorial UACh, Mexico 2000, pag
123-203.
Videos
https://www.youtube.com/watch?v=W6Ov-XUwpTY
https://www.youtube.com/watch?v=-CjvW1GHVGM

CUESTIONARIO ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATOMICA
1. ¿Quién estableció los principios teóricos de la absorción atómica?

Fueron establecidos en 1840 por Kirchhoff y Busen.
2. ¿Qué establece la ley general entregada por Kirchhoff?

Cualquier materia que pueda emitir luz a una cierta longitud de onda también absorberá
luz a esa longitud de onda.
3. ¿Qué es la espectroscopia de absorción atómica?

Es un método instrumental de la química analítica que permite medir las concentraciones
específicas de un material en una mezcla y determinar una gran variedad de elementos.
4. ¿Cuál es el fundamento de la espectroscopia de absorción atómica?

Es una técnica extremadamente sensible, y especifica debido a que las líneas de absorción
atómica son considerablemente estrechas (de 0,002 a 0,005 nm) y las energías de transición
electrónica son únicas para cada elemento.
5. ¿Cuál es la instrumentación básica para absorción atómica?

Fuente radiante, atomizador, monocromador, detector, amplificador y un sistema de
presentación.
6. ¿Cómo es el funcionamiento de la absorción atómica?

El haz emitido por la fuente atraviesa el sistema de atomización que contiene la muestra en
estado de gas atómico, esta llega al monocromador que elimina la radiación que no interesa
para el estudio, pasando así al revelador o detector de la radiación absorbida, que luego es
procesada y amplificada, dando como resultado una lectura de salida.
7. ¿Cuál es el rango principal de determinación de los elementos?

De μg/ml - ng/ml.
8. ¿Cuáles son algunas de las aplicaciones de la absorción atómica?

El análisis de: aguas, muestras geológicas, muestras orgánicas, metales y aleaciones,
petróleo y sus subproductos; y de amplia gama de muestras de industrias químicas y
farmacéuticas.

Resumen Absorción atómica partes y fundamentos del equipo.
La absorción atómica cuenta como principio básico que todo átomo es capaz de
absorber luz, cuya longitud de onda de esta misma es absorbida y es específica
para cada elemento y que a su vez la cantidad de luz succionada es igual a la
concentración de átomos que son absorbentes.
La espectroscopía de absorción atómica es una técnica que permite medir las

concentraciones específicas de un material en una mezcla y determinar una gran
variedad de elementos. Consta de las siguientes instrumentaciones básicas
necesarias para poder realizar las medidas de absorción:
o Fuente de radiación:
La radiación empleada en el espectrofotómetro origina una banda
estrecha, con una asertiva intensidad y basta estabilidad durante un
tiempo definido.
o Sistema nebulizador-atomizador:
Suelen estar integrados en uno, la disolución de la muestra es al comienzo
aspirada y dirigida hacia la llama, lugar donde se forman los átomos.
o Monocromador:
Dispone de una rendija de entrada, un conjunto de espejos, un elemento
y una rendija de salida.
o Detector:
El sistema detector recibe la energía lumínica y la convierte en una señal
eléctrica proporcional a la energía recibida. La señal eléctrica puede ser
procesada amplificada.
Referencias bibliográficas:
• Martínez Guijarro, M. (2020). Análisis Instrumental.
Espectrometría de Absorción Atómica (EAA)
DESDE LA ACADEMIA
ELECTROFORÉSIS: FUNDAMENTOS,
AVANCES Y APLICACIONES
Electrophoresis: fundamentals, advances and applications
Resumen
La electroforésis es una técnica para separación de biomoléculas según
su movilidad y naturaleza (generalmente ácidos nucleicos o proteínas) en
un campo eléctrico sobre una matríz porosa, cuya composición depende
de la biomolécula a analizar. Para la separación de ácidos nucléicos se
utilizan matrices de agarosa y para la separación de proteínas se utilizan
matrices de poliacrilamida. Esta técnica representa una herramienta
fundamental de análisis cuantitativos en diversos campos de ciencias
biológicas como biología molecular, bioquímica o proteómica. Entre las
distintas plataformas de electroforésis, las más utilizadas en análisis de
ácidos nucléicos son la electroforésis en gel de agarosa, la electroforésis
EPISTEMUS de campo pulsado (PFGE) o la electroforésis en gel con gradiente de
ISSN: 2007-8196 (electrónico) desnaturalización (DGGE), y las más utilizadas para análisis de proteínas
ISSN: 2007-4530 (impresa) son la electroforésis en gel de poliacrilamida con duodecil sulfato de sodio
(SDS) y la electroforésis bidimensional. Esta revisión discutirá las técnicas
Montalvo Navarro Carlos Antonio1 previamente mencionadas y sus recientes aplicaciones.
Lugo Flores Marco Antonio2
Palabras clave: electroforésis, ADN, PAGE, PFGE, DGGE
Recibido: 20 de septiembre de 2016,
Aceptado: 30 de noviembre de 2016
Autor de Correspondencia: Abstract

Lic. Montalvo Navarro Carlos Antonio
Correo: carmona1994@gmail.com Electrophoresis is a technique for separating biomolecules according to
their mobility and nature (usually nucleic acids or proteins) in an electric field
on a porous matrix, whose composition depends on the biomolecule to be
analyzed. For the separation of nucleic acids, agarose matrices are used and for
the separation of proteins, polyacrylamide matrices are used. This technique
represents a fundamental tool of quantitative analysis in various fields of
biological sciences such as molecular, biochemical or proteomic biology.
Among the different electrophoresis platforms, the most used in nucleic acid
analysis are agarose gel electrophoresis, pulsed field electrophoresis (PFGE) or
denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), and the most used for analysis
of proteins are polyacrylamide gel electrophoresis with sodium duodecyl
sulfate (SDS) and two-dimensional electrophoresis. This review will discuss the
previously mentioned techniques and their recent applications.
Keywords: electrophoresis, DNA, PAGE, PFGE, DGGE.
1 Universidad autónoma de baja california: campus ensenada Correo: carmona1994@gmail.com

2 Instituto tecnológico de los Mochis Correo: marco_lugo029@hotmail.com
48 EPISTEMUS: www.epistemus.uson.mx
INTRODUCCIÓN lo es el ensayo de comentado esencial (ensayo de una
Los microrganismos son un grupo de seres vivos que sola célula). Dicha técnica es utilizada para determinar el
se encuentran en una gran variedad de lugares como lo daño o reparación del ADN en células eucariotas y tejidos
son las plantas, animales y humanos en donde coexisten disgregados a partir de la adición de la suspensión de
con el huésped ayudando a realizar un sin fin de funciones. células junto con la agarosa sobre el molde para formar el
Sin embargo, algunos de estos como los microorganismos gel delgado. Después se realiza la lisis de las células con
patógenos pueden ocasionar enfermedades en los un detergente (Triton X-100) y NaCl 2M para la eliminación
organismos mencionados provocando la muerte de de histonas del ADN. Las moléculas que permanecen
los mismos. Desde la perspectiva de la salud, en seres adheridas al gel reciben el nombre de nucleoides que
humanos es necesario establecer protocolos que permitan se caracterizan por mantener el superenrollamiento del
la identificación de estos agentes perjudiciales y prevenir ADN. De acuerdo al modelo propuesto por Cook y col.
el efecto patógeno que generan sobre las personas. El En 1970, estipula que las moléculas de ADN están unidas
estudio del ADN de los microorganismos ha potenciado a una matriz nuclear formando una secuencia donde
la identificación de estos a partir de diferentes técnicas cada unidad estructural genera un bucle. Entonces, al
moleculares, tal es caso de la electroforésis, una técnica ocasionar rupturas de la cadena de ADN se dice que el
que permite el procesamiento de los fragmentos de ADN superenrrollamiento se relaja y al ser aplicado un campo
que al ser regiones muy conservadas dentro de cada electroforético, dicho bucle puede migrar hacia el anodo
especie, es posible identificar a estos. El presente estudio de la cámara de electroforésis. A mayor cantidad de
proporciona información acerca del fundamento de la rupturas se presenta una mayor cantidad de ADN en la
técnica de electroforésis, los procedimientos y reactivos cola del cometa, que después de teñirse (4,6-diamidino-2-
requeridos para la misma, así como los avances y nuevas fenilindol), la intensidad relativa de la fluorescencia de la
técnicas que han surgido con el paso del tiempo. cola se mide como índice de frecuencia de ruptura del ADN
por medio de microscopia de fluorescencia.
DESARROLLO Aplicaciones. La aplicación de dicho ensayo abarca el
estudio de células sanguíneas provenientes de animales
Métodos de separación de ácidos nucléicos.
o humanos, células de hemolinfa de moluscos e insectos,
Electroforésis en gel de agarosa. La creación de la
esperma, tejidos animales disgregados, levaduras, núcleos
electroforésis como un método de separación de ADN
liberados de tejidos vegetales, en otras palabras es
bicatenario de cadenas simples se remonta al año 1962,
aplicable a cualquier tipo de célula eucariota que pueda
elaborado por Matsubara y Takagi, donde se utilizaba al
obtenerse como una célula única [12].
almidón como gel de corrimiento. La necesidad de analizar
moléculas de ADN de longitudes variables propició el
estudio de otros compuestos que pudieran utilizarse
como gel de corrimiento en las pruebas de electroforésis,
surgiendo la agarosa en 1969 como un candidato adecuado
debido a las características que posee. La agarosa es un
polisacárido obtenido del aislado de agar de algas rojas
marinas, el cual está constituido por unidades repetidas de
agarobiosa, sustituida de manera extensa en grupo ester
de sulfato, acido pirúvico cetal y esteres metílicos. Dicho
polímero es de interés en el análisis del ADN debido a las
características que posee al ser gelificado, consiste en una
bobina aleatoria estructurada por una doble hélice en
etapas iniciales de la gelificación y a medida que avanza
la gelificación se forman las dobles hélices finales. La
configuración mencionada forma una red fibrosa que
puede ser utilizada como filtro para la clasificación de
diferentes moléculas, donde la concentración de agarosa
Figura 1. Imágenes de ensayo de cometa obtenidas por
es inversamente proporcional al tamaño del poro. Ha sido
microscopia de fluorescencia
reportado un límite de tamaño máximo de fragmentos
de ADN que pueden ser analizados con gel de agarosa,
Electroforésis de campo pulsado (PFGE). El desarrollo y
siendo entre 100 a 2000 pb a una concentración de 2-3%
modificaciones de la electroforésis convencional permiten
del polisacárido. Por otro lado la longitud mínima del
generar nuevas metodologías para mejorar el análisis e
fragmento se establece a valores superiores a 50 kb, donde
identificación de contenido genético de células eucariotas
la concentración recomendada es de 0.25% de agarosa
y procariotas. Scwartz y Cantor demostraron que la
[15]. La aplicación de la electroforésis con geles de agarosa
implementación de campos eléctricos podía ser utilizada
se ha implementado una gran variedad de estudios como
Montalvo Navarro Carlos Antonio et al.: Electroforésis: fundamentos, avances y aplicaciones EPISTEMUS 49
diferenciación de subtipos de bacterias, considerándose
la técnica de oro para dicho proceso. Algunos ejemplos
son: la medida y el número de cromosomas de DNA y/o
enlace genético de grupos bacterianos como S. pombe S.
cerevisiae, Candida albicans, Plasmodium, etc [14].
para la separación de moléculas largas de ADN por

electroforésis en geles de agarosa. El principio de la técnica
consiste en la aplicación de dos o más campos eléctricos Figura 2. Esquema de electroforesis campo pulsado
en direcciones perpendiculares por lapsos de tiempo para la separación de moléculas de ADN a partir de la
definidos, permitiendo alterar la dirección de las moléculas aplicación de campos eléctricos en diferentes
de DNA y orientándola a diferentes posiciones. Un aspecto direcciones.
importante a considerar en la técnica es la heterogeneidad
de los pulsos generados por los campos eléctricos ya que Electroforésis en gel con gradiente desnaturalizante
esto permite la producción de un gradiente de intensidad (DGGE). La electroforésis en gel por gradiente
de campo eléctrico a través de la longitud del gel y como desnaturalizante (DGGE) es una técnica usada para
consecuencia, líneas de campo eléctrico distorsionadas separar fragmentos cortos-medianos de DNA basado
tomándose como pistas de migración de las moléculas en sus características de fusión. Esta técnica ha sido
de ADN en los carriles de los geles. Lo anterior permite frecuentemente utilizada para identificar polimorfismos de
separar los fragmentos de interés para su posterior un solo nucleótido (SNP) sin la necesidad de secuenciación
análisis. Las medidas de las moléculas de interés definen el del DNA y como un método de huella molecular para
tiempo de aplicación requerido del campo eléctrico para comunidades en ecosistemas complejos, en particular con
reorientarlas, a mayor tamaño mayor tiempo de aplicación la amplificación de los genes de RNA ribosomal 16S debido
y viceversa para las moléculas de ADN pequeñas. La a que es altamente conservado [9].
preparación de las muestras de ADN consiste en el cultivo En el DGGE se utiliza un gel de poliacrilamida que
de células correspondientes a 500 µg/mL de DNA, después contiene un gradiente creciente de desnaturalizantes
son recolectadas y lavadas con solución isotónica para
mantener la integridad de las mismas. Posteriormente,
se agregan al gel de agarosa, se realiza una mezcla y
el producto formado es vertido en el molde. El molde
formado es sumergido en una solución con detergentes
y agentes desproteinizantes que permiten al material
genético estar listo para la aplicación de campos eléctricos.
Después se lleva a cabo la electroforésis aplicando los
campos eléctricos, donde previamente se requiere teñir
al gel con un agente de intercalación fluorescente para
la visualización del patrón, los más utilizados son: gel red,
SYBR® gold, SYBR® gold y bromuro de etidio. Estos tintes
permiten obtener patrones de intensidad de fluorescencia
que son digitalizados y analizados de manera visual o
mediante software.
Aplicaciones. A partir de la técnica mencionada
se pueden analizar mezclas de ADN mayores a 20 kb y
máximas a 5Mb mediante geles de agarosa que separar las
moléculas de acuerdo a su tamaño [13]. PFGE permite el
análisis de ADN intacto por lo que ha sido utilizado en la
50 EPISTEMUS Montalvo Navarro Carlos Antonio et al.: UNISON / EPISTEMUS 26 / Año 13/ 2019/ pág.: 48-54
químicos (generalmente urea o formamida) a través de convertido en una herramienta importante en la ecología
los cuales el DNA migra por electroforésis. A medida que microbiana, donde ha sido utilizado como método de
el DNA migra por el gradiente, cada molécula empezara huella molecular para evaluar la diversidad microbiana en
a desnaturalizarse a una concentración particular del comunidades con mezclas complejas de microorganimos.
desnaturalizante dependiendo del %GC en la molécula y Las investigaciones realizadas por Subasinghe et al., [10]
el orden de las bases en la secuencia. La migración de las para la identificación de bacterias en productos microbianos
moléculas se retardada cuando sucede la desnaturalización. utilizaron la técnica de DGGE, y con ella encontraron que la
La técnica DGGE se representa esquemáticamente en la formación de múltiples bandas en el gel representaban a
Fig. 3. una misma bacteria en lugar de un consorcio bacteriano.
Esto fue atribuido a inconvenientes con el PCR elaborado
previamente. Otro ejemplo de aplicación del DGGE fue el
realizado por Xin et al., [11] en el análisis de comunidades
bacterianas asociadas con pericoronitis asintomática
y sintomática, una enfermedad bucal inflamatoria. El
resultado del perfil bacteriano en pacientes clínicos mostro
una menor diversidad de microorganismos que en los
pacientes control (sin enfermedad), este descubrimiento
sugirió que la microbiota asociada a pericoronitis se
vuelve menos diversa, quizá debido a que ciertos grupos
de microorganismos dominan el las biopelículas a medida
que la pericoronitis progresa.
Métodos de separación de proteínas.

Electroforésis en gel de poliacrilamida (PAGE). La
electroforésis es una técnica para la separación de moléculas
según la movilidad de éstas en un campo eléctrico.
Figura 3. Diagrama esquemático de un DGGE Los geles de poliacrilamida son geles químicamente
entrelazados formados por la reacción de acrilamida con
Un gradiente de temperatura en lugar de un gradiente un agente de entrecuramiento bifuncional como el Bis
químico desnaturalizante puede ser utilizado, en este caso [8]. La electroforésis con geles de poliacrilamida (PAGE)
la técnica es llamada Electroforésis en Gel con Gradiente es útil para separar moléculas por tamaño-carga y hay
de Temperatura (TGGE). Recientemente, DGGE se ha muchos sistemas diferentes dependiendo de la muestra y
sus posteriores aplicaciones [2]. Las propiedades que debe
tener un medio de soporte ideal son [6]:
• Naturaleza química inerte (no debe reaccionar con el
analito o con cualquier reactivo utilizado)
• Alta conductividad eléctrica
• No debe absorber el analito
• Porosidad controlada para lograr un efecto de
separación deseado
• Transparencia para lograr una tinción e imagen
exitosa
• Baja toxicidad
• Fácil disponibilidad de los reactivos utilizados
• Rigidez razonable para un fácil manejo de la matriz
• Electroendoosmosis: flujo de un buffer a través de
una superficie cargada
Los geles de poliacrilamida tienen todas las

propiedades descritas anteriormente.
Formatos de PAGE. Varios formatos y versiones de
PAGE han sido desarrolladas, como:
1. SDS-PAGE
2. Gradiente de SDS-PAGE
3. PAGE de Ácido acético – Urea para proteínas
básicas
4. Gel de electroforésis discontinua con Bromuro de
cetiltrimetilamonio
5. Electroforésis con enfoque isoeléctrico
6. Electroforésis capilar
7. Electroforésis bidimensional Electroforésis en gel de poliacrilamida con duodecil
La popularidad de los geles de poliacrilamida proviene sulfato de sodio (SDS-PAGE). SDS es un detergente que
de varias propiedades fundamentales como claridad desnaturaliza estructuras secundarias y estructuras
óptica, neutralidad eléctrica y disponibilidad en un terciarias no enlazadas con disulfuro y las reviste con
amplio rango de porosidad. Su fórmula química, como una carga negativa que se correlaciona con su longitud,
comúnmente se polimeriza a partir de acrilamida y N, N0- permitiendo que los pesos moleculares sean estimados.
metileno bisacrilamida (Bis), se muestra en la Fig. 4, junto La movilidad a través del gel puede verse afectada por el
con la de los dos catalizadores más ampliamente usados, estado de la proteína (por ejemplo, fosforilación y presencia
el peroxodisulfato (amonio o potasio) y N, N, N0, N0- de moléculas multiméricas) [2]. La electroforésis SDS
tetrametiletilendiamina (TEMED) [6]. fue el siguiente paso lógico después de la electroforésis
discontinua. Mientras que esta última discrimina las
macromoléculas en función del tamaño y la carga
superficial, la electroforésis SDS fracciona las cadenas
polipeptídicas esencialmente en función de su tamaño. Por
lo tanto, es un método simple, pero poderoso y confiable
para la determinación de la masa molecular.
La muestra de proteína (1 mg/mL) generalmente se
desnaturaliza en 100 mmol/L fosfato pH 7.0, que contiene
1% SDS, 1% 2-mercaptoetanol, 5% -10% de sacarosa (para
aumentar la densidad de la muestra para cargar el gel) y
trazas de bromofenol azul (como un colorante de rastreo
para monitorear la formación de límites en sistemas
discontinuos y para verificar la terminación de la corrida).
Después calentando a 100ºC durante 5 minutos, la muestra
se deposita generalmente en posillos en la placa de gel [6].
Para detectar las bandas se realiza una tinción con
Figura. 4 Reacción de polimerización de la acrilamida e varios reagentes. Después de la tinción, las bandas pueden
iniciadores de la polimerización. ser cuantificadas por densitometría. Adicionalmente a la
gradiente de pH para separarlas respecto a su punto
isoeléctrico
3. Interfaz con la segunda separación con adición de
buffer conteniendo SDS para cargar negativamente
las proteínas
4. Segunda separación en un gel SDS PAGE para separar
las proteínas respecto a su masa molecular
5. Detección de proteínas en el gel
Generalmente, el orden de la separación es primero
por punto isoeléctrico y después por electroforésis SDS,
aunque también puede ser en el orden contrario. La
figura 2 resume los pasos básicos para llevar a cabo una
electroforésis en dos dimensiones [7].
detección de proteínas, métodos de detección específica

han sido desarrollados para tinción de motivos de lípidos y
carbohidratos, así como para tinción de actividad biológica
y detección de anticuerpos por sondas.
Aplicaciones. Magdy y Maged [4] utilizaron la técnica
de SDS-PAGE para validar un método de estimación
cuantitativa de la enzima digestiva papaína en
formulaciones farmacéuticas (tabletas, capsulas y jarabes)
comercializadas en mercados egipcios. Los resultados
obtenidos demostraron que la cantidad de papaína
obtenida por SDS-PAGE fué menor que la cantidad indicada
en los envases de producto en presentación de tabletas y Figura 5. Esquema sobre la metodología
capsulas. general de Electroforésis 2D
Otro estudio donde se utilizó la técnica SDS-PAGE es el
reportado por Min-Kyoung et al., [3] en el cual investigaron Aplicaciones. A pesar de las limitaciones que presenta
el patrón de bandeo de azucares reductores, péptidos la electroforésis en 2D hacia proteínas de membrana, esta
totales e isoflavonoides presentes en tofu congelado y técnica sigue siendo ampliamente utilizada en proteómica
descongelado fermentado con B. subtilis, así como la debido a la economía del proceso y a que los procesos
digestibilidad y el contenido de fenoles totales en el tofu. de análisis de las proteínas en el gel por espectroscopia
Electroforésis bidimensional. La electroforésis en 2D es de masas son simples y baratos. Sin embargo, la razón
una técnica clásica capaz de dar una imagen extendida de principal de la popularidad de esta técnica se encuentra en
las proteínas presentes en una muestra de interés. Se basa su reproducibilidad y su robustez así como en la facilidad
en una primera separación por el punto isoeléctrico de la de sus análisis cuantitativos [5].
proteína, seguido de una separación por peso molecular Las aplicaciones de la técnica de electroforésis en 2D
utilizando SDS-PAGE. El resultado es un mapa proteico son amplias. Se ha utilizado esta técnica en proteómica
con alta resolución donde una banda generalmente bacteriana donde la cantidad de muestras es limitada o en
contiene una única proteína [1].La electroforésis 2D estudios de toxicología donde se tiene un gran número de
generalmente se aplica para acceder al inventario total muestras. También en micro-enzimología donde se utiliza
de proteínas de las células vivas. La electroforésis 2D se como una herramienta micropreparativa de proteínas,
complementó más tarde con genómica para el análisis en inmunoproteómica donde la respuesta inmune de
de los genomas relativamente estáticos como modelo de pacientes es evaluada a nivel proteómico y en el estudio
vida y transcriptómica para acceder al inventario de ARNm de modificaciones post-traduccionales [5].
altamente dinámico necesario para una mayor producción
de proteínas. Aunque el nombre de electroforésis 2D CONCLUSIONES
sugiere que es un proceso de dos pasos, de hecho es un Las técnicas de electroforésis han revolucionado los
proceso de cinco pasos: métodos de análisis de biomoléculas y la caracterización
1. Extracción de proteínas de la muestra biológica de microorganismos en diferentes campos de las
2. Primera separación añadiendo la proteína en un ciencias biológicas como las ciencias ómicas (genómica,
transcriptómica, proteómica, metagenómica) ya que estas NGS ) in combination with enrichment culture techniques
técnicas se han combinado con otras plataformas como to identify bacteria in commercial microbial-based products.
Journal of Microbiological Methods, 161(April), 118–130,
PCR, técnicas de secuenciación de nueva generación 2019
y espectroscopía de masas acoplada a cromatografía [11] Zhang, X., Sun, Z., & Yang, Q. Application of Denaturing
de líquidos, entre otras lo cual ha permitido una mejor Gradient Gel Electrophoresis to the Analysis of Bacterial
resolución y precisión de resultados experimentales. Communities Associated With Asymptomatic and
Sin embargo, las limitaciones asociadas a esta técnica Symptomatic Pericoronitis. Journal of Oral Maxillofacial
Surgery, 76(3), 483–489, 2017
deben solucionarse para poder aproximarnos a un mejor [12] Azqueta, A., and Collins, A. R. “The essential comet assay:
entendimiento de la composición, funcionamiento y a comprehensive guide to measuring DNA damage and
cambios en el tiempo de los sistemas biológicos. repair,” Archives of toxicology, vol. 87, no. 6, pp. 949-968,
2013.
BIBLIOGRAFÍA [13] Lopez-Canovas, L., Benitez, M. B. M., Isidron, J. A. H., & Soto, E.
F. “Pulsed Field Gel Electrophoresis: Past, present, and future,”
[1] Kucharska, E., & Wróblewska, B. Food allergens. In Toxins and Analytical biochemistry, submitted for publication, 2019.
Other Harmful Compounds in Foods, 2017 [14] Pulpipat, T., Lin, K. H., Chen, Y. H., Wang, P. C., & Chen, S. C.
[2] Brunelle, J. L., & Green, R. One-dimensional SDS- “Molecular characterization and pathogenicity of Francisella
polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). In noatunensis subsp. orientalis isolated from cultured tilapia
Methods in Enzymology (1st ed., Vol. 541), 2014 (Oreochromis sp.) in Taiwan,” Journal of fish diseases, vol. 42,
[3] Lee, M. K., Kim, J. K., & Lee, S. Y. Effects of fermentation on pp. 643-655, 2019.
SDS-PAGE patterns, total peptide, isoflavone contents and [15] Upcroft, P., & Upcroft, J. A. “Comparison of properties
antioxidant activity of freeze-thawed tofu fermented with of agarose for electrophoresis of DNA,” Journal of
Bacillus subtilis. Food Chemistry, 249(July 2017), 60–65, 2018 Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications,
[4] Muharram, M. M., & Abdel-Kader, M. S. Utilization of gel vol. 618 no. (1-2), pp. 79-93, 1993.
electrophoreses for the quantitative estimation of digestive
enzyme papain. Saudi Pharmaceutical Journal, 25(3), 359–
364, 2017
[5] Rabilloud, T., & Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis
in proteomics: A tutorial. Journal of Proteomics, 74(10),
1829–1841, 2011
[6] Righetti, P. G. ELECTROPHORESIS | Polyacrylamide Gels. In
Encyclopedia of Analytical Science (3rd ed.), 2005a
[7] Righetti, P. G. ELECTROPHORESIS | Two-Dimensional Gels. In
Encyclopedia of Analytical Science (3rd ed.), 2005b
[8] Stellwagen, N. C. Electrophoresis of DNA in agarose gels,
polyacrylamide gels and in free solution. Electrophoresis,
30(SUPPL. 1), 188–195, 2009
[9] Strathdee, F., & Free, A. (n.d.). Chapter 9 Denaturing Gradient
Gel Electrophoresis ( DGGE ). 1054, 145–157, 2013
[10] Subasinghe, R. M., Samarajeewa, A. D., Scroggins, R., &
Beaudette, L. A. Evaluation of denaturing gradient gel
electrophoresis ( DGGE ) and next generation sequencing (
REV INST NAL ENF RESP MEX
VOLUMEN 17 - NÚMERO 1
REVISIÓN ENERO-MARZO 2004
PÁGINAS: 42-55
Citometría de flujo:
vínculo entre la investigación básica
y la aplicación clínica
LOURDES MARÍA BARRERA RAMÍREZ*
MA. ELISA DRAGO SERRANO‡
JULIA PÉREZ RAMOS‡
ANA CECILIA ZAMORA§,II
FABIOLA GÓMEZ ARROYO¶
TERESITA DEL ROSARIO SAINZ ESPUÑES‡
FELIPE MENDOZA PÉREZ*,‡
* Departamento de Biología Molecular. INER.
‡
Sistemas Biológicos. Universidad Autónoma Metropolitana.
Unidad Xochimilco.
§
Hospital Universitario “Dr. José E. González”. Monterrey, Nuevo
León.
II
Servicio Clínico 1, INER.
¶
Departamento de Microbiología e Inmunología. Facultad de
Veterinaria, UNAM.
Trabajo recibido: 17-II-2004; Aceptado: 26-III-2004
42
RESUMEN ABSTRACT
La citometría de flujo es un método analítico que Flow cytometry is an analytical method that allows
permite la medición rápida de ciertas características the rapid measurement of certain physical and chem-
Palabras clave: Ci-
físicas y químicas de células o partículas ical characteristics of cells or particles suspended in
tometría de flujo, suspendidas en líquido que producen una liquid and produce signals when they pass individu-
inmunofenotipifica-
ción, lavado bron-
señal de forma individual al interferir con ally through a beam of light. An important analytical
quioalveolar, en- una fuente de luz. Una de las característi- feature of flow cytometers is their ability to measure
fermedades pulmo-
nares, VIH.
cas analíticas más importantes de los citó- multiple cellular parameters such as cell size, shape
Key words: Flow metros de flujo es su capacidad de medir and internal complexity and, of course any cell com-
cytometry, immuno-
phenotyping, bron-
múltiples parámetros celulares, como el ta- ponent or function that can be detected by a fluores-
choalveolar lavage, maño, forma y complejidad y, por supues- cent dye. The most prominent uses of flow cytome-
lung diseases, HIV.
to, cualquier componente celular o función try in medical practice are in the related fields of
que pueda ser marcada con un fluorocromo. Las apli- laboratory hematology and clinical immunology, for
caciones más relevantes de la citometría de flujo en a variety of tasks involving blood cell counting and
la práctica médica se relacionan con la hematología classification. This technique is also used for counting
e inmunología clínicas, midiendo parámetros como lymphocyte subpopulations in patients with HIV,
número y clasificación de células sanguíneas. Esta téc- characterization of acute leukemias and chronic lym-
nica es empleada también en el conteo de subpobla- phomas between other diseases. Over the last 20
ciones de linfocitos en pacientes con el virus de la in- years, analysis of immunologica lung diseases by flow
munodeficiencia humana, así como la caracterización
de leucemias agudas y síndromes linfoproliferativos
edigraphic.com
cytometry has played a major role in the understand-
ing and as tool of diagnosis, such as sarcoidosis, eosi-
crónicos, entre otros padecimientos. En los últimos 20 nophilic pneumonia or hypersensitivity pneumonitis.
años, el análisis de enfermedades pulmonares de ori- So the applications of flow cytometry are numerous,
gen inmunológico por citometría de flujo ha jugado and this has lead to the widespread use of this instru-
un papel importante en el entendimiento y diagnós- ments in biological research and medical fields. Over-
REVISTA INSTITUTO NACIONAL DE ENFERMEDADES RESPIRATORIAS MG Enero-Marzo 2004 Segunda Época, Vol. 17 N o 1
www.iner.gob.mx
tico de enfermedades como sarcoidosis, neumonía all this review shows a brief overview of basic prin-
eosinofílica o neumonitis por hipersensibilidad. Las ciples of and shows this as a reproducible tool appli-
aplicaciones de la citometría de flujo son numerosas, cable to a wide range of medical approaches as well
lo cual ha permitido el empleo de estos instrumentos as its use in lung diseases field.
de manera amplia en los campos, tanto de la inves-
tigación biológica como médica. Esta revisión brinda
un panorama general de los principios básicos de la
citometría de flujo y la muestra como una herramien-
ta reproducible y aplicable a una gran variedad de
campos médicos, así como su empleo en el campo de
las enfermedades pulmonares.
INTRODUCCIÓN ¿QUÉ ES LA CITOMETRÍA DE FLUJO?
En los últimos años, el diagnóstico clínico ha ex- La citometría de flujo representa un método rá-
perimentado profundas modificaciones debidas, pido objetivo y cuantitativo de análisis de célu-
en gran medida, a los avances producidos por los las, núcleos, cromosomas, mitocondrias u otras
nuevos métodos cuantitativos de análisis celular. partículas en suspensión.
De entre ellos destaca la citometría de flujo, que El principio en el que se basa esta tecnología
ha alcanzado gran relevancia, además de la que es simple: hacer pasar células u otras partículas
ya tenía en la investigación básica. en suspensión alineadas y de una en una por
La citometría constituye un complemento valio- delante de un haz luminoso. La información pro-
so de las técnicas clásicas utilizadas para el estudio ducida puede agruparse en dos tipos fundamen-
de la morfología, biología y bioquímica celular. tales: la generada por la dispersión de la luz y la
Aunque, desde el punto de vista cronológico, la relacionada con la emisión de luz por los fluoro- 43
citometría de flujo es una tecnología relativamen- cromos presentes en la célula o partícula al ser
te reciente, sus características especiales como téc- excitados por el rayo luminoso. Las señales lumi-
nica de análisis celular han hecho que en la última nosas detectadas se transforman en impulsos
década su uso se haya extendido de forma rápida, eléctricos que se amplifican y se convierten en
desde los laboratorios de investigación básica hasta señales digitales que son procesadas por una
los laboratorios clínicos1. computadora (Figura 1)4.
La citometría de flujo ha encontrado amplia
utilidad en ciencias como la inmunología, he- CONCEPTOS SOBRE
matología, oncología, anatomía patológica y INMUNOFLUORESCENCIA
biología celular2. La conjugación de marcado-
res fluorescentes con anticuerpos monoclona- El término inmunofluorescencia se usa para
les o policlonales ha hecho posible los estudios describir las técnicas en que se emplea un fluo-
de la densidad y la distribución de determinan- rocromo para marcar un anticuerpo. Ya en
tes y receptores de la superficie y del citoplas- 1941, Coons5 informó de la aplicación de esta
ma celular, permitiendo identificar subpoblacio- técnica para localizar antígenos y anticuerpos
nes celulares3. en secciones de tejido. El descubrimiento de los
Por otra parte, en comparación con los mé- anticuerpos monoclonales por Kohler y Milstein
todos bioquímicos de análisis celular, en los que en 19756, incrementó dramáticamente el uso
se obtiene un resultado promedio para toda la de la inmunofluorescencia para la identificación
muestra, la citometría de flujo es capaz de pro-
porcionar una información cuantitativa sobre
edigraphic.com
de antígenos de superficie celular.
La fluorescencia ha sido usada para visualizar
cada célula en particular y permite identificar en ciertas moléculas y estructuras por medio de la
una muestra subpoblaciones de células diferen- microscopia óptica durante muchos años. Esta ha
tes, incluso cuando están escasamente repre- encontrado una extensa área de aplicación en la
sentadas. citometría de flujo. La capacidad para detectar
www.iner.gob.mx
simultáneamente la fluorescencia de dos, tres, determinar la proporción o el número de células
cuatro o actualmente hasta 13 fluorocromos de que poseen un determinado marcador, por ejem-
diferentes longitudes de onda, abre completa- plo, del marcador CD4 para monitorear el progreso
mente el campo del análisis multiparamétrico. de la enfermedad por el virus de la inmunodefi-
Cuando una molécula absorbe luz, y por tanto ciencia humana (VIH)8, entre muchas otras aplica-
energía, algunos de sus electrones pueden alcan- ciones clínicas.
zar una órbita de mayor energía. Se dice enton-
ces que la molécula ha alcanzado un estado de PARÁMETROS QUE SE PUEDEN
excitación, y puede volver a su estado basal ANALIZAR POR CITOMETRÍA DE FLUJO
cuando estos electrones vuelven a su órbita de
menor energía. En algunos compuestos el elec- La citometría de flujo permite medir diferentes
trón excitado cae rápidamente, usualmente en parámetros de una célula. Éstos se dividen en (Fi-
nanosegundos, al estado basal, emitiendo un gura 2):
cuanto de luz o fotón y desprendiendo energía. • Parámetros nucleares
Esta transición radiante se denomina fluorescen- • Parámetros citoplásmicos
cia7. A este tipo de compuestos se les denomi- • Parámetros de superficie
na fluorescentes o fluorocromos. • Parámetros extracelulares
El objetivo del análisis por inmunofluorescencia
en citometría de flujo es asignar a cada célula a un En la Tabla I se resumen los parámetros que
grupo específico de células que compartan propie- pueden ser medidos por medio de esta técni-
dades comunes. El primer paso es identificar las ca. Un aspecto importante y que representa
células de interés. Por ejemplo, para el análisis de una ventaja de ella, es la posibilidad de medir
subpoblaciones linfocitarias se requiere seleccionar tantos parámetros como anticuerpos se dis-
un área de trabajo distinguiendo los leucocitos por pongan para ello, marcados con distintos fluo-
44
sus propiedades de dispersión de luz (tamaño con- rocromos. Así, es posible caracterizar una cé-
tra complejidad celular). Una vez que las células de lula por su fenotipo de superficie (Figura 3) y,
interés han sido distinguidas de los otros tipos ce- al mismo tiempo, conocer el estado intracelu-
lulares, se puede usar la inmunofluorescencia para lar que guarda la célula como su patrón de
edigraphic.com
Figura 1. Principio
general de la cito-
metría de flujo.
www.iner.gob.mx
secreción de citocinas, o bien, la etapa del ci- diagnóstico, clasificación, evaluación pronóstica
clo celular en la que se encuentra. y valoración de enfermedad mínima residual. La
citometría de flujo permite el análisis de un gran
APLICACIONES CLÍNICAS DE LA número de células (habitualmente entre 10,000
CITOMETRÍA DE FLUJO células por muestra y, más de un millón en los
estudios de enfermedad mínima residual). La
Inmunofenotipificación aplicación de la citometría de flujo al análisis
celular permite conocer aspectos físicos de la
La citometría de flujo es una técnica que permite célula (tamaño y complejidad) y determinar la
un análisis celular multiparamétrico de forma presencia o ausencia de determinados antígenos
rápida, sensible y específica. La disponibilidad de (habitualmente entre 3 y 4) en los diferentes
amplios paneles de reactivos de gran calidad fa- compartimentos celulares (superficie celular,
cilita la aplicación de este método analítico en el citoplasma, mitocondria y núcleo) lo que contri-
Tabla I. Parámetros que se pueden analizar por citometría de flujo.

Parámetros Parámetros basados -Contenido de ADN -Ploidía de ADN
nucleares en ADN -Contenido de pares GC/AT -Ciclo celular
-Superenrollamiento de ADN -Apoptosis-necrosis
-Estructura de la cromatina -Cariotipo en flujo
-Roturas de hebras de ADN
ADN + otros parámetros -ADN/ARN -Regulación ciclo celular

-ADN/proteínas totales -Ciclo celular de
-ADN/antígenos nucleares poblaciones específicas
-ADN/antígenos celulares
45
Parámetros no basados -Receptores nucleares
en ADN -Expresión de genes
indicadores (“reporteros”)
-Morfología nuclear
-Componentes nucleares
Parámetros de Estructuras de la -Receptores de superficie

superficie superficie celular -Sitios de unión a lectinas
-Densidad de superficie
-Pared celular
Dinámica de la -Unión de ligandos

superficie celular -Transporte/internalización
de ligandos
-Eflujo de solutos
-Exposición de receptores
-Potencial de membrana
Parámetros Componentes -Proteínas totales

citoplasmáticos intracelulares -Proteínas estructurales
-Proteínas funcionales
-Glicoproteínas intracelulares
-Lípidos intracelulares
-Tioles libres
Funciones intracelulares -Actividad enzimática

-Síntesis de proteínas
Entorno intracelular
edigraphic.com
-Potenciales de membrana
-Concentración de iones
-Movimiento de iones
-Lípidos y proteínas oxidados
Parámetros Dinámica de la -Captura de proteínas secretadas -Activación celular

extracelulares secreción celular -Ensayos de cuantificación en suero -Diferenciación celular
www.iner.gob.mx
Figura 2. Parámetros medi-
bles por citometría de flujo
46
Figura 3. Procedimiento regular de marcaje o tinción fenotípica para células humanas.
buye a aumentar, tanto la especificidad como la seguimiento de la recuperación inmune tras el

sensibilidad de la prueba. En otras áreas como en trasplante de médula ósea12, en la identificación
el diagnóstico y clasificación de las inmunodefi-
ciencias primarias, en el monitoreo de enferme-
edigraphic.com
precoz del rechazo en pacientes que han recibi-
do un trasplante alogénico13, o en el monitoreo
dades autoinmunes como la esclerosis múltiple9, terapéutico de los enfermos con anemia aplási-
el lupus eritematoso sistémico10 y la artritis reu- ca14. En la Tabla II se condensan algunas de las
matoide11, la citometría de flujo ha demostrado aplicaciones clínicas más importantes y con ma-
su utilidad. También se ha demostrado útil en el yor empleo en la actualidad.
www.iner.gob.mx
Tabla II. Aplicaciones clínicas generales de la citometría de flujo.
Aplicaciones generales Aplicaciones por área Parámetros sujetos de análisis
Diagnóstico basado Caracterización de Parámetros estructurales

en el análisis celular células normales Tamaño
Complejidad
Antígenos de superficie
Identidad
Linaje
Función
Activación
ADN, ARN y parámetros relacionados
Ploidía
Estado proliferativo
Estadio de maduración
Expresión génica
Bioquímica intracelular
Condiciones basales
Respuesta bioquímica a estímulos controlados
Identificación y Alteraciones en la morfología celular

detección de células Cambios en tamaño
anormales Cambios en granularidad
Alteraciones en el inmunofenotipo
Inmunoproliferación/inmunodeficiencia
Alteraciones en el genotipo
Cambios en el contenido de ADN (ploidía)
Cambios en la expresión de genes
Alteraciones en la bioquímica intracelular
Cambios en la síntesis y concentración de moléculas 47
Cambios en la actividad de enzimas y en el flujo a
través de rutas
Alteraciones en el número y la función de orgánulos
subcelulares
Cambios en la respuesta bioquímica a estímulos
controlados
Detección de células de baja frecuencia
Detección de células tumorales circulantes
Detección de células fetales en sangre materna
Detección de células activadas o antígeno-específicas
circulantes
Aplicaciones Correlación de Estudios retrospectivos con material de archivo

pronósticas parámetros citométricos Estudios prospectivos
con otros parámetros
clínicos bien establecidos
Parámetros implicados Análisis de muestras específicas de la patología

directamente en el Análisis de parámetros específicos de la patología
proceso patológico
Parámetros implicados Análisis de muestras indicadoras

indirectamente en el Análisis de parámetros indicadores de la patología
proceso patológico Análisis de parámetros predictivos de riesgo
Evaluación y
monitorización del
Selección de células en
la terapia celular
edigraphic.com
Análisis de progenitores en el trasplante autólogo
Pruebas cruzadas de trasplantes heterólogos
tratamiento Detección y cuantificación de leucocitos residuales
en hemopreparados
Análisis de la acción Cambios en parámetros estructurales

terapéutica a nivel celular Cambios en parámetros funcionales
www.iner.gob.mx
Análisis de la acción Detección de recidivas y enfermedad mínima residual
terapéutica a nivel de Establecimiento de patrones pronósticos de éxito
paciente terapéutico
Detección y análisis Análisis de la capacitación y retención de fármacos

de resistencia a la terapia Análisis del metabolismo de fármacos
Análisis de la lesión Detección de células de Cambios en parámetros estructurales

y muerte celular lesión celular subletal Cambios en parámetros funcionales
Cuantificación de la Determinación de efectos citotóxicos globales

viabilidad celular Control de calidad de las preparaciones celulares
Caracterización de los Identificación y análisis de células apoptóticas

mecanismos de muerte Identificación de células necróticas
celular
Aplicaciones en Análisis de antígenos Inmunofenotipo de superficie

inmunohematología Detección de antígenos intracelulares
Detección de antígenos circulantes
Análisis de anticuerpos Detección de anticuerpos circulantes

Detección de anticuerpos unidos a células
Análisis de función celular Análisis de proliferación celular

Análisis de bioquímica intracelular
Análisis del índice de muerte celular
48
APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE CITOMETRÍA DE FLUJO Y LA
FLUJO A LA INVESTIGACIÓN BÁSICA INVESTIGACIÓN EN ENFERMEDADES
PULMONARES
Son innumerables las aplicaciones de la citometría
de flujo a la investigación básica, desde campos En los últimos 20 años, la citometría de flujo ha
como la microbiología, hematología, inmunolo- jugado un papel primordial en el avance del en-
gía, citología, patología, biología celular y mole- tendimiento y habilidad para diagnosticar una
cular, entre otros. Sin embargo, es posible inten- variedad de desórdenes linfoproliferativos18. Una
tar clasificar dichas aplicaciones según el área de las aplicaciones nuevas más interesantes es en
específica en la que es posible utilizar la citome- la evaluación de pacientes con enfermedades
tría de flujo como herramienta de investigación inmunológicas del pulmón19. Una muestra típi-
(Tabla III). La citometría de flujo ha sido utilizada ca es aquella que es recolectada a partir de la-
en el monitoreo del contenido de ADN15, expre- vados bronquioalveolares (LBA), cuya utilidad
sión fenotípica, transporte de drogas, flujo de diagnóstica ha quedado ampliamente demostra-
calcio16, proliferación y apoptosis17. Virtualmente da20-25. Cuando el lavado es realizado en pulmo-
es posible marcar cualquier molécula que sea de nes normales, la célula presente más predomi-
interés siempre que se disponga de un anticuer- nante es el macrófago, el cual está en un
po acoplado a un fluorocromo que pueda ser de- porcentaje de aproximadamente 90% o más de
tectado por el citómetro de flujo, esto hace posi- celularidad. Los linfocitos usualmente represen-
ble que las aplicaciones del citómetro de flujo se tan menos del 10% de la población celular, los
adapten prácticamente a cualquier necesidad de
investigación. Actualmente, la relación entre la
edigraphic.com
granulocitos representan la población celular
minoritaria con el 1-2%26. En fumadores, el por-
aplicación básica y clínica es cada vez más estre- centaje de linfocitos es aún menor27. En muchos
cha dando la oportunidad a su vez a la aplicación pacientes con enfermedades pulmonares inmu-
diagnóstica, pronóstica y de tratamiento en múl- nológicas, el LBA puede estar acompañado por
tiples enfermedades. un incremento en linfocitos o eosinófilos. Cuan-
www.iner.gob.mx
Tabla III. Aplicaciones generales de la citometría de flujo a la investigación básica.
Aplicación general Parámetros sujetos de análisis Información que proporciona
Inmunofenotipificación Identificación de subpoblaciones Linaje celular

de superficie celulares mediante anticuerpos Estadio de maduración hematopoyética
monoclonales Implicación en la respuesta inmune
Grado de activación celular
Identificación de subpoblaciones Diagnóstico y clasificación de

celulares en la hematopoyesis enfermedades hematológicas
Leucemias agudas y crónicas
Linfomas
Inmunodeficiencias
Hemoglobinuria paroxística nocturna
Detección de enfermedad mínima resi-
dual
Enumeración de precursores
hematopoyéticos CD34+
Diagnóstico de enfermedades
congénitas plaquetarias
Tromboastenia de Glanzmann
Síndrome de Bernard-Soulier
Antígenos Detección de proteínas intracelulares Producción de citocinas intracelulares

intracelulares con anticuerpos fluorescentes
Fenotipo intracelular de leucemias y Detección de células tumorales

linfomas circulantes
49
Expresión de reguladores del ciclo Cadenas ligeras de Ig intracelulares: κ y λ
celular: ciclina D1 Antígenos de superficie que todavía no se
expresan en superficie: CD3, CD22
Enzimas intracelulares
Expresión de proteínas
antiapoptóticas: BCl-2, Rb
Expresión de proteínas supresoras

de tumores: p53
Análisis de citocinas intracelulares Fenotipo Th0, Th1 y Th2
Antígenos circulantes Detección de autoanticuerpos Anticuerpos antiplaquetarios

circulantes Anticuerpos antineutrófilos
Detección de aloanticuerpos Pruebas cruzadas pretrasplantes

circulantes Uso de esferas recubiertas con HLA
específicos
Detección de anticuerpos unidos

a células de la sangre
Inmunoproliferación
edigraphic.com
Análisis monoparamétrico del ciclo celular Contenido de ADN
Análisis multiparamétrico del ciclo celular Fenotipo de superficie y contenido
Análisis de la historia de división celular de ADN
Contenido de ADN y antígenos
relacionados con el ciclo
Trazadores celulares y fenotipo de
superficie
www.iner.gob.mx
Bioquímica intracelular Funciones bioquímicas de la Síntesis y secreción de citocinas
inmunidad específica Expresión de moléculas de adhesión
Movimientos iónicos tras la activación
celular
Funciones bioquímicas de la Fagocitosis y destrucción de

inmunidad innata microorganismos
Generación intracelular de especies
reactivas de oxígeno
Actividad proteolítica intracelular
Respuestas quimiotácticas
Expresión de moléculas de adhesión
Explosión oxidativa
Funciones bioquímicas de las Activación y agregación plaquetarias

plaquetas
Muerte celular en Análisis de células efectoras citolíticas Identificación fenotípica de subpoblaciones

el sistema inmune CD8 y NK
Análisis de la citotoxicidad mediada

por células Interacción entre células blanco
y efectoras
Análisis de la citotoxicidad
dependiente de anticuerpos
Monitorización de la terapia con
50 Análisis del proceso y mecanismo anticuerpos monoclonales
de muerte celular
Identificación y cuantificación de
células apoptóticas
Identificación y cuantificación de
células necróticas
Análisis de parámetros celulares durante
la apoptosis
Análisis funcional Análisis cinético in situ Detección de efectos tempranos o

transitorios
Análisis secuencial Evaluación de procesos dinámicos
do las células que están incrementadas son los poblaciones celulares, requiriéndose sólo una
linfocitos, resulta importante saber qué subpo- pequeña cantidad de muestra (250,000 células
blación se encuentra elevada. La citometría de en 50µL) a partir de un LBA.
flujo es ideal para esta evaluación. La proporción Por ejemplo, un incremento en el número de
relativa de linfocitos, macrófagos y granulocitos células inflamatorias en un LBA sugiere una al-
se determina fácilmente a partir de gráficas de veolitis28. El tipo de células en el lavado puede
tamaño (Forward scatter FSC) contra compleji- correlacionar con el tipo de inflamación visto en
dad celular (Side scatter SSC). Los estudios de las paredes alveolares de la biopsia. Aunque
fluorescencia empleando diferentes fluorocro-
mos permiten determinar fácilmente la compo-
edigraphic.com
esas correlaciones no son diagnósticas, pueden
ayudar en el diagnóstico cuando son combina-
sición de subconjuntos de linfocitos (CD4+ y das con otros datos.
CD8+). De esta manera, es posible ensayar has- En otro ejemplo, un número elevado de eosi-
ta siete colores, con citómetros modernos, que nófilos sugiere una neumonía eosinofílica 29,
representan siete marcadores diferentes sobre asma30,31, toxicidad por drogas o aspergiliosis
www.iner.gob.mx
broncopulmonar alérgica. Los números más al- sarcoidosis32 y otras enfermedades que producen
tos de cuentas de eosinófilos son vistas en una granulomas, entre las que se encuentran la tu-
neumonía eosinofílica. Esos pacientes tienen tí- berculosis33, asbestosis34 y artritis reumatoide35.
picamente también un incremento moderado de En general, una enfermedad pulmonar activa
linfocitos con células plasmáticas ocasionales. El está asociada con una relación CD4/CD8 eleva-
cuadro típico del lavado insertado en el contex- da. Aproximadamente un 90% de los pacientes
to clínico adecuado es altamente sugerente de con sarcoidosis tienen una alveolitis linfocitaria.
neumonía eosinofílica y podría evitar que al pa- En el caso de la sarcoidosis, aproximadamente el
ciente se le practicara una biopsia a cielo abier- 60% de los pacientes tienen una relación CD4/
to. La linfocitosis en un LBA se puede asociar con CD8 mayor de 3.5. Para relaciones CD4/CD8
varias enfermedades pulmonares inflamatorias. mayores de 5 y cercanas a 10 la especificidad de
La distribución relativa de subpoblaciones de un diagnóstico de sarcoidosis es mayor36. Es ca-
células T puede suministrar información adicio- racterístico de la alveolitis alérgica extrínseca un
nal útil. Un número elevado de linfocitos T CD4+ incremento importante en la proporción de lin-
da como resultado que la relación CD4/CD8 sea focitos, siendo ésta de al menos el 50% del to-
mayor que uno, y esto es visto en pacientes con tal de las células presentes en el LBA37,38. En al-
51
edigraphic.com
Figura 4. Estudio de conteo total de linfocitos T CD4/CD8 en un paciente con VIH en estado temprano de la
infección (A) con una cuenta de linfocitos T CD4+ de 17% y en estado tardío, (B) con una cuenta de linfocitos
T CD4+ de 3%. Estudio de rutina realizado en el laboratorio de VIH del INER.
www.iner.gob.mx
gunos casos los neutrófilos y eosinófilos pueden consecuencia determinan los distintos estados de
verse incrementados. Dicha linfocitosis es predo- dichas enfermedades pulmonares.
minantemente CD8 (+) dando como resultado
una disminución de la relación CD4/CD839. Los CITOMETRÍA DE FLUJO Y VIH
trabajos publicados al respecto son contradicto-
rios40-43 y en nuestro laboratorio hemos observa- El monitoreo de subpoblaciones linfocitarias en
do que pacientes alveolíticos a diferentes etapas el síndrome de inmunodeficiencia adquirida
de la enfermedad (subagudos y crónicos), mues- (SIDA), fundamentalmente la cuantificación en
tran diferentes relaciones de CD4/CD8 (datos no sangre periférica de las células CD4+ y los lin-
publicados). Las células NK pueden también es- focitos CD8+ aporta un valor diagnóstico y pro-
tar presentes y se observa asimismo evidencia nóstico en esta patología57. En la actualidad, re-
clara de activación de células T por medio de presenta una técnica de rutina en muchos
marcadores como CD69 y HLA-DR44-46. En este laboratorios, ante la necesidad de establecer
mismo sentido, cabe aclarar:rop que odarobale
la evaluaciónFDP
de sustraídode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.c
controles periódicos del número de células
las muestras de LBA de los diferentes tipos de CD4+ en estos pacientes58. El antígeno CD4 es
cihpargidemedodabor
alveolitis noVC ed AS,
permite cidemihparG
distinguir entre los diferen- el receptor para el VIH. Cuando éste infecta hu-
tes cuadros clínicos, pero puede ayudar a excluir manos, las células que con más frecuencia infec-
otros. Las aplicaciones en el áreaarap de las enferme- ta son las CD4+, que se multiplican para com-
dades pulmonares de origen inmunológico se batir infecciones y producir más copias del VIH.
acidémoiB
extienden arutaretiL
aún más, :cihpargi-con el auxi-
se ha estudiado El número absoluto de linfocitos T CD4+ es el
lio de la citometría de flujo el papeldeMque juegan parámetro celular asociado más estrechamente
sustraídode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.c
ciertas citocinas en enfermedades como neumo- a la progresión de la enfermedad causada por el
nitis por hipersensibilidad47. O la expresión de VIH y al pronóstico del paciente59. La relación
ciertos receptores de quimiocinas y sus ligandos entre los linfocitos T CD4+ y CD8+ (CD4/
52
asociados con algunos padecimientos como re- CD8), se conoce como la relación cooperador/
chazo a trasplantes pulmonares48, asma49, alveo- supresor. En personas sanas esta relación se en-
litis50 o sarcoidosis51, así como la incidencia y fun- cuentra entre 0.9 y 1.9, lo que significa que hay
ción de las células NK 52,53 en estas mismas una a dos células CD4 por cada célula CD860. A
enfermedades intersticiales. Asimismo, la preva- partir de 1992, en los países desarrollados, se ha
lencia de las subpoblaciones de linfocitos T ga- establecido una serie de lineamientos para la
mma-delta ha mostrado ser importante para al- realización correcta del conteo de células CD4/
gunas enfermedades como la sarcoidosis 54 , CD8. Se propone el uso de citometría de flujo y
neumonitis por hipersensibilidad55 o fibrosis pul- un panel de 12 anticuerpos monoclonales com-
monar idiopática56. binados: CD45/CD14 (para enmarcar una ven-
Actualmente, están en proceso protocolos de tana); CD3/CD4 (para medir linfocitos T coope-
investigación en el Instituto Nacional de Enfer- radores); CD3/CD8 (para medir linfocitos T
medades Respiratorias (INER) que contemplan la supresores); CD3/CD19 (para separar la pobla-
determinación de un amplio perfil fenotípico que ción de linfocitos T y B); CD3/CD56 (para sepa-
proporciona información fundamental sobre el rar las células NK); y, el control de anticuerpos
estado celular de la neumonitis por hipersensi- de isotipo. Asimismo, en México se han publica-
bilidad inducida por antígeno aviario, la de ma- do trabajos donde se sugiere la conveniencia de
yor incidencia en México, en sus diversas etapas utilizar un panel semejante para el conteo de
clínicas, así como en la fibrosis pulmonar idiopá- células CD4+, considerando un mínimo de seis
tica. Mediante esta técnica hemos realizado tam- anticuerpos61. En el INER, el SIDA es la principal
bién mediciones de carácter funcional sobre la
actividad celular, como detección intracelular y
edigraphic.com
causa de mortalidad hospitalaria en personas de
18 a 45 años de edad y ocupa, desde hace va-
secreción de citocinas (datos no publicados). La rios años, una de las cinco primeras causas de
caracterización de estas enfermedades intersti- mortalidad general de los pacientes hospitaliza-
ciales en México, permitirá visualizar los meca- dos. Desde hace cinco años la citometría de flujo
nismos inmunes que se establecen y que como se utiliza en el INER para realizar el conteo de
www.iner.gob.mx
linfocitos T, tanto en los pacientes internados en REFERENCIAS
el hospital como a los que se presta este servi-
1. Orfao A, Ciudad J, López A, López-Berges MC, Vi-
cio de manera extrahospitalaria como segui- driales B, Macedo A, et al. La citometría de flujo en
miento de la enfermedad (Figura 4). Se atienden el diagnóstico clínico. Servicio General de Citometría.
un promedio de 300 pacientes mensuales, lo Universidad de Salamanca, 1993.
2. Orfao A, González M, Ciudad J, López-Berges MC,
cual muestra la importancia clínica, tanto diag-
López A, San Miguel JF, et al. Aplicaciones de la ci-
nóstica como pronóstica que la citometría de flu- tometría de flujo en el diagnóstico hematológico. Biol
jo tiene en este renglón dentro del INER. Clin Hematol 1992;13:456-523.
3. Goding JS. Conjugation of Antinodies with Fluoro-
LA CITOMETRÍA DE FLUJO A LA chromes Modifications to the Standard Methods. J Im-
VANGUARDIA EN EL INER: FACSAria munol Meths 1976;13:215-223.
4. Shapiro HM. Practical Flow Cytometry. 4th ed. New
Jersey: Wiley-Liss, Hoboken, 2003.
Actualmente se cuenta ya con el citómetro de 5. Coons AH, Creech HJ, Jones RN. Immunological
flujo que ha revolucionado la era moderna de Properties of an Antibody Containing a Fluorescent
la citometría, el FACSAria de Beckton Dickin- Group. Proc Soc Exptl Biol Med 1941;47:200-204.
son. Gracias a la fundación Gonzalo Río Arron- 6. Kohler G, Milstein C. Continuous Cultures of Fused
Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity. Na-
te, IAP, el INER adquirió el primer FACSAria ture 1975;356:495.
que llega a nuestro país y, el primero también 7. Longobardi GA. Flow Cytometry . First Principles.
en América Latina y que se pone al servicio del New Cork: Willey-Liss, 1992.
Instituto en el área de investigación básica. Se 8. Barry SM, Anossy G. Optimal Gating Strategies for
Determining Bronchoalveolar Lavage CD4/CD8 Lym-
trata de un separador celular de alta velocidad phocyte Ratios by Flow Cytometry. J Immunol Me-
y desempeño, capaz de medir hasta 11 pará- thods 2004;285:15-23.
metros de manera simultánea. Este instrumen- 9. Matsui M, Araya SI, Wang HY, Matsushima K, Saida
to cuenta con alineación automática de láser T. Immunomonitoring Measures in Relapsing-remitting
Multiple Sclerosis. J Neuroimmunol 2004;148:192-199.
y una nueva plataforma de análisis en sistema 10. Dai SM, Matsuno H, Nakamura H, Nishioka K, Yu- 53
Windows . Cuenta con un sistema de limpieza doh K. Interleukin-18 Enhances Monocyte Tumor Ne-
automático entre muestras, así como limpieza crosis Factor Alpha and Interleukin-1Beta Production
general del instrumento. Gracias a su sistema Induced by Direct Contact with T Lymphocytes: Impli-
cations in Rheumatoid Arthritis . Arthritis Rheum
totalmente digital es capaz de adquirir 70,000 2004;50:432-443.
eventos (células o partículas) por segundo y es 11. Liu MF, Wang CR, Fung LL, Wu CR. Decreased
posible separar 25,000 células con una pure- CD4+CD25+ T Cells in Peripheral Blood of Patients
za al menos del 98%. with Systemic Lupus Erythematosus. Scand J Immunol
2004;59:198-202.
Las aplicaciones en investigación básica del 12. Kalwak K, Turkiewicz D, Ussowicz M, Gorczynska
FACSAria son innumerables, van desde la ca- E, Toporski J, Ryczan R, et al. Clinical Value of the
racterización fenotípica de siete colores, has- Flow Cytometric Method for Measuring Lymphocyte
ta análisis de parámetros intracelulares, análi- Subset Activation: Spontaneous Activation of T-cell
Subpopulations is Associated with Acute GvHD .
sis de cromosomas, organelos celulares, Transplant Proc 2003;35:1559-1562.
apoptosis, estudios funcionales, así como se- 13. Cotteret S, Belloc F, Boiron JM, Bilhou-Nabera C,
paración celular altamente específica con fines Dumain P, Boyer C, et al. Fluorescent in situ Hybri-
dization on Flow-sorted Cells as a Tool for Evaluating
de clonación. Así, el INER se encuentra ya a la Minimal Residual Disease or Chimerism after Alloge-
vanguardia en citometría de flujo a nivel mun- nic bone Marrow Transplantation . Cytometry
dial y con la capacidad científica para desarro- 1998;34:216-222.
llar investigación básica en enfermedades pul- 14. Ruiz-Arguelles GJ, Ramirez Cisneros FJ, Ruiz-Ar-
guelles A, Perez-Romano B, Morales-Aceves R.
monares con calidad internacional Glycosilphosphatidylinositol-anchored Cell Surface
Agradecimientos edigraphic.com Protein Deficiency in Mexican Mestizo Patients with
Aplastic Anemia. Rev Invest Clin 1999;51:5-9.
15. Asbury CL, Esposito R, Farmer C, van den Engh G.
A la química Edna Hannia Rodríguez Aguirre por Fluorescente Spectra of DNA Dyes Measured in a
facilitarnos la imagen característica de un paciente Flow Cytometry. Cytometry 1996;24:234-242.
con VIH en estado avanzado y tardío tratado en 16. Krishan A. Rapad Flow Cytofluorometric Analysis of
Mammalian Cell Cycle by Ropidium Lodide Staining .
el INER. J Cell Biol 1975;66:188-194.
www.iner.gob.mx
17. McCloskey TW, Oyaizu N, Coronesi M, Pahwa S. 34. Sprince NL, Oliver LC, McLoud TC, Ginns LC. T-
Use of a Flow Cytometric Assay to Quantitate Apop- cell Alveolitis in Lung Lavage of Asbestos-exposed
tosis in Human Lymphocytes. Clin Immunol Immuno- Subjects. Am J Ind Med 1992;21:311-319.
pathol 1994;71:14-18. 35. Jones EA, English A, Henshaw K, Kinsey SE, Mar-
18. Orfao AC, González JM, San Miguel JF, López-Ber- kham AF, Emery P, et al. Enumeration and Pheno-
ges MC, García AR, Ramos F, et al. Prognostic Va- typic Characterization of Synovial Fluid Multipoten-
lue of S-phase WBC Count in B-cell Chronic Lympho- tial Mesenchymal Progenitor Cells in Inflammatory
citic Leukemia. Leukemia 1992;6:47-51. and Degenerative Arthritis . Arthritis Rheum
19. Rotaeche A, Costabel D. Bronchoalveolar Lavage in 2004;50:817-827.
Diagnostic Cytology. Compendium on Diagnostic Cyto- 36. Agostini C, Trentin L, Facco M, Sancetta R, Cerutti
logy. 8th ed. Chicago IL: Tutorials of Cytology, 1997. A, Tassirani C, et al. Role of IL-15, IL-2 and their Re-
20. Wallaert B. Value of Bronchoalveolar Lavage in the ceptors in the Development of T Cell Alveolitis in Pul-
Diagnosis and Management of Diffuse Interstitial Fo- monary Sarcoidosis. J Immunol 1996;157:910-918.
brosing Lung Diseases. Rev Prat 1991;41:1267-1270. 37. Cormier Y, Laviolette R. Persistent Bronchoalveolar
21. Walters EH, Ward C, Li X. Bronchoalveolar Lavage in Lymphocytosis in Asymptomatic Farmers . Am Rev
Asthma Research. Respirology 1996;1:233-245. Respir Dis 1986;133:843-847.
22. Gruchaa J, Górski P. Use of Bronchoalveolar Lavage 38. Semenzato G, Agostini C, Zambello R. Lung T Ce-
for Diagnosis of Respiratory Diseases . Med Pr lls in Hypersensitivity Pneumonitis: Phenotypic and
1995;46:173-178. Functional Analyses. J Immunol 1986;137:1164-1172.
23. Luisetti M, Meloni F, Ballabio P, Leo G. Role of 39. Hamagami S, Miyagawa T, Ochi T. A Reised Level
Bronchial and Bronchoalveolar Lavage in Chronic Obs- of Soluble CD8 in Bronchoalveolar Lavage Fluid in
tructive Lung Diseases . Monaldi Arch Chest Dis Summer-type Hypersensitivity Pneumonitis in Japan.
1993;48:54-57. Chest 1992;101:1044-1049.
24. Strauz J. Bronchoalveolar Lavage: Clinical Routine 40. Lynch DA, Newell JD, Logan PM. Can CT Distinguish
Examination or Research Method? Orv Hetil Hypersensitivity Pneumonitis from Idiopathic Pulmona-
1992;133:471-2,477-8. ry Fibrosis? Am J Roentgenol 1995;165:807-811.
25. Drent M, Costabel U. Bronchoalveolar Lavage in the 41. Murayama J, Yoshikawa Y, Ohtsuka M, Hase-
Diagnosis of Difusse Interstitial Lung Disease. Ned Ti- gawa S. Lung Fibrosis in Hypersensitivity Pneumo-
jdschr Geneeskd 1998;142:2661-2665. nitis: Association with CD4+ but not CD8+ Cell
26. Wahlström J, Berlin M, Sköld CM, Wigzell H, Eklund Dominant Alveolitis and Insidious Onset . Chest
54 A, Grunewald J. Phenotipic Analysis of Lymphocytes 1993;104:38-43.
and Monocytes/macrophages in Peripheral Blood and 42. Semenzato G, Trentin L, Zambello R, Agostini C,
Bronchoalveolar Lavage Fluid from Patients with Pul-
Corpiani A, Marcer G. Different Types of Citotoxic
monary Sarcoidosis. Thorax 1999;54:339-346.
Lymphocytes Recovered from the Lungs of Patients
27. Hoser G, Kawiak J, Domagala-Kulawik J, Kopinski P,
with Hypersensitivity Pneumonitis. Am Rev Respir Dis
Droszcz W. Flow Cytometric Evaluation of Lymphocy-
1988;137:70-74.
te Subpopulations in BALF of Healthy Smokers and
43. Keller RH, Swartz S, Schlueter D, Bar-Sela S, Frank
Nonsmokers. Folia Histochem Cytobiol 1999;37:25-30.
28. Wahlstrom J, Berlin M, Lundgren R, Olerup O, J. Immunoregulation in Hypersensitivity Pneumonitis:
Wigzell H, Eklund A, et al. Lung and Blood T-cell Re- Phenotypic and Functional Studies of Bronchoalveo-
ceptor Repertoire in Extrinsic Allergic Alveolitis. Eur lar Lavage Lymphocytes . Am Rev Respir Dis
Respir J 1997;10:772-779. 1984;144:1744-1752.
29. Albera C, Ghio P, Solidoro P, Marbritto I, Marchetti 44. Selman M, Teran L, Mendoza A, Camarena A, Mar-
L, Pozzi E. Activated and Memory Alveolar T-lympho- tinez-Cordero E, Lezama M, et al. Increase of HLA-
cytes in Idiopathis Eosinophilic Pneumonia. Eur Res- DR7 in Pigeon Breeder’s Lung in a Mexican Popula-
pir J 1995;8:1281-1285. tion. Clin Immunol Immunopathol 1987;44:63-70.
30. Walker Ch, Kaegi MK, Braun P, Blaser K. Activated 45. Cordier G, Mornex JF, Brune J, Revillard JP. Flow
T Cells and Eosinophilia in Bronchoalveolar Lavages Cytometry Assessment of Local T Cell Activation in
from Subjects with Asthma Correlated with Disease Hypersensitivity Pneumonitis . Ann N Y Acad Sci
Severity. J Allergy Clin Immunol 1991;88:935-942. 1986;465:362-369.
31. Gratziou C, Carroll M, Montefort S, Teran L, 46. Mornex JF, Cordier G, Pages J, Vergnon JM, Lefe-
Howarth PH, Holgate ST. Inflammatory and T-cell bvre R, Brune J, et al. Activated Lung Lymphocytes
Profile of Asthmatic Airways 6 Hours after Local Aller- in Hypersensitivity Pneumonitis. J Allergy Clin Immu-
gen Provocation . Am J Respir Crit Care Med nol 1984;74:719-727.
1996;153:515-520. 47. Gudmundsson G, Monick M, Hunninghake GW. IL-
32. Mukae H, Kohno S, Morikawa T, Kusano A, Kadota 12 Modulates Expression of Hypersensitivity Pneumo-
J, Hara K. Two Color Analysis of Lymphocyte Subsets
of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Peripheral Blood
in Japanese Patients with Sarcoidosis . Chest
edigraphic.com nitis. J Immunol 1998;161:991-999.
48. Agostini C, Calabrese F, Rea F, Facco M, Tosoni A,
Loy M, et al. CXCR3 and its Ligand CXCL 10 are Ex-
1994;105:1474-1480. presen by Inflammatory Cells Infiltrating Lung Allo-
33. Yu CT, Wang CH, Huang TJ, Lin HC, Kuo HP. Re- grafts and Mediate Chemotaxis of T Cells at Sites of
lation of Bronchoalveolar Lavage T Lymphocyte Rejection. Am J Pathol 2001;158:1703-1711.
Subpopulations to Rate of Regression of Active Pul- 49. Campbell J, Brightling CE, Symon F, Quin A, Mur-
monary Tuberculosis. Thorax 1995;50:869-874. phy KE, Hodge M, et al. Expression of Chemokine
www.iner.gob.mx
Receptors by Lung T Cells from Normal and Asthma- Cellular and Serologic Markers in Infection with Hu-
tic Subjects. J Immunol 2001;166:2842-2848. man Immunodeficiency Virus Type 1. N Engl J Med
50. Agostini C, Facco M, Siverio M, Carollo D, Galvan 1990;322:166-172.
S, Catelan A, et al. CXC Chemokines IP-10 and Mig 58. Centers for Disease Control. Guidelines for the Per-
Expression and Direct Migration of Pulmonary CD8+/ formance of CD4+ T Cell Determinations in Persons
CXCR3+ T Cells in the Lungs of Patients with HIV In- with Human Immunodeficiency Virus Infection. Morb
fection and T Cell Alveolitis. Am J Respir Crit Care Mortal Wkly Rep 1992;41:8-16.
Med 2000;162:1466-1473. 59. Lang W, Perkins H, Anderson RE, Royce R, Jewell
51. Agostini C, Cassatella M, Zambello R, Trentin L, N, Winkelstein W Jr. Patterns of T-lymphocyte Chan-
Gsaperini S, Perin A, et al. Involvement of the IP-10 ges with Human Immunodeficiency Virus Infection:
Chemokine in Sarcoid Granulomatous Reactions. J Im- From Seroconversion to the Development of AIDS.
munol 1998;161:6413-6420. AIDS 1989;2:63-69.
52. Weissler JC, Nicod LP, Lipscomb MF, Toews GB. 60. Soto-Perea C, Alvarado-Alemán FJ. La fenotipifica-
Natural Killer Function in Human Lung is Comparta- ción inmunológica (CD3+, CD4+ y CD8+) por cito-
mentalized. Am Rev Respir Dis 1987;135:941-994. metría de flujo en el paciente VIH positivo: presenta-
53. Agostini C, Trentin L, Zambello R, Luca M, Cipria- ción gráfica simplificada . Enf Infecc Microbiol
ni A, Pizzolo G, et al. Phenotypical and Functional 1994;14:184-190.
Analysis of Natural Killer Cells in Sarcoidosis. Clin Im- 61. Reyes-Terán G, Ponce de León-RS. Conteo de célu-
munol Immunopathol 1985;37:262-275. las T CD4+ y su uso en el manejo de pacientes con
54. Wilsher M, Hallowes M, Birchall N. Gamma/delta VIH-1. Rev Invest Clin 1993;45:363-370.
Cells in Tissue from Patients with Sarcoidosis. Thorax
1996;51:1123-1126. Correspondencia:
55. Raulf M, Liebers V, Steppert C, Baur X. Increased M en C. Felipe Mendoza Pérez,
γ/δ-positive T-cells in Blood and Bronchoalveolar La- Jefe del Laboratorio de
vage of Patients with Sarcoidosis and Hypersensitivi- Inmunoquímica.
ty Pneuomonitis. Eur Respir J 1994;7:140-147. Departamento de Biología Molecular.
56. Gruber R, Pforte A, Beer B, Riethmuller G. Deter- Instituto Nacional de Enfermedades
mination of Gamma/delta and other T Lymphocyte Respiratorias. Calzada de Tlalpan
Subsets in Bronchoalveolar Lavage Fluid and Periphe- 4502, Colonia Sección XVI. México,
ral Blood from Patients with Sarcoidosis and Idiopathic DF, 14080.
Fibrosis of the Lung. APMIS 1996;104:199-205. Tel: 5666 45 39 extensión 270, 55
57. Fahey JI, Taylor JMG, Detels R, Hofmann B, Mel- Fax: 5665 46 23
med R, Nishanian R, et al. The Prognostic Value of E-mail: femendo@yahoo.com
edigraphic.com
www.iner.gob.mx

Resumen para Segundo Parcial Ia

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Resumen para Segundo Parcial Ia

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Fundamentos físicos la espectroscopia de RMN

DESCRIPCION: La Resonancia Magnética Nuclear es una Técnica de análisis no destructivo que

En la siguiente gráfica se representa el aumento de la diferencia energética entre los estados de

COMO SE OBTIENE UN ESPECTRO RMN?

1. Un imán estable, con un controlador que produce un campo magnético preciso.

2. Un transmisor de radiofrecuencias, capaz de emitir frecuencias precisas.

3. Un detector para medir la absorción de energía de radiofrecuencia de la muestra.

4. Un ordenador y un registrador para realizar las gráficas que constituyen el espectro de

PARA OBTENER UN ESPECTRO DE RMN: Se coloca una pequeña cantidad del

En los aparatos modernos, el campo magnético se mantiene constante mientras un breve

¿Que es el deuterio y cual es su utilidad en la RMN?

Disolventes de mayor uso

Hasta ahora se ha descrito el concepto de resonancia de un núcleo aislado dentro de un

Este apantallamiento es muy importante desde el punto de vista experimental ya que el

El compuesto de referencia más común en resonancia magnética nuclear es el

Como consecuencia de este apantallamiento, estos protones absorben a una intensidad de

TABLA DE DESPLAZAMIENTOS QUIMICOS MAS COMUNES

2.- Que es y Cual es el fundamento de la espectrometría de masas?

3.- Cuales son las aplicaciones principales de la Espectrometría de masas?

4.- Cuales son los campos de aplicación de la espectrometría de masa?

5.- Cual es el fenómeno molecular en que se basa la Espectrometría de masas?

8.- Que es un espectro de masas?

9.- Cuales son las Ventajas de la Espectrometría de Masa en el análisis Cualitativo?

10.- Cuales son las desventajas del método?

11.- Mencione algunas aplicaciones específicas de la espectrometría de masas.

PROCESO DEL ESPECTRÓMETRO DE MASAS

Sistema de entrada de muestras

En los espectrómetros de masas más modernos encontramos diferentes tipos de

Facultad de Bioanálisis Ana Karen Ramírez Ortigoza

Los analizadores más utilizados, son el de campo magnético, el analizador cuadrupolar,

Facultad de Bioanálisis Ana Karen Ramírez Ortigoza

 Analizador cuadrupolar: no utiliza campos magnéticos para la dispersión, este

 Analizador de trampa de iones: es un dispositivo en el que los cationes o aniones

Facultad de Bioanálisis Ana Karen Ramírez Ortigoza

Facultad de Bioanálisis Ana Karen Ramírez Ortigoza

ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION ATOMICA

La base de la espectroscopia de absorción atómica (EAA) la entregó Kirchhoff al formular su

La forma moderna de la espectroscopia de absorción atómica fue desarrollada en gran parte

Es un método instrumental de la química analítica que permite medir las concentraciones

INSTRUMENTACION AVANZADA RUIZ GONZALEZ ARMANDO

La instrumentación básica para la AA se presenta en la Figura 1, y está constituida de una

Figura 1. Esquema básico de un EAA

En términos generales, el funcionamiento es el siguiente: el haz emitido por la fuente

Los componentes básicos de un equipo de absorción atómica son: 1

INSTRUMENTACION AVANZADA RUIZ GONZALEZ ARMANDO

Componentes de un espectrofotómetro de absorción atómica 4

INSTRUMENTACION AVANZADA RUIZ GONZALEZ ARMANDO

1. Razmilic B. Espectroscopia de Absorción Atómica.

INSTRUMENTACION AVANZADA RUIZ GONZALEZ ARMANDO

CUESTIONARIO ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN ATOMICA

1. ¿Quién estableció los principios teóricos de la absorción atómica?

2. ¿Qué establece la ley general entregada por Kirchhoff?

3. ¿Qué es la espectroscopia de absorción atómica?

4. ¿Cuál es el fundamento de la espectroscopia de absorción atómica?

5. ¿Cuál es la instrumentación básica para absorción atómica?

6. ¿Cómo es el funcionamiento de la absorción atómica?

7. ¿Cuál es el rango principal de determinación de los elementos?

8. ¿Cuáles son algunas de las aplicaciones de la absorción atómica?

INSTRUMENTACION AVANZADA RUIZ GONZALEZ ARMANDO

La espectroscopía de absorción atómica es una técnica que permite medir las

Autor de Correspondencia: Abstract

Keywords: electrophoresis, DNA, PAGE, PFGE, DGGE.

1 Universidad autónoma de baja california: campus ensenada Correo: carmona1994@gmail.com