Manual de Microbiología 2022

MICROBIOLOGÍA
MANUAL DE PRÁCTICAS
MARÍA GUADALUPE VEGA ROMERO

MAURICIO SALVADOR RODRÍGUEZ OJEDA
REYNA DE JESÚS ROMERO GERALDO
Ingeniería Bioquímica
2021
Instituto Tecnológico de La Paz
TecNM | ITLP
Índice
Seguridad e higiene en el laboratorio de microbiología ..................................................................................................... 3
Eliminación de microorganismos ......................................................................................................................................... 5
Disposición de desechos ......................................................................................................................................................... 6
Sistema armonizado para la identificación y comunicación de peligros derivados por sustancias químicas
peligrosas ................................................................................................................................................................................ 7
Estudio microscópico de los microorganismos.................................................................................................................... 8
Reglamento de seguridad en el laboratorio de microbiología ......................................................................................... 11
............................................................................................................................................................................................... 13
Módulo 1 ............................................................................................................................................................................... 13
Práctica 1. Esterilización del material ........................................................................................................................... 14
Práctica 2. Preparación de medios de cultivo................................................................................................................ 18
Práctica 3. Técnicas de siembra y cultivo de microorganismos .................................................................................. 23
Práctica 4. Preparaciones fijas y teñidas ....................................................................................................................... 29
Práctica 5. Estudios de bacterias .................................................................................................................................... 36
Práctica 6. Cuantificación de microorganismos............................................................................................................ 40
Práctica 7. Evaluación de agentes antimicrobianos...................................................................................................... 45
............................................................................................................................................................................................... 48
Módulo II .............................................................................................................................................................................. 48
Práctica 8. Aislamiento y morfología de hongos ........................................................................................................... 49
Práctica 9. Aislamiento e identificación de mohos y levaduras ................................................................................... 52
Módulo III ............................................................................................................................................................................ 59
Práctica 10. Recuento de organismos coliformes .......................................................................................................... 60
Práctica 11. Respiración frente a fermentación en un tubo de ensayo ....................................................................... 63
Práctica 12. Aislamiento de bacterias de ambientes salinos ........................................................................................ 66
Módulo IV ............................................................................................................................................................................. 71
Examen práctico .............................................................................................................................................................. 72
Anexos ................................................................................................................................................................................... 75
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Índice de tablas
Tabla 1. Niveles de bioseguridad______________________________________________________________ 3

Tabla 2. Cepas existentes en el laboratorio de bioquímica del I.T.L.P _________________________________ 4
Tabla 3. Agentes desinfectantes comúnmente utilizados en microbiología _____________________________ 5
Tabla 4. Pictogramas de peligros físicos y para la salud. ___________________________________________ 7
Tabla 5. Funciones de los componentes del sistema óptico _________________________________________ 9
Tabla 6. Funciones de los componentes del sistema mecánico _______________________________________ 9
Tabla 7. Funciones de los componentes del sistema de iluminación _________________________________ 10
Tabla 8. Métodos de esterilización ___________________________________________________________ 14
Tabla 9. Dispositivos de siembra por emplear de acuerdo con el tipo de medio de cultivo e inóculo ________ 24
Tabla 10. Resultados de inhibición del crecimiento bacteriano frente a antimicrobianos. _________________ 47
Tabla 11. Identificación de levaduras del género Candida. _________________________________________ 57
Tabla 12. Cuantificación de hongos y levaduras. ________________________________________________ 58
Tabla 13. Características macroscópicas del hongo aislado. ________________________________________ 58
Tabla 14. Características macroscópicas de la levadura aislada._____________________________________ 58
Tabla 15. Reactivos correspondientes a cada tipo de medio. _______________________________________ 72
Tabla 16. Concentrado de pruebas y presentación de resultados. ____________________________________ 73
Índice de figuras
Figura 1. Símbolo universal de material biológico infeccioso. .............................................................................. 4
Figura 2. Componentes básicos de un microscopio de campo claro. ..................................................................... 8
Figura 3. Clasificación de las técnicas de siembra de acuerdo al estado del medio de cultivo ............................ 24
Figura 4. Técnicas de siembra para la caracterización de bacterias ..................................................................... 38
Figura 5. Técnica de siembra para bacterias con características especiales ......................................................... 39
Figura 6. Caracterización de bacterias con diferentes requerimientos de oxigeno .............................................. 39
Figura 7. Características de la morfología macroscópica de las colonias bacterianas. ........................................ 75
Figura 8. Morfología microscópica de las bacterias ............................................................................................ 76
Figura 9. Crecimiento microbiano en caldo. A) Turbidez, B) Floculante, C) película y D) sedimento. ............. 77
Figura 10. Crecimiento bacteriano en agar inclinado. A) Crecimiento filiforme, B) equinulado, C)barbado,
D)difuso, E) arborescente y F) rizoide .................................................................................................................. 77
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Seguridad e higiene en el laboratorio de microbiología

Dentro de un laboratorio microbiológico, además de los riesgos generales, como los que implican el fuego y el
manejo de sustancias químicas, existen riesgos biológicos causados por agentes infecciosos o no infecciosos. De
tal forma que, es indispensable trabajar de acuerdo a las reglas de seguridad e higiene establecidas, además de la
disciplina y precauciones que esto implica. Las características de los microorganismos que sugieren una mayor
precaución al trabajar con ellos, son las siguientes.
Los microorganismos se caracterizan por pasar totalmente inadvertidos, aun cuando se encuentran en
cantidades muy elevadas, a diferencia de la mayoría de los contaminantes químicos.
Pueden diseminarse más ampliamente que una sustancia.
Pueden multiplicarse fuera de control en zonas del laboratorio, como el drenaje, la basura o los reactivos.
Pueden alterar el equilibrio ecológico y, además, cuando se pierden, su reposición es más difícil que la de
casi cualquier reactivo.
Pueden ser patógenos.
A continuación se describen los niveles de bioseguridad (tabla 1) y los grupos de riesgo con base en los
microorganismos relacionados. El laboratorio de microbiología que se encuentra en el Instituto Tecnológico de
La Paz pertenece al nivel de bioseguridad I y trabaja con microorganismos clasificados dentro de los grupos de
riesgo 1 y 2, los cuales se mencionan en la tabla 2.
Tabla 1. Niveles de bioseguridad.
Nivel de Prácticas y técnicas Equipo de seguridad Instalaciones
bioseguridad
I § Seguir las reglas generales de seguridad § Ninguno: las medidas de Básicas
e higiene personal. contención primarias correctas son
dadas por las aplicaciones de las
buenas prácticas de laboratorio,
durante el trabajo en mesas.
II § Nivel I más bata y guantes protectores. § Uso de equipos de protección como Básicas
§ Manual de descontaminación y manejo gabinetes de seguridad tipo II para
de desechos infecciosos. aislar aquellas actividades que
§ Acceso limitado a las áreas de trabajo y generen aerosoles.
uso de carteles de advertencia de riesgo.
III § Nivel II más ropa especial de § Uso de equipo de protección para De contención
laboratorio. aislar todas las actividades
§ Acceso limitado y controlado a las riesgosas, como la producción de
instalaciones. aerosoles.
IV § Nivel III más entrada a través de una § Usar para todas las actividades De máxima
sala de cambio de ropa; se debe cambiar equipo de contención máxima. contención
la ropa de calle por ropa especial de
laboratorio, ducharse al salir del área de
trabajo y descontaminar todos los
materiales a la salida.
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Grupo de riesgo 1. A este grupo pertenecen los microorganismos que tienen

pocas probabilidades de provocar enfermedades en humanos o enfermedades de
importancia en los animales. Alguno de microorganismos que se encuentran
dentro de este grupo son: Bacillus cereus, Escherichia coli K12 y Lactobacillus
acidophilus.
Grupo de riesgo 2. Incluye a los microorganismos patógenos que pueden
provocar enfermedades en el humano o en animales, pero que tienen pocas
Figura 1. Símbolo universal de
probabilidades de provocar un daño grave para el personal de laboratorio que material biológico infeccioso.
los manipula, la comunidad, el ganado o el ambiente. Los microorganismos que
se encuentran dentro de este grupo son: Actinomyces sp, Bordatella bronchiseptica, Clostridium
sp,*Klebsiella pneumoniae,*Listeria monocytogenes, *Proteus sp, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio
parahemolyticus, Candida sp y Salmonella typhi*.
Grupo de riesgo 3. Está constituido por agentes patógenos que provocan enfermedades humanas graves, pero
que de manera ordinaria no se propagan de una persona infectada a una persona sana. Los agentes de este
grupo pueden ser Mycobacterium tuberculosis, Coccidioides inmitis, Histoplasma capsulatum, Brucella sp,
Ricketsia sp y virus.
Grupo de riesgo 4. Este grupo lo integran los agentes patógenos que provocan enfermedades graves en las
personas o en los animales y que pueden propagarse fácilmente de un individuo a otro, directa e
indirectamente. Dentro de este grupo se encuentran el virus de Marbug, el virus de la fiebre aftosa, el virus
del ébola, entre otros.
Tabla 2. Cepas existentes en el laboratorio de bioquímica del I.T.L.P.
Cepario en laboratorio de bioquímica
v Escherichia coli v Vibrio Cholerae
v Staphylococcus aureus v Vibrio parahaemolyticus
v Staphylococcus epidermis v Shigella sonnei
v Proteus mirabilis v Shigella flexneri
v Proteus vulgaris v Enterococcus faecium
v Salmonella tiphy v Bacillus subtilis
v Salmonella enteriditis v Serratia marcescens
v Citrobacter freundi v Pseudomonas aeruginosa
v Enterobacter cloacae v Saccharomyces cerevisiae
v Enterobacter aerogenes v Saccharomyces boulardii
v Klebsiella neumoniae v Micrococcus sp.
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Eliminación de microorganismos
Durante el trabajo del laboratorio es común tener que desinfectar la mesa de trabajo o bien, esterilizar los
materiales a utilizar, sin embargo, para poder realizar adecuadamente dichos procesos es necesario conocer su
significado y aplicaciones, los cuales se mencionan a continuación:
a) Desinfección: es la destrucción de microorganismos presentes en la superficie de objetos y equipos,
utilizando sustancias químicas denominadas desinfectantes. No implica esterilización por lo que no
siempre se eliminan todos los microorganismos presentes ni sus estructuras de resistencia.
Todo buen método de desinfección deberá cumplir las siguientes condiciones: (i) eliminar el mayor
número de microorganismos (al menos todos los patógenos), (ii) ser económico (iii) no debe ser
corrosivo, tóxico o irritante para los tejidos y (iv) ser soluble en agua (tabla 3).
b) Esterilización: eliminación de todos los microorganismos que contiene un objeto o sustancia.
Tabla 3. Agentes desinfectantes comúnmente utilizados en microbiología.
Agente Mecanismo de acción Aplicaciones
§ Efecto letal por la combinación con § Purificación del agua
proteínas § Sanitización de utensilios
Compuestos clorados: § Reaccionan con el agua para formar § Microbicida
Halógenos
NaClO ácido hipocloroso que es bactericida. § En superficies se recomienda una
§ Oxidante, corrosivo para metales concentración de 1% con variaciones
entre 1g/L y 10g/L
§ Altera la estructura de proteínas e § Desinfección en una solución al 5%
Compuestos induce su precipitación
Fenol
fenólicos § Alteración de la membrana celular
§ Irritante y altamente tóxico
Compuestos Tintura de iodo § Precipitación de proteínas § Antiséptico
con base en Solución povidona- § Efectivo contra esporas, hongos y
Iodo iodo virus
El agente desinfectante más utilizado en los laboratorios escolares es el hipoclorito comercial y para preparar la
solución se recomienda utilizar la siguiente fórmula:
(𝐂𝐝)(𝐕𝐝)
𝐕=
𝐂𝐜
Donde:
Vd: volumen deseado
Cd: concentración deseada
Cc: concentración conocida
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Disposición de desechos
Debido a la constante manipulación de microorganismos dentro del laboratorio y al riesgo que esto conlleva, es
necesario tener un conocimiento básico en cuanto a la correcta disposición de desechos, por tal motivo, una vez
que se desocupe el material que estuvo en contacto con algún residuo peligros, el alumno deberá:
1. Depositar el material peligroso dentro de un contenedor designado exclusivamente para residuos
biológicos peligrosos y/o infecciosos.
2. Esterilizar el material de vidrio (tubos, cajas y pipetas) en autoclave, para ello:
a) Retirar las etiquetas, marcas de plumón o masking tape empleados para identificar el material.
b) Colocar los tubos y cajas en cilindros de acero inoxidable o en bolsas.
c) Colocar cinta testigo.
d) Esterilizar.
3. Retirar el medio de cultivo de tubos y cajas y depositarlo en bolsas de plástico, cerrar herméticamente y
el paquete resultante depositarlo en el contenedor de residuos biológicos peligrosos.
4. Lavar el material de vidrio. Dejar secar y guardar.
5. Después de efectuar las observaciones, los portaobjetos se sumergen durante 10 minutos en una solución
sanitizante de hipoclorito de sodio al 10% a partir de una solución comercial, después se lavan con jabón,
se enjuagan y se sumergen en alcohol al 95% durante 24 horas.
6. En caso de romper algún instrumento o material, será necesario esterilizarlo primero y posteriormente
depositarlo en el contenedor exclusivo para material roto de vidrio.
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Sistema armonizado para la identificación y comunicación de peligros derivados por sustancias químicas
peligrosas
La norma NOM-018-STPS-2015 establece un conjunto de pictogramas que nos ayudan en la identificación de
sustancias químicas peligrosas, con la finalidad de evitar riesgos mediante un solo sistema de clasificación a nivel
internacional a través de una manera gráfica (etiqueta) y una escrita (hoja de seguridad). Los pictogramas
implementados se muestran a continuación en la tabla 4.
Tabla 4. Pictogramas de peligros físicos y para la salud.
§ Gases comburentes (categoría 1). § Toxicidad aguda por ingestión (categorías 1 al 3).
§ Líquidos comburentes (categorías 1 al 3). § Toxicidad aguda por vía cutánea (categoría 4).
§ Sólidos comburentes (categorías 1 al 3). § Toxicidad aguda por inhalación (categorías 1 al
3).
§ Gases inflamables (categoría 1). § Corrosión/Irritación cutáneas (categoría 1).
§ Aerosoles (categorías 1 y 2). § Lesiones oculares graves/Irritación ocular
§ Líquidos inflamables (categorías 1 al 3). (categoría 1).
§ Sólidos inflamables (categorías 1 y 2).
§ Sustancias y mezclas que reaccionan
espontáneamente (tipos B al F).
§ Líquidos pirofóricos (categoría 1).
§ Sólidos pirofóricos (categoría 1).
§ Sustancias y mezclas que experimentan
calentamiento espontáneo (categoría 1 y 2).
§ Sustancias y mezclas que en contacto con el
agua, desprenden gases inflamables
(categorías 1 al 3).
§ Peróxidos orgánicos (tipos B al F).
§ Explosivos (inestable y divisiones 1.1 al 1.4) § Sensibilización respiratoria (categorías 1, 1A* y
§ Sustancias y mezclas que reaccionan 1B*).
espontáneamente (tipo A y B). § Mutagenicidad en células germinales (categorías 1
§ Peróxidos orgánicos (tipo A y B) [tanto 1A como 1B] y 2).
§ Carcinogenicidad (categorías 1 [tanto 1A como
1B] y 2).
§ Toxicidad para la reproducción (categorías 1
[tanto 1A como 1B] y 2).
§ Toxicidad sistémica específica de órganos blanco
(exposición única) (categorías 1 y 2).
§ Toxicidad sistémica específica de órganos blanco
(exposiciones repetidas) (categorías 1 y 2).
§ Peligro por aspiración (categorías 1 y 2).
§ Gases a presión (comprimido, licuado, licuado § Toxicidad aguda por ingestión (categoría 4).
refrigerado y disuelto). § Toxicidad aguda por vía cutánea (categoría 4).
§ Toxicidad aguda por inhalación (categoría 4).
§ Corrosión/Irritación cutáneas (categoría 2).
§ Lesiones oculares graves/Irritación
ocular (categoría 2/2A).
§ Sensibilización cutánea (categorías 1, 1A* y 1B*).
§ Lesiones oculares graves (categoría 2A)
§ Toxicidad específica de órganos blanco
(exposición única) (categorías3).
§ Sustancias y mezclas corrosivas para los
metales (categoría 1).
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Estudio microscópico de los microorganismos

Una de las características más importantes de los microorganismos es su tamaño, el cual los hace imperceptibles
a simple vista, por lo que es necesario utilizar el microscopio y técnicas especiales para observar y estudiar la
citología, es decir, su morfología, y algunas de sus características.
El estudio microscópico de los microorganismos proporciona datos fundamentales para su identificación, como
forma, tamaño, agrupación, estructuras celulares y reacción a diferentes colorantes; orienta al microbiólogo,
cuando trata de aislar microorganismos y permite establecer características como la pureza, presencia de
contaminantes y variedad de una población, entre otras cosas. Por ello, el microscopio es considerado el equipo
más importante en el laboratorio de microbiología, por ende, es indispensable saber utilizarlo adecuadamente.
El microscopio fotónico es el más utilizado dentro del ámbito estudiantil, ya que permite el estudio de diversos
microorganismos mediante el paso de luz no alterada a través de un sistema de lentes, produciendo un campo
brillante donde se pueden observar pequeños objetos. Los microscopios fotónicos se pueden utilizar con diversos
contrastes como: campo claro, campo oscuro, contraste de fases y epifluorescencia. No obstante, el de campo
claro es el más utilizado en el campo de la microbiología.
Microscopio fotónico de campo claro. El campo microscópico o área observada se ilumina y los objetos en
estudio aparecen más oscuros en el fondo, dado que, la luz procedente de la lámpara y del condensador atraviesa
la preparación y permite que la primera lente forme una imagen aumentada de lo que hay en ella; antes de ser
“vista”, esta imagen es amplificada nuevamente por otra lente que corresponde al ocular.
Este microscopio está integrado por un sistema mecánico que da soporte y movimiento a los componentes ópticos
y un sistema óptico y de iluminación, que permiten iluminar el objeto en estudio y amplificar su imagen (Figura
2)
Figura 2. Componentes básicos de un microscopio de campo claro.
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A continuación en se describen las funciones del sistema óptico (tabla 5), los componenetes del sistema mecánico
(tabla 6) y los componentes del sistema de iluminación (tabla 7) del microscopio de campo claro:
Tabla 5. Funciones de los componentes del sistema óptico.
Componente Función
§ Aumentar, a manera de lupa, la imagen real proyectada por el objetivo tantas veces
como indique el número inscrito en ellos.
Oculares § Posee dos lentes
§ Ocular: Queda cerca del ojo
§ Colectora: Lente que queda en el extremo inferior
§ Conjunto de lentes que producen imágenes de la muestra aumentadas 4, 10, 40 o
100 veces, según indique en los mismos.
§ Consta de dos lentes, el que queda más ceca de la preparación de llama lente frontal
Objetivos y el que queda en la parte superior se llama lente posterior.
§ Se distinguen dos clases de objetivos: los secos y los de inmersión, al primer tipo
pertenecen los objetivos de aumento débil o mediano (5x,10x, y 40x).
§ Los de inmersión son los de mayor aumento con mayor poder de resolución (100x).
Tabla 6. Funciones de los componentes del sistema mecánico.

Componente Función
Base § Parte inferior en la cual se apoya el microscopio.
Brazo o columna § Porción central de la cual se debe tomar el microscopio.
§ Por donde se ubican los objetivos. Está constituido de manera que un sistema
Revolver rotatorio engrane automáticamente y se pueden rotar los objetivos girando el
revolver.
§ Placa cuadrada firmemente montada sobre el microscopio en forma horizontal.
Platina Presenta un orificio central para permitir el paso de la luz y sobre la cual se coloca
la muestra que se va a observar.
§ Sistema de 2 pinzas ubicado encima de la platina, que sirve para desplazar la
Carro mecánico muestra en el eje X y en el eje Y (izquierda-derecha y adelante-atrás,
respectivamente).
§ Cilindro que soporta los oculares en la parte superior y en la inferior se ubica el
Tubo o cabezal revolver.
§ Puede ser monocular o binocular.
§ Sirve para localizar la imagen, se acciona por medio de dos tornillos de cremallera
Tornillo macrométrico que se encuentran a ambos lados del microscopio.
§ Se caracteriza por un enfoque “grueso”.
§ Se utiliza para dar el enfoque adecuado a la imagen localizada con el tornillo
macrométrico. Lleva un tambor graduado que se desplaza sobre un índice fijo que
sirve para indicar su posición.
Tornillo micrométrico § Es de extraordinaria precisión y por lo tanto muy delicado.
§ Una vez enfocada la imagen con el lente de menor aumento solo se debe usar el
tornillo micrométrico para cambiar el aumento y dar la nitidez necesaria a la imagen
(enfoque fino).
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Tabla 7. Funciones de los componentes del sistema de iluminación.

Componente Función
§ Es un sistema de lentes convergentes entre la luz y la platina. Estos lentes concentran
los rayos luminosos sobre la preparación.
Condensador
§ Está ubicado en la base del microscopio y su función es concentrar la luz
proveniente de la fuente hacia el condensador de abertura.
§ Es un disco de vidrio mate o de diferente color que se puede ubicar en la parte
Filtro inferior del diafragma y sobre un anillo transportable; este filtro permite seleccionar
la longitud de onda de luz a emplear.
Foco o fuente emisora § Proporciona la luz necesaria para la observación de la muestra.
de luz
§ Está formado por un conjunto de láminas falciformes las cuales por medio de una
Diafragma (iris) palanca lateral se pueden cerrar concentricamente regulando la cantidad de luz
proveniente del condensador.
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Reglamento de seguridad en el laboratorio de microbiología

En el trabajo de laboratorio es fundamental la seguridad e integridad de las personas involucradas, por ello, no
podrá realizarse ninguna práctica o actividad experimental si el ejecutante no cuenta con los elementos de
protección indispensables para su desarrollo o no cumple con las disposiciones normativas aplicables, para lo cual
se deberán de cumplir siempre las siguientes reglas:
Sobre el acceso personal
1. Es obligatorio el uso de bata dentro del laboratorio. Queda prohibido entrar con short, blusas
desmangadas, sandalias, tacones o plataformas. Es recomendable vestir ropa cómoda, que proteja la mayor
parte del cuerpo, de preferencia de algodón, zapatos cerrados y con suelas gruesas.
2. Solo se permitirá el acceso con el cabello recogido, las uñas cortas, sin esmalte ni acrílico, y sin maquillaje
en el rostro.
3. No introducir ni consumir alimentos o bebidas en el laboratorio.
4. Lavarse de manera meticulosa las manos con jabón y agua antes de entrar y salir del laboratorio.
5. Al manipular sustancias químicas corrosivas o peligrosas se utilizarán guantes, lentes protectores y/o
mascarillas.
6. No se permitirá el uso de aparatos que distraigan la atención y pongan en riesgo la seguridad durante las
prácticas.
7. Evitar la acumulación de materiales innecesarios en las mesas de trabajo. Realizar las actividades de
manera ordenada y en silencio para evitar accidentes.
8. Localizar extintores, botiquín y salidas de emergencia.
9. Se negará el acceso a estudiantes que no hayan leído y comprendido previamente el protocolo a realizar
y/o que no lleve su bitácora con los requerimientos solicitados.
Sobre los procedimientos
1. Antes y después de cada sesión práctica, los alumnos limpiarán las mesas de trabajo.
2. Cuando se utilice el mechero, éste será colocado en un lugar alejado del microscopio y otros equipos.
3. En el caso de derrame de cultivos o ruptura de recipientes con cultivos activos, tratar de conservar la
calma, inmediatamente informar al profesor y/o realizar el siguiente procedimiento:
a) Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar su dispersión.
b) Agregar abundante solución desinfectante sobre las toallas.
c) Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el recipiente destinado para la
eliminación de materiales contaminados.
4. Es necesario realizar los procedimientos de forma ordenada y en silencio, en caso de tener alguna duda,
levantar la mano.
5. La puerta y ventanas permanecerán cerradas durante las sesiones, con el fin de evitar contaminantes.
6. Al concluir la sesión práctica, el estudiante se asegurará de que los materiales de desecho u objetos
contaminados sean colocados en recipientes específicos para ello, así como en lugares apropiados.
Deberán lavar todos los instrumentos utilizados que no representen un riesgo al manipularlos.
7. El alumno deberá de cerciorarse de que la llave del gas quedó cerrada al momento de terminar la práctica.
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Sobre el uso de instalaciones y equipos de laboratorio

1. Operar un instrumento o aparato solamente cuando se sabe hacerlo, de otra manera, solicitar la ayuda del
profesor, del ayudante o del técnico del laboratorio, para adquirir la destreza necesaria.
2. Una vez concluido el uso de un aparato o instrumento, seguir el procedimiento adecuado para apagarlo,
desconectarlo, guardarlo y entregarlo al responsable de su custodia.
3. Siempre dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analíticas,
autoclave, etc.) y reportar al encargado cualquier irregularidad en su funcionamiento.
4. Verificar que las tomas de agua y gas en el lugar de trabajo estén bien cerradas. Dejar limpias y secas las
mesas de trabajo.
Materiales indispensables en cada sesión de laboratorio

1. Bitácora que contenga el diagrama de flujo de la práctica a realizarse.
2. Cinta masking tape.
3. Tijeras.
4. Marcador indeleble.
5. Cerillos o encendedor.
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Se pretende dar a conocer una serie de

técnicas, procedimientos y conceptos de
uso frecuente en microbiología,
relacionados con el aislamiento,
identificación y caracterización de los
cultivos bacterianos, con la finalidad de
que los estudiantes puedan dominar las
habilidades y destrezas básicas que
servirán de referencia para poder
realizar con éxito las otras prácticas que
propone este manual.
Módulo I
Aislamiento, identificación y
caracterización de bacterias
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Módulo I
Práctica 1. Esterilización del material
Objetivos
1. Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización del material de laboratorio.
2. Conocer el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminación microbiana en el
laboratorio.
3. Esterilizar adecuadamente el material que se utilizará durante el curso de microbiología.
Fundamento
La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de organismo que asegura la ausencia absoluta
de cualquier forma viviente. Una esterilización deficiente o manipulación incorrecta de materiales y medios de
cultivo conlleva a contaminaciones, resultados erróneos o pérdida del material biológico. Por ello, se requieren
buenas prácticas de laboratorio para su adecuado manejo.
La esterilización por calor seco o húmedo son los métodos que se utilizan con mayor frecuencia en el laboratorio
de microbiología. El calor seco destruye a los microorganismos por oxidación, por ejemplo, al exponerlos
directamente a la flama de un mechero o en horno a 150-180°C durante 2 horas. Estos métodos se aplican en la
esterilización de asas de inoculación y para todo tipo de material de vidrio y quirúrgico.
Los procesos con calor húmedo afectan la estabilidad de estructuras celulares y proteínas; se aplican para
esterilizar medios de cultivo, soluciones termoestables, materiales de vidrio y cultivos bacterianos que se
desechan. El equipo de uso común es la autoclave, que utiliza vapor de agua a presión (15 lb/in), ya que con esta
presión el material alcanza una temperatura de 121 °C y si se mantiene durante 15 minutos se asegurará la
inactivación de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resistentes al calor.
Como en los estudios de microbiología se requiere la esterilización de espacios, superficies y materiales de

naturaleza diversa (plástico, vidrio, instrumentos, medios de cultivo, cultivos para desechar, etc.), hay diferentes
métodos que se aplicarán de acuerdo con el tipo de materiales requeridos, tal como se observa en la tabla 8.
Tabla 8. Métodos de esterilización.

Métodos físicos Métodos químicos
Calor Filtración Radiaciones Gases Líquidos
Húmedo Seco No ionizantes Ionizantes
§ Vapor a § Aire caliente § Discos de § Rayos UV. § Rayos X. § Dióxido § Formaldehído.
presión (horno). membranas § Rayos § Rayos de § β-propiolactona.
(autoclave). § Flameado. o filtros infrarrojos. (cobalto-60). etileno.
§ Incineración. absolutos. § Radiación
§ Flujo electrónica
laminar. de alta
energía.
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Material
Reactivos Instrumentos Equipos Otros
§ Ácido clorhídrico 0.1N § Bureta de 25 ml § Horno de § Agua purificada
§ Azul de metileno 0.03% § Cajas Petri de vidrio de esterilización § Algodón
§ Fenolftaleína 0.5% 100x150mm § Autoclave § Cinta testigo
§ Hidróxido de sodio 0.1N § Cilindro de acero inoxidable para § Gasa, hilo de cáñamo
§ Sacarosa al 1% pipeta y cajas de Petri § Masking tape
§ Gradilla § Papel Kraft
§ Matraz Erlenmeyer de 250 ml § Bolsas para esterilizar
§ Pinzas para bureta/soporte § Tijeras
universal
§ Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 ml
§ Tubos de cultivo bacteriológicos
con tapa baquelita
Procedimiento
A. Preparación del material para esterilización.
1. Poner el filtro de algodón a cada pipeta y envolverlas con papel Kraft. Marcar el volumen de cada
pipeta y la fecha de preparación. En caso de tener cilindros de acero inoxidable colocar las pipetas
dentro, sin que queden muy apretadas.
2. Si no se cuenta con tubos de tapón de rosca, tapar con algodón los tubos de ensayo y colocarlos en un
bote o vaso de precipitado. Tapar el bote con papel.
3. Envolver con papel las cajas de Petri, en grupos de 5. Colocarlas con la tapa hacia abajo. Si hay
cilindros de acero disponibles, lavarlas y secarlas perfectamente y colocarlas con la tapa hacia abajo.
4. Poner el tapón de algodón al matraz Erlenmeyer y colocarle encima un gorro de papel.
5. Este material se esterilizará por calor húmedo (autoclave) y calor seco (cilindros de acero inoxidable
y material de vidrio).
Diagramas de flujo
A) Preparación del material para esterilización
1. Esterilización de pipetas.
15
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2. Esterilización de tubos de ensayo.
3. Esterilización de cajas Petri.
4. Esterilización de matraces Erlenmeyer.
B. Manejo de diluciones (Preparación de diluciones decimales utilizando como diluyente agua

destilada y azul de metileno).
1. Rotule el material a utilizar.
2. Con una pipeta de 10 ml agregue a una serie de 8 tubos de ensayo, 9 ml de agua destilada.
3. Con una pipeta de 1 ml adicione al primer tubo, 1 ml de azul de metileno al 0.03% y hacer 8 diluciones
decimales (1:10) seriadas.
4. Anotar sus observaciones.
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5. Colocar en un tubo de ensaye limpio de 16x150mm, 2 ml de sacarosa al 1% + 2 ml de azul de metileno

0.03% añadir lentamente resbalando por las paredes del tubo 6 ml de agua destilada. Agitar
cuidadosamente sin mojar el tapón.
6. Anote lo que observa.
Diagrama de flujo
C. Manejo de cajas y tubos.

1. Colocar 10ml de solución de HCl 0.1N en el fondo de una caja de Petri.
2. Añadir una gota de fenolftaleína al 0.5% y titular el ácido con NaOH 0.1N.
3. Homogenice cuidadosamente para aprender a abrir y a cerrar perfectamente una caja de Petri.
Diagrama de flujo
Guía de observación
v ¿Qué características de un material o sustancia se requieren conocer para elegir el método adecuado de
esterilización?
v Describa el tipo de contaminantes microbianos que se encuentran con mayor frecuencia en las cajas
Petri. ¿Cómo explicaría estos resultados?
v ¿Cuáles son las tres principales recomendaciones de uso correcto de la autoclave?
v Describa correctamente la forma de utilizar una pipeta.
v Explique qué utilidad tienen las diluciones, mencione ejemplos.
v Explicar que se observa en las diluciones de la primera serie (1:10), registre el dato de cuál fue el factor
de la dilución final.
v Explicar en qué dilución ya no se detecta el colorante, discútalo.
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Módulo I
Práctica 2. Preparación de medios de cultivo
Objetivos
1. Preparar adecuadamente diferentes medios de cultivo.
2. Relacionar la composición de los diversos medios de cultivo con su clasificación y aplicaciones.
Fundamento
Los microorganismos son extraordinariamente diversos en sus características fisiológicas y sus requerimientos
nutricionales. En condiciones naturales, los nutrimentos requeridos para sintetizar su material celular, generar
energía y efectuar su funcionamiento son tomados del ambiente. En tanto que para cultivarlos in vitro, se han
diseñado múltiples medios de cultivo que son disoluciones acuosas con base en sustancias orgánicas, inorgánicas
o ambas que proporcionan los nutrimentos requeridos para los microorganismos.
El primer aspecto que se considera en la formulación de un medio, es la composición química de las células, la
que indica los principales nutrientes para el crecimiento. Con base en las cantidades requeridas, los nutrientes se
dividen en macronutrientes y micronutrientes. Entre los primeros se encuentran el carbono, oxígeno, hidrógeno y
nitrógeno, los que se constituyen en el esqueleto de las biomoléculas; el fósforo, azufre, potasio, magnesio, calcio,
hierro y sodio son los elementos menos abundantes pero igualmente importantes para su metabolismo.
Los micronutrientes o elementos traza son requeridos pero en muy pequeñas cantidades, sin embargo, son tan
importantes como los macronutrientes para la función celular. Algunos ejemplos de estos, son metales como,
cromo, cobalto, cobre, manganeso, molibdeno, níquel, selenio, tungsteno, vanadio y zinc.
Las necesidades nutrimentales de los microorganismos son muy variables, algunos solo requieren sales, en tanto
que otros, especialmente los patógenos, necesitan compuestos complejos semejantes en composición a los fluidos
del cuerpo humano o de los hospedadores que parasitan; otros más exigentes emplean un compuesto orgánico
específico que utilizan como precursores porque no pueden sintetizarlos a partir de fuentes de carbono sencillas,
por lo que deben ser administrados. Este tipo de nutrimentos orgánicos se denominan colectivamente factores de
crecimiento y son requeridos en cantidades muy pequeñas. Es por esta razón que muchos de los medios de cultivo
contienen extractos de carne, sales, peptonas, y en casos específicos se les debe adicionar componentes como
suero, sangre, hemoglobina, aminoácidos, purinas, pirimidinas y vitaminas.
Los medios de cultivo se clasifican con base en su composición química, estado físico y aplicación.
A. Por su composición se dividen en:
1. Sintéticos o de composición química definida. Se conoce la composición química exacta y son utilizados
para el crecimiento de autótrofos, fotoautótrofos y para el cultivo de cepas muy exigentes utilizadas como
herramientas analíticas.
2. Naturales o complejos. Se elaboran con ingredientes de naturaleza variable como extractos de tejidos,
animales o vegetales y sueros, por lo que su composición química es desconocida o no definida. Se
emplean para el cultivo de la mayoría de los organismos quimioheterótrofos.
B. Por su estado físico los medios de cultivo se clasifican en:
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1. Líquidos. Conocidos como caldos, son especialmente útiles para hacer diluciones, homogenizar mezclas
de microorganismos, enriquecer cultivos y reactivar cepas.
2. Semisólidos. Son medios con una concentración de agar de 0.4 a 0.8%. Se emplean para determinar la
movilidad de los microorganismos, así como sus requerimientos de oxígeno.
3. Sólidos. Estos medios se preparan agregando algún agente solidificante a las soluciones nutritivas
líquidas. El más utilizado es el agar en una concentración de 1.5 a 2.0%. Estos medios son especialmente
útiles para separar microorganismos y favorecer el desarrollo de colonias aisladas, así como para la
purificación de cultivos, su posible identificación y en la realización de antibiogramas.
C. Por último, de acuerdo con su aplicación se dividen en:
1. Generales. Son medios ya sea en forma líquida o sólida, que contienen los nutrientes necesarios para la
multiplicación de microorganismos heterótrofos de uso común en el laboratorio. Entre los más utilizados
se encuentran el caldo nutritivo y el caldo soya tripticaseína.
2. Selectivos. Son aquellos que favorecen el desarrollo de microorganismos específicos y suprimen el
crecimiento de otros.
3. De enriquecimiento. Aquellos que favorecen la multiplicación y enriquecimiento celular de un grupo de
microorganismos con características específicas, combinando el uso de medios selectivos con factores
como la temperatura, el pH, fuerza iónica, iluminación, aireación y fuente de inóculo.
4. Enriquecidos. Permiten el desarrollo de microorganismos heterótrofos exigentes. Son medios
químicamente complejos o ricos en nutrientes, tales como sangre, suero o extractos de tejidos.
5. Diferenciales. Contienen componentes nutritivos y reactivos indicadores que permiten poner de
manifiesto alguna actividad metabólica específica de los microorganismos.
6. Especiales. Se emplean para cultivar microorganismos que son parásitos estrictos.
7. Mínimos. Son útiles para estudiar las preferencias nutricionales de los microorganismos, por ejemplo:
fuentes específicas de carbono, energía, nitrógeno o fosfato, y en algunos casos para detectar auxotrofía.
8. Para mantenimiento de cepas. Permiten preservar satisfactoriamente la viabilidad de las células en un
cultivo y se caracterizan por tener concentraciones muy limitadas de nutrientes.
Material
§ Extracto de carne. § Cajas Petri de vidrio. § Autoclave. § Algodón.
§ Peptona de carne. § Canastilla o botes de lámina. § Balanza analítica. § Tijeras.
§ Agar bacteriológico o § Matraces Erlenmeyer de 250, 500 § Balanza § Cinta masking
nutritivo. y 1000 ml. granataria. tape.
§ Caldo nutritivo. § Pipetas de 1 y 10 ml. § Parrilla eléctrica. § Hilo de cáñamo.
§ Agar dextrosa Sabouraud. § Probeta de 100 ml. § Potenciómetro. § Papel Kraft.
§ Agar EMB. § Vaso de precipitado de 250 ml. § Termómetro. § Marcador.
§ Agar ST-110. § Gradilla. § Cinta testigo.
§ HCl 0.1 N. § Tubos de ensayo de 16x150mm.
§ NaOH 0.1 N. § Tubos de ensayo de 22x175mm.
§ Soluciones amortiguadoras.
Procedimiento
Lavar toda la cristalería con detergente líquido, enjuagar con abundante agua hasta eliminar el detergente.
Enjuague con agua destilada y ponga a escurrir perfectamente el material.
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A) Preparación de medio líquido (caldo nutritivo).

1. Leer cuidadosamente la información proporcionada por el fabricante en el membrete del frasco.
2. Calcular la cantidad necesaria de cada componente o del medio deshidratado para preparar el volumen
requerido.
3. En una balanza calibrada, pesar con precisión la cantidad requerida del medio en polvo o reactivos.
Para evitar la hidratación y contaminación, tapar inmediatamente el frasco y colocarlo en su lugar.
4. Disolver los componentes en la mitad del volumen de agua destilada, una vez disuelto completar el
volumen y homogenizar el contenido. Debido a que la mayoría de los componentes de los medios
líquidos son solubles en agua, no es necesario calentarlos para la disolución.
5. Ajustar el pH a 7 ± 0.2. En caso necesario, ajustar el pH con soluciones de ácido clorhídrico o de
hidróxido de sodio o potasio en concentraciones 1.0 N.
6. Distribuir el medio de acuerdo con las necesidades de trabajo.
7. Tapar el material con torundas de algodón y esterilizar. El algodón o papel pueden ser sustituidos por
tapas especiales de baquelita, de metal o de plástico termorresistente en este caso, las tapas deberán
estar a medio cerrar (no apretado) y al término del ciclo de esterilización, girar las tapas con el fin de
cerrar herméticamente.
8. Esterilizar el material 15min/121°C/15 Ib. de presión.
Diagrama de flujo
B) Preparación de medio semisólido.

1. Calcular y agregar la cantidad de agar necesaria para una concentración final de 0.3% en un volumen
determinado de caldo nutritivo contenido en un matraz.
2. Tapar el matraz con una torunda de algodón y calentar a ebullición hasta disolver el agar.
3. Distribuir en tubos de 16x150 con 10 ml cada uno (etiquetar previamente los tubos) y taparlos.
4. Colocar los tubos en un vaso de precipitado y cubrir con papel Kraft; marque sobre el papel el número
y tamaño de los tubos y colocar sobre ese un trozo de cinta testigo.
5. Esterilizar el material 15min/121°C/15 Lb. de presión.
6. Una vez terminado el ciclo de esterilización, dejar que el medio se enfrié de manera vertical.
C) Preparación de medio sólido (agar nutritivo, EMB, Dextrosa Sabouraud, ST-110, TSA).
2. Calcular la cantidad necesaria para preparar el volumen de agar nutritivo requerido.
3. En una balanza calibrada, pesar con precisión la cantidad requerida del medio en polvo. Para evitar la
hidratación y contaminación, tapar inmediatamente el frasco y colocarlo en su lugar.
20
TecNM | ITLP
4. Disolver el medio en la mitad del volumen de agua destilada, una vez disuelto, completar el volumen
y homogenizar el contenido.
5. Ajustar el pH entre 7 ± 0.2.
6. Tapar el matraz con una torunda de algodón para concentrar el calor y evitar la pérdida de agua.
7. Calentar sin llegar a ebullición y en agitación hasta disolver el agar. El medio queda listo cuando se
observa translucido. (nota este paso puede omitirse)
9. Homegenizar muy bien el medio antes de distribuir el medio de cultivo en placas Petri. Vaciar el medio
abriendo el matraz junto a la flama del mechero, flamear la boca del recipiente y vaciar el contenido
en cajas Petri previamente esterilizadas, teniendo cuidado de no tocar con los dedos la boca del
recipiente y de no apoyarla en los bordes de las cajas a fin de evitar el escurrimiento del medio. Dejar
las cajas en reposo durante 20 minutos para que solidifique el agar y después voltearlas para evitar que
se forme agua de condensación en las tapas.
10. Rotular el material con el nombre del medio y la fecha de preparación.
Diagrama de flujo
1. Rotular el material con el nombre del medio y la fecha de preparación.

2. Para comprobar la esterilidad del material, incubarlo durante 24 hrs a 37°C o 48°C a 28°C. Al término de
este tiempo, revisar cuidadosamente el material y observar que no haya desarrollo microbiano.
3. Registrar resultados del proceso de esterilización, así como de la preparación de las placas.
4. Los medios cuya esterilidad haya sido comprobada, podrán ser utilizados, en tanto que los contaminados
deberán ser correctamente desechados, esterilizándolos primeramente.
5. Si los medios no se van a utilizar inmediatamente, protegerlos con bolsas de polietileno y almacenarlos en
refrigeración.
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Preparación de agar inclinado en tubo (agar nutritivo).

2. Calcular la cantidad necesaria para preparar el volumen de agar nutritivo requerido.
3. En una balanza calibrada, pesar con precisión la cantidad requerida del medio en polvo. Para evitar la
hidratación y contaminación, tapar inmediatamente el frasco y colocarlo en su lugar.
7. Calentar sin llegar a ebullición y en agitación hasta disolver el agar. El medio queda listo cuando se
observa translucido.
8. Distribuir el agar nutritivo en cada tubo de 3 a 5 ml de agar fundido.
10. Para tener tubos con medio en pico de flauta, estos deberán colocarse en una superficie inclinada de
tal manera que, el medio se solidifique a una distancia aproximada de 1-2 cm de la boca del tubo, el
medio deberá ocupar las 2/3 partes del tubo cuidando que la columna del fondo tenga
aproximadamente 1 cm de profundidad y evitar el contacto entre el pico de flauta y el tapón.
Diagrama de flujo
v Indicar si aplicaron los métodos de esterilización adecuados para los medios de cultivos preparados.
v ¿Cuáles son las tres principales recomendaciones para una correcta preparación de medios de cultivo?
v Indicar si el proceso de esterilización aplicado al medio de cultivo fue eficiente.
v Clasificar los medios de cultivo preparados de acuerdo con su composición, estado físico y aplicación.
v Describir las dificultades a las que se enfrentó y los errores que cometió durante el desarrollo de esta
práctica, así como las consecuencias de estos cuando sean utilizados en cultivos de microorganismos.
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Módulo I
Práctica 3. Técnicas de siembra y cultivo de microorganismos
Objetivos
1. Organizar el material para su identificación y fácil manejo dentro de una zona aséptica.
2. Manipular adecuadamente los dispositivos que se emplean en la transferencia de cultivos microbiano.
3. Aplicar diferentes técnicas de siembra y aislamiento de bacterias.
Fundamento
El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del conocimiento de técnicas de siembra o
inoculación y de aislamiento para transferirlos de un medio a otro, o para mantener su crecimiento y actividad.
Es indispensable para realizar diversos estudios morfológicos, de identificación, bioquímicos, de patogenicidad
y ecológicos, entre otros.
Para efectuar la siembra o inoculación de microorganismos es necesario considerar la ubicuidad de los mismos y
no perder de vista que el aire y todas las superficies están densamente pobladas por ellos; de este modo en la
transferencia de muestras microbiológicas se debe tener en cuenta una serie de cuidados a fin de eliminar los
riesgos de contaminación. Estos incluyen: limpieza y sanitización del área de trabajo y de las manos, esterilización
de los dispositivos y medios de cultivo por emplear, y realizar la transferencia en un área libre de
microorganismos, es decir en un área aséptica.
El dominio de la técnica aséptica es esencial en el laboratorio de microbiología, y constituye una de las primeras
técnicas que el microbiólogo tiene que aprender. La transferencia de una muestra o inóculo a un medio de cultivo
se efectúa mediante diferentes técnicas y dispositivos de acuerdo con el estado físico del inóculo y del medio, así
como el objetivo del estudio, los cuales se muestran en la tabla 9.
En cualquier técnica de siembra es fundamental realizar correctamente la inoculación o transferencia de la
muestra, por lo que a continuación se describen los cuidados generales que se deben tener para la realización del
procedimiento.
1. Organización del material en el área previamente sanitizada y desinfectada.
2. Identificación del material por inocular.
3. Homogenización del cultivo o muestra, especialmente cuando se encuentra en estado líquido.
4. Esterilización del asa
5. Tomar los tubos o matraces por la parte inferior para facilitar su manejo y evitar quemaduras o
contaminantes.
6. Sujetar los tapones entre el dedo meñique y la palma de la mano.
7. Al destapar los tubos, flamear la boca de los mismos y mantenerlos en posición inclinada y con la boca
cerca de la flama del mechero.
8. Es innecesario tomar muestras grandes de cultivos microbianos
9. Finalmente, se recomienda efectuar la transferencia de la muestra en el menor tiempo posible.
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Tabla 9. Dispositivos de siembra por emplear de acuerdo con el tipo de medio de cultivo e inóculo
Medio de cultivo Tipo de inóculo Dispositivos de siembra

Líquido § Asa
Líquido § Hisopo
§ Pipetas (serológica, Pasteur, micropipeta)
§ Asa
Sólido
§ Espátula
Semisólido § Asa recta
Líquido
§ Pipetas (serológica, Pasteur, micropipeta)
Sólido § Asa recta
Sólido en tubo § Asa(bacteriológica o micológica)
§ Aguja
Líquido
§ Hisopo
§ Pipetas(serológica, Pasteur, micropipeta)
Sólido § Asa(bacteriológica o micológica) Aguja
Sólido en caja § Asa(bacteriológica o micológica)
§ Hisopo
Líquido
§ Pipetas(serológica, Pasteur, micropipeta)
§ Asa de Drigalsky
Sólido § Asa
Existen diferentes técnicas de siembra, no obstante, las más empleadas son: siembra o inoculación en caldo, en
medio semisólido y en medio sólido, cada una con sus respectivas variantes (véase figura 3 ). Con la aplicación
de cada técnica se obtiene información de importancia para el estudio básico o aplicado de los microorganismos
de interés.
Figura 3. Clasificación de las técnicas de siembra de acuerdo al

estado del medio de cultivo
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Material
Reactivos Instrumentos Equipos
§ Caja Petri con 20ml de agar (TSA). § Asa bacteriológica. § Incubadora.
§ Caja Petri con 20ml de agar (PDA) o § Asa de Drigalsky. § Baño maría.
(DSA). § Asa micológica.
§ Cepas de referencia: E. coli, § Caja Petri estéril.
Micrococcus luteus, Aspergillus § Gradilla.
niger, Staphylococcus sp. § Hisopo.
§ Mechero de Fisher.
§ Pipetas de 1ml estériles.
§ Pipetas Pasteur.
§ Propipeta.
§ Rejilla metálica.
§ 6 tubos de ensayo de 16x150mm con
medio de cultivo.
§ Vaso de precipitado.
Procedimiento
1. Etiquetar correctamente todo el material que a sembrar (tú nombre, nombre del microorganismo, fecha y
grupo al que perteneces).
2. Separar un tubo con medio líquido, uno con medio semisólido, uno con agar inclinado y una placa de agar
y marcarlos como controles.
3. Inocular los medios de cultivo líquidos (asa), semisólidos (punsión) y sólidos (estría simple y cruzada;
dispersión con varilla; punsión) para ello emplear las técnicas de siembra adecuada.
Diagramas de flujo
A. Inoculación en medio líquido.
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B. Inoculación en medio semisólido.

1. Con punsión.
2. Estría simple en tubo inclinado.
Incubar los cultivos bacterianos a 37°C durante 24 a 48 h.

4. Vaciado en placa.
1. Colocar 1 ml de la dilución en una caja Petri diferente (estéril).
2. Adicionar 15 ml de agar nutritivo mantenido a 42-45°C aproximadamente.
3. Homogenizar girando suavemente la placa (6 movimientos de arriba hacia abajo; 6 de derecha a
izquierda, 6 rotaciones hacia la derecha y 6 rotaciones a la izquierda).
4. Deje solidificar el medio, invertir e incubar los cultivos bacterianos a 37°C durante 24 a 48 h.
Diagrama de flujo
5. Dispersión con varilla de vidrio (Drigalsky).

1. Colocar 0.1 ml de la dilución seleccionada sobre la superficie de una placa de medio sólido de agar
nutritivo.
2. Dispersar el inóculo en toda la superficie del medio, empleando una varilla de vidrio y previamente
flameada (debe estar fría cuando se toque la suspensión de bacterias).
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3. Deje absorber el inóculo e invierta las placas e incube los cultivos bacterianos a 37°C durante 24
a 48 h.
Diagrama de flujo
6. Estría cruzada.
1. Flamear el asa bacteriológica hasta llevarla al rojo vivo.
2. Deje enfriar el asa y de la dilución de la muestra tomar una asada.
3. Descargar el asa en la orilla de la placa del medio de cultivo sólido haciendo una estría continua de
dicha orilla hacia el centro.
4. Una vez que se realice la primera estría se flamea el asa suavemente.
5. Sin volver a tomar cultivo, hacer otra estría continúa procurando que la porción inicial de ésta toque
la porción final de la primera estría.
6. Repetir lo anterior hasta llenar la placa con 3 estría, teniendo la precaución de flamear y enfriar el
asa antes de empezar cada una de las estrías.
7. Cuando solo le quede una pequeña porción de la superficie de la caja hacer una última estría muy
abierta.
Ø NOTA: Flamee el asa antes de cada serie de estrías. Con la última serie de estrías, NO debe
volver a tocar la primera serie.
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TecNM | ITLP
Diagrama de flujo
4. Invierta e incube los cultivos bacterianos a 37°C durante 24 a 48 h, y el fúngico a 28°C durante
5 días.
v Comparar los tubos y cajas control con los inoculados y describir las diferencias observadas.
v En el medio líquido indique en que zona del tubo se encuentra el desarrollo, y especifique si el crecimiento
fue, a) homogéneo, b)floculante, c)anillo, d) película o e) membranoso. Además describa el olor percibido.
v Comparar el desarrollo obtenido en medio semisólido inoculado con aguja y con pipeta, e indique:
a) En cuál y cómo se manifiesta la movilidad.
b) En qué zona se observa el crecimiento y a qué se debe.
v Comparar el desarrollo de los tubos inclinados por estría ondulada y recta; y señale las semejanzas o
diferencias observadas.
v Comparar el desarrollo obtenido en las cajas sembradas por estría e indicar:
a) En cuál de ellas se logró tener colonias separadas.
b) Describa la morfología colonial de tres colonias diferentes aisladas, tomando en cuenta su forma,
color, pigmentación al medio, elevación, superficie y consistencia.
v Observar las diferencias y similitudes que presenta el desarrollo obtenido por inoculación por estría, por
extensión y por vertido en placa.
v ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la técnica de estría cruzada? Proponga otras técnicas de
aislamiento en medios sólidos que se aplican en microbiología.
v Describa las diferencias que presenta el desarrollo de la bacteria y el hongo en estudio.
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Módulo I
Práctica 4. Preparaciones fijas y teñidas
Objetivos
1. Realizar adecuadamente las preparaciones y tinciones comúnmente empleadas para el estudio
microscópico de los microorganismos.
2. Identificar y describir correctamente las características microscópicas de las bacterias.
3. Seleccionar y aplicar la o las tinciones adecuadas para resolver problemas específicos.
4. Organizar e interpretar correctamente los resultados del estudio microscópico de los microorganismos.
Fundamento
Los microorganismos vivos o activos son por lo general incoloros (excepto algas y cianobacterias), por lo que no
se observan con facilidad en un microscopio óptico de campo claro por la falta de contraste entre las células y el
medio circundante, por lo que es necesario fijarlos y teñirlos en un frotis.
Un frotis se prepara distribuyendo una pequeña suspensión de los microorganismos sobre una superficie
transparente que, posteriormente, se fija a la superficie con calor o solventes orgánicos; lo que causa la
inactivación o muerte celular y algunas modificaciones de sus características. Existen diferentes tipos de tinciones,
no obstante las más comunes se clasifican en:
1. Preparaciones en fresco. Son aquellas en la que los microorganismos pueden observarse vivos y sin teñir
y se emplean para observar la movilidad, el tamaño, la agrupación de los microorganismos, y para
identificar algunas estructuras celulares, como las esporas y los cloroplastos.
2. Preparaciones especiales. Se utilizan para evitar el daño de ciertos microorganismos, así como de sus
estructuras, se pueden observar con o sin colorantes y pueden realizarse por:
¾ Extensión de la muestra con portaobjetos.
¾ Impronta.
3. Preparaciones fijas y teñidas. Aquellas que se basan en la preparación de un frotis y en la utilización de
colorantes básicos y ácidos para la identificación de los microorganismos. Se clasifican en:
¾ Tinción negativa: cuando no se tiñe la estructura de interés
a. Tinción de cápsula: dado que la cápsula procariota no se combina fácilmente con colorantes, se
observa utilizando tinta china o nigrosina para oscurecer el fondo.
¾ Tinción positiva: se colorea directamente a los microorganismos o a las estructuras en estudio.
a. Tinción simple. Consisten en aplicar un solo colorante a la preparación para observar la
morfología, tamaño y agrupación de los microorganismos. Se utilizan principalmente colorantes
básicos como el azul de metileno, el cristal violeta o la safranina.
b. Tinciones diferenciales. Consisten en aplicar una combinación de colores, mordentes y
decolorantes que permiten poner de manifiesto alguna diferencia importante en la composición
química de los microorganismos. En bacteriología las dos tinciones más importantes son la de
Gram y la de Ziehl-Neelsen.
c. Tinciones selectivas o específicas. Son aquellas que permiten observar una estructura y organelo
celular determinado, en algunos casos se requieren mordentes, agentes acidificantes o
precipitantes. Las tinciones selectivas más importantes son: tinción de endosporas, flagelo y
genoma.
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Materiales
Reactivos/Microorganismos Instrumentos Equipos Otros

§ Azul de metileno § Asa bacteriológica § Microscopio § Kleenex
§ Cristal violeta § Gradilla § Pinza sujetadora
§ Safranina al 0.5% § Mechero
§ Alcohol-acetona § Pipetas Pasteur c/ bulbo
§ Verde de malaquita § Portaobjetos
§ Tinta china § Cubreobjetos
§ Lugol § Piseta
§ fucsina fenicada § Tela de alambre y tripié
§ Albúmina 1% § Soporte para calentar
§ Klebsiella pneumoniae preparaciones
§ Ácido acético al 5%
§ Cultivos de 7 días de
Bacillus subtilis
§ Cultivos de 72 h de
Mycobacterium sp. y
Staphylococcus aureus
Procedimiento
A) Preparación de los frotis.
1. Organizar el área de trabajo y colocar todo lo necesario, sin movimientos bruscos a fin de evitar
accidentes o contaminación de los cultivos.
2. Lavar y desengrasar los portaobjetos y cubreobjetos a utilizar.
3. Esterilizar el asa hasta que todo el alambre esté al rojo vivo.
4. Introducir el asa en el tubo o placa que contenga el microorganismo de interés.
5. Colocar la muestra en la parte central del portaobjetos y extenderla.
6. Para cultivo en medio sólido, es necesario suspender la muestra en una gota de agua y extenderla.
7. Dejar secar la preparación a temperatura ambiente.
8. Esterilizar el asa para eliminar la muestra restante.
9. Fijación
a) Con metanol (bacterias procedentes de medio liquido): añadir unas gotas de metanol sobre el frotis
completamente seco y esperar a que el metanol se evapore completamente.
b) Por calor: pasar el frotis con cuidado sobre la flama de cuatro a cinco veces. Evitar exponer por
tiempos muy prolongados el frotis sobre la flama del mechero.
10. El frotis está listo para teñir.
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TecNM | ITLP
Diagrama de flujo
B) Tinciones simples.
1. Hacer un frotis de cada uno de los microorganismos en estudio y rotularlo con su nombre o clave.
2. Cubrir la zona del portaobjetos que contiene la muestra con el colorante elegido y dejarlo actuar por
un minuto.
3. Eliminar el exceso del colorante y lavar la preparación con un chorro muy fino y suave de agua
destilada para eliminar todo exceso de colorante.
4. Escurrir, secar la preparación al aire y colocarla en la platina del microscopio.
5. Observar con objeto de inmersión, registrar las observaciones y describirlas en términos
microbiológicos.
Diagrama de flujo
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TecNM | ITLP
C) Tinciones diferenciales.
¾ Tinción de Gram.
1. Hacer un frotis de cada uno de los microorganismos en estudio y rotularlo con su nombre o clave.
2. Cubrir la zona del portaobjetos que contiene la muestra con cristal violeta y dejar actuar durante 1
min.
3. Eliminar el exceso del colorante, lavar con agua destilada y escurrir.
4. Añadir Lugol y dejarlo actuar durante 1 minuto.
5. Repetir los mismos pasos anteriores para eliminar el colorante.
6. Añadir de 5 a 10 gotas de alcohol-acetona y dejar actuar por 30 segundos.
7. Lavar y posteriormente añadir safranina durante 30-60 segundos.
8. Eliminar el exceso y lavar.
9. Dejar secar a temperatura ambiente la preparación.
Diagrama de flujo
¾ Tinción de Ziehl-Neelsen.
Preparación del frotis
1. En un portaobjetos limpio y desengrasado. Colocar tres gotas de agua (o de una solución de
albúmina al 1%).
2. En la primera gota emulsificar una muestra del cultivo de Mycobacterium sp; en la segunda, una
muestra del cultivo Staphylococcus aureus y en la tercera una mezcla de los microorganismos
anteriores.
3. Secar al aire y fijar a la flama.
32
TecNM | ITLP
Diagrama de flujo
Tinción sin calentamiento

1. Cubrir la preparación con el colorante primario (fucsina fenicada concentrada y adicionada de
Tween 80) y dejar actuar durante 5 a 10 minutos sin calentar.
2. Lavar la preparación con agua corriente.
3. Decolorar agregando la solución alcohólica acida, mantener la preparación inclinada y dejar correr
hasta que no arrastre colorante.
4. Lavar con agua corriente.
5. Agregar azul de metileno de Löffler y dejar reaccionar durante 1 a 2 minutos.
6. Lavar con agua, dejar secar y observar la preparación al microscopio.
Diagrama de flujo
D) Tinciones selectivas.
¾ Tinción de endosporas.
Preparación de frotis 1.
1. Cubrir un frotis de cada uno de los microorganismos con azul de metileno y dejarlo actuar durante
un minuto. Lavar y secar al aire.
2. Observar con objeto de inmersión y anotar resultados.
33
TecNM | ITLP
Diagrama de flujo
Preparación del frotis 2 (Método de Wirtz-Cortitlin).

1. Cubrir el segundo frotis de cada microorganismo con verde de malaquita, calentar la preparación
hasta que el colorante se empiece a evaporar, continuar calentando durante 10 minuto. Cuidar que
el colorante NO hierva y de mantener húmeda la preparación.
2. Escurrir el exceso de colorante y lavar con agua.
3. Cubrir la preparación con safranina 0.5% y dejarla reaccionar durante 30 segundos.
4. Lavar la preparación, dejarla secar al aire y observar con el objetivo de inmersión.
Diagrama de flujo
E) Tinciones negativas.
¾ Tinción de cápsula.
1. Hacer una suspensión ligera en solución salina de K. pneumoniae y mezclar una gota de esta
suspensión con una pequeña gota de nigrosina o tinta china en el borde central de un portaobjetos.
2. Dejar secar al aire (NO SE FIJA CON CALOR)
3. Observe con el objetivo de inmersión.
Diagrama de flujo
34
TecNM | ITLP
Tinciones simples v Comparar las preparaciones de los cultivos puros, con los de productos
naturales.
v Identificar las formas de las bacterias.
v Examinar cuidadosamente los bacilos para detectar sus diferencias.
v Localizar células de bacterias y levaduras en procesos de división:
indicar las diferencias que presentan.
v Comparar los tamaños de diferentes bacterias entre sí y con las
levaduras.
Tinciones v Observar las preparaciones de los cultivos control y verificar que
diferenciales presenten la tinción de Gram característica.
v Observar la presencia conjunta de Gram positivos y negativos en las
muestras naturales.
v Comparar el Gram de los cultivos en estudio con los cultivos control e
indicar cual es el Gram que presentan.
v Comparar las preparaciones de los microorganismos estudiados, hasta
distinguir los colores típicos de los microorganismos ácido-alcohol
resistentes, de los que no lo son.
v Comparar la morfología y tamaño de los microorganismos.
Tinciones selectivas v Registrar todas las características de las endosporas bacterianas:
o especificas tamaño y localización dentro de la célula.
Tinción negativa v Comparar el groso de la cápsula con el diámetro de la célula.
v Relacionar el tamaño de la cápsula con la viscosidad del medio y
localizar cápsulas que alberguen a más de una bacteria.
35
TecNM | ITLP
Módulo I
Práctica 5. Estudios de bacterias
Objetivos
1. Manipular adecuadamente cultivos puros.
2. Aplicar las diferentes técnicas de siembra que se emplean para el estudio de bacterias.
3. Relacionar la presentación del medio de cultivo con la técnica de siembra.
4. Identificar y describir correctamente las características de cultivo y microscópicas de algunas bacterias.
5. Comprobar la pureza de los cultivos mediante tinción de Gram.
6. Organizar e interpretar los resultados del estudio macroscópico y microscópico.
Fundamento.
La Eubacterias son microorganismos que tienen dimensiones de 0.2 a 10 µm, y son predominantemente
unicelulares, aunque también existen formas filamentosas. En este tipo de células el material genético no está
separado del citoplasma por un sistema de membrana unitaria. La membrana citoplasmática forma intrusiones
vesiculares, laminares y tubulares que están asociadas con la respiración y la fotosíntesis. Tienen ribosomas del
tipo 70S dispersos en el citoplasma. La presencia de una envoltura celular constituida por una pared rígida es
común pero no universal. La célula puede ser inmóvil o tener movilidad mediada por flagelos bacterianos o por
desplazamiento sobre superficies.
Se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan en el agua, en el suelo, en la superficie o en el

interior de plantas y animales incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o establecer simbiosis positivas
y negativas con otros organismos. Fisiológicamente este grupo presenta características muy variables en lo que
respecta a movilidad, fuente de carbono, energía y factores de crecimiento.
El dominio Eubacteria está dividido en 23 filos que se subdividen en 28 clases. Para propósitos prácticos éste se
divide en tres subgrupos fenotípicos.
a) Con pared celular gramnegativa.

b) Con pared celular grampositiva.
c) Células que carecen de pared celular.
El Comité Internacional de Sistemática de Procariotas (ICSP), es el organismo encargado de la nomenclatura,

taxonomía y las normas según las cuales son designados los procariotas a través del Código Internacional de
Nomenclatura Bacteriana (ICBN). No obstante, no existe una clasificación oficial de los procariotas porque la
taxonomía sigue siendo una cuestión de criterio científico. La clasificación más aceptada es la elaborada por la
oficina editorial del Manual Bergey de Bacteriología Sistemática.
La taxonomía polifásica consiste en nuevos métodos de identificación y criterios para la descripción de nuevas
especies de acuerdo a métodos fenotípicos, genotípicos y filogenéticos. La caracterización fenotípica continúa
siendo una parte indispensable de la descripción de propiedades que permite la diferenciación y la descripción de
los grupos.
36
TecNM | ITLP
A lo largo de esta práctica se abordarán algunos de los criterios que se emplean para caracterizar a las bacterias
ente las que se incluyen: tamaño, morfología celular, formas de agrupación, reacción a la tinción de Gram,
formación de esporas, movilidad, y características en medios líquidos y sólidos, en los que se presentan patrones
de desarrollo en cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las colonias.
Materiales
Reactivos/microorganismos Instrumentos Equipos Otros
§ Colorantes para la tinción § Mechero. § Microscopio. § Papel seda.
de Gram. § Tubos de ensayo de 16x150 con § Jarra de § Marcador/etiquetas.
§ Cultivos de 24 h de: solución salida isotónica, caldo anaerobiosis. § Paño limpio de
Bacillus subtilis, nutritivo, medio inclinado, algodón.
Escherichia coli, medio semisólido y medio
Micrococcus luteus, semisólido (fundir).
Proteus vulgaris, § Gradilla.
Pseudomonas aeruginosa, § Portaobjetos y cubreobjetos.
Serratia marcescens y § Charola para tinción.
Staphhylococcus aureus. § Pipeta Pasteur estéril.
§ Cultivos de 24 h de § Pipetas graduadas de 1 ml.
Streptomyces erythraeus y § Asa.
Streptomyces griseus. § Cajas Petri estériles.
§ Cultivos de 24 h de § Cajas Petri con TSA o gelosa,
Clostridium sp. YPDM.
§ 1 matraz con parafina estéril.
§ Tubos de 16x150 con agar
para anaerobiosis (fundir), de
caldo BHI, de tioglicolato y
de TSA o gelosa semisólida
(fundir).
Procedimiento
A. Técnicas de siembra para la caracterización de bacterias
1. A partir del cultivo puro de alguna de las siguientes cepas: Bacillus subtilis, Escherichia coli,
Micrococcus luteus, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens o
Staphylococcus aureus, preparar un frotis, teñir con Gram y observar con el objetivo de 100X.
2. Registrar sus observaciones.
3. Separar un tubo con caldo, uno con agar nutritivo inclinado, uno con agar nutritivo semisólido y una
placa con agar nutritivo y marcar como controles.
4. Identificar y organizar el material de modo que cada alumno cuente con el material indicado en la
figura. Preparar una suspensión bacteriana, para ello a partir del cultivo puro transferir 0.2 ml a uno
de los tubos de ensayo de 16x150 mm con 10 ml de caldo nutritivo (tubo 1).
5. Sembrar los medios de cultivo de acuerdo a su preparación.
6. A partir de la suspensión bacteriana inocular los tubos y cajas siguiendo las instrucciones de la figura
4.
7. Invertir las cajas para evitar que el agua de condensación caiga sobre los cultivos.
8. Incubar el material sembrado junto con los controles por 24 h a 37°C en condiciones aeróbicas.
37
TecNM | ITLP
9. Registrar los resultados
Figura 4. Técnicas de siembra para la caracterización de bacterias
B. Técnicas de siembra para bacterias con características especiales (actinobacterias)

1. Preparar una suspensión a partir del cultivo de Streptomyces erythraeus o Streptomyces griseus,
preparar un frotis, teñir con Gram y observar con el objetivo 100X.
3. Identificar una placa de YPDM como control.
4. Tomar una alícuota de la suspensión con una pipeta Pasteur estéril y colocar dos gotas del cultivo en
un extremo de una segunda placa de YPDM.
5. Estriar el cultivo sobre el medio con la técnica de estría radial.
6. Invertir las cajas inoculadas y el control e incubar a 28°C durante 3 a 7 días.
7. Registrar los resultados.
C. Caracterización de bacterias con diferentes requerimientos de oxígeno.
1. Preparar los frotis correspondientes a partir de cultivos de Escherichia coli, Micrococcus luteus,
Clostridium sp., teñir con Gram y observar con el objetivo 100X.
3. Organizar 4 series de tubos con los medios indicados en la figura 6.
4. Identificar los tubos de la serie 1 como controles y los otros con el nombre del microorganismo
correspondiente.
5. Inocular con una pipeta Pasteur la segunda serie con el cultivo de Clostridium sp.
6. Preparar suspensiones de Escherichia coli y Micrococcus luteus, y a partir de estas inocular las series
restantes en la forma indicada en el inciso anterior.
7. Agregar a los cuatro tubos que contienen BHI (tres inoculados y un control), una capa delgada de
parafina estéril fluida o aceite mineral estéril.
8. Colocar dentro de la cámara de anaerobiosis las placas en posición invertida.
9. Incubar las cajas y los tubos sembrados, así como los controles a 37°C durante 24 a 48 h.
38
TecNM | ITLP
Figura 5. Técnica de siembra para bacterias con Figura 6. Caracterización de bacterias con
características especiales diferentes requerimientos de oxigeno
v Observar las características culturales en los diferentes medios de cultivo.
v Describir las observaciones.
v Describir las características microscópicas de las diferentes bacterias.
v Comparar el desarrollo de las bacterias inoculadas en los diferentes medios para anaerobios, así como
las incubadas en anaerobiosis.
v Con base en los resultados obtenidos, indicar cual bacteria es aerobia, anaerobia, anaerobia facultativa
o microaerofílica.
39
TecNM | ITLP
Módulo I
Práctica 6. Cuantificación de microorganismos
Objetivos
1. Explicar el fundamento de las técnicas más utilizadas en el recuento microbiano: dilución y siembra por
vertido en plaza o número más probable, cuenta en placa por el método de extensión superficial, método
de Miles y Misra.
2. Establecer la cantidad de microorganismos en una muestra mediante la aplicación de métodos
estandarizados.
3. Explicar las causas que determinan la variación de los resultados.
Material
Reactivos/microorganismos Instrumentos Equipos
§ Cultivo microbiano. § Cajas Petri estériles. § Incubadora.
§ Agua peptonada al 0.1%. § Matraces Erlenmeyer de 250 ml § Baño maría a 45-50°C.
§ Solución desinfectante. de medio de cultivo.
§ Matraces de 300 ml con tapón
de baquelita.
§ Matraz de 500 ml con 250 ml de
diluyente estéril.
§ Mechero.
§ Pipetas de 1 y 10 ml estériles.
§ Cajas Petri con medio sólido.
§ Pipeta Pasteur o micropipeta.
§ Tubos de 16x150 mm.
§ Varilla de Drigalsky.
Procedimiento
A. Método de dilución y vertido en placa.
1. Procesamiento de la muestra. Cuando se parte de muestras sólidas como alimentos y pastillas es
necesario fragmentarlas, para ello utiliza un mortero estéril, una licuadora con vaso estéril o bolsas
estériles para el “stomacher” con la finalidad de disgregar las muestras antes de preparar las diluciones.
En el caso de muestras particuladas como suelo y polvo, se suspenden directamente en el diluyente.
2. Preparación de las diluciones.
a) Colocar los tubos en una gradilla, en condiciones de asepsia adicionarles 9 ml exactos de diluyente
a cada uno. Distribuirlos en tres series de 5 tubos.
b) Rotular los matraces que contienen 90ml de diluyente con las claves A, B y C.
c) Rotulas los tubos de la primera serie con las diluciones A 10-2 - A 10-5.
d) Repetir el inciso con las otras dos series de tubos correspondientes a B y C.
e) Rotular tres series de cajas con las claves A(10-2 a 10-5), B(10-2 a 10-5) y C(10-2 a 10-5).
f) Realizar la primera dilución de acuerdo con el tipo de muestra:
¾ Sólida. Pesar 10g y transferirlos al matraz que contiene 90 ml de diluyente (dilución 1:10).
¾ Liquida. Introducir la pipeta a 2.5 cm de profundidad de la muestra, tomar 10 ml, descargar
el contenido en el matraz con diluyente, teniendo cuidado de evitar el contacto entre la pipeta
y el diluyente. Una vez que se haya vaciado la pipeta, esperar 3 segundos y colocar la pipeta
en el bote de material sucio.
40
TecNM | ITLP
g) Tapar el matraz y agitarlo, dibujando la trayectoria de un arco de 30 cm aproximadamente 25 veces

en 7 segundos hasta lograr la dispersión total de la muestra.
h) Introducir una pipeta estéril a 2.5 cm de profundidad del líquido de la primera dilución, aspirar y
dejar caer 10 veces el líquido (sin producir burbujas). Tomar 1 ml y transferirlo al primer tubo
(dilución 1:100), teniendo cuidado de que la pipeta no haga contacto con el líquido.
i) Preparar las diluciones 10-3 a 10-5 transfiriendo en cada ocasión 1 ml de la dilución anterior al
siguiente tubo que contiene 9 ml de diluyente, para ello hay que seguir las instrucciones del inciso
h.
j) Repetir los incisos f a i con los matraces y tubos de las series B y C.
3. Inoculación y vertido en placa. El medio de cultivo deberá fundirse previamente y mantenerlo en baño
maría a 45°C hasta el momento de su uso.
a) Con una pipeta limpia y estéril mezclar el contenido de la dilución 10-3 de la serie A, dejar caer el
contenido, esperar 3 segundos, tomar 1 ml de la dilución y colocarlo en el centro de la caja marcada
con la dilución correspondiente.
b) Con pipetas limpias repetir el procedimiento e inocular las cajas correspondientes con las
diluciones 10-4 a 10-5.
c) En condiciones de asepsia, añadir a cada una de las cajas inoculadas de 15 a 20 ml del medio
previamente fundido y mantenido a una temperatura de 45°C.
d) Colocar las cajas en la superficie de la mesa y moverlas suavemente en las direcciones siguientes:
en el sentido de las manecillas del reloj, describiendo círculos de unos 15 cm de diámetro, con un
recorrido de unos 15 cm; repetir el movimiento en sentido lateral. Realizar los movimientos 6
veces en cada dirección.
e) Repetir el procedimiento con las series B y C.
f) Dejar solidificar el medio, invertir las cajas e incubar a la temperatura adecuada para el tipo de
microorganismo que se va a cuantificar.(37ºC/24-48h)
g) Después de la incubación, observar el efecto de la dilución. Cuando éste sea aparente, seleccionar
las placas que muestren entre 30 y 300 colonias.
NOTA:
¾ Cuidar que el medio de cultivo tenga la temperatura adecuada.
¾ La inoculación puede hacerse directamente en tubos que contienen el medio de cultivo
previamente fundido, y después de ser inoculados y homogenizados se procede a vaciar el
contenido en una caja estéril, operación que debe realizarse rápidamente y antes de que el medio
solidifique.
h) Colocar la caja en el contador de colonias, con la tapa hacia abajo y la base hacia arriba y marcar
cada colonia con plumón.
i) Calcular la cantidad de microorganismos por mililitro o gramo de la muestra con la siguiente
fórmula:
𝑼𝑭𝑪 𝑷𝒓𝒐𝒎𝒆𝒅𝒊𝒐 𝒅𝒆 𝒄𝒐𝒍𝒐𝒏𝒊𝒂𝒔 𝒄𝒐𝒏𝒕𝒂𝒅𝒂𝒔 𝑿 𝒓𝒆𝒄𝒊𝒑𝒓𝒐𝒄𝒐 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒅𝒊𝒍𝒖𝒄𝒊ó𝒏
=
𝒎𝒍 𝑽𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒊𝒏𝒄𝒍𝒖𝒊𝒅𝒐 𝒆𝒏 𝒍𝒂 𝒄𝒂𝒋𝒂
NOTA:
¾ El recuento se realiza a simple vista colocando las placas sobre una pantalla iluminada que tiene
un lente de aumento.
41
TecNM | ITLP
¾ Para obtener una muestra representativa, contar las colonias que se encuentran en todas las áreas
con cuadricula pequeña.
¾ Obtener el promedio por cuadro (1 cm2).
¾ Calcular el área de la caja de Petri.
Obtener el número de UFC por volumen de la muestra inoculada mediante la siguiente fórmula:
𝑵ú𝒎𝒆𝒓𝒐 𝒅𝒆 𝑼𝑭𝑪 𝑼𝑭𝑪
𝟐
× Á𝒓𝒆𝒂 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒑𝒍𝒂𝒄𝒂 =
𝒄𝒎 𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆𝒑𝒐𝒔𝒊𝒕𝒂𝒅𝒐 𝒆𝒏 𝒍𝒂 𝒄𝒂𝒋𝒂
El resultado se expresa como unidades formadoras de colonias (UFC), no como número de
microorganismos.
Diagrama de flujo
B. Método de extensión superficial

1. Distribuir los tubos en una gradilla y rotularlos con las diluciones
2. Preparar las diluciones decimales de las tres series en la forma indicada en el método anterior.
3. Inoculación de las placas. En condiciones de asepsia.
a) Tomar 0.1 ml de la dilución 10-5 de la serie A, para ello emplear la pipeta calibrada o micropipeta
y colocarlo en el centro de la placa Petri.
b) Extender la gota sobre toda la superficie del medio con el asa de Drigalski, previamente esterilizada
por flameado con alcohol y enfriada.
c) Repetir el procedimiento con las diluciones 10-3 y 10-4.
d) Dejar que la muestra se absorba en el medio, invertir las cajas e incubar.
e) Repetir el procedimiento con las series B y C.
f) Contar el número de colonias desarrolladas en la superficie y calcular el número de
microorganismos/ml de la muestra.
g) Registrar los resultados.
42
TecNM | ITLP
Diagrama de flujo
C. Método de la gota de Miles y Misra

1. Dividir la parte externa inferior de las cajas en seis secciones con un marcador.
2. Marcar tres sectores de una caja con las diluciones A 10-2, B 10-2 y C 10-2 y los otros tres con A 10-3,
B 10-3 y C 10-3; tres sectores de la segunda caja con las diluciones A 10-4, B 10-4 y C 10-4 y los otros
tres sectores con A 10-5, B 10-5 y C 10-5.
3. Tomar una muestra de la dilución 10-2 de la serie A con una pipeta.
4. Destapar la caja, colocar la pipeta en posición vertical a una altura aproximada de 2 cm sobre la
superficie del medio de cultivo, dejar caer una gota en el centro del primer sector que corresponde a
la dilución.
5. Repetir los incisos 3 y 4 con las diluciones 10-3, 10-4 y 10-5 de cada serie de diluciones con lo que se
tiene cada dilución por triplicado.
6. Dejar que las gotas se absorban en el medio.
7. Invertir las cajas e incubar a la temperatura y tiempo adecuados para los microorganismos que se desea
cuantificar.
8. Después de la incubación, seleccionar los sectores que presenten entre 10 y 20 colonias y proceder a
la cuantificación de las mismas.
9. Calcular el número de bacterias/ml o g de la muestra con la siguiente fórmula.
𝑵×𝒇
𝑵𝒐. 𝒅𝒆 𝒃𝒂𝒄𝒕𝒆𝒓𝒊𝒂𝒔 𝒑𝒐𝒓 𝒎𝒍 𝒅𝒆 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 =
𝑽
Donde:
N= número promedio de colonias
F= inverso del factor de dilución
V= volumen que se coloca en la placa.
43
TecNM | ITLP
Diagrama de flujo
44
TecNM | ITLP
Módulo I
Práctica 7. Evaluación de agentes antimicrobianos
Objetivos
1. Aplicar las técnicas microbiológicas comúnmente utilizadas en la evaluación de agentes antimicrobianos
sobre cepas bacterianas y observar la respuesta frente a los diferentes tipos de compuestos.
Fundamento
Los antimicrobianos son compuestos que se obtienen a partir de bacterias, hongos y levaduras o de forma sintética.
Los de origen microbiano, por lo general, son metabolitos secundarios producidos durante la fase estacionaria de
crecimiento y presentan toxicidad selectiva, de tal forma que son muy efectivos contra los microorganismos, por
lo que se utilizan como agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de enfermedades infecciosas en seres
humanos y animales.
La resistencia antimicrobiana es la capacidad de las bacterias u otros microorganismos para contrarrestar el efecto
de algún antibiótico; esta resistencia sobreviene cuando la bacteria sufre algún cambio que reduce o elimina la
efectividad de antibiótico, compuestos químicos o cualquier otro agente destinado para curar o prevenir alguna
infección. La resistencia puede ser una consecuencia evolutiva vía selección natural, pero también es causada por
el uso indiscriminado de los agentes antimicrobianos.
De manera que, los antimicrobianos afectan el crecimiento microbiano en diferentes niveles y etapas del
crecimiento causando un efecto microbiostático, es decir, cuando se inhibe el crecimiento pero no se produce la
muerte, solamente hay inhibición de procesos, como la síntesis de proteínas por unirse a los ribosomas. En
cambio, un agente bacteriolítico induce la muerte mediante lisis celular y un bactericida elimina completamente
a la célula sin producir lisis o ruptura celular.
Los antibióticos que inhiben la síntesis de la pared celular y/o de la membrana plasmática son de gran aplicación
para la eliminación de especies bacterianas. El efecto particular de los antibióticos sobre grupos de bacterias
específicas se le conoce como espectro de acción.
Existen diversos métodos para determinar la sensibilidad bacteriana a los antibióticos, presentando además cada
uno de estos métodos, múltiples variantes. No obstante, el más popular es el antibiograma con discos de papel,
que es un método in vitro que permite determinar la susceptibilidad de los microorganismos a una variedad de
agentes antimicrobianos, bajo condiciones de laboratorio específicas y estandarizadas. La variante más utilizada
de este método es la de Kirby Bauer, la cual consiste en utilizar una sola concentración de antibiótico y medir el
tamaño de la zona de inhibición.
La eficiencia de un antibiótico se establece determinando la concentración mínima inhibitoria (CMI) que nos
indica “la concentración mínima en mg/ml de antibiótico necesaria para inhibir el crecimiento microbiano”.
Otro parámetro de evaluación de antimicrobianos es la cantidad mínima bactericida (CMB), que se refiere a la
concentración de agente antibiótico necesaria para producir una disminución del tamaño original del inóculo
bacteriano en un porcentaje mayor o igual al 99.9%. Muchas veces, el CMI es equivalente a la CMB.
45
TecNM | ITLP
Materiales
Reactivos/microorganismos Instrumentos Equipos
§ Cepas en caldo nutritivo de § 12 cajas de Petri con agar nutritivo. § Incubadora.
Staphylococcus sp. Escherichia coli y § 2 pipetas de cada volumen 10,5 y 1 ml.
Pseudomonas sp. § 30 círculos de papel filtro (Whatman 1)
§ Solución de ampicilina, penicilina G y de 10-15 mm de diámetro.
ketoconazol (100, 1500 y 5000 μg/ml) § Pinza de disección.
§ Solución de desinfectante comercial de § Mechero.
verduras o para limpieza (1:10, 1:100 y § 8 hisopos de madera de 20 cm.
1:1000).
§ Agua destilada estéril.
Procedimiento
1. Dividir la base de cada caja en cuatro cuadrantes con el uso de un plumón indeleble y rotular en cada
cuadrante las concentraciones a probar.
2. Introducir un hisopo estéril en la suspensión de la cepa correspondiente y sembrar las placas arrastrando
el hisopo por toda la superficie.
3. Con las pinzas de disección previamente flameadas y frías tomar un disco de papel filtro que se sumerge
en agua destilada estéril y se deje escurrir. Colocar cuidadosamente en el centro del cuadrante “control”,
asegurando el contacto del disco sobre el agar.
4. De la misma manera se sumergen discos de papel en las diferentes concentraciones de los antibióticos.
5. Realizar el mismo procedimiento para una de las cepas y diluciones correspondientes de cada agente.
6. Incubar las placas a 37°C durante 24 horas.
Diagrama de flujo
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TecNM | ITLP
Resultados
1. Retirar con la pinza de disección los discos y medir el diámetro (mm) de las zonas de inhibición del
crecimiento microbiano en relación al control.
2. Los cuadros de resultados se compartirán en el grupo para calcular la desviación estándar y el
coeficiente de variación.
3. Reportar el diámetro de inhibición del crecimiento en la tabla 10.
Tabla 10. Resultados de inhibición del crecimiento bacteriano frente a antimicrobianos.
Concentración de Diámetro de inhibición (mm)

antibiótico μg/ml Control Staphylococcus sp. E. coli Pseudomonas sp. CMI
(mg/ml)
Ampicilina
0
100
1500
5000
Penicilina G
0
100
1500
5000
Ketoconazol
0
100
1500
5000
Desinfectante
comercial
0
1:10
1:100
1:1000
v Discutir los resultados con base en la capacidad de cada microorganismo para crecer en diferentes
concentraciones de agentes antimicrobianos.
v Comparar los resultados de CMI obtenidos con los reportados en la literatura.
v De los antimicrobianos, ¿Cuál presentó mayor espectro de inhibición?¿Por qué?
v Explique el mecanismo bioquímico de inhibición de cada uno de los antimicrobianos probados.
v Explique el porqué de los resultados de CMI para cada uno de los agentes y bacterias.
47
TecNM | ITLP
Este apartado tiene la finalidad de

proporcionar las herramientas y
conocimientos necesarios para que los
alumnos puedan llevar a cabo un
correcto aislamiento, identificación,
caracterización y diferenciación de los
hongos y levaduras.
Así mismo, se pretende que los
protocolos y técnicas presentes en este
módulo le permitan al estudiante
Módulo II adquirir la capacidad de distinguir entre
Aislamiento, identificación y las diferentes técnicas microbiológicas.
caracterización de hongos y levaduras
48
TecNM | ITLP
Módulo II.
Práctica 8. Aislamiento y morfología de hongos
Objetivos
1. Aislar cepas fúngicas a partir de una muestra conocida.
2. Identificar estructuras fúngicas.
Fundamento
Los hongos son organismos eucariotas que pueden ser uni o multicelulares y microscopicos o macroscópicos.
Presentan dos tipos de células; las somáticas y las reproductoras; las primeras incluyen núcleos muy pequeños y
su proceso de división es por mitosis, en tanto que las reproductoras poseen núcleos más grandes y su división
celular es por meiosis. Como todos los organismos eucariotas poseen organelos característicos y su pared celular
está constituida por quitina, celulosa, glucanos, manonas y algunos glicopéptidos, compuestos cuya proporción
varía en los diferentes tipos de hongos, por lo que se usa para su identificación.
Se encuentran ampliamente distribuidos y viven en cualquier sitio que presente material orgánico, agua y una
temperatura adecuada, comprendida entre 4 y 60°C. Su hábitat es diverso, la mayoría son terrestres, sin embargo
existen acuáticos y algunos establecen asociaciones con otros organismos a los que pueden beneficiar
(mutualismo) o perjudicar (parásitos).
Los rasgos de los hongos considerados como criterios para su identificación y clasificación corresponden a
características:
a) Estructurales. Tipo de talo, morfología macroscópica del micelio, tipos de hifas, diferenciación y
disposición o agrupación de las mismas.
b) Reproductivas. Tipo de hifas reproductivas asexuales, estructura y modo de formación del cuerpo
fructífero sexual, tipos de esporas (forma, tamaño, aspecto externo, agrupación, tabicación, color,
movilidad).
c) Fisiológicas. Saprófitos y parásitos.
d) Composición de la pared celular. Quitina, celulosa, glucanas, mananas y glicopéptidos.
e) Características de biología molecular.
Por lo regular, los hongos se examinan en preparaciones húmedas, tomando muestras del micelio con un asa
rígida y ligeramente planas o bien, utilizando cinta adhesiva transparente, cuya operación debe realizarse con
mucho cuidado para evitar que las esporas y otras estructuras se destruyan.
Para ser observados se utiliza azul de lactofenol dado que aparte de teñir, también actúa como clarificante de la
muestra, gracias a la acción conjunta del ácido láctico y el fenol, además el fenol se comporta como un mordiente
y a la vez evita la lisis del microorganismo al inhibir las enzimas hidrolíticas que puedan estar presentes. El ácido
láctico preserva la morfología de las estructuras del hongo.
En el aislamiento y cultivo de la mayoría de hongos, se aprovechan algunas características especiales de los
mismos, como su tolerancia a pH ácido, su preferencia por medios de cultivo con gran cantidad de azúcar
fermentable. Gracias a su resistencia a la penicilina y estreptomicina, estos antibióticos al ser agregados a los
medios de cultivo, permiten eliminar a las bacterias contaminantes.
49
TecNM | ITLP
Materiales
§ Agar papa y dextrosa (PDA). § Espátula. § Balanza analítica. § Muestra opcional
§ Colorante azul de lactofenol. § Gradilla. § Microscopio. con presencia de
§ Aceite de inmersión. § Mechero. § Incubadora. hongos.
§ Agar nutritivo. § Pipeta de 1 ml. § Cinta adhesiva
§ Porta y cubreobjetos. transparente.
§ Varilla de dispersión. § Tijeras.
§ Tubo de cultivo con 9 § Papel especial para
ml de solución salina óptica.
estéril.
Procedimiento
A) Aislamiento.
1. Pesar 1g de muestra (cortando solo la corteza donde se observe crecimiento fúngico).
2. Colocarlo en el tubo de cultivo con 9 ml de solución salina estéril y homogenizar.
3. De la dilución realizada tomar 1 ml por cada medio, sembrar por vertido en agar nutritivo y PDA.
4. Después de 5 días de incubación a 28°C, revisar las siembras, tomar fotografía y anotar observaciones
para el análisis.
Diagrama de flujo
B) Morfología
1. Cortar un tramo (5 cm aprox.) de cinta adhesiva transparente.
2. Colocar sobre la muestra la superficie adhesiva de la cinta.
3. La cinta (parte adhesiva) con crecimiento fúngico colocarla sobre una gota de azul de lactofenol
previamente montada en un portaobjetos.
50
TecNM | ITLP
4. Observar al microscopio con los diferentes objetivos y documentar.
v ¿Cuáles son las diferencias entre los procedimientos de observación de bacterias y hongos?
v ¿Cuáles son los principales criterios de identificación de los hongos?
v Describir el fundamento del medio PDA.
51
TecNM | ITLP
Módulo II.
Práctica 9. Aislamiento e identificación de mohos y levaduras
Objetivos
1. Identificar y cuantificar mohos filamentos y levaduras en productos de interés biotecnológico.
Fundamento
Los hongos son organismos eucariotas, de mayor tamaño y complejidad que las bacterias. Se distinguen de otros
eucariontes, como los animales, por ser inmóviles y, de las algas y plantas, por carecer de pigmentos
fotosintéticos. Son de nutrición heterótrofa; es decir, dependen de nutrientes orgánicos disueltos por sistemas
enzimáticos específicos, que son absorbidos a través de su pared celular y membrana plasmática.
En este grupo de organismos se encuentran formas unicelulares (levaduras) o pluricelulares (filamentosos). Las
levaduras son células de forma esférica u oval, ampliamente distribuidas en la naturaleza; con frecuencia se
encuentran formando una cubierta pulverulenta fina sobre frutos y hojas. Las levaduras se reproducen en forma
asexual por gemación, un proceso por el cual brota una protuberancia o yema de la célula madre que,
posteriormente se separa como célula individual.
Los hongos filamentosos (mohos) tienen una estructura vegetativa característica denominada hifa. El conjunto de
hifas ramificadas constituye el micelio. Las hifas de algunos hongos presentan tabiques transversales o septos,
aunque en el caso de los hongos que pertenecen al grupo Zygomycota, las hifas no presentan estos septos y se
conocen como hifas cenocíticas.
El principal mecanismo de reproducción de los hongos es asexual por fragmentación de hifas vegetativas o por
la producción de esporas en conidióforos y esporangióforos, formados en hifas aéreas, llamadas reproductivas.
La presencia de estructuras de reproducción sexual, es el principal criterio de clasificación que permite ubicar a
los hongos en tres divisiones o phyla: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota. Otros criterios importantes para
la clasificación de los hongos son las características de las hifas y las estructuras de producción de esporas
asexuales.
Para estudiar a los hongos se dispone de dos tipos de cultivos:
1. Los microcultivos, que son aquellos que se pueden observar directamente día a día, lo que permite hacer
el seguimiento del desarrollo del hongo en estudio.
2. Los cultivos en placa, que se siembran por picadura en el centro de las placas que contienen diferentes
medios.
Los zimogramas se emplean para la identificación de diversos géneros y especies fúngicas, principalmente
levaduras con base en su capacidad de fermentar azúcares, utilizando un medio base que contiene carbohidratos
y un indicador de pH.
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Materiales
§ Agua peptonada al 0.1%. § Pinzas de disección § Autoclave. § Muestra con
§ Agar PDA a 45°C, PDA y estériles. § Incubadora a 28 y presencia
DSA en tubo. § Espátula. 35°C. fúngica.
§ Agar Rosa de Bengala. § Caja Petri estéril. § Balanza analítica. § Papel para óptica.
§ YPD, PDA y DSA en caja § Asa de platina. § Baño maría. § Barniz
Petri. § Bisturí estéril. § Contador de colonias. transparente.
§ Glicerol al 10%. § Cámara de microcultivo § Microscopio. § Muestra con
§ Formol al 10%. estéril. levaduras.
§ Ácido tartánico al 10% § Pipeta Pasteur.
§ Kit de tubos con base de rojo § Pipetas de 1 ml
fenol que contenta (dextrosa al estériles.
10%, maltosa al 10%, sacarosa
al 10%, galactosa al 10%,
lactosa al 10%, trehalosa al
10%), alcohol al 70%.
§ Aceite de inmersión.
Cuestionario previo
1. Anota la composición y utilidad de los medios de cultivo: PDA, DSA, ARB y YPD.
2. Describe el fundamento de la técnica de microcultivo.
3. ¿Por qué se inocula con esporas y micelio un medio de cultivo?
4. ¿Por qué se utiliza la técnica de punto para sembrar mohos?
5. ¿Por qué es necesario realizar la técnica de microcultivo para identificar mohos?
6. ¿Cuál es la función del glicerol y el formaldehído en un microcultivo?
7. ¿Cómo identificarías un moho contaminante de un producto biológico?
8. ¿Qué otras técnicas se utilizan para la identificación de levaduras?
9. ¿Cuáles son las mejores condiciones físicas para el desarrollo de la mayor parte de las levaduras?
10. ¿Qué requerimientos nutricionales debe contener un medio de cultivo de levaduras?
Procedimiento
A) Cuantificación de mohos filamentosos y levaduras.
1. Pesar y colocar 1g de muestra (pan, tortilla, verdura, tierra, fruta, etc.) que contenga mohos, en un tubo
que contenga 9 ml de agua peptonada al 0.1% con una pinza estéril y en condiciones de esterilidad.
2. Homogenizar y espera hasta que se sedimente.
3. Realizar diluciones decimales de 10-1 a 10-4 en tubos que contengan 9 ml de agua peptonada al 0.1%.
4. Llevar a cabo la técnica de vaciado en placa, colocando 1 ml de la dilución 10-2 hasta la dilución 10-4
en cajas de Petri estéril.
5. Vaciar a la caja aproximadamente 20 ml de agar papa y dextrosa previamente acidificado y a una
temperatura de 42°C.
6. Homogenizar perfectamente con movimiento circulares y dejar solidificar.
7. Realizar la técnica por duplicado.
8. Incubar una serie de placas a 28°C durante 5 días para mohos y otra serie durante 48 horas para
levaduras.
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9. Revisar las placas a las 48 y 72 horas y hacer recuentos correspondientes donde las colonias estén bien
aisladas. Realizar cálculos y reportar el número de UFC/ml o g.
Diagrama de flujo
¾ Aislamiento de levaduras.
1. Tomar una asada de la muestra (fruta, mermelada, cajeta en descomposición) y sembrar por la técnica
de estría cruzada en la caja de YPD.
2. Incubar a 35°C durante 48 horas.
Diagrama de flujo
B) Morfología colonial de mohos.

1. Observar la morfología colonial de los mohos aislados y reportar: tamaño, forma, aspecto, color del
micelio vegetativo y reproductor, además de observar si hay pigmento difusible.
C) Resiembra del moho aislado.
1. Elegir una colonia de moho bien aislada y sembrarla por punto en tubos con PDA y DSA, y en cajas
con agar rosa de bengala y DSA.
2. Incubar los tubos y las cajas a 28°C durante 48 horas.
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3. Una vez terminado el tiempo de incubación anotar las diferencias de morfología colonial en los
diferentes medios de cultivo.
Diagrama de flujo
D) Identificación de mohos por la técnica de Ridell (microcultivo).

1. De una caja Petri con agar PDA cortar cuadros de 1 cm de lado y 3 mm de espesor con un bisturí
estéril.
2. Con una pinza estéril colocar el cuadro PDA en un portaobjetos que esta sobre una varilla de vidrio
doblada en forma de “V” en una caja Petri (todo esto previamente esterilizado).
3. Tomar con el asa micológica doblada en “L” el inóculo del moho el cual se quiere identificar.
4. Inocular por picadura uno de los 4 lados del cuadro de agar PDA.
5. Colocar sobre el cuadro de agar el cubreobjetos y presionar ligeramente para que se adhiera este al
medio.
6. Adicionar a la caja 5 ml de glicerol al 10%. Sellar la caja Petri e incubarla a 28°C durante 48 horas.
7. Realizar observaciones mínimo cada 12 horas para identificar los cuerpos fructíferos.
8. Si se observa que el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar, quitar el glicerol con una pipeta
Pasteur.
9. Adicionar 5 ml de formaldehído al 10% para inactivar el moho. Esto es de 15 a 60 minutos.
10. Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo sobre un
portaobjetos limpio que contenta una gota de colorante de azul de algodón-lactofenol.
11. En el portaobjetos que aún se encuentra en la cámara coloque sobre un cuadro de agar y una gota del
mismo colorante y cubra con otro cubreobjetos limpio.
12. Realizar las observaciones de las preparaciones en el microscopio con el objetivo 10X y 40X.
13. Dibujas las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografía comparar las estructuras
reproductivas e identificar el moho.
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Diagrama de flujo
E) Observación microscópica de levaduras

1. De la placa de PDA y YPD que se incubó a 35°C seleccionar una colonia de levadura. Realizar
descripción de la morfología macroscópica (tamaño (mm),color, forma, borde, elevación, superficie,
consistencia, aspecto, pigmento difusible al medio).
2. Fijar la levadura de la misma forma que se fija una bacteria (pasándola ligeramente por el mechero).
3. Teñir la preparación con azul de metileno durante un minuto.
4. Lavar la preparación y dejar secar.
5. Observe la preparación al microscopio con el objetivo de 10X y 40X.
6. Dibuje sus observaciones.
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Diagrama de flujo
NOTA: poner una gota de Lugol en un portaobjetos limpio; tome una asada de la colonia de levadura seleccionada
y mézclela con la gota de Lugol; coloque un cubreobjetos sobre la preparación y observe con el microscopio.
F) Zimograma.
1. Tomar una colonia de levadura aislada e inocular cada tubo que contiene diferentes azúcares, incubar
a 72 horas y observar fermentación de carbohidratos comparando con la tabla 11.
Tabla 11. Identificación de levaduras del género Candida.
Microorganismo Dextrosa Maltosa Sacarosa Galactosa Lactosa Trehalosa

Candida albicans + + - + - +
Candida tropicalis + - + + - +
Candida glabrata + - - - - +
Candida guilliermondii + - + + - +
Candida parapsilosis + - - + - +
Candida krusei + - - - - -
Candida kefyr + - + + + +
Candida lipolytica + - - - - -
Candida zeylanoides + - - - - -
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Resultados
1. Anotar el número de UFC/ml o g de mohos y levaduras de las diluciones correspondientes en la tabla 12:
Tabla 12. Cuantificación de hongos y levaduras.
Dilución Mohos (UFC/ml o g) Levaduras (UFC/ml o g)
10-2
10-3
10-4
2. Dibujar la levadura observada al microscopio.
3. Dibujar las estructuras de reproducción del moho.
4. Anotar en la tabla 13, las características morfológicas colonial del moho:
Tabla 13. Características macroscópicas del hongo aislado.
Características Agar de papa y Agar Dextrosa de Agar Rosa de Bengala
dextrosa (PDA) Sabouraud (DSA) (ARB)
Tamaño (mm)
Forma
Aspecto
Color del micelio
vegetativo
Pigmento difusible
5. Anotar el nombre del moho identificado.
6. Anotar las características de la morfología colonial de la levadura utilizando de guía la tabla 14.
Tabla 14. Características macroscópicas de la levadura aislada.
Características PDA YPD
Tamaño
Forma
Color
Elevación
Borde
Consistencia
Aspecto
Pigmento difusible
v Discutir las características de cada grupo de mohos, así como su importancia microscópica en
la naturaleza.
v Discutir la relación que guarda el crecimiento de los mohos en los diferentes medios de cultivo.
v Discutir la cantidad de colonias fúngicas aisladas de acuerdo al tipo de muestra.
v Discutir sobre el moho identificado, así como la fermentación de azucares de la levadura
seleccionada.
v Describir como diferenciar una levadura de una bacteria.
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Al llegar a este módulo el estudiante

deberá dominar todas las técnicas
microbiológicas previamente enseñadas
en los apartados anteriores.
Por tanto, se pretende que integren el
conocimiento teórico-práctico y sean
capaces de realizar un análisis
microbiológico de una muestra
determinada.
Módulo III
Observación y cuantificación de
microorganismos procedentes de
muestras ambientales
Módulo 3.
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Práctica 10. Recuento de organismos coliformes
Objetivos
1. Conocer las características generales de los organismos coliformes como grupo indicador.
Fundamento
Los organismos coliformes pertenecen a un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente intestinal para la
mayoría de las especies que involucra, es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, su capacidad
de sobrevivencia y multiplicación fuera del intestino también se observan en aguas potables, por lo que este grupo
se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua; encontrándose que mientras mayor sea el número de
coliformes en agua, mayor será la probabilidad de estar frente a una contaminación reciente.
Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los
alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. Cuando los productos
alimenticios han recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), estos microorganismos
se utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias.
Para su estudio, se dividen en dos grupos. El primer grupo pertenece al de bacterias coliformes totales que
comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan
la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo está conformado por 4
géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. El segundo grupo se denomina
coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con producción
de gas a las 48 h de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la
más prominente es Escherichia coli.
La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de

cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y diferenciales. No obstante, su identificación se da
comúnmente por el método del Número Más Probable (NMP), el cual se fundamenta en la capacidad de este
grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C ± 1°C durante 48
horas, utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares.
Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase presuntiva el medio
de cultivo que se utiliza es el caldo lauril triptosa, el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados
que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono.
Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosa-bilis verde brillante el cual es
selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como
el verde brillante.
Finalmente, la búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se
siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar MacConkey, Agar eosina azul de metileno)
y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas a las colonias típicas
Materiales
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TecNM | ITLP

§ Agua peptonada 0.1% § Pipeta de 10 ml estéril § Baño María § Muestra común
§ Agar de Bilis y rojo violeta § Botella o placa de
§ Caldo de Lauril Sulfato Triptosa muestreo estéril
§ Caldo Lactosa-Bilis Verde Brillante § Tubos con campana de
2% Durham
§ Caldo EC
Procedimiento
A) Microorganismos coliformes en placa.
1. Realizar diluciones decimales de 10-1 a 10-5.
2. Transferir 1 ml de la dilución (10-1, 10-3 y 10-5) a placas Petri estériles.
3. Agregar de 12 a 15 ml de medio agar de bilis y rojo violeta mantenido a 45-48°C en baño maría.
4. Mezclar correctamente el medio con la muestra. Dejar solidificar.
5. Agregar 4 ml del mismo medio extendiéndolo para cubrir completamente la superficie.
6. Dejar solidificar.
7. Incubar las cajas en posición invertida a 35°C durante 24 horas.
8. Contar el número de colonias en cada placa y multiplicar por la inversa de la dilución.
9. Reportar el conteo de microorganismos coliformes a 35°C/24h/g o ml de muestra.
Diagrama de flujo
B) Microorganismos coliformes por número más probable (NMP).

De las diluciones decimales 10-1 a 10-3.
¾ Prueba presuntiva.
1. Inocular 1ml de cada dilución en cada uno de los tres tubos con 10 ml de caldo lauril sulfato de triptosa.
2. Incubar los tubos a 35°C durante 48 horas.
3. Examinar los tubos a 24 horas y observar si hay producción de gas en la campana de fermentación, si
no la hay, seguir incubando hasta las 48 horas. La presencia de gas, en cualquier cantidad dentro del
tiempo de incubación hace positiva a la prueba.
¾ Prueba confirmativa.
1. Agitar suavemente los tubos de caldo lauril triptosa que resultaron positivos en la prueba presuntiva.
2. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo a caldo lactosa bilis verde brillante. Al efectuar la reinoculación
sostener el tubo primario (lauril sulfato triptosa) en ángulo tan que se pueda tomar la asada, evitando
la película que existiera en el medio. Sacar el asa del medio en sentido perpendicular a la superficie
de manera que se forme un menisco bien definido.
3. Incubar el caldo lactosa-bilis verde brillante a 35°C durante 48 horas.
4. Considerar la prueba positiva si hay formación de gas en cualquier cantidad.
61
TecNM | ITLP
5. Determinar el número de microorganismos coliformes de acuerdo a la tabla correspondiente, tomando

como base el número de tubos en que se observe producción de gas.
6. Reportar como número más probable de coliformes por g o ml de muestra.
¾ Prueba confirmativa de microorganismo coliformes fecales.
1. Transferir de 2 a 3 asada de cada tubo positivo durante la prueba presuntiva a un tubo de 16x150 mm
con caldo EC conteniendo campana de Durham.
2. Agitar los tubos para su homogenización.
3. Incubar a 44.5 ± 0.1°C en incubadora a un baño de agua durante 24 a 48 horas.
4. Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y producción de gas después
de un periodo de incubación de 24 a 48 horas.
5. Consultar la tabla de NMP (ANEXO) para conocer el número más probable de organismos coliformes
fecales por ml.
NOTA: Control de calidad.
Ø Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E.coli como control positivo y una de Enterobacter
aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.
Diagrama de flujo
v ¿Cuál es el fundamento del medio agar bilis, rojo violeta y de los caldos de Lauril sulfato triptosa, caldo
lactosa-bilis verde brillante y del caldo EC?
v ¿Por qué se utilizan tubos con campana de Durham?
v ¿Qué son los organismos coliformes y en donde los podemos encontrar?
v ¿Por qué la presencia de gas indica un resultado positivo?
v ¿Qué es el número más probable y cuando se utiliza?
62
TecNM | ITLP
Módulo III
Práctica 11. Respiración frente a fermentación en un tubo de ensayo
Objetivos
1. Identificar los diferentes tipos de respiración anaerobia de los microorganismos.
Fundamento
La respiración anaerobia utiliza otros elementos químicos o moléculas orgánicas como último aceptor de
electrones a través de la cadena transportadora de electrones. Este tipo de respiración celular es exclusiva de
ciertos organismos procariotas (bacterias), especialmente de aquellos que habitan en condiciones de escasa o nula
presencia del oxígeno.
Los microorganismos reductores de sulfato son aquellos que utilizan el sulfato como último aceptor de electrones
en la respiración anaerobia de materia orgánica. Para ponerlo de manifiesto, solo tenemos que poner un medio
rico en materia orgánica junto a una sal sulfatada en un ambiente anaerobio. Por ejemplo, el medio KIA (agar de
Kligler) contiene azúcares (glucosa y lactosa) y tiosulfato sódico. Para detectar la posible formación de sulfhídrico
derivado de la reducción de los sulfatos, el medio KIA también contiene citrato férrico; así, el H2S reaccionará
con el Fe2+ formando un precipitado negro de sulfuro de hierro.
Los microorganismos nitratorreductores utilizan el nitrato como último aceptor de electrones en la respiración
anerobia de materia orgánica. Como consecuencia de ello, el nitrato se reduce a nitrito. El medio comercial BBL
Nitrite Medium TM contiene glucosa y nitrato potásico. Tras la incubación con la bacteria que se estudia, se
añaden ácido sulfanílico y N,N-dimetilo-1-naftilamina, que producirán un cambio de color hacia el rojo en caso
de que exista presencia de nitrito.
Podemos complementar estos ensayos con una medida del grado de oxidación de los azúcares tras un proceso de
respiración empleando los reactivos de Fehling: A(CuSO4), B(NaOH y tartrato de sodio y potasio). En un medio
alcalino (B), el cobre (A) se encontrará en forma de hidróxido cúprico (cobre II). La reacción de Fehling se basa
en el poder reductor del grupo carbonilo de un aldehído que se oxidará a ácido, reduciendo el cobre II (reactivo
A, de color azul) a óxido de cobre I (precipitado rojo).
Materiales
§ Medio KIA § Tubos de ensayo § Incubadora § Muestra
§ BBL Nitrite Medium TM § Asa bacteriológica ambiental
§ Ácido sulfanílico
§ N,N-dimetilo-1-naftilamina
§ CuSO4
§ NaOH
§ Tartrato de sodio y potasio
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TecNM | ITLP
Procedimiento
a) Respiración anaerobia de sulfatos
1. Tomar un inóculo de la muestra ambiental a analizar y sembrar tanto en profundidad como en
superficie en el medio KIA.
3. Realizar las observaciones y analizar los resultados.
b) Respiración anaerobia de nitratos
1. Inocular la muestra ambiental en un tubo que contenga medio BBL Nitrite Medium TM.
2. Incubar a 37°C durante 24-48 horas.
3. Examine los tubos para verificar que haya crecimiento.
4. Una vez que se observe crecimiento, agregar cinco gotas de ácido sulfanílico y N,N-dimetilo-1-
naftilamina.
5. Observar y anotar resultados.
c) Oxidación de azúcares
1. Mezclar 3 ml del reactivo de Fehling A y 3 ml de reactivo de Fehling B en un tubo de ensayo limpio.
2. Inocular el tubo con la muestra ambiental.
3. Calentar el reactivo hasta ebullición en un baño maría.
4. Anotar observaciones.
Diagrama de flujo
A) Respiración anaerobia de sulfatos
B) Respiración anaerobia de nitratos
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TecNM | ITLP
C) Oxidación de azúcares
v Discutir las características de los microorganismos de respiración anaerobia.
v Establecer la relación que guarda la oxidación de azúcares con la respiración.
v Discutir las características de cada uno de los tipos de bacterias en estudio.
v Discutir el fundamento de cada prueba y los reactivos involucrados
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TecNM | ITLP
Módulo III.
Práctica 12. Aislamiento de bacterias de ambientes salinos
Objetivos
1. Aislar bacterias halófilas o halotolerantes.
2. Utilizar como criterio de aislamiento las condiciones y características del sitio de muestreo y de las
bacterias de interés.
Fundamento
En los ambientes naturales se encuentra un amplio reservorio de microorganismos con adaptaciones y capacidades
sumamente interesantes para su aplicación en la biotecnología. Especialmente destacan los ambientes
considerados como extremos, los cuales presentan parámetros físicos y químicos con valores superiores o
inferiores a los ambientes que comúnmente estudiamos. Entre estos parámetros se encuentra la salinidad, la
temperatura, la presión, entre otros.
Dichas características ejercen una presión evolutiva que favorece la capacidad de los microorganismos a adaptarse
a estos ambientes. Ejemplo de ello son los ambientes hipersalinos, donde los microorganismos presentan
adaptaciones en sus membranas, proteínas, así como la capacidad de producir compuestos osmoreguladores y
otros metabolitos de vital importancia. Estas adaptaciones son aprovechadas para resolver problemáticas de gran
relevancia a nivel social y económico. Los microorganismos halófilos o halotelerantes han sido reconocidos por
su potencial aplicación en la bioremediación de suelos salobres.
El uso de microorganismos halófilos y halotolerantes ha permitido recuperar suelos en los que no se podían llevar
a cabo actividades agrícolas. Este tema es de especial importancia en regiones como Baja California Sur, donde
el aumento en la salinidad en el agua de riego por la intrusión salina a los pozos son una problemática latente.
Para realizar un aislamiento selectivo se utiliza algún factor asociado al crecimiento de los microorganismos de
interés, ya sea utilizando alguna fuente de carbono específica, un parámetro como la salinidad, o bien utilizando
agentes selectivos como los antibióticos. En esta práctica se propone utilizar diferentes medios de cultivo con
diferentes concentraciones de sal y determinar su efecto en el aislamiento de bacterias halófilas y halotolerantes.
Materiales
§ Caldo nutritivo § Cajas Petri § Autoclave § algodón
§ Caldo TSB § Matraces § Balanza analítica § Papel filtro
§ Medio marino § Pipetas § Parrilla eléctrica § Termómetro
§ Agar bacteriológico § Vasos de precipitado § Incubadora
§ Cloruro de sodio § Embudo
§ Glucosa § Tubos de ensayo
§ Agua destilada § Asas bacteriológicas
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TecNM | ITLP
Procedimiento
A) Preparación de medio líquido (gradiente de salinidad).
1. Seleccionar el medio de cultivo base a preparar (TSB – Medio nutritivo).
2. Se prepararán 3 variantes del medio de cultivo con diferente salinidad (0, 2 y 8%). Considerar la
preparación de 5 tubos con 9 ml de medio por cada medio a preparar.
4. Calcular la cantidad necesaria de cada componente o del medio deshidratado para preparar el volumen
requerido.
5. En una balanza calibrada, pesar con precisión la cantidad requerido del medio en polvo o reactivos.
6. Disolver los componentes en la mitad del volumen de agua destilada, una vez disuelto completar el
volumen y homogenizar el contenido.
7. Ajustar el pH a 7 ± 0.2. En caso necesario, ajustar el pH con soluciones de ácido clorhídrico o de
hidróxido de sodio o potasio en concentraciones 1.0 N.
8. Distribuir cada medio de cultivo en 5 tubos con 9 ml.
9. Esterilizar en autoclave (15min/121°C/15 Ib de presión).
Diagrama de flujo
B) Preparación de medio sólido (gradiente de salinidad)

1. Utilizar el medio seleccionado en el paso anterior y considerar las variantes con diferente salinidad
(0,2 y 8%).
2. Calcular la cantidad necesaria para preparar el volumen de agar requerido.
3. En una balanza calibrada, pesar con precisión la cantidad requerida del medio en polvo y de NaCl si
es necesario.
7. Calentar a ebullición y en agitación hasta disolver el agar. El medio queda listo cuando se observa
translucido. En el caso de medios con salinidad del 8% se observa ligeramente turbio.
8. Esterilizar en autoclave (15min/121°C/15 Ib. de presión).
9. Transferir a placas Petri estériles y dejar enfriar. Se recomienda eliminar el líquido condensado previo
a su almacenamiento.
67
TecNM | ITLP
Diagrama de flujo
C) Preparación de medio extracto de suelo.

1. Tomar una muestra de 200g de suelo del sitio de muestreo.
2. Disolver el suelo en agua destilada estéril en una relación 1:1.
3. Esterilizar la mezcla en autoclave (15min/121°C/15 Ib. de presión).
4. Filtrar la mezcla. Utilizar un embudo con algodón y papel filtro.
5. Utilizar el producto filtrado como base líquida para preparar el medio de cultivo.
6. Calcular la cantidad necesaria para preparar el volumen de agar requerido.
7. Tapar el matraz con una torunda de algodón y calentar a ebullición hasta disolver el agar.
8. Esterilizar en autoclave (15min/121°C/15 Ib. de presión).
9. Transferir a placas Petri estériles y dejar enfriar. Se recomienda eliminar el líquido condensado previo
a su almacenamiento.
Diagrama de flujo
D) Recolección de muestras y enriquecimiento de muestras.

1. Seleccionar el sitio de muestreo (Ej. Manglares, vasos concentradores de sal, residuos salobres).
2. Recolectar muestras de suelo de los sitios seleccionados. Utilizar material estéril y limpiar con etanol
70% entre cada sitio de muestreo.
3. Transportar las muestras al laboratorio. Se recomienda considerar la temperatura del lugar de muestro,
evitar bajas y altas temperaturas.
4. En una balanza granataria, pesar 1 gramo de la muestra y transferir bajo condiciones de esterilizada a
los tubos preparados con medio líquido. Inocular un tubo por cada tipo de medio 0, 2, y 8% de NaCl.
5. Incubar de 30 a 35°C hasta observar un cambio en la densidad del cultivo.
68
TecNM | ITLP
Diagrama de flujo
E) Diluciones seriadas y conteo de células viables.

1. Preparar las diluciones decimales. Preparar hasta 4 diluciones por cada muestra enriquecida.
2. En condiciones de asepsia, inocular las placas con el agar correspondiente al medio líquido empleado.
3. Tomar 0.1 ml de la dilución 10-4, para ello emplear la pipeta calibrada o micropipeta y colocarlo en el
centro de la placa Petri.
4. Extender la gota sobre toda la superficie del medio con el asa de Drigalsky, previamente esterilizada
por flameado con alcohol y enfriada.
5. Repetir el procedimiento con las diluciones 10-2 y 10-3.
6. Dejar que la muestra se absorba en el medio, invertir las cajas e incubar.
7. Contar el número de colonias desarrolladas en la superficie y calcular el número de
microorganismos/ml de la muestra.
Diagrama de flujo
F) Aislamiento y caracterización morfológica.

1. A partir del medio líquido de enriquecimiento. Realizar un aislamiento mediante la técnica de estría
cruzada.
2. Flamear el asa bacteriológica hasta llevarla al rojo vivo.
3. Deje enfriar el asa y del cultivo tomar una asada.
4. Descargar el asa en la orilla de la placa del medio de cultivo sólido haciendo una estría continua de
dicha orilla hacia el centro.
5. Repetir lo anterior hasta llenar la placa con 3 estría, teniendo la precaución de flamear y enfriar el
asa antes de empezar cada una de las estrías.
6. Cuando solo le quede una pequeña porción de la superficie de la caja hacer una última estría muy
abierta.
7. Incubar de 30 a 35°C hasta observar el desarrollo de colonias.
69
TecNM | ITLP
8. Realizar una caracterización morfológica de las colonias aisladas. Considerar características como
color, consistencias, elevación y forma.
Diagrama de flujo
v Indicar el conteo de células viables para cada muestra y tipo de medio utilizado ¿Cómo impactó
el medio de cultivo en aislamiento de bacteria de una misma muestra?
v En una tabla, describir el número de aislados obtenidos y describir su morfología ¿La salinidad
del medio tuvo un efecto en la morfología de los aislados obtenidos?
v ¿Se observa un patrón entre el gradiente de salinidad y el número de aislados obtenidos por cada
muestra?
v ¿En alguna escala del gradiente de salinidad utilizado no se desarrolló ningún microorganismo?
70
TecNM | ITLP
Con la realización de este apartado se

busca poner de manifiesto las
competencias, habilidades y destrezas
prácticas desarrolladas a lo largo del
curso, así como evaluar la capacidad de
comprensión y de análisis respecto a las
características estructurales y
Módulo IV
metabólicas de los microorganismos.
Examen práctico
Con la realización de este apartado se

busca poner de manifiesto las
competencias, habilidades y destrezas
prácticas desarrolladas a lo largo del
curso, así como evaluar la capacidad de
comprensión y de análisis respecto a las
características estructurales y
metabólicas de los microorganismos.
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TecNM | ITLP
Módulo IV
Examen práctico
Objetivo
1. Identificar las competencias actitudinales y formativas del estudiante mediante una prueba de
identificación microbiana.
Procedimiento
A) Primera sesión
1. Realizar un agotamiento por estría en una placa de agar sangre y una de agar MacConkey.
2. Incubar a 37°C por 24 horas.
3. Identificar al microorganismo por tinción de Gram.
4. Prueba de catalasa.
a) Colocar una gota del reactivo (H2O2) sobre un portaobjetos con cavidad.
b) Añadir una asada de la colonia.
c) Si la prueba es positiva se manifestará por la aparición de burbujas, en este caso, resembrar en agar
sal y manitol e incubar a 37°C durante 24 horas.
5. Siembra de medios diferencias. Inocular la muestra por estría o picadura según corresponda en los
siguientes medios diferenciales: 1) Agar Citrato de Simmons (CS); Agar Fenilalanina (FA); 3) Medio
SIM (semisólido); 4) Caldo Rojo de Metilo-Vogues Proskauer (RM-VP); 5) Caldo Malonato; 6) Caldo
Urea; 7) Agar Hierro y Triple Azúcar (TSI).
B) Segunda sesión
7. Del crecimiento bacteriano en agar sangre: Prueba citocromo oxidasa.
a) Colocar un pedazo de papel filtro (1.5 cm x 1.5 cm) sobre un portaobjetos limpio.
b) Añadir sobre el papel filtro una gota del reactivo tetrametil-p-fenilendiamonio al 1%.
c) Inocular el microorganismo usando un palillo de madera estéril.
d) Esperar el resultado de 2 a 3 minutos.
8. Una vez pasado el tiempo de incubación de 24 horas de los medios diferenciales, añadir los distintos
reactivos a sus correspondientes cultivos (tabla 15).
Tabla 15. Reactivos correspondientes a cada tipo de medio.

Medio Adición de reactivos
Adicionar 4-5 gotas de FeCl3 acidificado. Esperar 5 min en posición inclinada e
Agar Fenilalanina
interpretar.
Medio SIM Adicionar 2-3 gotas del reactivo Kovacks. Reposar de 2-3 min e interpretar,
Adicionar 2-3 gotas de rojo de metilo al 1%, agite gentilmente. Reposar de 2-3 min
Caldo MR
e interpretar.
Adicionar 0.6 ml de α-naftol 5%, adicionar 0.2 ml de KOH 40%, agitar gentilmente.
Caldo VP
Reposar 10-15 minutos e interpretar.
72
TecNM | ITLP
Resultados.
v La presentación de resultados deberá ser un reporte técnico escrito a mano.
v En la sección de metodología hacer la descripción a renglón corrido, los resultados se presentarán con
base en la tabla 16.
v En la sección de discusión se hará un análisis de los resultados obtenidos, incluyendo el nombre del
microorganismo identificado. Se deberá incluir como anexo de manera impresa y legible la tabla
consultada para el análisis de todas las pruebas.
Tabla 16. Concentrado de pruebas y presentación de resultados.

Prueba Resultado Fotografía (control vs muestra)
( ) α-hemólisis
Agar sangre ( ) β-hemólisis
( ) γ-hemólisis
( ) Lactosa +
Agar MacConkey
( ) Lactosa -
( ) Positiva
Catalasa
( ) Negativa
Agar Sal y Manitol
( ) Positiva
Citocromo c oxidasa
( ) Negativa
Agar Citrato Simmons
Agar Fenilalanina
Medio SIM
Caldo MR
Caldo VP
Caldo Malonato
Caldo Urea
Agar TSI
El nombre del microorganismo es: ______________________________________
73
TecNM | ITLP
Referencias
Aquiahuatl, M. & Pérez, M. (2004). Manual de Prácticas de Laboratorio de Microbiología General. UNAM.
Brooks, F.G., Carroll, C.K., Butel. S.J., Morse, A.S., y Mietzner, A.T. (2011).Microbiología médica. Mc Graw
Hill.
Cortes, J. A. (2005).Ensayos Microbiológicos: Manual de Laboratorio. Reverté.
Cuervo, R. (2010). Manual de protocolos de microbiología general. Universidad de San Buenaventura.
De Vos, P., Garrity, G., Jones, D., Krieg, N. R., Ludwing, W., Rainey, F. A., Schleifer, K.H. and Whitman, W.
B. (2009). Bergey’s. Manual of Systematic Bacteriology. Springer Verlag.
Herrera, T. y Ulloa, M. (2004). El reino de los Hongos. Micología básica y aplicada. Fondo de Cultura
Económica.
Madigan, T.(2015). Brock. Biología de los microorganismos. Pearson
Organización Mundial de la Salud. (2005). Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. Ginebra.
Ramírez, R. (2015). Técnicas básicas de microbiología y su fundamento. Trillas
Ramírez, R., Luna, B., Velásquez, O., Vierna, L., Mejía, A., Tsuzuki, G., Hernández, L., y Muggenburg, I. (2000).
Manual de prácticas de microbiología general. UNAM.
Ramos, A., Sepúlveda,T., Barragán, L., Vives, F. y González, M. (2012). Manual de prácticas de laboratorio.
Microbiología general. Universidad Autónoma Metropolitana.
Romero, A.L., Pimentel, B.E., Iglesias, C.G., Díaz G. (2017). Manual de laboratorio. Microbiología general
I.FES Zaragoza
The World Health Organization. (2004). Laboratoty biosafety manual. Geneva.
Tortora, G., Funke, B., y Case, C. (2017). Introducción a la Microbiología. Médica Panamericana
Triviño, A.(2011).Conceptos y práctica de microbiología general. Universidad Nacional de Colombia
Valencia, H (2010). Manual de prácticas de microbiología de suelo. Universidad Nacional de Colombia.
Negroni. M (2009). Microbiología estomatológica: fundamento y guía práctica.Medica Panamericana
Mier,T ., Toriello,C (2002). Hogos microscópicos y parásitos métodos de laboratorio. Universidad autónoma
metropolitana
Garces, E . (2003). Introducción a los hongos. morfología y clasificación de los hongos. Colombia
Campbell, N.,y Reece, J. (2007) Biología. Berkeley. California: Editorial medica Panamericana
74
TecNM | ITLP
Anexos
Figura 7. Características de la morfología macroscópica de las colonias bacterianas.
75
TecNM | ITLP
Figura 8. Morfología microscópica de las bacterias
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TecNM | ITLP
Caracterización del crecimiento bacteriano en tubos

Caldo nutritivo
Son evaluados según la distribución y apariencia del
crecimiento presentado.
A. Turbidez fina uniforme: Crecimiento fino y
totalmente disperso.
B. Floculante: Crecimiento en agregados escamosos
totalmente dispersos.
C. Película: Crecimiento en la superficie.
D. Sedimento: Concentración del crecimiento en el
fondo del caldo; puede ser granular, escamoso o
floculante.
Figura 9. Crecimiento microbiano en caldo. A) Turbidez,

B) Floculante, C) película y D) sedimento.
Agar inclinado
Los cultivos en este medio se inoculan en una sola línea
recta (sobre la superficie) y se evalúan de la siguiente
manera:
1. Abundancia de crecimiento. La cantidad de
crecimiento es designada como ninguna, leve,
moderada y abundante.
2. Pigmentación. Los microorganismos
cromogénicos, pueden producir pigmentos
intracelulares; otros microorganismos
producen pigmentos solubles extracelulares
que son excretados en el medio y también Figura 10. Crecimiento bacteriano en agar inclinado.
producen color. A) Crecimiento filiforme, B) equinulado, C)barbado, D)difuso, E)
arborescente y F) rizoide
3. Forma: La apariencia del crecimiento se
designa de la siguiente forma (figura 10).
A) Filiforme. Crecimiento en forma de hilo con borde lisos continuos.
B) Equinulado. Crecimiento en forma de hilo con borde irregulares continuos.
C) Barbado. Colonias semi-confluentes o no confluentes.
D) Difuso. Crecimiento difuso y reducido.
E) Arborescente. Crecimiento en forma de árbol.
F) Rizoide. Crecimiento en forma de raíz.
77

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MICROBIOLOGÍA

MARÍA GUADALUPE VEGA ROMERO

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Como en los estudios de microbiología se requiere la esterilización de espacios, superficies y materiales de

Tabla 8. Métodos de esterilización.

2. Esterilización de tubos de ensayo.

3. Esterilización de cajas Petri.

4. Esterilización de matraces Erlenmeyer.

B. Manejo de diluciones (Preparación de diluciones decimales utilizando como diluyente agua

5. Colocar en un tubo de ensaye limpio de 16x150mm, 2 ml de sacarosa al 1% + 2 ml de azul de metileno

C. Manejo de cajas y tubos.

A) Preparación de medio líquido (caldo nutritivo).

B) Preparación de medio semisólido.

1. Rotular el material con el nombre del medio y la fecha de preparación.

Preparación de agar inclinado en tubo (agar nutritivo).

Medio de cultivo Tipo de inóculo Dispositivos de siembra

Figura 3. Clasificación de las técnicas de siembra de acuerdo al

B. Inoculación en medio semisólido.

2. Estría simple en tubo inclinado.

Incubar los cultivos bacterianos a 37°C durante 24 a 48 h.

5. Dispersión con varilla de vidrio (Drigalsky).

Reactivos/Microorganismos Instrumentos Equipos Otros

Tinción sin calentamiento

Preparación del frotis 2 (Método de Wirtz-Cortitlin).

Se encuentran ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan en el agua, en el suelo, en la superficie o en el

a) Con pared celular gramnegativa.

El Comité Internacional de Sistemática de Procariotas (ICSP), es el organismo encargado de la nomenclatura,

9. Registrar los resultados

Figura 4. Técnicas de siembra para la caracterización de bacterias

B. Técnicas de siembra para bacterias con características especiales (actinobacterias)

10. Registrar los resultados.

g) Tapar el matraz y agitarlo, dibujando la trayectoria de un arco de 30 cm aproximadamente 25 veces

B. Método de extensión superficial

C. Método de la gota de Miles y Misra

Tabla 10. Resultados de inhibición del crecimiento bacteriano frente a antimicrobianos.

Concentración de Diámetro de inhibición (mm)

Este apartado tiene la finalidad de

4. Observar al microscopio con los diferentes objetivos y documentar.

B) Morfología colonial de mohos.

D) Identificación de mohos por la técnica de Ridell (microcultivo).

E) Observación microscópica de levaduras

Tabla 11. Identificación de levaduras del género Candida.

Microorganismo Dextrosa Maltosa Sacarosa Galactosa Lactosa Trehalosa

Al llegar a este módulo el estudiante

Práctica 10. Recuento de organismos coliformes

La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de

Reactivos/Microorganismos Instrumentos Equipos Otros

B) Microorganismos coliformes por número más probable (NMP).

5. Determinar el número de microorganismos coliformes de acuerdo a la tabla correspondiente, tomando

B) Respiración anaerobia de nitratos

B) Preparación de medio sólido (gradiente de salinidad)

C) Preparación de medio extracto de suelo.

D) Recolección de muestras y enriquecimiento de muestras.

E) Diluciones seriadas y conteo de células viables.