Ena Luz Torres Arroyo Lisy Gracia Herrera Eduardo Thorrens Romero Rossana Villegas Gracia

ENA LUZ TORRES ARROYO
LISY GRACIA HERRERA

EDUARDO THORRENS ROMERO
ROSSANA VILLEGAS GRACIA
MANUAL DE INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA
Primera edición
ENA LUZ TORRES ARROYO

LISY GRACIA HERRERA
EDUARDO THORRENS ROMERO
ROSSANA VILLEGAS GRACIA
Fondo Editorial de la Universidad de Córdoba

Montería, Colombia. 2021
Ena Luz Torres Arroyo. M.Sc
Lisy Gracia Herrera. M.Sc
Eduardo Thorrens Romero. M.Sc
Rossana Villegas Gracia. M. Sc
Universidad de Córdoba
Carrera 6 No. 77- 305
Montería. Córdoba
2021
Fondo Editorial Universidad de Córdoba
Manual de Introducción a la Microbiología

Autores:
Ena Luz Torres Arroyo. M.Sc
Lisy Gracia Herrera. M.Sc
Eduardo Thorrens Romero. M.Sc
Rossana Villegas Gracia. M. Sc
ISBN 978-958-5104-41-9
Primera edición 2021
137 p.
Prohibida la reproducción total o parcial de esta obra, por cualquier medio, sin
autorización escrita de los autores.
Impreso en Colombia
1. Índice
Capítulo 1. Microscopía ...................................................................................................... 7

Tipos de microscopio .....................................................................................................12
Pasos para la observación de muestras en el microscopio compuesto ......................... 17
Cuidados del microscopio ..............................................................................................18
Capítulo 2. Técnicas para la observación microscópica de microorganismos.................... 22
Preparaciones en fresco o no coloreadas ...................................................................... 22
Tinciones o coloraciones ...............................................................................................25
Capítulo 3. Técnicas básicas para el aislamiento de microorganismos ............................. 40
Procedimientos básicos en el laboratorio de microbiología ........................................... 40
Técnicas de siembra......................................................................................................44
Capítulo 4. Metabolismo bacteriano. ..................................................................................54
Transporte transmembranal...........................................................................................56
Mecanismos de obtención de energía ........................................................................... 56
Viabilidad y pureza de cepas de referencia ................................................................... 58
Fundamentación de las pruebas bioquímicas para determinación de características
metabólicas de las bacterias..........................................................................................59
Capítulo 5. Generalidades de bacterias. ............................................................................ 66
Comparación de las características de las bacterias grampositivas y gramnegativas. 69
Tamaño de las bacterias ................................................................................................70
Formas de las bacterias ................................................................................................70
Forma de las colonias bacterianas ................................................................................ 74
Caracterización del crecimiento en medios líquidos como caldo nutritivo ...................... 76
Capítulo 6. Morfología de los hongos. ...............................................................................78
Características de la célula micótica .............................................................................. 78
Morfología de los hongos ..............................................................................................78
Características del cultivo de hongos. ........................................................................... 80
Enfermedades micóticas ...............................................................................................82
Capítulo 7. Generalidades de parásitos. ............................................................................ 86
Generalidades de los protozoos. ................................................................................... 86
Generalidades sobre helmintos .....................................................................................90
Diagnóstico de parásitos ...............................................................................................93
Capítulo 8. Medios de cultivo. ............................................................................................97
Generalidades de medios de cultivo ..............................................................................97
Control de calidad en los medios de cultivo ................................................................. 100
Control de calidad de la esterilización mediante indicadores físicos, mecánicos,
químicos o biológicos ..................................................................................................102
1
Procedimientos para preparación de medios de cultivo, control de calidad de
esterilización y valoración de la calidad de los mismos .................................................... 103
Capítulo 9. Control de microorganismos .................................................................................. 107
Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos ................................................................... 108
Prueba de sensibilidad por difusión en agar con discos (método Kirby Bauer) ............. 110
Limpieza y desinfección .......................................................................................................... 111
Métodos de esterilización ........................................................................................................ 112
Valoración de desinfectantes .................................................................................................. 113
Capítulo 10. Bioseguridad en el laboratorio de microbiología................................................ 116
Principios de la bioseguridad .................................................................................................. 117
Clasificación de los microorganismos por grupos de riesgo.............................................. 117
Niveles de contención .............................................................................................................. 118
Categorización de los laboratorios según el nivel de bioseguridad .................................. 119
La bioseguridad como ejercicio práctico .............................................................................. 120
Uso de elementos de protección personal .......................................................................... 120
Cabinas de seguridad biológica CSB ................................................................................... 121
Prácticas generales de seguridad en el laboratorio ........................................................... 123
Prevención y control ................................................................................................................ 125
Control del riesgo biológico .................................................................................................... 126
Procedimientos de desinfección en el laboratorio de microbiología ............................... 128
Medidas en caso de emergencia .......................................................................................... 130
Otros aspectos de la bioseguridad en el laboratorio .......................................................... 131
Simbología utilizada de acuerdo con los procedimientos de seguridad y bioseguridad
establecidos.............................................................................................................................. 131
2
Autores
Ena Luz Torres Arroyo. Bacterióloga y Laboratorista Clínico. Especialista en Microbiología

Médica. Magister en Biotecnología. Docente de planta Programa de Bacteriología,
Universidad de Córdoba
Eduardo Enrique Thorrens Romero. Bacteriólogo. Magister en Salud Pública. Docente del
programa de Bacteriologia, Universidad de Córdoba.
Rossana Villegas Gracia. Bacterióloga. Magister en Microbiología y bioanálisis énfasis

hematología, Universidad de Antioquia. Docente de planta Universidad de Córdoba.
Lisy Gracia Herrera, Bacterióloga. Especialista en Microbiología médica. Magister en

ciencias ambientales. Docente de planta de Universidad de Córdoba.
3
Prefacio
El laboratorio de microbiología es el lugar en el cual se manejan y estudian los

microorganismos, con la finalidad de establecer el diagnóstico de las enfermedades
infecciosas. Este texto busca hacer de una manera didáctica una revisión precisa y
actualizada de los procedimientos básicos empleados para la manipulación y el
procesamiento de muestras clínicas, dirigidos al diagnóstico, seguimiento y tratamiento de
las enfermedades de etiología microbiana. El objetivo principal de este manual es servir
de guía para los estudiantes de pregrado que se forman en programas de bacteriología,
microbiología y afines, quienes en su futuro ejercicio profesional se desempeñarán en el
laboratorio de microbiología en el campo asistencial clínico humano o veterinario, de
investigación o de docencia.
Considerando que estos estudiantes inician su experiencia en el manejo de los
microorganismos, estimamos de gran importancia incluir una serie de recomendaciones
relacionadas con las reglas generales del laboratorio y los principales procedimientos que
el estudiante deberá aprender, para manipular en forma adecuada los microorganismos,
garantizando tanto su seguridad como la de sus compañeros, o sea la bioseguridad
aplicada al laboratorio. Además, comprende temas fundamentales como los
procedimientos para el aislamiento de microorganismos en medios de cultivo, microscopía;
preparaciones y coloraciones para la observación microscópica de microorganismos;
morfología macro y microscópica de bacterias, hongos y parásitos; generalidades y control
de calidad de medios de cultivo; metabolismo bacteriano y viabilidad y pureza de cepas de
referencia; y control de microorganismos: pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos,
limpieza y desinfección y métodos de esterilización. En este contenido se enfatizan
aspectos prácticos indispensables en el procesamiento bioseguro de muestras clínicas,
para la realización del estudio microbiológico que incluye exámenes directos, cultivo y
antibiogramas para el diagnóstico de enfermedades causadas por bacterias, hongos y
parásitos.
La inclusión de imágenes en 3D y la Realidad Virtual tiene la capacidad de potencializar el
proceso de pedagógico al brindar una nueva perspectiva del contenido al mostrarse desde
un escenario inmersivo en donde el estudiante activa la construcción del aprendizaje en
base a la experiencia en primera persona.
4
Instrucciones para Reproducir la
realidad virtual
Instrucciones para reproducir la

Realidad Virtual, Videos e Interactividad
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del Manual B) Abrir el link

escaneado mediante estas
Apps según lo solicite el
teléfono,
es opcional
utilizar una CardBoard
Escáner de QR
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5
Capítulo 1. Microscopía
El microscopio es un instrumento que permite observar estructuras con tamaño inferior a

250 µm, correspondiente al nivel de resolución del ojo humano. El primer microscopio fue
construido a finales del siglo XVI por dos holandeses fabricantes de anteojos, Hans Janssen
y su hijo Zacharias; fue el también holandés Anton van Leeuwenhoek, quien vio ydescribió
por primera vez las bacterias y levaduras presentes en una gota de agua. El primer
microscopio electrónico, fue construido en el año 1931 por Max Knoll y Ernst Ruska en
Berlin, Alemania.
La microscopía se define como el uso de un microscopio para ampliar el tamaño de objetos

tan pequeños que no pueden ser visualizados a simple vista. Este método es el más
comúnmente usado para la identificación de microorganismos en muestras clínicas y para
la caracterización de microorganismos aislados en cultivos. En muchas ocasiones, la
combinación de coloraciones específicas con la microscopía permite identificar agentes
etiológicos de enfermedades infecciosas de forma rápida, barata y efectiva.
La microscopía se fundamenta en dos principios: poder de resolución y el aumento o
magnificación. La resolución del microscopio es la capacidad para distinguir dos objetos
muy cercanos el uno al otro y el aumento es la capacidad que posee un microscopio de
amplificar una imagen en varias veces su tamaño original; esta propiedad está ligada con
el poder de aumento de los lentes objetivos y oculares. Para optimizar la visualización,
además de la magnificación, es esencial la resolución, la cual permite mantener el detalle
del objeto ampliado.
En la mayoría de los microscopios de luz, el lente del objetivo cercano a la muestra

magnifica el objeto 100 veces 100X, y el lente ocular cercano a los ojos magnifica 10 veces
10X. Usando estos dos lentes, el tamaño real de los organismos en las muestras son
magnificados 1000X; este aumento permite observar hongos, la mayoría de lasbacterias y
parásitos, pero no es suficiente para observar los virus, los cuales requieren magnificación
de 100.000 o más.
Para lograr un óptimo nivel de resolución con aumento 1000X, se adiciona aceite de
inmersión, que tiene las propiedades ópticas y características de viscosidad específicas
para la observación microscópica; el tener igual índice de refracción que el vidrio, hace que
el aceite de inmersión reduzca la dispersión de la luz entre el objetivo de 100X y la lámina
portaobjetos. Los bajos aumentos de 100X y 400X son útiles para observar
microorganismos como hongos y parásitos, mientras que el aumento de 1000X con aceite
de inmersión se usa para la observación de bacterias.
6
El microscopio compuesto está constituido por tres sistemas articulados para garantizar
un óptimo funcionamiento: Sistema mecánico, que sirve de soporte al sistema óptico,
iluminación y elementos como el pie o base, columna, mecanismo de enfoque, platina,
revolver, tubo; Sistema óptico, constituido por los objetivos y ocular, que son los lentes
para el aumento y resolución; Sistema de iluminación, conformado por los elementos
como lámpara o fuente de iluminación, espejo, condensador y diafragma, que producen las
radiaciones y transmiten, reflejan y regulan la intensidad y la cantidad de rayos quevan
a incidir sobre el espécimen. Adicionalmente, el microscopio puede estar dotado de
accesorios como cámaras fotográficas, de video, computadoras, accesorios para dibujar,
entre otros; que permiten potenciar las capacidades del instrumento (figura 1.1).
SISTEMA MECÁNICO
Componente Características y Funciones
Base o pie Parte inferior en la cual se apoya el microscopio, soporta

el brazo o columna sobre el cual reposa el resto del aparato
y contiene la fuente de iluminación.
Brazo o columna Junto con la base constituyen el soporte del instrumento.

Sitio por donde se debe tomar el microscopio. Tiene en su
parte más inferior el condensador y en la parte superior
posee una cremallera que permite desplazar en sentido
vertical el condensador, la platina o el revólver y el tubo.
Revolver Constituido por una semiesfera que posee una serie de

anillos en los cuales van atornillados los objetivos. Permite
el intercambio rápido de objetivos mediante un movimiento
de rotación.
La platina Placa cuadrada, soporte horizontal donde se colocan las

preparaciones a observar. Presenta en el centro un orificio
circular por donde pasa el rayo de luz producido por la
fuente luminosa y proveniente del condensador. Posee un
sistema de fijación e inmovilización de la lámina porta-
objeto. Tiene un desplazamiento hacia adelante o hacia
atrás y de derecha a izquierda y viceversa que permite el
examen completo de la preparación.
Carro mecánico Sistema de dos pinzas ubicado encima de la platina, que

sirve para desplazar la muestra izquierda-derecha y
7
adelante-atrás, mediante perillas ubicadas en el costado
de la platina.
Tubo o cabezal Cilindro que soporta los oculares en la parte superior y el

revólver en la parte inferior. Puede ser monocular o
binocular. En estos últimos, tiene una escala de ajuste
interpupilar que permite mover los oculares hacia los lados
y hacia el centro, con el fin de ajustar a la distancia de los
ojos de quien usa el microscopio.
Tornillo macrométrico Localiza la imagen y permite hacer un enfoque grueso,

son dos tornillos de cremallera ubicados en ambos lados
del microscopio.
Tornillo micrométrico Su precisión le permite hacer el enfoque adecuado o enfoque

fino de la imagen obtenida con el tornillo macrométrico,
proporcionándole la nitidez necesaria.
SISTEMA ÓPTICO
Oculares Aumentan la imagen real proyectada por el objetivo, 10, 40 o

100 veces según el número inscrito en ellos. Posee doslentes,
una superior llamada ocular que queda cerca del ojo y es la
que produce el aumento de la imagen real del objetivo;y una
lente inferior denominada colectora encargada de aplanar y
aclarar el campo. Generalmente en el ocular izquierdo, se
ubica un anillo de dioptrías para ajustar la visión binocular.
Objetivos Constituyen un sistema óptico formado por una o varias lentes

que producen imágenes de las muestras aumentadas 4,10,40
o 100 veces según el número grabado en ellos y con base en
el cual se nombran. Su función es colectar la luz proveniente
del espécimen y proyectar una imagen nítida, real, invertida y
aumentada hacia el cuerpo del microscopio. Constan de dos
lentes, la lente frontal que queda cerca de la preparación y
la lente posterior ubicada en la parte superior. Hay dos clases
de objetivos, los secos, correspondientes a los marcados
como 5x, 10x y 40x y losde inmersión u objetivo de 100x,
con el mayor aumento y
8
poder de resolución.
SISTEMA DE
ILUMINACIÓN
Condensador Sistema de lentes convergentes ubicados debajo de la platina

entre la fuente de luz y el espécimen. El microscopio tiene dos
condensadores, el de abertura que concentra los rayos
luminosos sobre la preparación mientras que el condensador
de campo ubicado en la base del microscopio concentra la luz
de la fuente hacia el condensador de abertura.
Fuente de luz Proporciona la luz necesaria para la observación de la

muestra. Además de la luz solar utilizada en microscopios con
espejo, se dispone de fuentes de iluminación artificial como
las bombillas de tungsteno y halógenas y lámparas de arco
eléctrico utilizadas en el microscopio de fluorescencia.
Diafragma Dispositivo colocado inmediatamente debajo de la platina, con

diseño que permite cambios en la apertura en relación con el
tipo de objetivo que se esté utilizando y con diámetros
variables para ofrecer conos luminosos cada vez más
estrechos y eliminar los rayos de luz sobrantes.
Filtro Disco de vidrio mate o de algún color ubicado sobre un anillo

transportable en la parte inferior del diafragma, que permite
seleccionar la longitud de onda de luz a emplear.
En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura filamentosa denominada

señalador, usada para indicar de manera específica alguna estructura en particular en el
campo de observación. El señalador se aprecia como una línea oscura que parte del borde
del campo hacia el centro de este.
9
Ocular
Tubo de observación Cuerpo del microscopio
Tubo de lentes
Objetivo
Apertura de diafragma
Condensador
Diafragma de campo
Figura 1.1 Partes del microscopio
Componente Función
Oculares de Permiten cuantificar longitudes, células y ángulos. En la
medición actualidad hay disponibles instrumentos para morfometríacon
tecnología digital que permite transmitir los datos obtenidos a
un computador, adicionando el manejo automatizado,
almacenamiento de datos y obtención de variables
estadísticas a partir de ellos.
Cámaras y Utilizadas para obtener una representación exacta del

dispositivos para espécimen en estudio mediante el dibujo de las preparaciones
dibujar microscópicas.
Cámaras digitales La microfotografía permite preservar lo observado al

de alta resolución microscopio mediante el archivo de las imágenes obtenidas
que pueden ser empleadas en publicaciones científicas,
docencia y banco de datos.
Cámaras de video Con la videomicroscopía se capturan imágenes en

movimiento de la actividad de muestras vivas como células en
cultivo, para la demostración y análisis de procesos
fisiológicos.
Filtros y Transforman el microscopio de campo claro en un
10
instrumento con microscopia de campo oscuro, contraste de
condensadores
fases o polarización, que facilita la observación de
especiales
especímenes con una estructura particular y células vivas.
Tipos de microscopio
Existen varias clases de microscopios, según la conformación, la naturaleza de los
sistemas de luz y otros elementos utilizados para obtener las imágenes.
Microscopio vertical. Es el microscopio convencional y de uso más común, que posee la

fuente de luz ubicada en la base, por debajo de la platina.
Microscopio invertido. Su estructura es inversa a la del microscopio convencional,aunque

el principio de funcionamiento y formación de la imagen es el mismo que el del microscopio
tradicional; la fuente de luz está ubicada por encima de la platina, facilitando la observación
de células vivas en cultivos celulares y el monitoreo de crecimiento y comportamiento.
Microscopio estereoscópico. Este microscopio proporciona una imagen estereoscópica,

en tres dimensiones del espécimen que por lo general son de gran tamaño, sin corte o
preparación previa. Es ideal para realizar microdisección.
Microscopio quirúrgico. Es un microscopio empleado en microcirugía porque proporciona

un campo muy bien iluminado y un aumento de las estructuras anatómicas, facilitando
mayor visibilidad de los tejidos sanos y patológicos que serán manipulados más
cuidadosamente y con menores posibilidades de lesión. Hay modelos muy sofisticados que
tienen piezas automatizadas robóticas.
Microscopios fotónicos especiales. Permiten la observación de células vivas o muestras

no coloreadas, con un incremento muy satisfactorio del contraste, en comparación con el
obtenido con el microscopio común de campo claro. Los microscopios de campo oscuro,
microscopio de luz ultravioleta microscopio de fluorescencia,microscopio de polarización,
microscopio de contraste de fases y microscopiosinterferenciales están incluidos en este
tipo de microscopios.
Microscopio de contraste de fases. El microscopio de contraste de fases utiliza un haz
de luz que pasa a través de la muestra que se desvía parcialmente por las diferentes
densidades o espesores de las células microbianas o las estructuras celulares de la
muestra; traduce las diferencias en las fases dentro de la muestra en diferencias en las
intensidades de luz que resultan en contraste entre los objetos dentro de la muestra
observada. Este método tiene la ventaja de permitir observar microorganismos vivos. Se
11
usa para identificar hongos de importancia medica aislados en medios de cultivo (Figura
1.2).
Los rayos de luz que Ocular

salen del ocular viajan
hacia el ojo
Placa anular
de fase en el
objetivo
Objetivo
Luz retardada
Muestra
Condensador
Diafragma anular
Rayos de luz
Figura 1.2 Microscopio de contraste de fases
Microscopio de fluorescencia. La fluorescencia es un fenómeno físico por el cual ciertas

moléculas conocidas como fluorocromos emiten luminiscencia tras ser excitadas
previamente por un haz de luz de una determinada longitud de onda. La microscopía de
fluorescencia utiliza la fluorescencia para la visualización y el estudio de la localización
celular de estructuras biológicas que han sido previamente marcadas con fluorocromos
(Figura 1.3).
12
Luz fluorescente
Fuente de Luz Exitada

luz
Filtro Exitado Espejo divisor de

onda de luz
Muestra (Contiene
microorganismos coloreados con
fluorocromo)
Figura 1.3 Principio del microscopio de florescencia
Microscopio de campo oscuro. El microscopio de campo oscuro se fundamenta en el

efecto de Tyndall, que permite observar partículas casi invisibles bajo una iluminación
normal que, al ser iluminadas oblicuamente en un ambiente oscuro, reflejan la luz y se
muestran como objetos o puntos luminosos.
En este microscopio el condensador no permite que la luz pase directamente a través de la

muestra, sino que dirige la luz para que golpee la muestra en un ángulo oblicuo. Solo la luz
que golpea objetos, como los microorganismos, se desviará hacia arriba en la lente del
13
objetivo para su visualización. El resto de la luz que atraviesa la muestra perderá el
objetivo, haciendo que el fondo sea un campo oscuro (figura 1.4).
Objetivo
Muestra
Platina
Condensador
Filtro opaco
Filtro de luz de día
Fuente de luz
Figura 1.4 Microscopio de campo oscuro
Microscopio electrónico. El micoscopio electrónico usa electrones en lugar de luz para

visualizar objetos pequeños y, en vez de lentes, los electrones son enfocados por campos
electroagnéticos y forman una imagen en una pantalla fluorescente como una pantalla de
televisión. Con este microscopio se logra magnificación por encima de 100,000,000X,
permitiendo observar objetos con tamaño de 0,001µm que no se pueden observar con el
microscopio óptico, como son los virus o estructuras bacterianas.
Existen dos tipos de microscopio electrónico, el microscopio electrónico de transmisión

(TEM), por su siglas en inglés y el microscopio electrónico de barrido (SEM, por su siglas
en inglés). El primero pasa el haz de electrones a través de los objetos y permite la
visualización de estructuras internas; la imagen se forma sobre una pantalla fluorescente
(figura 1.5). El SEM usa los haces de electrones para escanear la superficie de objetos y
proporciona vistas tridimensionales de estructuras superficiales; no tiene la resolución que
se alcanza con el TEM pero tiene la ventaja de su excelente impresión tridimensional (figura
1.6).
Con el uso del microscopio electrónico, se han descubierto muchas nuevas características
morfológicas de las bacterias y se han descubierto parásitos, hongos y virus.
14
Fuente de
electrones
Lente
condensador
Haz de
electrones
Muestra
Lente objetivo
Lente proyectora
Imagen sobre una pantalla

fluorescente
Figura 1.5 Microscopio electrónico de transmisión
Fuente de
electrones
Lente
condensador
Haz de
electrones
Deflector de
electrones
Lente de
proyección
Detector
Imagen
En TV
Muestra
Figura 1.6 Microscopio electrónico de Barrido
15
Microscopía digital automatizada. La automatización en microscopía digital utilizando
software sofisticado y tecnología única permite adquirir imágenes digitales microscópicas
de las coloraciones de Gram utilizando una interfaz basada en la web. Esta interfaz permite
que las imágenes que utilizan un microscopio totalmente automatizado se veanen una
sola pantalla.
Microscopios fotónicos especiales: Permiten la observación de células vivas o muestras

no coloreadas, con un incremento muy satisfactorio del contraste, en comparación con el
obtenido con el microscopio común de campo claro. Los microscopios de campo oscuro,
microscopio de luz ultravioleta y el microscopio de fluorescencia, están incluidos en este
tipo de microscopios.
Pasos para la observación de muestras en el microscopio compuesto

Empleo del objetivo de 10x y 40x
• Colocar el objetivo de menor aumento(4x) en posición de uso y bajar la platina
• Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
• Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya en posición) o colocar el de 10x.

• Para realizar el enfoque, acercar al máximo la lente del objetivo 10x a la preparación,
empleando el tornillo macrométrico, bajar el condensador y cerrar el diafragma.
• Mirar a través de los oculares, separar lentamente el objetivo de la preparación con

el tornillo macrométrico hasta observar algo nítida la imagen, girar el micrométrico
para obtener un enfoque fino.
• Si es necesario, mejore la iluminación de la preparación girando la perilla reguladora

de intensidad de la luz.
• Mover los oculares lateralmente, para ajustar la visión a su distancia interpupilar.
• Ajustar la visión binocular con el tornillo de dioptrías así: Mirar con el ojo derecho por
el ocular respectivo, cubrir el ocular izquierdo y enfocar con el tornillo
micrométrico hasta lograr una imagen nítida. Luego mirar con el ojo izquierdo por el
ocular izquierdo, cubrir el ocular derecho y enfocar con el anillo de dioptrías hasta
lograr una imagen nítida.
16
• Colocar el objetivo de 10x en posición de enfoque girando suavemente el revolver,
evitar girar por el objetivo para evitar su desajuste, luego aclarar la imagen haciendo
uso solo del tornillo micrométrico.
• Pasar al objetivo 40x, subir hasta la mitad el condensador y abrir hasta la mitad el
diafragma, la imagen debe estar casi enfocada y suele ser suficiente con girar un
poco el tornillo micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar el objetivo se
pierde por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivoanterior
(10x) y repetir la operación.
Empleo del objetivo de inmersión 100x

• Después de haber realizado el enfoque inicial con el objetivo de 10x para escoger
el mejor campo de lectura, girar el revolver dejándolo entre este y el de 100x.
• Abrir completamente el diafragma para ver claramente el circulo de luz que indica
la zona que se va a visualizar y donde debe echar el aceite de inmersión.
• Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el circulo de luz.
• Terminar de girar suavemente el revolver por el lado del objetivo de 4x hasta la

posición del objetivo de inmersión 100x.
• Subir el condensador.
• Enfocar cuidadosamente con el tornillo micrométrico, la distancia de trabajo entre el

objetivo de inmersión y la preparación es mínima por lo que el riesgo de daño de la
preparación es muy grande.
• Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede

volver a usar el objetivo de 40x sobre esta zona pues se mancharía de aceite.
• Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el

objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento se puede retirar
la preparación de la platina; nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en
posición de observación.
Cuidados del microscopio

• Al finalizar el trabajo, dejar el objetivo de 4x en posición de observación, asegurarse
de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de esta y cubrir con su
funda.
17
• Evitar tocar las lentes con las manos; si se requiere limpiarlos utilizar solo el papel
y la solución destinada para tal fin.
• Evitar dejar láminas porta objetos sobre la platina en posición de observación.
• Después de utilizar el objetivo de inmersión, limpiar el aceite con papel de arroz o

paño de óptica con movimiento circular por la lente de adentro hacia afuera y con
suavidad. Cuando el aceite se ha pegado al objetivo, limpiar con una mezcla de
alcohol acetona o xilol. La aplicación en exceso de estos disolventes puede dañar
las lentes.
• No forzar nunca los tornillos giratorios de microscopio (macrométrico, micrométrico,

platina, revolver y condensador).
• El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a

la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de
objetivo agarrándolo por el tubo de este ni hacerlo mientras se está observando
a través del ocular.
• Nunca retire la preparación con el objetivo de inmersión en posición de enfoque.
• Encienda la bombilla únicamente en el momento de hacer las observaciones.
• Mantener limpia y seca la platina del microscopio, en caso de derrame algún líquido,
secar con un paño humedecido con xilol.
• Para transportar el microscopio debe sujetarse siempre con las dos manos por la
base y la columna o brazo. Nunca tener objetos adicionales en las manos.
• Colocar el microscopio sobre la mesa, situado a 10 o 15 cm del borde.
• Hacer mantenimiento correctivo y preventivo Al momento de apagar definitivamente

el microscopio: colocar el objetivo de menor aumento en posición de enfoque,
retirar la muestra, limpiar el objetivo de inmersión con papel especial o paño óptico
sin frotar el lente, bajar completamente la platina, ubique en “cero” la perilla de
intensidad de luz, apagar el interruptor de la fuente y desconectar del tomacorriente.
Dejar enfriar el bombillo. Nunca enrolle el cable sobre elmicroscopio.
18
Referencias
Tille P. Diagnostic Microbiology. 13a ed. Brookings: Elsevier Health Sciences; 2013
Rodríguez-Cavallini E, Gamboa-Coronado M, Hernández-Chavarría F, García-Hidalgo JD.

Bacteriología General: Principios y Prácticas de Laboratorio. Costa Rica: Editorial
Universidad de Costa Rica; 2012.
Ruiz-Ruiz E, Porres-Osante, N. Microbiología clínica. Madrid: Ediciones Paraninfo SA; 2018
Gamazo C, López I, Díaz R. Manual práctico de microbiología. 3ª ed. Barcelona: Masson;

2005.
Murray PR, Rosental KS y Pfaller MA. Microbiología Medica. 8a edición. Barcelona: Elsevier;
2017.
Rubio-Granero C, García-García A, Cardona-Serrate F. Técnicas básicas de microbiología

y bioquímica. Madrid: Editorial síntesis;2017
Gutiérrez-Romero AL, Arellano-Pimentel BE, Gutiérrez-Iglesias C, Escalera-Zúñiga E,

Romero-Díaz GA, Saucedo-Constantino J etal. Manual de Laboratorio Microbiología
General I[Internet]. Universidad Nacional Autónoma de México-Facultad de Estudios
Superiores Zaragoza; 2017. Available from:
https://www.zaragoza.unam.mx/wpcontent/Portal2015/Licenciaturas/qfb/manuales/
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Tortora GJ, Funke BR y Case CL. Introducción a la Microbiología. 12ª ed. Buenos Aires:
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Rojas-Triviño A. Conceptos y Práctica de Microbiología General [Internet]. Universidad

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microbiologia _09diciembre2016.pdf
19
Egas-Ribadeneira D. Microscopía Electrónica: Fundamentos, Teoría y Aplicaciones.
Disponible en: https://bibdigital.epn.edu.ec/bitstream/15000/10421/3/T1421.pdf
Ubero-Pascal N. Fundamentos Técnicos de la Microscopía Óptica. Disponible en:

https://www.um.es/innova/OCW/Microscop%C3%ADa-aplicada-a-las-ciencias-forenses/
microscopia/material_clase/Sesion_Teorico-02.pdf
20
Capítulo 2. Técnicas para la observación
microscópica de microorganismos
La observación microscópica de los microorganismos proporciona información importante

para su identificación precoz y definitiva; se hace por medio de métodos como las
preparaciones en fresco o no coloreadas que permite observarlos vivos, o por medio de
tinciones biológicas positivas o negativas, que mejoran la imagen a observar. En la tinción
positiva, un colorante se une a ciertas estructuras bacterianas y en la negativa se utilizan
compuestos que no penetran en la célula, sino que impregnan el medio circundante y los
microorganismos aparecen refringentes en un medio negro. Las coloraciones más
utilizadas en microbiología son las coloraciones o tinciones diferenciales, en las que se usa
más de un colorante.
Preparaciones en fresco o no coloreadas

El término en fresco hace referencia a preparaciones o suspensiones de una muestra en
agua u otro líquido que se colocan entre porta y cubreobjeto. Este procedimiento es la forma
más simple para observar microorganismos vivos mediante un examen microscópico en el
que se evidencia su morfología, tamaño, color y movilidad. Existen dos técnicas para su
realización, la técnica en fresco simple entre porta y cubreobjetos y la técnica en gota
pendiente entre cubreobjetos y portaobjetos invertido. Las muestras que generalmente se
observan en fresco son: sedimento urinario, secreción vaginal, exudado uretral, esperma,
heces, esputo, exudados de lesiones, líquido de aspiraciones, entre otros.
Técnica en fresco Simple
Procedimiento
• Colocar una gota de líquido o muestra sobre un portaobjetos.
• Cubrir con un cubreobjetos. Evitar la formación de burbujas (figura 2.2).

• Observar al microscopio primero con objetivo de 10X y luego con objetivo de 40X
(figura 2.3).
21
Figura 2.2 Inmersión del hisopo en Solución
Figura 2.1 Frotis de la mucosa bucal
Salina
Figura 2.3 Colocación de la muestra y cobertura con cubreobjetos para

observación al microscopio
Técnica en gota pendiente.

• Colocar una gota del material en un cubreobjetos (figura 2.4).
• Cubrir con un portaobjetos invertido y con una excavación central (figura 2.5).
• Sellar la preparación con vaselina alrededor de la excavación (figura 2.6).
• Observar al microscopio primero con objetivo de 10X y luego con objetivo de 40X
(figura 2.6).
Por el sellado, esta técnica tiene la ventaja de poder ser observada durante un tiempo
más prolongado.
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Muestra
Porta
Cubre Objeto
objetos
Figura 2.5 Posicionamiento de portaobjeto sobre el
Figura 2.4 Depósito de muestra en cubreobjeto
cubreobjeto
Vaselina
Figura 2.6 Posicionamiento de porta objeto en la platina del

microscopio para visualización
Examen en fresco para el diagnóstico de parasitosis intestinales.

Este examen es el más sencillo para la búsqueda y observación de características
morfológicas de trofozoitos o quistes de protozoos, ooquistes de coccidios intestinales y
huevos o larvas de helmintos; permite además evidenciar el movimiento de las estructuras
que lo presentan.
Procedimiento:
• Colocar una gota de solución NaCl al 0.85%, en el centro de la mitad derecha de
un portaobjetos y una gota de lugol en el centro de la mitad izquierda (figura 2.7).
• Con un aplicador obtener aproximadamente 2 mg de la materia fecal y mezclarla

primero en la gota de solución salina y luego en la gota de lugol (figura 2.8).
• Hacer una suspensión uniforme y retirar los detritos macroscópicos si los hay.
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• Colocar un cubreobjetos en ambos montajes y hacer la observación microscópica
inmediatamente con los objetivos 10X y 40X (figura 2.9).
Figura 2.7 Gotas de solución salina (S.S) y Figura 2.8 Emulsión de la muestra con solución
lugol sobre el portaobjetos salina y lugol
Figura 2.9 Cubrimiento de montajes con cubreobjetos para

observación al microscopio
Tinciones o coloraciones
Los microorganismos poseen un protoplasma con índice de refracción cercano al del agua,
lo que hace difícil el contraste con el entorno y por consiguiente la visualización detallada
de sus características morfológicas, haciéndose necesario aplicar tinciones o coloraciones
para facilitar su identificación. Existe una gran variedad de tinciones, desarrolladas para la
detección de bacterias, hongos y parásitos.
Los colorantes utilizados en las tinciones son sales compuestas por un ión positivo y un ión
negativo, uno de los cuales está coloreado y se conoce como cromóforo. El color de los
colorantes básicos está en el ión positivo y en los ácidos está en el ión negativo. Bajo
24
condiciones de crecimiento la mayoría de las bacterias tienen un pH interno de 7 y una
superficie celular cargada negativamente, por lo que atrae el ión positivo coloreado del
colorante básico. Los colorantes más utilizados son los básicos, entre los que se
encuentran la violeta de genciana, safranina, verde de malaquita, azul de metileno. Son
ejemplo de colorantes ácidos la eosina, la fuchina ácida y el rojo Congo, entre otros; se
utilizan para teñir componentes como las proteínas.
Todas las tinciones se realizan a partir de extensiones o frotis de microorganismos sobre

un portaobjetos, secadas al aire y posteriormente fijadas; la fijación más utilizada es por
calor y consiste en pasar el portaobjetos, con la extensión bacteriana seca, a través de la
llama de un mechero; este método preserva la morfología externa de los microorganismos,
pero no las estructuras internas. Además, se puede hacer fijación química con agentes
como etanol, folmaldehido y ácido acético, utilizada cuando se requiere preservar las
estructuras celulares. Si no se realiza la fijación, los microorganismos en el portaobjetos
pueden ser arrastrados por el colorante.
A continuación, se describe el fundamento y procedimiento de las coloraciones más

utilizadas en el laboratorio de microbiología para la observación de muestras con
microscopía óptica y microscopía de fluorescencia.
Tinción negativa
Este método es ideal para observar cápsulas de bacterias u hongos Cryptococcus spp. En
esta coloración no se presenta reacción entre el colorante y las estructuras celulares, por
lo general se utiliza tinta china o nigrosina, ambos insolubles, los cuales forman una película
opaca.
Procedimiento.
• Agregar una gota de nigrosina o de tinta china sobre un portaobjetos (figura 2.10).
• Tomar una porción de la colonia a estudiar y hacer un frotis. Si el montaje es a partir

de una muestra líquida como líquido cefalorraquídeo, adicionar una gota (figura
2.11).
• Dejar secar la preparación si es in frotis. Para el montaje a partir de muestra líquida

colocar un cubreobjetos encima del montaje, evitando la formación de burbujas
(figura 2.12).
• Observar al microscopio los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro con

objetivo de 100x. El montaje líquido se debe observar con objetivo de 10x y 40x, con
el condensador bajo (figura 2.12).
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Figura 2.10 Gota de tinta china sobre el Figura 2.11 Mezcla con la muestra
portaobjetos
Figura 2.12 Mezcla con cubreobjeto dispuesto

sobre la platina del microscopio
Tinción simple
Es un método muy sencillo y rápido en el cual toda la muestra se tiñe del mismo color
porque se utiliza un solo colorante; brinda información acerca del tamaño, la forma y el
tipo de agrupación de los microorganismos.
Procedimiento.
• Colocar con el asa de siembra estéril sobre un portaobjetos, una gota de agua
destilada y una pequeña porción de un cultivo bacteriano. Hacer el frotis, formando
una película homogénea sobre el portaobjetos con el asa de siembra (figura 2.13).
Dejar secar.
• Fijar con calor pasando el portaobjetos a través de la llama del mechero (figura
2.14).
26
• Cubrir la preparación durante 1 minuto con una película de cualquier colorante
básico (figura 2.15).
• Lavar el exceso de colorante con agua (figura 2.16).
• Dejar secar al aire.
• Agregar una gota de aceite de inmersión. Enfocar con objetivo de 10X y luego
observar con 100X (figura 2.17).
Figura 2.13 Frotis de muestra sobre agua Figura 2.14 Fijación de la muestra al calor del
destilada mechero
Figura 2.16 Lavado con agua destilada

Figura 2.15 vertimiento del colorante
Figura 2.17 Montaje de la placa coloreada para observación al

microscopio
Tinciones Diferenciales
La forma más común de utilizar los colorantes en microbiología es en coloraciones o

tinciones diferenciales, en las que se visualiza más de un color porque usa más de un tipo
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de colorante de diferente color y para el caso de las bacterias, permiten distinguir entre
varios tipos de células bacterianas, que por sus características estructurales, tienen
comportamientos diferentes a los colorantes. Una tinción diferencial típicamente consiste
de tres pasos principales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para teñir a todas
las células en la tinción; enseguida un paso de decoloración, el cual remueve el colorante
solo de ciertos tipos de células y finalmente un colorante de contraste, el cual tiñe las células
recién decoloradas pero no tiene efecto sobre las células que aún retienen el colorante
primario. Las dos tinciones diferenciales más empleadas en microbiología son la tinción de
Gram y la tinción de Ziehl-Neelsen.
Coloración de Gram.
Esta tinción fue desarrollada por el médico danés Christian Gram en 1884, la cual es una
de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos
bacterianos en menos de 24 horas en Gram positivos y Gram negativos. La tinción de Gram
se fundamenta en una reacción basada en la cantidad de peptidoglucano presente en las
paredes celulares de estas bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen muchas capas
de peptidoglucano, las cuales, a su vez, sostienen moléculas de ácido teicoico. El ácido
teicoico reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tinción. Un
complejo de las moléculas cristal violeta-yodo-ácido teicoico es muy difícil de remover.
Como la pared celular de las células Gram positivas retiene estos compuestos, es más difícil
decolorar una célula Gram positiva que una Gram negativa. Una mezcla de alcohol remueve
el cristal violeta de la célula Gram negativa, pero no de la Gram positiva. Esta mezcla de
alcohol también disuelve mucho la capa exterior de lipopolisacáridos de la pared celular de
la pared Gram negativa, lo cual acelera la remoción del coloranteprimario cristal violeta de
estas células. Cuando otro colorante, usualmente safranina, se añade, las células Gram
positivas siguen de color azul-violeta mientras que las Gram negativas absorben el color
rojizo de la safranina. Al final del procedimiento de tinción, las células Gram positivas serán
del color del cristal violeta, o colorante primario, y las células Gram negativas serán del color
de la safranina que es el colorante de contraste (figura 2.18).
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Gram Positiva Gram Negativa
Fijación
Cristal Violeta
Lugol
Alcohol Acetona
Safranina
Figura 2.18 Cambios en la tinción de la pared celular de las bacterias gramnegativas y

grampositivas según los pasos de la tinción de Gram
La coloración de Gram es la técnica más empleada en los protocolos rutinarios de

identificación bacteriana. A excepción de clamidias, micoplasmas, ureaplasmas y
espiroquetas, todas las bacterias pueden observarse con esta coloración.
Procedimiento
• Poner sobre un portaobjetos una gota de agua destilada y una pequeña porción del
cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril. Preparar un extendido fino del
material en estudio y dejarlo secar al aire (figura 2.19).
• Fijar el material al portaobjeto de modo que no sea arrastrado durante el proceso de

tinción, pasando el porta objeto 3 o 4 veces por la llama de un mechero de Bunsen
(figura 2.20).
• Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con solución

de cristal violeta por un (1) minuto (figura 2.21).
29
• Pasado el minuto, lavar el exceso de colorante con agua destilada. Eliminar el
exceso de agua (figura 2.22).
• Añadir el mordiente lugol, dejar 1 minuto (figura 2.23).
• Lavar el exceso de mordiente con agua (figura 2.24).
• Lavar la preparación con alcohol acetona formando un ángulo con la preparación,

hasta decolorarla, durante aproximadamente 20 segundos (figura 2.25).
• Lavar con agua destilada y colocar nuevamente el portaobjeto sobre el soporte

(figura 2.24).
• Cubrir la superficie con Safranina, durante 1 minuto (figura 2.26). Lavar con agua.
• Colocar el preparado en un soporte de tinción en posición vertical, dejando

escurrir el exceso de agua hasta el secado completo del extendido.
• Examinar la preparación al microscopio con objetivo de inmersión (100X) (figura
2.27).
Figura 2.19 Frotis de muestra sobre agua Figura 2.20 Fijación del material con el
destilada mechero
Figura 2.21 Vertimiento de cristal violeta Figura 2.22 Lavado con agua destilada
30
Figura 2.23 Vertimiento de lugol Figura 2.24 Lavado con agua destilada
Figura 2.25 Vertimiento de alcohol cetona Figura 2.26 Vertimiento de safranina
Figura 2.27 Montaje de la placa coloreada en el microscopio
Control de calidad de la coloración de Gram
El objetivo principal del control de calidad de la coloración de Gram es evaluar en primer

lugar la realización adecuada del proceso de coloración, teniendo en cuenta el protocolo,
los tiempos de tinción, la calidad y el estado de los colorantes y la organización al momento
de realizar el procedimiento. Se utilizan dos microorganismos cuyas características
tintoriales han sido previamente establecidas, con el fin de que el resultado de la coloración
concuerde con dichas características.
31
Procedimiento.
• Agregar una gota de solución salina estéril en un portaobjeto limpio, con un asa
previamente esterilizada tomar una porción de cultivo de S. aureus (coco Gram
positivo) para depositarla sobre la gota de solución salina. Esterilizar el asa y tomar
una porción de cultivo de E. coli o Salmonella spp. (bacilos Gram negativos) para
depositarla sobre la gota de solución salina donde se colocó la anterior bacteria.
• Mezclar suavemente los dos microorganismos, sin tocar los bordes de la placa. Dejar
secar el frotis a temperatura ambiente. Una vez seco fijar el frotis pasando 3a 4
veces sobre la llama del mechero.
• Realizar la coloración de Gram. Dejar secar la placa y observar al microscopio con

objetivo de 100x.
Debe observarse claramente los cocos Gram positivos de color violeta y los bacilos Gram
negativos de color rosado – fucsia.
Coloración de Ziehl Neelsen.
Las micobacterias están cubiertas por ácido micólico, un material grueso, ceroso, que
resiste la tinción; no obstante una vez se tiñen las paredes celulares bacterianas resisten
a la decoloración por solventes orgánicos fuertes, como el alcohol ácido.
Consecuentemente dichas bacterias son conocidas como ácido alcohol resistentes, un
fenómeno descubierto en 1881 por Ziehl Neelsen. Se requiere un tratamiento especial para
que el colorante primario, la carbolfuscina, penetre en el material ceroso de los bacilos
resistentes al ácido. En esta técnica se utiliza calor. Una vez que la carbolfuscina se
deposita en la superficie del extendido, se pasa por debajo del porta objeto, hacia atrás y
hacia delante de la llama de un mechero. También se puede utilizar un componente que
permite la penetración de la tinción en la cápsula llamado Tergicol. Las bacterias resistentes
al ácido, resisten a la decoloración con alcohol ácido y las no resistentes se colorean con
colorantes de contraste como el azul de metileno o verde de malaquita.
Las bacterias que retienen el colorante carbolfuscina luego de decolorarse con alcohol
ácido son denominadas Ácido Alcohol Resistentes y se observan al microscopio de color
rojo o rosado. Habitualmente se utiliza esta coloración para la observación debacterias
como Mycobacterium spp, Nocardia spp., Streptomices spp. La técnica de Ziehl Neelsen
modificada es útil para el estudio de parásitos como Cryptosporidium, Isospora y
Cyclospora.
Procedimiento
32
• Hacer un extendido en una lámina porta objetos y dejar secar a temperatura
ambiente (figura 2.28).
• Cubrir el extendido con papel filtro y agregue carbolfuscina, calentar la lámina
pasando la llama de un mechero por debajo hasta el desprendimiento de vapores.
Si el colorante se empieza a secar, agregar más colorante. Este procedimiento se
hace por 5 minutos (figura 2.29).
• Descartar el papel con una pinza y lavar la lámina con agua (figura 2.30), cubrir el
extendido con azul de metileno o verde de malaquita por 1 minuto (figura 2.31).
• Lavar con agua y dejar secar a temperatura ambiente (figura 2.30).
• Observar al microscopio con objetivo de inmersión. Las bacterias ácido alcohol

resistentes se ven rojas o rosadas y las otras de color azul o verde dependiendo
del colorante de contraste (figura 2.32).
Figura 2.28 Extendido de muestra Figura 2.29 Vertimiento de carbolfuscina

mientras la muestra es calentada
Figura 2.30 Lavado de la Muestra con agua Figura 2.31 Vertimiento de azul de metileno o
destilada verde malaquita
Figura 2.32 Montaje de

la placa coloreada en el
microscopio
33
Coloración de Giemsa
Es útil para la coloración de hemoparásitos como Trypanosoma cruzi, Plasmodium spp. y

microfilarias, diagnóstico de micosis como histoplasmosis, neumocistosis, adiaspiromicosis
y foliculitis por Malassezia spp.
Procedimiento.
• Fijar el extendido con metanol por 3 - 5 minutos (figura 2.33).
• Cubrir la preparación con la solución de trabajo por 15 minutos (figura 2.34).
• Retirar el colorante y lavar con agua (figura 2.35).
• Secar la lámina y observar al microscopio con objetivo de inmersión (figura 2.36).
Figura 2.33 Fijado de la muestra con metanol Figura 2.34 Vertimiento de giemsa
Figura 2.35 Lavado de la muestra con agua Figura 2.36 Montaje de la placa coloreada en el
destilada microscopio
34
Coloración con azul de lactofenol
Esta tinción a pesar de no ser considerada una tinción diferencial, posee características
tintoriales que permiten observar claramente las estructuras de los hongos para hacer una
adecuada identificación de las diferentes especies de hongos de interés clínico a partir de
los cultivos.
Procedimiento
• Colocar una gota de azul de lactofenol sobre un porta objetos.
• Tomar con un asa o estilete una pequeña porción de la colonia o del crecimiento del
hongo y depositarla sobre el colorante, enseguida disgregarla cuidadosamente con
la ayuda del estilete (figura 2.37).
• Cubrir la preparación con un cubre objetos y observar al microscopio con objetivos

de 10X y 40X, el aspecto morfológico de las estructuras fúngicas (figura 2.38).
Figura 2.37 Disgregación de la muestra en una Figura 2.38 Montaje de la placa con
gota de azul de lactofenol cubreobjeto en el microscopio
Técnicas de tinción para microscopía de fluorescencia
La microscopía de fluorescencia supera a la microscopía óptica al aumentar el contraste,

permitiendo visualizar muestras con concentraciones de microorganismos diez veces
menores a las requeridas en la microscopía óptica. Hay dos tipos de técnicas de tinción por
fluorescencia, tinciones directas con fluorocromos y tinciones indirectas con
inmunofluorescencia.
Tinciones Directas. En las tinciones directas existe una unión directa entre el fluorocromo
y un componente de la célula microbiana. Las más utilizadas son la tinción de
35
naranja de acridina, la tinción de auramina-rodamina y Calcoflúor blanco con azul de Evans.
El calcoflúor blanco con azul de Evans es un método muy sensible para identificar las
estructuras micóticas en muestras clínicas, aunque su uso es limitado porque requiere de
un microscopio de fluorescencia. El calcoflúor es un fluorocromo que se une a polisacáridos
con enlaces beta 1-3 y beta 1-4, presentes en la pared celular de loshongos.
Tinciones Indirectas. En las tinciones indirectas los colorantes fluorescentes se unen con
anticuerpos específicos formando conjugados colorante-anticuerpo. Dichos conjugados se
unirán a antígenos microbianos específicos permitiendo su detección mediante el
microscopio de fluorescencia. Esta técnica combina el alto contraste de la fluorescencia con
la alta especificidad de las uniones antígeno- anticuerpo. El fluorocromomás utilizado en
los laboratorios de Microbiología es isotiocianato de fluoresceína por su estabilidad en
soluciones acuosas, intensidad y ausencia de interferencia con la reacción inmunológica
(figura 2.39).
Figura 2.39 Principios de la técnica con fluorocromos y de la inmunofluorescencia. La técnica con

fluorocromos (A) incluye la tinción de cualquier célula bacteriana con un colorante fluorescente. La
inmunofluorescencia (B) utiliza aticuerpos marcados con un colorante fluorescente (es decir, un
conjugado) para teñir de manera específica una especie bacteriana particular.
36
Referencias
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Ediciones Universidad Católica de Chile; 2018
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Directos. Medellín: CIB – INS; 2003
38
Capítulo 3. Técnicas básicas para el
aislamiento de microorganismos
Por su ubicuidad, los microrganismos se encuentran en la naturaleza en diversos ambientes

y materiales cumpliendo funciones benéficas y perjudiciales. Pueden encontrarse en el
suelo, el agua, el aire, los alimentos y superficies corporales; por lo tanto, las muestras en
las que se pueden estudiar los microrganismos van desde especímenes biológicos como
orina, pus, secreciones hasta muestras de alimentos, agua y suelo, entre otras.
El estudio de los microorganismos requiere de la aplicación adecuada de las técnicas
establecidas para el aislamiento en el cultivo y observación de característicasmicroscópicas
y macroscópicas que permiten la identificación y conocimiento de propiedades, cualidades
y rasgos distintivos.
Para obtener cultivos puros se hace la siembra o proceso en el que se colocan los
microrganismos en un medio de cultivo, empleando métodos asépticos, que exigen el
mantenimiento de un ambiente estéril con el uso del mechero de Bunsen y las cabinas de
siembra, la esterilización del material de trabajo como asas de siembra, frascos, tubos,
entre otros. Cuando la siembra se hace de un cultivo microbiano a otra toma el nombre de
subcultivo o repique.
A continuación, se revisan algunos de los procedimientos básicos, utilizados de rutina en el
adecuado procesamiento de muestras en el laboratorio de microbiología.
Procedimientos básicos en el laboratorio de microbiología

Preparación del área de trabajo
Para el trabajo en el laboratorio de microbiología se requiere disponer de un ambiente limpio
y ordenado, por lo que es necesario emplear una buena técnica de asepsia que garantice
el mantenimiento de la esterilidad de los elementos a utilizar. Por lo general la superficie
del área de trabajo se desinfecta con una solución de hipoclorito de sodio al 0.5% o 5 g/L
de cloro libre, aunque también se puede utilizar un compuesto a base de peróxido de
hidrógeno al 3%.
El mantenimiento de condiciones mínimas de asepsia exige que todo el material que se
va a emplear se encuentre estéril, disponible al alcance de la mano para evitar
39
desplazamientos innecesarios y mantener cerrados los medios de cultivo u otros recipientes
con microorganismos aislados.
Las necesidades particulares de la desinfección dependen del tipo de trabajo experimental
a realizar y de la naturaleza de los agentes infecciosos manipulados.
Cuando el trabajo se va a realizar en cabina de flujo laminar, se recomienda poner a
funcionar la cabina entre 15 y 30 minutos antes de iniciar el trabajo y dejarla encendida este
mismo tiempo después de finalizar. Colocar en el interior de la cabina solo el material
necesario y de uso inmediato; dividir la superficie de la cabina en tres zonas, una zona
limpia, una zona de trabajo y una zona de residuos en donde se ubicará un recipiente
para descartar productos de desechos como muestras, placas, tubos, entre otros. Si se
requiere introducir material adicional luego de iniciado el trabajo, se recomienda esperar
dos minutos para reiniciar el trabajo, para que se restablezca el flujo laminar.
Descontaminar semanalmente la superficie de trabajo y las superficies interiores de la
cabina con etanol al 70%.
Espátula de Asa Recta Asa en

Drigalski Anillo
Pipeta
Pasteur Mechero
Micropipeta
Figura 3.1 Materiales utilizados en el aislamiento de microorganismos
Esterilización del asa.

Para utilizar el asa bacteriológica, previamente debe esterilizarse en la llama del mechero,
calentando el alambre de ferroníquel en toda su extensión incluyendo la base del mango
hasta que se ponga roja (figura 3.2) o utilizando esterilizadores que funcionan mediante
rayos infrarrojos
40
El flameado o proceso de esterilización por incineración destruye cualquier forma de vida
sobre la superficie del asa. Al dejar de usar el asa también debe realizar este procedimiento.
Figura 3.2 Método de esterilización del asa bacteriológica por incineración.
Manejo de los tubos y el asa bacteriológica para hacer siembras o pases

bacterianos de un tubo a otro.
Procedimiento.
• Tomar el tubo con la mano izquierda y quitar la tapa con la mano derecha, flamear
de inmediato la boca del tubo (figura 3.3).
• Sostener la tapa entre el dedo meñique y la palma de la mano derecha, cerca de la

llama del mechero; con esta misma mano tomar el asa entre el dedo índice y el
pulgar (figura 3.4).
• Sembrar la muestra: Volver a flamear la boca del tubo antes de tapar de nuevo para
evitar la formación de aerosoles o la contaminación del tubo conmicrorganismos del
ambiente (figura 3.5).
• Realizar estos procedimientos cerca del mechero. Del correcto manejo de los tubos
depende el éxito de los cultivos y por consiguiente el resultado de los estudios
microbiológicos.
41
Figura 3.3 Figura 3.4
Figura 3.5
Manejo de la caja de Petri.

Procedimiento.
• Ubicar la caja de Petri sobre la mesa con el medio de cultivo hacia arriba
• Tomar la caja con la mano izquierda manteniendo la base y la tapa simultáneamente

y voltear para destaparla con el dedo pulgar de la misma mano, abrir la caja
parcialmente cerca de la llama del mechero para realizar la respectiva
siembra y cerrar al terminar (figura 3.6).

Figura 3.6 Apertura de la caja de petri
42
• La caja se debe marcar antes de llevar a la incubadora con cinta de enmascarar o
marcador en el borde de la base, para evitar tapar la superficie de los cultivos y hacer
difícil su observación.
Técnicas de siembra
Un cultivo puro se define como una población de células todas procedentes de una misma
célula. Con el uso de diferentes tipos de siembra se obtienen cultivos puros, indispensables
para la identificación y conocimiento de características morfológicas, bioquímicas y de
tinción, patogenicidad, sensibilidad a los antibióticos.
Para efectuar una siembra es fundamental trabajar bajo estricta asepsia, utilizar medios
de cultivo y materiales estériles, esterilizar los instrumentos utilizados antes y después de
cada procedimiento, no contaminar ni destruir el inóculo, depositar el inóculo sépticamente
en el medio de cultivo, trabajar lejos de corriente de aire, usando mechero o en cabina de
flujo laminar y realizar los procedimientos del protocolo específicos a seguir.
Tipos de siembra
Existen diferentes técnicas de siembra, entre las más utilizadas se destacan la siembra por
agotamiento o siembra por estrías en caja de Petri y en tubo con agar inclinado, siembra
masiva, siembra por estría sencilla, siembra por picadura en tubo, siembra en profundidad.
Siembras en caja de petri
Siembra por agotamiento o por estrías
El aislamiento de bacterias a partir de muestras biológicas se realiza, en la mayoría de los
casos, mediante la siembra por agotamiento. Este es un método en donde se da un
agotamiento progresivo y continuo del inóculo sobre un medio sólido contenido en una caja
de Petri, con el objetivo de obtener colonias aisladas y así disponer de un cultivo puroo
axénico o cepa.
Procedimiento.
• Esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero y enfriarla en el

área cercana a este antes de usar (figura 3.2).
• Introducir el asa en la muestra o suspensión bacteriana para tomar el inóculo (figura

3.4).
• Inocular o sembrar la muestra haciendo 4 o 5 estrías simples muy juntas de lado a lado
sobre un área pequeña próxima al borde de la caja, luego cerrarla (figura 3.7 y 3.8a).
43
• Flamear de nuevo el asa y girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la
caja, tocar la superficie de las estrías recién hechas en un punto alejado del inicio para
hacer un segundo grupo de estrías como las anteriores y cerrar la caja (figura
3.8b).
• Girar de nuevo la caja de Petri un cuarto de vuelta. Realizar el mismo procedimiento,

cerrar la caja (figura 3.8c).
• Hacer un último giro de la caja y sin flamear el asa de siembra hacer una estría más
abierta (figura 3.8d).
• Incubar las cajas con la base hacia arriba a la temperatura y condiciones óptimas para
el cultivo procesado. La gran mayoría de las bacterias y levaduras de interés clínico se
incuban a temperatura de 37°C durante 24-48 horas, los mohos se incuban a
temperatura ambiente entre 24 y 28°C por 1 a 6 semanas dependiendo el agente
sospechado.
Figura 3.7
a) b) c) d)
Figura 3.8 Siembra por agotamiento
Siembra en superficie
44
Con este procedimiento se obtiene el crecimiento de colonias en la superficie del agar que
permite el recuento de microorganismos o recuento de UFC (unidades formadoras de
colonias); se utiliza este método en el procesamiento de urocultivos y en el control de
calidad microbiológico de alimentos.
Procedimiento
• Depositar en la superficie del medio de cultivo una asada de muestra de orina con
asa calibrada para el caso de los urocultivos o 0.1 ml de cada dilución seriada del
alimento a analizar, haciendo una única estría a través del centro de la caja (figura
3.9a).
• Esparcir el inóculo de manera uniforme en ángulos rectos respecto de la primera

estría; girar luego 90° la placa y esparcir hasta cubrir toda la superficie del agar.
También se puede extender la muestra sobre toda la superficie de la placa, usando
un asa de Drigalski estéril (figura 3.9b).
• Marcar y luego Incubar las placas a la temperatura y tiempo de incubación acorde

con el cultivo realizado.
• Evaluar el crecimiento en las placas de agar a través de la observación de colonias
en la superficie y con base en el número de colonias, la cantidad de muestra
sembrada y la dilución correspondiente, calcular el número de microorganismos
viables en la muestra original (figura 3.9c).
Asa de
Asa 0.1 mL de Drigalski
Calibrada muestra
a) b)
45
Colonia
c)
Figura 3.9 Métodos de siembra de superficie
Siembra en profundidad.
Este método al igual que la siembra en superficie en placa de agar, permite realizar
recuento de UFC; consiste en mezclar el inoculo con el agar y durante la incubación las
colonias crecen en el interior del agar.
Procedimiento
• Depositar 1 ml de cada dilución en cajas de Petri estériles, vacías.
• Agregar a cada caja de 15 a 20 ml del medio de cultivo a emplear, previamente

fundido y mantenido a temperatura de 45 – 50ºC.
• Para mezclar el inóculo con el agar, agitar moviendo la placa tapada sobre la
superficie de la mesa con movimientos circulares y de vaivén (siempre sin levantar la
placa de la mesa).
• Dejar solidificar y llevar las placas a incubar a la temperatura y tiempo de incubación

acorde con el cultivo realizado.
• Evaluar el crecimiento en las placas de agar a través de la observación de colonias

en la superficie y con base en el número de colonias, la cantidad de muestra
sembrada y la dilución correspondiente, calcular el número de microorganismos
viables en la muestra original.
Medio fundido Colonia

1 mL de atemperado
muestra
por profundidad
Figura 3.10 Siembra
46
Siembra para aislamiento de hongos
Para el aislamiento de hongos causantes de micosis humanas, se debe introducir un poco
en el agar la muestra obtenida de la lesión, haciendo uso del asa de punta o estilete o a
través de incisiones con un bisturí en el medio de cultivo; se recomienda hacer varios
inóculos separados por una distancia aproximada de 1 cm. Estos cultivos deben sellarse
con parafilm, o cinta de enmascarar y se rotula con el nombre y la fecha correspondiente.
Los cultivos se incuban a temperatura ambiente y se invierten las cajas colocando la tapa
hacia abajo y la base hacia arriba; se revisan cada ocho días sin descartar antes de tres
semanas o más dependiendo del agente sospechado. Al crecer la colonia se analizan la
morfología macro y microscópica de ella (figura 3.11).
Colonia
Figura 3.11 Siembra de hongos
Siembra en tubo
Siembra en superficie de agar en tubo inclinado o bisel.

Este tipo de siembra permite el cultivo de microorganismos aerobios o anaerobios
facultativos, se utiliza además para almacenar cultivos a temperatura de 4ºC durante
períodos cortos de tiempo, para la amplificación de un inóculo pequeño y para hacer
algunas pruebas bioquímicas empleadas para la identificación de microrganismos.
Procedimiento.
• Tomar el recipiente que contenga la muestra con la mano izquierda, sujetando el asa
(previamente esterilizada) entre el índice y el pulgar de la mano derecha.
• recolectar con ella una porción de la muestra, seguidamente agarrando el tubo de

siembra con la mano izquierda, quitar la tapa y sostenerla entre el dedo meñique y
la palma de la mano derecha.
47
• flamear de inmediato la boca del tubo (figura 3.13) y esparcir el espécimen en la
superficie del bisel en forma de zig-zag desde el fondo hasta la parte superior,
cuidando de no dañar el agar, flamear antes de volver a cerrar el tubo(figura 3.12).
También, para algunas pruebas bioquímicas se puede hacer siembra en este agar de forma
simultánea en superficie (aerobiosis) y profundidad del agar (anaerobiosis). Para esto, se
procede de la siguiente forma:
• Tomar la colonia con asa de punta e introducirla primero por punción hasta el fondo
del medio (figura 3.14).
• Retirar el asa por el mismo sitio de entrada y luego sembrar en zigzag en superficie,
flamear antes de volver a cerrar (figura 3.12).
• Después de incubar en las condiciones apropiadas, se evalúa la presencia de

crecimiento en el agar por la formación de una película o por el crecimiento de
colonias en la superficie. Para el caso de pruebas bioquímicas se observará cambio
de color, precipitados, formación de burbujas, entre otras características.
Figura 3.12 Siembra en zig zag en tubo de agar inclinado
Siembra en medio semisólido.

Este tipo de siembra se utiliza para la conservación de cepas y en el procesamiento de
pruebas bioquímicas como SIM-sulfuro indol movilidad.
Procedimiento.
• Flamear la boca del tubo en la llama del mechero luego de abrirlo para hacer la
siembra (figura 3.13).
48
• Tomar el inoculo e introducirlo con el asa recta hasta el fondo del medio con un
solo movimiento cuidando de hacer el mismo trayecto de entrada y de salida, flamear
antes de volver a cerrar (figura 3.14).
• Después de incubar en las condiciones apropiadas, se evalúa el crecimiento en el

agar por la presencia de turbidez; la movilidad es positiva cuando se observa
turbidez tanto en el inóculo inicial, como alrededor de este; las bacterias no móviles
solo se desarrollan en el trayecto del inóculo inicial (figura 3.15).
Figura 3.13 Flameado de tubo
Figura 3.14 Siembra por punción en medio semisólido Figura 3.15 Evidencia de
crecimiento con movilidad positiva
Siembra en medio líquido

La siembra en medio líquido permite aumentar una población microbiana a partir de un
inoculo inicial, para obtener un elevado número de microorganismos, que por lo general
serán utilizados en studios o procedimientos posteriores.
Procedimiento
49
• Flamear la boca del tubo después de quitar la tapa (figura 3.16a), introducir el asa
previamente esterilizada y fría, tomar la muestra (figura 3.16b), retirarla del tubo ya
cargada, manteniéndola siempre cerca del mechero y luego flamear de nuevo la
boca del tubo antes de cerrarlo (figura 3.16a).
• Mantener el asa cargada entre el índice y pulgar derechos, tomar el tubo donde va
a colocar la muestra y retirar la tapa siguiendo el procedimiento del paso anterior,
flamear la boca del tubo (figura 316.a), colocar la muestra en el medio de cultivo
rotando con movimientos suaves el asa (figura 3.16d), luego de lo cual la debe retirar
y flamear de nuevo la boca del tubo antes de cerrarlo (figura 3.16a). Flamear de
nuevo el asa antes de colocarla en su soporte (figura 3.16c) . Esta siembra puede
hacerse además con hisopo o pipeta.
• Después de incubar en las condiciones apropiadas, el crecimiento microbiano se
interpreta como positivo cuando hay presencia de turbidez, formación de una
película o velo sobre la superficie o aparición de sedimento en el fondo del tubo,
entre otros (figura 3.16e).
a) Flameado del tubo b) Toma de muestra de medio líquido
c) Inoculación en medio líquido d) Esterilización del asa
e) Crecimiento bacteriano en médio líquido

Figura 3.16 Siembra en medio líquido
50
Referencias
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2017.
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Conceptos y Aplicaciones. 3a ed. España: Elsevie; 2011.
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Diagnóstico Microbiológico. Texto y atlas color. 6a ed. Buenos Aires: Editorial Médica
Panamericana; 2008.
Forbes BA, Sahm D, Weissfeld A. Bailey & Scott. Diagnóstico Microbiológico. 12a ed.
Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana; 2009.
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Rica: Editorial Universidad de Costa Rica; 2012.
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Paraninfo SA; 2018
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Ediciones Universidad Católica de Chile; 2018
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Martínez-Flores MG, Ortiz de Montellano MG, Flores-Cabrera Y. Manual de Laboratorio
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nacional de Colombia. Sede Palmira; 2011. Available from:
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S. Docencia-Manual de Practicas de Microbiología Básica[Internet]. UAM-Cuajimalpa;2016.
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from: http://www.fqbf.unsl.edu.ar/documentos/mde/micro/Micro_Biotec-2019.pdf
52
Capítulo 4. Metabolismo bacteriano
Se considera crecimiento bacteriano al incremento ordenado de todos los elementos

celulares y con ello, el aumento del número de células, particularmente su duplicidad. El
crecimiento bacteriano requiere una fuente de energía y de materia prima necesaria para
fabricar las proteínas, las estructuras y las membranas que conforman la maquinaria
estructural y bioquímica de la célula, para ello, deben obtener o sintetizar carbohidratos,
aminoácidos y lípidos que son las principales unidades moleculares de la célula bacteriana.
La captación de los anteriores elementos puede ser a partir del medio ambiente, y los
eventos que se dan desde la captación de dichos elementos hasta la división celular
conforman el metabolismo bacteriano.
El metabolismo bacteriano está compuesto por una etapa de destrucción o Catabolismo y

una etapa de síntesis o Anabolismo. Dentro de la primera se llevan a cabo la degradación
controlada de diversos sustratos orgánicos como carbohidratos, lípidos y proteínas; esto,
con el fin de obtener la energía necesaria para vivir produciendo trifosfato de adenosina
(ATP). La energía conseguida se emplea en la síntesis de estructuras celulares como la
pared celular, proteínas, ácidos grasos y ácidos nucleicos, este proceso de construcción se
le conoce por anabolismo.
De forma concreta, para las necesidades mínimas del desarrollo bacteriano se requiere
de una fuente de carbono, fosforo, azufre, nitrógeno, una fuente de energía, agua y diversos
iones. Sin embargo, aunque algunas bacterias como Pseudomona sp, Escherichia sp y
Staphylococcus sp sólo requieren adicionalmente ciertas moléculas simples para su
desarrollo (bacterias nutricionalmente no exigentes), otras como Haemophilus sp y
Neisseria sp demandan compuestos más complejos como vitaminas, cofactores, etc.
(bacterias nutricionalmente exigentes). No obstante, otro grupo de bacterias como
Chlamydias sp y Rikettsia sp requiere incluso parasitar otras células para su completo
desarrollo, a este grupo se les llama energéticamente exigentes.
El oxígeno (O2) es esencial para millones de organismos, no obstante, para muchas

bacterias sugiere una sustancia tóxica. Estos organismos como Clostridium perfringens,
llevan a cabo su desarrollo en ausencia total de O2 y se les conoce por anaerobios estrictos.
En el caso contrario, al grupo de bacterias que requieren la estricta presencia de O2 se les
llama aerobias estrictas (por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis). No obstante,la mayor
parte de las bacterias puede crecer tanto en presencia como en ausencia de O 2, estas se
denominan anaerobias facultativas.
53
El pH también es determinante para el crecimiento bacteriano, en función de la capacidad
de desarrollo de una bacteria de acuerdo con la concentración de iones de Hidrogeno en
un medio se pueden clasificar en:
• Neutrófilas: Si crecen en un pH que va desde 5,5 - 8,0. Ejemplo: Staphylococcus

sp y enterobacterias.
• Acidófilas: Estas bacterias pueden crecer en medios ácidos con índices de pH

comprendidos entre los 0,0- 5,5. Ejemplo: Lactobacillus sp
• Alcalófilas: Las bacterias que crecen en medios alcalinos o básicos con índices de
pH comprendidos entre los entre 8,0 - 11,5. Ejemplo: Vibrio sp.
Existen bacterias que son capaces de usar la luz como fuente de energía, llevando a cabo
procesos de fotosíntesis; un ejemplo de ellas son las cianobacterias. Otro grupo es capaz
de obtener energía directamente de la oxidación de iones metálicos como el hierro como
lo son las bacterias quimiotrofas.
Las bacterias halófilas son aquellas que tienen el potencial de desarrollarse en ambientes
con altas concentraciones de sal y de acuerdo con ello se clasifican en halotolerantes,
moderadamente halófilas y halófilas extremas, dependiendo de su requerimiento de sal.
Poseen dos mecanismos de adaptación: uno basada en la acumulación de sal en el interior
de la célula y el otro en la adaptación a todos los sistemas a las altas concentraciones
salinas.
Nutricionalmente las bacterias se pueden clasificar en autótrofas o litótrofas, puesto que

solo requieren sustancias químicas inorgánicas y de una fuente de carbono como el CO2
para producir energía, a diferencia de las bacterias heterótrofas o organótrofas que precisan
fuentes de carbono orgánico.
Dependiendo del tipo de bacteria, también varía la temperatura óptima para su desarrollo
y supervivencia. Con estas características se analizan ciertas peculiaridades patógenas de
las mismas, comprendiendo como estas se transmiten desde el medio ambiente al hombre
y el aseguramiento de muestras clínicas a la temperatura adecuada hasta su
procesamiento en el laboratorio.
• Bacterias Psicrófilas: Pueden sobrevivir a bajas temperaturas, entre 0 - 20ºC.

Ejemplo: Pseudomona sp, Listeria sp.
54
• Bacterias Mesófilas: Tienen un alto desarrollo con temperaturas comprendidas
entre los 20ºC - 45ºC. Ejemplo: Staphylococcus sp, Streptococcus sp.
• Bacterias Termófilas: Soportar altas temperaturas superiores a 55ºC. Ejemplo:

Rhodothermus obamensis.
• Bacterias Estenotérmicas: Son mesófilas, sin embargo, sólo se desarrollan y

sobreviven en rangos estrechos de temperatura alrededor de 35ºC - 36ºC. ejemplo:
Neisseria sp.
• Bacterias Euritérmicas: puede desarrollarse en amplios rangos de temperatura,

entre 0ºC - 44ºC. Ejemplo: Enterococcus sp.
Transporte transmembranal
Por la membrana citoplasmática sucede la absorción selectiva de nutrientes debido a que
la pared es porosa e impide solo el paso de elementos de gran tamaño, insolubles o
particulados. A través de la membrana no sólo ingresan sustancias, si no que a través de
ella también son eliminadas muchas de ellas mediante procesos activos y pasivos.
Como el interior de la membrana es hidrofóbico, siempre procura bloquear el pasaje de la

mayoría de moléculas hidrosolubles. Por lo tanto, podemos decir que cuanto menor sea el
tamaño de la molécula y mayor sea su liposolubilidad, mayor será su velocidad dedifusión
a través de la membrana.
• Difusión pasiva: Se produce por el contraste de concentracion de nutrientes entre

el interior de la célula y el medio ambiente como glicerol, agua, O2, CO2. Este
movimiento puede suceder a favor o en contra del gradiente de concentración
electroquímico.
• Difusión facilitada: En este transporte participan proteínas de la membrana

(proteína transportadora o Carrier) que permiten el paso de moléculas desde el
exterior al interior celular.
• Transporte activo: Este mecanismo conlleva a un gasto de energía y constituyen

las denominadas bombas de transporte, por ejemplo, bombas de sodio, calcio,
oxígeno, etc.
55
Mecanismos de obtención de energía
• Respiración aeróbica (oxidación): sucede en la presencia de O2 usando como
sustrato la glucosa u otro carbohidrato y el aceptor final de electrones es el oxígeno
molecular.
Glucosa + O2 CO2 + H2O + 38 ATP

Se comprende en los siguientes procesos:
• Glucólisis
• Decarboxilación oxidativa
• Ciclo de Krebs
• Transporte de electrones
Dentro del proceso se forman productos tóxicos como el O - y H O que2 son transformados
2 2
por la bacteria en O2 y agua mediante enzimas como la peroxidasa y la

superóxidodismutasa. Este mecanismo es utilizado por las bacterias aerobias y anaerobias
facultativas.
• Respiración anaeróbica: Es empleado por bacterias anaerobias estrictas y las

anaerobias facultativas en anaerobiosis. Sucede en ausencia de O2 usando como
sustrato la glucosa u otro carbohidrato y los aceptores finales de electrones son iones
inorgánicos.
Glucosa + S CO2 + SH2 + 34 ATP

• Glucólisis
• Descarboxilación oxidativa
• Ciclo de Krebs
• Transporte de electrones
• Fermentación: este mecanismo es el utilizado por las bacterias anaerobias estrictas y

anaerobias facultativas en anaerobiosis. Por tanto, prima la ausencia de O2. El sustrato
es la glucosa u otros carbohidratos y los aceptores finales de electrones son moléculas
orgánicas.
Glucosa + NADH Piruvato + NAD+ + ATP

• Glucólisis
56
• Degradación del piruvato
• Productos con alta energía: ácido láctico, propiónico, butírico, acético, alcohol
etílico, etc.
Viabilidad y pureza de cepas de referencia

Una cepa es una clona o una población de clonas celulares genéticamente conservadas
por lo que son genotípicamente similares entre ellas, son el resultado de la sucesiva división
celular de una sola célula. Con base en esto, las cepas de referencia sonmicroorganismos
definidos por lo menos a nivel de género y especie, catalogados y descritos según sus
características y preferiblemente de origen conocido. Son obtenidos de una colección
nacional o internacional reconocida. Es así como al conjunto de cultivos individuales
idénticos obtenidos por medio de un único subcultivo de una cepa de referencia se le
denomina cepas de reserva y a las cepas de reserva que se encuentran en el último pase
permitido para ser empleados en los ensayos se les llama cepas de trabajo. Entiéndase por
pase, la transferencia de microorganismos a un nuevo medio de crecimiento o conservación
lo que implica diferentes generaciones de microorganismos.
Algo crucial para las características de una cepa es su pureza que garantiza la presencia
de un solo tipo de microorganismo en un cultivo, la viabilidad, que posibilita a las cepas
crecer y reactivar su metabolismo luego de un proceso de reconstitución y la Estabilidad
que consiste en la facultad de un cultivo biológicamente activo de conservar sus
características genéticas y morfológicas a lo largo del tiempo; las características de una
célula varían como resultado de cambios genéticos, mutaciones o contaminación cruzada,
durante el tiempo de su manipulación y modo de conservación. Los métodos de
conservación pueden ser métodos físico-químicos que permiten conservar a los
microorganismos viables por un tiempo sin cambios genotípicos.
Las cepas de referencia de gran utilidad para demostrar que los medios de cultivo y kits
de análisis poseen características aceptables, para validar métodos diagnósticos o
investigativos (trazabilidad), además con ellos se puede controlar y verificar que los
reactivos y medios de cultivo conservan sus características.
Ejemplos de Proveedores de cepas de referencia:

• ATCC (American Type Culture Collection).
• SVM (Foundation for the Advancement of Public and Environmental Protection)
• CECT (Colección española de cultivos tipos).
• CNCM (Collection Nationale Cultures Microorganismes) lnst.Pasteur, Fance
57
• NCCB (The Netherlands Culture Collection of Bacteria, Holanda).
• NRRL: (ARS Culture Collection, USA).
• UKNCC: (United Kingdom National Culture Collections, (Reino Unido).
Fundamentación de las pruebas bioquímicas para determinación de

características metabólicas de las bacterias.
Medio TSI (triple-azúcar-hierro): El medio de cultivo TSI es universalmente usado para
la diferenciación de microorganismos tipo entero bacterias, teniendo en cuenta la
fermentación de carbohidratos, tales como glucosa, lactosa y sacarosa, y mediante la
producción de ácido sulfhídrico (H2S). Tiene extracto de carne y pluripeptona como
nutrientes adicionales para el crecimiento bacteriano, tiosulfato de sodio como otro sustrato
para evidenciar la producción del ácido sulfhídrico mencionado anteriormente y finalmente
rojo de fenol como indicador de PH. La fermentación de azúcar con formación de ácido (A)
está indicado por un cambio del rojo fenol indicador a un color amarillo, y la alcalinización
(K) por un cambio hacia rojo oscuro.
Se debe realizar una punción hasta el fondo (figura 4.1) del tubo agotando luego sobre la
parte inclinada (figura 4.2). Se debe Incubar a 37°C por 24 horas. Luego realizar la lectura
correspondiente. La formación de grietas en medio del cultivo se considera como signo de
formación de gas. (G) (figura 4.3a). El oscurecimiento o ennegrecimiento delAgar debido
a la precipitación de sulfuro de Fe nos indica la presencia de H2S (figura 4.3b). Si hay
fermentación de la glucosa, el fondo o parte inferior del medio se torna amarillo (Figura
4.3c). Si en cambio hay fermentación de lactosa y/o sacarosa o ambas, tanto la parte
inclinada como el fondo estarán amarillos.
Asa
Figura 4.1 Siembra por punción en medio TSI Figura 4.2 Siembra sobre superficie
inclinada
58
Fermentación
de la glucosa
H2S
a) b) c)
Gas
Figura 4.3 Cambios bioquímicos

del medio TSI
Medio SIM (sulfuro-indol-movilidad): Es un medio semisólido destinado a evidenciar la

producción de movilidad, la producción de indol y de ácido sulfhídrico por parte de los
microrganismos. En este medio la tripteina y la peptona aportan los nutrientes para el
crecimiento bacteriano, contiene triptófano que es un aminoácido que permite la
visualización de la formación o no de indol por parte de los microorganismos poseedores
de la enzima triptofanasa, la producción del indol se evidencia al agregar reactivo de erlich
o de kovacs para apreciar la formación de un compuesto rojo en la cima del medio y
finalmente contiene tiosulfato de sodio como otro sustrato para visualizar la producción de
ácido sulfhídrico el cual se evidencia mediante el ennegrecimiento del medio.
Al medio SIM se inocula por puntura simple sin estría (figura 4.4). Se debe Incubar a 37°C
por 18-24 horas y realizar la lectura correspondiente observando motilidad (figura 4.5),
producción de H2S e indol (figura 4.6). Las lecturas deben hacerse antes de efectuar el test
para indol. Los organismos móviles muestran un crecimiento difuso alrededor de la línea de
siembra (figura 4.5), mientras que los organismos con movilidad negativa, muestran
crecimiento solo a lo largo de la línea de siembra (figura 4.5). La formación de H2S se
manifiesta por ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en la totalidad del medio
(figura 4.6).
Figura 4.4 Siembra por punción en agar SIM
59
Rastro de Indol
movilidad al
Crecimieto en el rededor del sitio
sitio de siembra de siembra
H2O
Figura 4.5 Apreciación de Figura 4.6 Agar SIM con

Motilidad en agar SIM formación de indol y H2O
Medio citrato de simmons: Este medio de cultivo se utiliza para evidenciar la utilización
de citrato como única fuente de carbono y de sales de amonio como fuente de nitrogeno
por parte de los microorganismos. Su sustrato principal es el citrato de sodio y suindicador
es el azul de bromotimol para visualizar el viraje de colores dependiendo de la
transformación de los sustratos dentro del metabolismo bacteriano, La extracción de
nitrógeno de las sales de amonio producen amoniaco y se alcaliniza el medio virando el
indicador al alcalino (de color verde a color azul).
En este medio la inoculación se realiza por puntura y agotamiento (figura 4.1 y figura 4.2).
Se debe Incubar a 35-37°C por 24 horas y realizar la lectura correspondiente. Un test
positivo es indicado por el desarrollo de un color azul en el medio, indicativo de crecimiento
de gérmenes que utilizan el citrato como única fuente de carbono. En el caso de un test
negativo, no hay crecimiento o no hay cambio de color (figura 4.7). Este test depende de la
habilidad del organismo para utilizar el citrato del medio como única fuente de carbono.
Utilización
del citrato
como fuente
de carbono
Figura 4.7 Viraje medio citrato de simmons
60
Prueba de catalasa: La enzima catalasa está presente en la mayoría de las bacterias
aerobias y anaerobias facultativas, con la excepción importante de los estreptococos y
enterococos, el peróxido de hidrógeno, producto final del metabolismo aerobio de los
carbohidratos, es muy tóxico para las bacterias. La catalasa es una enzima que poseen la
mayoría de las bacterias aerobias. Descompone el peróxido de hidrógeno en agua y
oxígeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxígeno indica que la prueba es
positiva.
Se debe colocar una gota de agua oxigenada o peróxido de hidrogeno sobre un

portaobjetos con una pipeta o gotero, y posteriormente adicionar un inoculo de colonia de
interés, homogeneizar las colonias en la placa y visualizar la formación o no de burbujas
(figura 4.8).
Figura 4.8 Vertimiento de gotas de Peróxido de Hidrógeno sobre frotis de colonias bacterianas
con producción de burbujas (Catalasa Positivo)
Prueba de coagulasa: Para la realización de esta prueba se necesita un pequeñovolumen

de plasma de conejo o plasma humano, se fundamenta en la formación de un coagulo
mediante la inoculación de colonias sospechosas de producir la enzima coagulasa, esta
actúa sobre los factores de coagulación presentes en dicho plasma y da origen a un
coagulo. Esta prueba suele realizarse para confirmar presencia de bacterias como
Staphylococcus aureus. Esta prueba también puede ser realizada en placas portaobjetos y
tiene el mismo fundamento.
Se realiza con un inoculo de colonias sospechosas en aproximadamente 2 ml de plasma

de conejo o plasma humano, se pone en incubación a 37 grados centígrados en aerobiosis
durante 3-4 horas para posteriormente evidenciar la formación o no de un coagulo. (figura
4.9 y figura 4.10)
61
Figura 4.9 Vertimiento de gotas de plasma Figura 4.10 Homogenización de la mezcla para
citratado de conejo y de muestra evidenciar grumos
62
Pruebas De Viabilidad Y Pureza.
Viabilidad y pureza a partir de cultivo de E.coli ATCC 25922:
Cultivo de E. Coli No utiliza el

ATCC 25922 Citrato como
fuente de
Carbono
Observación de Crecimiento Colonias Verde Indol positivo, A/A,

Bacilos Gram significativo Metálico existencia de Produccion
negativos (Agar Nutritivo) (agar EMB) movilidad de Gas
(Coloración de (SIM) (TSI)
Gram)
Figura 4.11 Pruebas de viabilidad y pureza de un cultivo de E. Coli ATCC 25922
Viabilidad y pureza a partir de cultivo S. aureus ATCC 6538:
Cultivo de S. aureus
ATCC 6538
Coagulasa
Positiva
Catalasa
Observación de Crecimiento Viraje del medio a color positiva
Cocobacilos significativo amarillo, colonias
Gram positivos (Agar Nutritivo) amarillas. Fermentación
en racimos del manitol
(Coloración de (Agar Manitol Salado)
Gram)
Figura 4.12 Pruebas de viabilidad y pureza de un cultivo de S. aureus ATCC 6538
63
Valoración del reactivo de oxidasa. La prueba se fundamenta en la detección de la
enzima citocromo C oxidasa presente en diferentes tipos de microorganismos en presencia
del compuesto NNN'N',tetrametil, 1-4,fenilendiamina, que al reaccionar con la enzima de
dichos microorganismos produce una coloración violeta intensa.
La prueba puede realizarse mediate tirillas reactivas impregnadas con el anterior

compuesto o mediante papel filtro, las colonias sospechosas y el NNN'N', tetrametil,1-
4,fenilendiamina como solución al 1% en agua destilada.
Reactivo de oxidasa
Cinta de reactivo de oxidasa

(Negativo)
cultivo E. Coli ATCC 25922
Cinta de reactivo de oxidasa

(Positivo)
cultivo Pseudomona
aeruginosa ATCC 27853
64
Referencias
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65
Capítulo 5. Generalidades de bacterias
Las bacterias, pertenecientes al reino procariota, son microorganismos capaces de

reproducirse mediante fisión binaria, replicando al mismo tiempo su ADN, de esta manera,
cada célula hija tendrá el mismo genoma. Estas células presentan una estructura similar a
las eucariotas puesto que tienen una membrana celular y ribosomas que contienen la
información genética.
La presión osmótica interna de la mayoría de las bacterias varía de 5 a 20 atm como

consecuencia de la concentración de solutos a través del transporte activo. En la mayoría
de los entornos, esta presión sería suficiente para hacer explotar la célula si no estuviera
presente una pared celular con alta resistencia a la tracción. La pared celular bacteriana
debe su resistencia a una capa compuesta por varias sustancias conocidas como mureína,
mucopéptidos o peptidoglicanos.
La mayoría de las bacterias se clasifican como Gram positivas o Gram negativas según
su respuesta al procedimiento de tinción de Gram. La diferenciación entre estos dos grupos
se debe principalmente a sus envolturas celulares.
Bacterias Gram positivas.

La mayoría de las paredes celulares de las bacterias Gram positivas contienen cantidades
considerables de ácidos teicoico y teicurónico, los cuales pueden constituir hasta 50% del
peso seco de la pared, además, algunas paredes de bacterias Gram positivas pueden
contener moléculas de polisacáridos. El término ácido teicoico abarca la totalidad de la
pared celular, membrana o polímeros capsulares que contienen glicerofosfato o residuos
de ribitol fosfato. Estos polialcoholes están conectados por enlaces fosfodiéster y por lo
común se encuentran unidos con otros carbohidratos y con d-alanina (figura 5.1).
El hecho de que las cadenas de peptidoglicano estén reticuladas significa que cada capa
de peptidoglicano tiene una única molécula gigante. En una bacteria Gram positiva existen
hasta 40 láminas de peptidoglicanos, que constituyen hasta el 50% del material dela pared
celular; en las bacterias Gram negativas parece haber solo una o dos hojas, lo que
constituye del 5 al 10% del material de la pared. La bacteria adquiere su forma, quees
característica de cada especie en particular, debido a la estructura de su pared celular.
66
Figura 5.1 Estructura de la pared ceular de una bacteria Gram positiva. Fuente: Prescott, Harley,
and Klein’s. Microbiology, 7a. ed. Nueva York: McGraw-Hill;2008
Bacterias Gram negativas.

Las paredes celulares de las bacterias Gram negativas contienen tres componentes que se
encuentran fuera de la capa de peptidoglicano: lipoproteínas, membrana externa y
lipopolisacáridos (figura 5.2).
Membrana externa. Es diferente desde el punto de vista químico de todas las demás
membranas biológicas. Es una estructura con bicapa cuya hoja interna tiene una
composición similar a la de la membrana celular, en tanto que la hoja externa contiene un
constituyente diferente, lipopolisacáridos (LPS), además posee conductos especiales,
formados por proteínas denominadas porinas, que permiten la difusión pasiva de
compuestos hidrofílicos de bajo peso molecular como azúcares, aminoácidos y ciertos
iones.
Lipopolisacáridos (LPS). De bacterias Gramnegativas consisten en un glucolípido
complejo, denominado lípido A, el cual está unido a un polisacárido constituido por una
porción central y series terminales de unidades repetidas. El lípido A se encuentra
embebido en la hoja externa de la membrana a la cual se unen los LPS. Estos últimos se
sintetizan en la membrana citoplásmica y se transportan a su posición exterior final. La
presencia de LPS es necesaria para la función de muchas proteínas de la membrana
externa y son extremadamente tóxicos para los animales se denominan endotoxinas de
bacterias Gramnegativas porque se encuentran firmemente unidas a la superficie celular y
se liberan sólo cuando las células sufren lisis. Cuando los LPS se desdoblan en
polisacáridos y lípido A, toda la toxicidad se relaciona con este último. El antígeno O es
67
muy inmunógeno en animales vertebrados y le confiere especificidad antigénica, porque
éste es muy variable entre las especies e incluso en cepas de una misma especie.
Lipoproteínas. Las moléculas poco comunes de lipoproteínas unen la membrana externa
con las capas de peptidoglucanos. Las lipoproteínas son la proteína más abundante
desde el punto de vista numérico en las células gramnegativas. Su función es estabilizar
la membrana externa y fijarla a la capa de peptidoglucano.
Figura 5.2 Estructura de la pared celular de una bacteria Gram negativa. Fuente:
Bacterial endotoxins: Extraordinary lipids that activate eucaryotic signal transduction. J
Bacterial 1993;175:5745.
68
Comparación de las características de las bacterias Grampositivas y
Gramnegativas
Grampositivas Gramnegativas
Color de la células después
de la tinción de Gram Violeta Rojizo-rosado
Género representativo Bacillus, Staphylococus, Escherichia, Neisseria,

Streptococcus Pseudomonas
Componentes y estructuras distintivas
Peptidoglucano Capa gruesa Capa delgada
Ácido teicoico Presente Ausente
Membrana externa Ausente Ausente
Lipopolisacáridos Ausente Presente

(endotoxinas)
Proteínas porinas Ausentes (innecesarias Presentes; permiten el paso

porque carecen de de moléculas a través de la
membrana externa) membrana externa
Periplasma Ausente Presente
Características generales
Sensibilidad a penicilina Generalmente más Por lo general poco

susceptibles (con notables susceptibles (con notables
excepciones) excepciones)
69
Sensibilidad a las lisozimas Si No
Tamaño de las bacterias

Las bacterias son invisibles al ojo humano, por lo tanto, estas se miden en micrómetros
µm), unidad que equivale a 10-3 mm. El tamaño de las bacterias varía dependiendo de las
especies entre menos de 1µm y 250µm; siendo lo más habitual entre 1 y 10µm. Una
característica de las células bacterianas es la alta proporción que existe entre el área de
la superficie y el volumen de la célula. Esto significa que, poseen una gran superficie a
través de la que entran nutrientes para alimentar a un pequeño volumen; con lo cual,
pueden realizar muchas reacciones metabólicas y crecer rápidamente. Así, por ejemplo
Escherichia coli, tarda 20 minutos en dividirse mientras que, una célula de mamífero en
laboratorio tarda de 13 a 24 horas.
Formas de las bacterias

Las múltiples formas bacterianas pueden estar determinadas por distintos factores, siendo
la rigidez de la pared celular, el más importante de ellos. Las bacterias pueden ser
observadas individualmente a través de un microscopio o a simple vista si estas están en
conjunto al formar colonias.
Vistas al microscopio, por lo general, las bacterias presentan tres formas básicas: las
bacterias esféricas se denominarán cocos, las alargadas serán bacilos, las bacterias
curvadas y las que tienen forma de espiral serán los espirilos, espiroquetas, comas o
vibriones; cada una de ellas presentarán distintas características.
COCOS
Estas bacterias presentan formas casi esféricas y sus agrupaciones son homogéneas. El
tamaño de los cocos oscila entre los 0,8 a 1,0µ y pueden presentar y tomar diversas formas,
producto de dos factores importantes como son la tendencia de las células a mantenerse
unidas, una vez sucedida la división y el o los planos de división celular. Estas
agrupaciones pueden ser:
Diplococos. Son los que, después de su división, permanecen en pares
Estreptococos. Se dividen formando una secuencia de cuatro o más células como si se
tratase de una cadena. Ambos, se dividen en un solo plano quedando las células hijas
adheridas entre sí.
Diplococos
Plano de
división Streptococos
70
Tétradas. Estos cocos se dividen en dos direcciones perpendiculares, formando una
agrupación de cocos en una disposición cuadrada.
Tetradas
Sarcinas. Producto de la división de los cocos en tres direcciones perpendiculares.
Sarcinas
Estafilococos. Formados por la agrupación irregular de cuatro o más cocos, en ocasiones

se asemejan a racimos de uvas.
Estafilococos
Algunas veces la forma de estas bacterias presenta variaciones, pudiendo observarse

cocos de forma lanceolada, en forma de granos de café o achatados, estos últimos suelen
denominarse cocobacilos.
71
BACILOS
Estas bacterias forman agrupaciones bastante heterogéneas por su variedad de subtipos
morfológicos, que pueden ser cilíndricos, en forma de bastón, largos y delgados, pequeños
y gruesos, también pueden presentar variaciones en sus extremos pudiendoser rectos,
afilados o redondeados.
Al igual que los cocos, pueden presentar varias formas según la tendencia que tengan
células hijas para mantenerse unidas, estas agrupaciones pueden ser:
Los bacilos pueden presentarse aislados o agrupados.
Bacilo
Diplobacilos. Formados por bacilos agrupados en pares.
Diplobacilo
Cocobacilos. Ciertas especies se presentan como bacilos pequeños, redondos difíciles de

distinguir.
Cocobacilo
Estreptobacilos. Agrupación semejante a una cadena formada por cuatro o más bacilos.
Estreptobacilos
Empalizado. Son bacilos agrupados lado a lado como palitos de fósforo.
Bacilos
empalizado
72
Formas filamentosas. Son bacilos que crecen en forma de fibras y toman distintas
disposiciones por lo que esta formación se denomina también letras chinas.
Formas en V, L o letras chinas
ESPIRILOS
Dentro de este tipo de bacterias se encuentran aquellas que en su forma presentan una o
más curvaturas, algunas pueden presentar forma de hélices. Dentro de este grupo se
encuentran:
Vibriones: Son espirilos bastante cortos, por lo general presenta la forma de una coma.
Vibrión
Espirilo: Estas bacterias, relativamente rígidas, presentan una forma helicoidal; se mueven
a través de flagelos externos dando una o más vueltas alrededor de su propioeje.
Espirilo
Espiroquetas. Presentan una forma helicoidal, pero a diferencia de los espirilos, poseen
un cuerpo flexible, se mueven con la ayuda de filamentos axiales que son flagelos
periplasmáticos, lo que les permite dar varias vueltas completas alrededor de su propio eje.
Espiroqueta
73
OTRAS FORMAS
Las bacterias pueden presentar una serie de variaciones y entre estas se pueden presentar
bacterias en forma de estrella conocidas como género Stella, también se presentan
bacterias de forma rectangular y planas pertenecientes al género Haloarcula, ciertas células
alargadas en forma de pera pertenecen al género Hyphomicrobium y por último se
menciona bacterias que forman pedúnculos no celulares.
Forma de las colonias bacterianas

Las colonias son la manera macroscópica de observar la morfología de una agrupación
de bacterias, formadas por la reproducción de las bacterias en un medio en el cual son
incubadas por espacio de 24 horas aproximadamente; algunas requieren semanas de
incubación para su desarrollo y pueden estar formadas por millones de bacterias, de esta
manera el tamaño de las colonias puede variar desde 0,5 a 4,0 mm de diámetro.
La morfología de una colonia dependerá del borde y la forma en que se eleva sobre el
medio de cultivo.
La Forma de una colonia puede ser:
• Circular. Pueden medir hasta 4,0 mm.
• Puntiforme. Denominados también en cabeza de alfiler.
• Irregular. No representan una forma geométrica.
• Rizoide. Presentan una forma helicoidal.
• Fusiforme. En forma de husos.
En cuanto a los Bordes, estos pueden ser:
• Enteros. Son homogéneos en todo su recorrido.
• Ondulados. Presentan pequeñas fenestraciones.
• Lobulados. Sus bordes son curveados de manera irregular.
• Filamentos. Presentan finos filamentos alrededor de toda la colonia.
• La Elevación de la colonia puede ser Plana, Convexa y Elevada.
Las colonias pueden presentar diferentes Texturas, estas pueden ser:
• Lisas. Presentan una superficie homogénea.
• Concéntricas. Su textura se extiende de manera circular, por lo general de afuera
hacia adentro.
• Arrugadas. Su superficie presenta pequeñas áreas sobresalientes y leves
depresiones.
74
• Con curvas. Llamadas también sinuosas, presenta una textura similar a la
concéntrica, la diferencia radica en que este presenta un contorno más irregular.
Forma Borde Elevación Superficie

Puntiforme Entero Plana Lisa o rugosa
Circular Irregular Elevada Mate o brillante
Rizoide Lobulado Convexa Seca o cremosa
Irregular Crateriforme Invasiva o superficial
Figura 5.3 Aspectos más comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre
medio sólido
Las bacterias en conjunto presentan también otras características como:

• Pigmentación. Que pueden ser verde, amarillo o grisáceo.
• Olor. frutal o putrefacto. Consistencia: mucoide, liso o rugoso.
• Comportamiento óptico. frente a luz transmitida estos pueden ser opacos,

translúcidos o transparentes; frente a la luz reflejada estos pueden ser
brillantes u opacos.
Como ya se mencionó, las bacterias pueden observarse a simple vista cuando estas
se encuentran en colonias o pueden ser vistas a través de un microscopio óptico o
electrónico; en el último caso las bacterias pueden ser observadas con tinción
puesto que son incoloras y una correcta tinción mejora la visibilidad, pero también
75
pueden ser vistas sin tinción si son colocadas en soluciones no acuosas aumentando
de esta manera el índice de refracción.
Algunas bacterias son difíciles de teñir como el Treponema Pallidum, pueden ser
observadas con el microscopio de campo oscuro, que permite observar estos
microorganismos brillantes en un fondo oscuro.
Caracterización del crecimiento en medios líquidos como caldonutritivo.

Son evaluados según la distribución y apariencia del crecimiento como sigue:
• Turbidez fina uniforme: Crecimiento fino y totalmente disperso.
• Floculante: Crecimiento en agregados escamosos totalmente dispersos.
• Película: Crecimiento en la superficie como plataforma, grueso.
• Sedimento: Concentración del crecimiento en el fondo del caldo; puede ser

granular, escamoso o floculante.
A B C D
Figura 5.4 Apariencia del crecimiento cacteriano, sembrado en caldo nutritivo, donde: (A)
crecimiento de turbidez fina uniforme, (B) floculante, (C) película Y, (D) sedimento
76
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77
Capítulo 6. Morfología de los hongos
Características de la célula micótica

Los hongos son organismos de organización eucariota, más grandes que las bacterias; se
diferencian de otros eucariotas en su inmovilidad, aunque algunos poseen zoosporas con
un flagelo polar; tienen pared celular rica en quitina y glucanos, en general se consideran
aerobios, algunos pueden sobrevivir en microaerofilia o incluso en ausencia total de
oxígeno como es el caso de los Chytridiomycota, falta de pigmentos fotosintéticos y
cambios en la composición de sus estructuras como las paredes celulares. Presentan una
nutrición heterotrófica (nutrición química orgánica), que depende de nutrientes orgánicos,
que son disueltos por el sistema de enzimas fúngicas y absorbidos a través de las paredes
y membranas celulares.
Figura 6.1 Pared celular de los hongos.
Morfología de los hongos

Los hongos pueden ser unicelulares (como las levaduras), o multicelulares (hongos
filamentosos o mohos); sin embargo, existen hongos pleomórficos, que de acuerdo con el
medio en el cual se encuentren, desarrollan un crecimiento filamentoso o un crecimiento de
tipo levadura. Estos últimos son principalmente hongos patógenos.
Las levaduras son hongos unicelulares de forma esférica, alargada u oval y con diferentes
colores (blanco, rosado, beige o rojo). Su tamaño oscila entre 2,5–10 x 4,5-21 µm. Son
anaerobios facultativos, siendo las levaduras aeróbicas productoras de CO2, agua y
biomasa relativamente alta y las levaduras anaerobias, fermentadoras de azúcar en
78
alcohol, CO2 y menos biomasa. La mayoría son mesófilas, con una temperatura máxima
de crecimiento entre 24 y 48ºC, crecen en un rango amplio de pH entre 2,5 y 8. No
presentan mecanismos de locomoción, por lo que únicamente pueden ser transportadas a
través de corrientes de aire, fluidos o por insectos.
Las levaduras se reproducen por gemación, durante la cual se producen la célula madre,
una o varias yemas que, crecen y se separan formando células independientes; otra forma
de división de las levaduras es la división transversal o escisión, y algunas especies
producen yemas que de manera característica no se desprenden, y terminan por alargarse;
el paso siguiente en ese proceso produce una cadena de levaduras alargadas llamadas
seudohifas (figura 6.2a). En medios de cultivo forman colonias opacas, cremosas o
pastosas (figura 6.2b).
a) C. albicans. Blastoconidias y tubo b) C. albicans, colonias en medio

germinal. Cortesia: Ena Luz Torres. CHROMagar Cándida. Cortesia: Ena
Laboratorio de Micología, programa de Luz Torres. Laboratorio de Micología,
Bacteriología, U. de Córdoba programa de Bacteriología, U. de
Córdoba
Figura 6.2
En comparación con las levaduras, los hongos filamentosos (mohos), presentan un talo
compuesto por hifas ramificadas, que agrupadas conforman el micelio del hongo que es
macroscópicamente observable. Estas hifas, a su vez, pueden presentar septos o tabiques
transversales, conformando el micelio tabicado o septado (las hifas septadas asu vez
pueden contener un núcleo o varios núcleos formando células multinucleadas) (figura 6.4).
De forma contraria, en algunas clases de hongos, las hifas son continuas (sin ningún tipo
de separaciones), denominándose hifas cenocíticas, como en los hongos de la Clase
Zygomycetes (figura 6.3). Las estructuras de los hongos pueden ser hialinas (figura 6.3) si
el hongo carece de pigmentos o dematiáceas u oscuras, cuando los hongos producen
pigmentos como la melanina (figura 6.4).
Figura 6.3 Hifas hialinas aseptadas. Cortesia: programa de Bacteriología, U. de Córdoba

Ena Luz Torres. Laboratorio de Micología,
79
Figura 6.4 Hifas dematiáceas septadas.
Cortesia: Ena Luz Torres. Laboratorio de
Micología, programade Bacteriología, U. de
Córdoba
80
Características del cultivo de hongos.
Para estudiar los hongos se usan los mismos métodos generales que para las bacterias.
Casi todos se desarrollan en condiciones de aerobiosis en medios de cultivo para hongos
como el medio Sabouraud dextrosa agar, papa dextrosa agar, agar Sabouraud modificado
y medios bacteriológicos como agar sangre y agar chocolate que son útiles principalmente
para el aislamiento de levaduras. La temperatura óptima para el crecimiento de los mohos
varía entre 20 y 30ºC, mientras que las levaduras lo hacen mejor entre 35° y 37°C. El tiempo
de crecimiento de los hongos en el medio adecuado varía de acuerdo a su género y especie,
los mohos aseptados crecen entre 24 y 48 horas, los dermatofitos entre 10 y 20 días y los
agentes de micosis sistémicas entre 4 y 5 semanas.
Un hongo se identifica en primer lugar por la morfología macroscópica en la que se debe

tener en cuenta los criterios de consistencia, topografía y color de las colonias en el anverso
y reverso. La consistencia puede ser algodonosa, granulosa, pulverulenta, aterciopelada,
cremosa; la topografía puede ser plana, crateriforme, cerebriforme; el color de las colonias
de hongos es de un espectro muy variado, desde blanco hasta el negro, pasando por
tonalidades de rosado, salmón, morado, verde, marrón y gris.
Las levaduras se desarrollan como colonias de aspecto y morfología similar a las
bacterianas, así, algunas son lisas, otras rugosas, algunas son aplanadas, otras elevadas;
tienen bordes bien definidos e irregulares; en los medios convencionales la mayoría son de
color blanco o crema como Cándida spp, aunque algunas como Rhodotorula spp. pueden
producir pigmentos.
Las colonias de los hongos filamentosos tienen morfología mucho más variable y en general
se diferencian fácilmente de las levaduras. Los hongos filamentosos se identifican a nivel
de género especie por la morfología del micelio, pero sobre todo por las características
microscópicas de sus esporas asexuadas y los elementos que las originan.
Además del estudio macroscópico, se hace el estudio de la morfología microscópica a partir
de preparaciones con azul de lactofenol, en la que se deben tener en cuenta la presencia
de macroconidias, microconidias, conidias, esporas y otras estructuras. Se deben tener en
cuenta criterios específicos; es así como en las microconidias es importante el tamaño,
forma y organización sobre la hifa, mientras que en las macroconidias se observará el
tamaño, forma y tipo de pared.
Para conseguir la producción de esporas a veces se requieren medios de cultivo especiales
que facilitan la esporulación. Los hongos no esporulados (micelio estéril) son difícilmente
identificables. Las levaduras se identifican mediante pruebas metabólicas, de modo
semejante a las bacterias.
81
Morfología macróscopica de algunos hongos.
Figura 6.5 Topografía: plana Figura 6.6 Topografía: plana

Consistencia: algodonosa (Fusarium spp). Consistencia: granulosa. Cortesia: Ena Luz
Cortesia: Ena Luz Torres. Laboratorio de Torres. Laboratorio de Micología, programa de
Micología, programa de Bacteriología, U. de Bacteriología, U. de Córdoba
Córdoba
Figura 6.7 Topografía: plana Figura 6.8 Topografía: crateriforme

Consistencia: pulverulenta (Aspergillus flavus). Consistencia: aterciopelada. Cortesia: Ena Luz
Cortesia: Ena Luz Torres. Laboratorio de Torres. Laboratorio de Micología, programa de
Córdoba
Figura 6.9 Topografía: plana Figura 6.10 Topografía: cerebriforme

consistencia: cremosa (Candida albicans). Consistencia: rugosa. Cortesia: Ena Luz Torres.
Cortesia: Ena Luz Torres. Laboratorio de Laboratorio de Micología, programa de
Córdoba
82
Dimorfismo
Algunas especies de hongos pueden crecer ya sea como levadura o como moho,
dependiendo de las condiciones ambientales. Estos hongos se conocen como dimórficos,
entre los cuales se encuentran varios patógenos para los humanos; crecen en forma de
moho en el medio ambiente y en medios de cultivo a temperatura ambiental, pero se
convierten en levaduras o en alguna otra forma en tejidos infectados y en medios de cultivo
a 35° o 37°C. Es posible manipular las condiciones de cultivo para que se presenten in vitro
las fases de levadura y moho. Los eventos fisiológicos y morfológicos relacionados con la
conversión de moho a la fase de levadura se han estudiado ampliamente en el hongo
patógeno para humanos Histoplasma capsulatum que se observa a continuación.
Figura 6.11 Histoplasma capsulatum, Figura 6.12 Histoplasma capsulatum forma

forma saprofítica a temperatura parasitaria a 37 °C (levaduras
ambiente(macroconidias tuberculadas). intracelulares). Cortesia: Ena Luz Torres.
Cortesia: Ena Luz Torres. Laboratorio de Laboratorio de Micología, programa de
Micología, programa de Bacteriología, U. Bacteriología, U. de Córdoba
de Córdoba
Enfermedades micóticas
Actualmente hay descritas cerca de 100.000 especies de hongos, de las cuales solo
alrededor de 100 pueden considerarse patógenos potenciales para el ser humano. Las
infecciones que causan los hongos en los humanos van desde infecciones localizadas
cutáneas, subcutáneas hasta enfermedades sistémicas potencialmente fatales causadas
tanto por hongos patógenos como por hongos oportunistas que causan lesiones en
circunstancias de susceptibilidad anormal de paciente.
Hoy en día, las micosis pasaron de ser procesos de poca trascendencia a ser desordenes
habituales y en muchas ocasiones severos, especialmente en el creciente grupo de
pacientes inmunocomprometidos, para quienes estas enfermedades representan una
complicación.
83
En las micosis cutáneas superficiales, los hongos crecen en lugares en que exista queratina
como la capa cornea de los epitelios, pelos, uñas. Dentro de este grupo de micosis se
encuentran la pitiriasis versicolor, piedra negra, piedra blanca, tiña negra, dermatofitosis o
tiñas y las dermatomicosis por hongos no dermatofitos.
Figura 6.13 Alteración de lámina ungueal causada por hongos

en un caso de onicomicosis. Cortesia: Ena Luz Torres.
Laboratorio de Micología, programa de Bacteriología, U. de
Córdoba
Las micosis subcutáneas, son causadas por hongos que se encuentran en restos vegetales
o material orgánico en descomposición, los cuales son introducidos en los tejidos por un
trauma causado por espinas, astillas de madera o fómites. Este grupo de micosis incluye
esporotricosis, cromoblastomicosis, micetomas, lacaziosis ; se caracterizan por la
presencia de lesiones en piel y tejido subcutáneo, que van desde nodulares, costrosas,
verrucosas y queloideas hasta induradas con fistulas y secreción de gránulos.
Las micosis sistémicas se clasifican en endémicas y oportunistas. Las primeras, son
causadas por hongos dimórficos, patógenos primarios, cuyo nicho ecológico está
restringido a ciertas áreas geográficas; se adquieren por la inhalación de esporas que se
encuentran en el suelo o el ambiente, las que luego de su entrada a los pulmones pueden
diseminarse por vía hemática y algunas veces linfática para afectar diferentes órganos y
sistemas. Este grupo de micosis incluye histoplasmosis, paracoccidioidomicosis,
blastomicosis y coccidioidomicosis. En contraste, las micosis sistémicas oportunistas son
causadas por hongos saprofitos, que afectan a personas susceptibles o inmunodeprimidas
por algún otro cuadro médico, o sometidas por periodos prolongados a tratamiento con
inmunosupresores o agentes antibacterianos; en los que producen manifestaciones agudas
como neumonía progresiva, fungemia o signos y síntomas de diseminación extrapulmonar.
84
La Candida albicans, hace parte de la micobiota humana en las mucosas de la boca, vagina
y tubo digestivo. Cuando el sistema inmune está alterado, esta levadura puede desarrollar
un proceso invasivo, produciendo lesiones conocidas con el nombre de candidiasis, siendo
las más frecuentes las aftas a nivel de la mucosa de boca y faringe, el muguet, candidiasis
vaginal y broncopulmonar.
85
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Editorial Trillas; 2012
Manual de Laboratorio. Universidad de Antioquia. Facultad de Medicina. Departamento de
Microbiología y Parasitología Micología Médica
86
Con el advenimiento de las técnicas moleculares, surgen nuevas propuestas de
clasificación taxonómica de los seres vivos, dentro de las cuales una de las más seguidas
es la de Cavalier- Smith, que propone dos imperios, Prokaryota y Eukaryota y seis reinos,
en dos de los cuales se ubican los microorganismos considerados como protozoos
(Cromista y Protozoa).
Generalidades de los protozoos

Los reinos Potozoa y Cromista, agrupan los organismos unicelulares que siempre hemos
denominado protozoos o protozoarios, unos de vida libre y otros parásitos de animales y
plantas. Son organismos microscópicos unicelulares, eucarióticos, de forma y tamaño
variable. La mayoría de los protozoos son móviles en una etapa de su desarrollo, lo que se
conoce conel nombre de forma vegetativa o trofozoíto que es la forma patógena.
así:
Membrana nuclear
. Se observan 4 núcleos.
Cortesia: OMS
a) Trofozoito deGiardia lamblia. Cortesia: b) Quiste deGiardia lamblia. Cortesia:Oscar
Oscar Vanparís, Janssen, Bélgica Vanparís, Janssen, Bélgica
Figura 7.5Giardia lamblia(Flagelados intestinales)
Flagelados atriales:Parásitos de la boca, uretra y vagina:
Figura 7.6Trofozoito de Trichomonas

vaginalis. Cortesia: OMS
Hemoflagelados:flagelados de la sangre ejemplos:
Figura 7.7Tripanosoma,
Cortesía:
Sullivan J:A Color Atlas of
88
Parasitology, 8a. ed. 2009
89
Cilias. Los que tienen su cuerpo cubierto de cilias o pestañas vibrátiles que se mueven
sincrónicamente y producen la traslación del organismo, se clasifican en el filo Ciliophora.
Figura 7.8Trofozoito de Balantioides coli. Figura 7.9Quiste de Balantioides coli.

Cortesía: OMS Cortesía: OMS
Esporozoario. Los que carecen de órganos de locomoción en casi todas sus etapas de
desarrollo, se clasifican en la clase Sporozoea.
a) b) c)
Figura 7.10Plasmodium viva xy Plasmodium falciparum. a) trofozoito de Plasmodium viva x
dentro de un eritrocito, b) anillos dobles, c) gametocitos en forma de banana que de forma
atípica se observa en las infecciones por la Psmodium falciparum.
Cortesia:Sullivan J:A Color of Parasitology, 8a. de. 2009.
90
Transmisión de parásitos del reino protista.
Hay protozoos que se transmiten por vía fecal-oral Ejemplo: (Amebas-Giardia- Balantidium)
poseen fase quística o de resistencia y trofozoíto. Mientras que los que se transmiten por
vectores (Tripanosomas-Leishmania-Plasmodium) y contacto íntimo (Trichomona) no
adoptan forma resistente o de quistes.
Generalidades sobre helmintos

Los helmintos o vermes, comúnmente llamados gusanos, son seres multicelulares o
metazoarios y sus funciones vitales ocurren en estructuras celulares organizadas como
tejidos y órganos. De los helmintos parásitos del hombre se estudian dos grandes phylum:
Nematelmintos (phylum Nematoda) yPlatelmintos(phylum Platyhelminthes).
Los nemathelmintoso nemátodosson gusanos de cuerpo cilíndrico no segmentados,

con sexos separados, cavidad corporal y tubo digestivo completo Ejemplos:
Huevos Adultos
Ascaris
lumbricoides
Cortesia:Hospital Universitario Cortesia:Hospital Universitario

San Vicente de Paúl, Medellín, San Vicente de Paúl, Medellín,
Colombia Colombia
Necator
americanus
(uncinarias)
Cortesia:Hospital Universitario Cortesia:Oscar Vanparis, Jansen

San Vicente de Paúl, Medellín, Pharmaceutica, Bélgica
Colombia
Enterobius
vermicularis
(oxiuro)
Cortesia:Oscar Vanparis, Jansen Cortesia:Oscar Vanparis, Jansen

Pharmaceutica, Bélgica Pharmaceutica, Bélgica
91
Trichuris trichura
(tricocéfalo)
Cortesia:MC López-Páez, A Cortesia:Shiba kumar Rai et al.

Corredor-Arjona, RS Nicholls- Atlas of medical Parasitology,
Orjuela. Atlas de Parasitología. Kobe University, Kobe, Japón
Manual moderno
Platelmintos (Phylum platyhelminthes)

Se dividen en dos clases de interés médico:
Clase Trematodaque agrupa a los tremátodos: gusanos planos no segmentados, forma
de hoja ejemplo:
Figura 7.11Fasciola hepàtica

Cortesia: Montoya-Palacio MN, Gómez Calderon VA, Agudelo-López SP. Atlas
de Parasitología. CIB. Medellìn Colombia
Clase Cestoda o Cestoideason gusanos planos, que tienen un cuerpo o estrobila formada
por segmentos denominados proglótides. Se fijan a la mucosa del intestino delgado por
unórgano llamad o escólex, que posee ventosas o ganchos. Son hermafroditas y
sereproducen por huevos.
92
Figura 7.12Taenia solium(tenia del cerdo) Figura 7.13Taenia sollium o Taenia saginata
Cortesia:Shiba kumar Eai et al. Atlas of (tenia de la vaca)
medical Parasitology, Kobe University, kobe, Cortesía:Oscar Vanparis, Janssen
Japón Pharmaceutica, Bélgica
Eamen coprológico o estudio de las materias fecales.

Es el método más simple, pero existen otros procedimientos complementarios para el
diagnóstico de parásitos intestinales, que pueden efectuarse de acuerdo con las
necesidades.
Recolección de la muestra fecal. Generalmente la muestra emitida espontáneamente es

la adecuada para el examen coprológico. Necesita recogerse en un recipiente (frasco o
caja plástica), seco y limpio. La muestra no debe mezclarse con orina y enviarse al
laboratorio inmediatamente después de obtenida. En algunas circunstancias, se puede
obtener muestra adecuadas directamente del intestino, por ejemplo, rectoscopias o tacto
rectal. Son muestras inadecuadas las que se han mantenido por más de un día a
temperatura ambiente; las que se obtienen después de un estudio radiográfico del tubo
digestivo, en el cual se usa bario; y las que presentan abundante cantidad de algunas
sustancias que se han ingerido con fines terapéuticos, como aceite, algunos antidiarreicos
con bismuto, etc.
Examen coprológico directo

Examen macroscópico. Es importante determinar la consistencia de las heces fecales y
clasificarlas en líquidas, blandas o duras. El color anormal tiene significado patológico, por
ejemplo: negro en melenas, blanco en acolia. Observar si existe moco, sangre, restos
alimenticios o helmintos.
93
Examen microscópico.Mediante el microscopio es posible identificar huevos, larvas,
quistes, etc, en los parásitos intestinales. En un portaobjetos se coloca separadamente
una gota de solución salina-eosina o solución salina al 0.85% y otra de Lugol. Con un
palillo se toma una pequeña porción de materias fecales y se hace una suspensión en la
gota de solución salina, y luego se repite el mismo procedimiento en la gota de Lugol con
palillos diferentes. Se cubren con portaobjetos de 22 x 22 mm y se observa al microscopio
con objetivo 10X y luego con 40X. las preparaciones no deben ser muy gruesas o
delgadas.
Diagnóstico de parásitos
Gota gruesa
Es un examen microscópico que permite establecer la presencia de hemoparásitos en
una muestra de sangre concentrada, la cual es coloreada con los derivados de
Romanowsky. Permite el estudio cualitativo y cuantitativo del parásito y es considerado el
método de referencia o Gold Estándar para el diagnóstico de malaria. Los parásitos se
identifican por su forma y por la coloración diferencial de su citoplasma, cromatina y
pigmento; se deben distinguir de otros microorganismos sanguíneos y demicroorganismos
o artefactos que puedan estar presentes en la lámina o en el colorante.
Se pueden observar los parásitos del género Plasmodium, con las características propias
de cada especie, tanto de los estadios parasitarios asexuados (trofozoitos y esquizontes)
como de los sexuados (gametocitos). Sin embargo, las características del glóbulo rojo o
célula huésped solamente es posible evaluarlas en el extendido. Para el Trypanosoma
cruzitambién se puede utilizar la gota gruesa, la única desventaja es que la membrana
ondulante no es fácilmente identificable, ya que durante el procedimiento puede perderse,
por el proceso de deshemoglobinización y por el secado de las láminas, aun así, permite
evidenciar el parásito identificándose cinetoplasto, núcleo y flagelo, en sangre periférica
capilar o venosa el parásito se observa con su morfología característica.
Para Leishmania la confirmación diagnóstica se hace principalmente por el

hallazgo de los amastigotes en e l frotis directo coloreado y tomado del borde de la lesión.
También se pueden encontrar los parásitos en biopsia y cultivos.
Procedimiento para la toma de muestra y elaboración de la gota gruesa.

La Gota gruesa puede hacerse de sangre con anticoagulante o de gotas obtenidas por
punción. Éstas se obtienen del lóbulo de la oreja, de la parte lateral de la yema del dedo
medio de la mano y en niños pequeños del dedo gordo del pie. Para la punción limpiar la
piel con alcohol, dejarla secar, puncionar con lanceta desechable y limpiar la primera gota
de sangre con algodón seco. Presionar para obtener una gota pequeña, la cual se recibe
directamente en el tercio externo de un portaobjetos, sin tocar la piel. Se extiende la
94
sangre utilizando el ángulo y los primeros 5 mm del borde longitudinal de otro portaobjetos,
para formar un rectángulo ele 1.5 cm por 0.5 cm. A unos S mm por debajose hace otra
preparación semejante a la anterior. Después de estar secas, se utiliza uno de los
rectángulos para marcar la identificación de la muestra, con un lápiz de punta final. Colorear
a la mayor brevedad posible.
Los frotis secos son coloreados con la coloración de Giemsa. Se colocan las láminas con
los frotis sobre un soporte y se cubren con metanol durante 5 a 10 minutos para su fijación,
posteriormente se derrama el resto de metanol que se encuentra sobre lasláminas y se
cubren los portaobjetos con solución de Giemsa diluida, preparada en el momento para la
coloración. Para cubrir cada lámina, la dilución del colorante de Giemsa se confecciona
agregando 2 a 4 gotas de colorante puro a 2 ml de agua destilada (o agua corriente), se
adicionan una gota de la solución tampón PBS pH = 7,2 y se agita la mezcla vigorosamente.
Se dejan las láminas con el colorante diluido por al menos 30 minutos. Posteriormente se
lavan las láminas con agua corriente por unos segundos y se secan para su observación al
microscopio. Cada laboratorio debe ajustar la concentración del colorante, el pH y el tiempo
de coloración para una visualización correcta de los elementos parasitarios. Pueden
utilizarse también otras fórmulas de coloración del tipo Romanowsky, como May-Grünwald,
o Wrigth, pero la que tiene una mejor tinción para parásitos es la coloración original de
Giemsa.
95
Referencias
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eukaryotic tree. Biol Lett. 2010;6(3):342-345. doi:10.1098/rsbl.2009.0948
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96
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https://www.ins.gov.co/buscador eventos/Informacin%20de%20laboratorio/Gu%C3%ADa
%20Vigilancia%20por%20laboratorio%20Plasmodium%20spp.pdf
97
Capítulo 8. Medios de cultivo
Generalidades de medios de cultivo

Uno de los métodos más importantes para la identificación de microorganismos es observar
su crecimiento en materiales alimenticios artificiales preparadas en el laboratorio. El
material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el “medio de cultivo” y el
crecimiento de los microorganismos es el “cultivo”. Se han desarrollado más de 10.000
medios de cultivo diferentes.
Para permitir el crecimiento de microorganismos en condiciones de laboratorio, es

necesario aportarle al medio de cultivo, los nutrientes y condiciones fisicoquímicas
adecuadas para el desarrollo de estos. Los medios de cultivo son preparaciones nutritivas
especiales para la recuperación, aislamiento y mantenimiento de microorganismos
bacterianos y fúngicos.
De forma general, se puede decir que los medios de cultivo se componen de:
• Una fuente de carbono. Normalmente son azúcares sencillos como, por ejemplo,
glucosa, lactosa, etc.
• Una fuente de nitrógeno. Se suelen usar proteínas parcialmente hidrolizadas,

peptonas u otros componentes, como Na+, K+, vitaminas, etc.
• Amortiguadores de pH (soluciones tampón o buffer). Son sustancias que ayudan a

mantener el pH del medio de cultivo dentro de un rango adecuado para el
crecimiento de los microorganismos. Por ejemplo, suelen usarse como tampones
los fosfatos disódicos (Na2HPO4) o monosódicos (NaH2PO4).
Existen preparados comerciales (infusiones o extractos) obtenidos a partir de tejidos

animales como cerebro, corazón o hígado. Y a veces se usan también fluidos corporales
como la sangre animal. Todos estos productos contienen los componentes básicos
necesarios para el crecimiento de microorganismos.
No todos los microorganismos son cultivables en el laboratorio, pero sí, una enorme
cantidad de ellos. Podría hablarse de cultivos bacteriológicos porque en la mayoría de los
casos lo que se cultiva en el laboratorio clínico son bacterias, pero también lo pueden hacer
otro tipo de microorganismos, como es el caso de los hongos. Debido a esto, es
98
mejor hablar de cultivo de microorganismos. La gran diversidad metabólica que tiene este
conjunto de organismos explica la amplia gama de medios de cultivo que existen en el
mercado.
El agar es un poligalactósido que se obtiene a partir de algas rojas marinas. La mayoría

de microorganismos son incapaces de degradarlo. Las concentraciones habitualmente
utilizadas en los medios de cultivo bacteriológicos son de 13-20 g/l para medios sólidos y
5-7 g/l para medios semisólidos.
Los medios de cultivo se clasifican según diversos criterios: según su consistencia, su

composición y su función.
Según su consistencia
Líquidos: No contienen agar-agar. El crecimiento bacteriano o fúngico se evidencia por la

turbidez del caldo (que originalmente es traslúcido), precipitaciones o formación de natas.
Sólidos: Contienen entre 1,5 a 2% de agar-agar. La mezcla solidificada posee una

superficie que resiste el fino desplazamiento de las asas bacteriológicas sin que estas se
rompan.
Semisólidos: Contienen 0,5% aproximadamente de agar-agar, por tanto, es un estado

intermedio entre el líquido y el sólido. Ideal en medios que sirven para ver motilidad.
También son recomendables para la conservación de cepas, pues estos mantienen por
mucho más tiempo la humedad.
Bifásicos: Son medios que se preparan de tal manera que existe una fase sólida y sobre
este un medio líquido. Muy utilizado para los hemocultivos.
Según su Composición
Medios de cultivo naturales: Son sustancias tomadas directamente de la naturaleza para

cultivar bacterias, brindándoles un ambiente lo más parecido a cómo se desarrollan en el
ecosistema normalmente. Ejemplo, leche, jugos, sangre diluida, suero, etc.
Medios de cultivo sintéticos: Son los más utilizados hoy en día, son los medios
deshidratados que adquirimos en las casas comerciales y a los cuales se les conoce toda
su composición química, puesto que han sido diseñados estratégicamente de acuerdo
con el tipo de microorganismo que se busca aislar.
99
Medios de cultivo semisintéticos: Es la combinación de un medio sintético al cual se le
añade un elemento natural para enriquecer el medio.
Medios de cultivo celulares: Son medios especiales para el cultivo de virus, como estos
microorganismos son incapaces de sobrevivir fuera de las células, estos deben contener
tejido o células vivas, provenientes de un animal o una planta. Ejemplo: los cultivos
celulares de riñón de mono o los huevos embrionados.
Según su Utilidad
Medios de cultivo nutritivos, selectivos, diferenciales, de transporte, de enriquecimiento,
identificación, mantenimiento y de pruebas de susceptibilidad.
Medios de cultivo simples nutritivos: Como su nombre lo indica, estos medios de cultivo
contienen sustancias nutritivas, como fuentes de vitaminas, aminoácidos, nitrógeno y
carbono, entre ellos se pueden mencionar: extracto de carne o extracto de levadura,
almidón de maíz, digerido pancreático, peptonas, glucosa, entre otros. La finalidad de estos
medios de cultivo es recuperar la microbiota bacteriana o fúngica que exista en una muestra
determinada. No discrimina entre microorganismos, pues en él es capaz de crecer una
gran cantidad de bacterias, tanto Gram positivas como Gram negativas, así como también
hongos levaduriformes y miceliales.
Medios de cultivo enriquecidos: Si se les agrega sangre o sangre calentada a los medios
simples nutritivo, se convierten en medios enriquecidos (agar sangre y agar chocolate
respectivamente). Estos medios son muy útiles para sembrar muestras que normalmente
son estériles, para rescatar cepas que se encuentran débiles y para aislar microorganismos
exigentes desde el punto de vista nutricional.
Medios de cultivo selectivos: Los medios de cultivo selectivos además de contener

nutrientes esenciales para el crecimiento de ciertos microorganismos de interés, también
se le adicionan sustancias inhibidoras, tales como antibióticos, antifúngicos, colorantes,
sales biliares, entre otros. Las sustancias inhibidoras tienen la finalidad de reducir la
variedad de cepas que puedan crecer, favoreciéndose el crecimiento de un grupo
particularmente especial que se quiere rescatar.
Medios de cultivo diferenciales: Los medios diferenciales contienen elementos

nutricionales necesarios para el crecimiento de un grupo específico de microorganismos y
además contiene sustancias que en presencia de ciertos microorganismos serán
metabolizados o degradados. Es decir, producirán reacciones químicas que de una u otra
manera será evidenciada en el medio de cultivo.
100
Medios de cultivo de transporte: Como su nombre indica, son medios utilizados para
transportar muestras que han sido tomada en un lugar más o menos lejano al laboratorio
que procesará la muestra. Por lo general son medios semisólidos, lo que permite que la
muestra se mantenga hidratada. Sin embargo, no debe escatimarse en hacer llegar la
muestra lo más pronto posible al laboratorio. Ejemplos de medios de transporte: medio
Stuart, Cary Blair y Amies.
Medios cultivo de enriquecimiento: Estos medios de cultivo son líquidos. Se utilizan para
rescatar patógenos específicos que en un momento dado puedan estar presentes enuna
muestra en mínima cantidad, también es útil para rescatar una cepa patógena que pueda
estar débil por algún tratamiento previo recibido. Ejemplo: agua peptonada, caldo
tioglicolato y caldo selenito.
Medios de cultivo con fines de identificación: Estos medios poseen sustancias que
pueden ser metabolizadas químicamente por ciertas bacterias, produciendo reacciones
químicas que evidencian la presencia de enzimas o vías metabólicas específicas. Por tanto,
son usadas como pruebas bioquímicas que ayudan al reconocimiento del género y de la
especie de un grupo de cepas en particular.
Medios de cultivo para mantenimiento: Estos medios tienen como finalidad reproducir
al microorganismo y además mantener en un mayor tiempo posible la viabilidad de la
bacteria u hongo y además que se preserven sus funciones fisiológicas.
Medios de cultivo para pruebas de susceptibilidad: El medio estandarizado para tal fin
es el agar Müeller Hinton, este medio es ideal para evaluar el comportamiento de los
diferentes antibióticos frente a un microorganismo patógeno aislado.
Control de calidad en los medios de cultivo

Para el estudio de los microorganismos se requiere contar con medios de cultivo estériles,
el éxito en el desarrollo de procesos de siembra aislamiento e identificación de los
microorganismos está ligado al aseguramiento de la calidad de los procedimientos de
asepsia y desinfección adecuados.
La limpieza, desinfección y esterilización son tareas fundamentales para reducir los riesgos
en entornos donde se presenta una alta carga microbiana, principalmente aquellos
asociados con la contaminación. Por tanto, como parte de los programas de limpieza y
seguridad en la industria farmacéutica, alimenticia, bioquímica y en entornos de servicios
sanitarios, se deben implementar procesos que garanticen que tal limpieza, desinfección y
esterilización se realicen de manera correcta, según las características específicas del tipo
de trabajo realizado en cada entorno. Para comenzar se debe realizar
101
un lavado de instrumental y material para laboratorio. Una vez hecho esto, se puede
proceder a su desinfección, y en caso de ser requerido, a su esterilización. Todas estas
tareas deben estar a cargo de personal capacitado para llevarlas a cabo de manera
satisfactoria.
Para que un producto o material sea clasificado como estéril, se debe garantizar que
todas las etapas del proceso fueron realizadas de forma correcta y que el proceso de
esterilización es validado. Para el monitoreo del proceso de esterilización se utilizan
indicadores: los indicadores de esterilización son equipos o reactivos que tienen como
objetivo certificar o validar que el proceso se efectuó de forma adecuada.
Existen diferentes tipos de métodos de esterilización dependiendo del tipo de agente, lo

cuales pueden ser físicos, mecánicos o físicos:
Agentes físicos: El calor se puede aplicar como agente esterilizante de dos formas: el
calor húmedo el cual destruye a los microorganismos por desnaturalización de las proteínas
y el calor seco que destruye a los microorganismos por oxidación de sus componentes
celulares. El calor es considerado como el método de esterilización por excelencia siempre
y cuando el material a esterilizar soporte altas temperaturas sin sufrir ningún tipo de daño.
La radiación, o emisión y propagación de la energía a través de un medio, puede ser
utilizada como agente para la eliminación de microorganismos. Así tenemos que las
radiaciones ionizantes se pueden utilizar para la esterilización de materiales termolábiles,
como por ejemplo materiales plásticos, y las radiaciones no ionizantes, como la luz
ultravioleta, puede ser empleada en el control de áreas cerradas.
Agentes mecánicos: La filtración permite la remoción de todos los microorganismos

presentes en un líquido o un gas reteniéndolos sobre la superficie de un material.
Agentes químicos: Algunas sustancias químicas pueden ser usadas como agentes
esterilizantes porque tienen la capacidad de promover una o más reacciones químicas
capaces de dañar los componentes celulares de los microorganismos (proteínas,
membranas, etc.). La limpieza del material es la primera parte de los procesos de
desinfección y esterilización. Normalmente se creería que la limpieza con agua y jabón o
alguna otra sustancia detergente no causa gran impacto sobre el alto contenido de
microorganismos en el material, sin embargo, es muy importante que se realice
correctamente puesto que al hacerlo se elimina la suciedad contenida en las superficies del
material que generan una barrera que impide la acción de los agentes desinfectantesy
esterilizantes.
Uso de autoclave
102
Una autoclave de laboratorio es un dispositivo que sirve para esterilizar material de
laboratorio, utilizando vapor de agua a alta presión y temperatura, evitando con las altas
presiones que el agua llegue a ebullir a pesar de su alta temperatura. El fundamento del
autoclave es que coagula las proteínas de los microorganismos debido a la presión y
temperatura, aunque recientemente se ha llegado a saber de algunas formas acelulares,
tal como los priones, que pueden soportar las temperaturas de autoclave.
Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generación de vapor de agua pero

restringiendo su salida, hasta obtener una presión interna de 103 kPa, lo cual provoca que
el vapor alcance una temperatura de 121 grados centígrados. Un tiempo típico de
esterilización a esta temperatura y presión es de 15-20 minutos. Los autoclaves más
modernos permiten realizar procesos a mayores temperaturas y presiones, con ciclos
estándares a 134 °C a 200 kPa durante 5 min para esterilizar material metálico; llegando
incluso a realizar ciclos de vacío para acelerar el secado del material esterilizado.
Control de calidad de la esterilización mediante indicadores físicos,

mecánicos, químicos o biológicos
Indicadores físicos: Entre los principales indicadores físicos se encuentran los medidores
de presión y los termómetros los cuales permiten constatar las condiciones físicas dentro
de la cámara de esterilización. También existen los termógrafos los cuales, además de
registrar la temperatura alcanzada en el proceso, permiten conocer durante cuánto tiempo
ésta se mantuvo.
Indicadores químicos: Son dispositivos que contienen sustancias químicas que cambian
de color o estado cuando se exponen a una o más variables críticas del proceso de
esterilización como temperatura-humedad o temperatura-concentración del agente
esterilizante. Un gran ejemplo son las cintas termo sensibles. No garantizan la calidad del
proceso por si solas debido a:
• Cambian de color aun cuando no ha terminado el proceso de esterilización
• Su sola lectura no es suficientemente clara.
• Si el indicador no vira se interpreta como falla de proceso y el paquete no debe de
ser utilizado.
Indicadores biológicos: Los Indicadores biológicos son dispositivos preparados de

esporas de microorganismos no patógenas y altamente resistentes a los procesos de
esterilización y por lo tanto son útiles y eficaces para establecer la capacidad del ciclo de
esterilización para destruir microorganismos específicos, que se sabe son más resistentes
al proceso que se está probando. Los más utilizados son Bacillus subtilis y Geobacillus
stearothermophilus.
103
Geobacillus stearothermophilus es una bacteria termófila, aeróbica, formadora de esporas
con esporas elipsoidales que dilatan el esporangium. Es una especie heterogénea en la
que las características distintivas son una temperatura máxima de crecimiento de 65-75
°C, una temperatura mínima de crecimiento de 40°C y una tolerancia limitada al ácido. La
bacteria no crece a 37°C; su crecimiento óptimo es a 55°C con una tasa de crecimiento
rápida. Las esporas de G. stearothermophilus se utilizan como indicadores para verificar la
exposición de un producto a un proceso de esterilización.
Bacillus subtilis es una bacteria Gram positiva, Catalasa-positiva, aerobio facultativo

comúnmente encontrada en el suelo. Miembro del Género Bacillus, B. subtilis tiene la
habilidad para formar una resistente endospora protectora, permitiendo al organismotolerar
condiciones ambientalmente extremas.
Procedimientos para preparación de medios de cultivo, control de

calidad de esterilización y valoración de la calidad de los mismos
Preparación de medios de cultivo
Se deben leer las instrucciones dadas por la casa comercial, disponible en la etiqueta
adherida al recipiente que contiene el medio de cultivo que se piensa preparar. Ensegundo
lugar, se deben realizar los cálculos correspondientes, para pesar los gramos que se
requieren de acuerdo con el volumen requerido, teniendo presente la proporción para 1 litro
que está por lo general en las etiquetas.
Para hacer el cálculo de la cantidad de medios que se requieren preparar, es importante

determinar el recipiente en que se va a envasar. Generalmente la cantidad de medio
necesaria para tubos de 13x100 es de 5ml, para tubos de 16x150 es de 12ml y para cajas
de petri 20ml aproximadamente.
Posterior a la realización de los cálculos de volumen y gramos de medio deshidratado

(mediante reglas de tres simple), se debe colocar el peso calculado de gramos de dicho
medio en un balón de vidrio y lentamente mezclarlo con el volumen final de preparación, se
utiliza como diluyente agua destilada. Inmediatamente después de tener una mezcla
homogénea, se pasa a calentar mediante estufa o mechero hasta obtener una solución
uniforme, teniendo la precaución de que durante el calentamiento no haya adherencia del
preparado en el fondo del balón, por ende, se debe calentar bajo constante agitación.
Finalmente se procede a tapar el recipiente, marcar con el nombre del medio, llevar a la
autoclave 121 ° C durante 15 min a 15 libras de presión según las instrucciones de la
casa comercial escogida, posteriormente servirlo en las cajas a una temperatura de 45-
50°C.
104
Control de calidad de la esterilización de medios de cultivo
Uno de los controles químicos más utilizadas es la cinta indicadora termosensible, para
hacer uso de ella se deben cortar porciones de aproximadamente 3-5 cm de longitud de la
misma, seguidamente se deben adherir a los recipientes que contienen los medios de
cultivo preparados. Luego del proceso, se deben anotar los cambios observados en la
superficie de la cinta.
Otro control empleado para los procesos de esterilización es el biológico, mediante esporas
de Geobacillus stearothermophilus, se debe colocar dentro de la autoclave una ampolla
comercial que contenga esporas de esta bacteria (colocar de forma horizontal o con el tapón
hacia arriba), igualmente envuelta como los otros materiales destinados a esterilizar.
Concluido el tiempo de esterilización, se debe retirar el indicador biológico y dejarlo enfriar
por un tiempo de al menos 5 minutos, luego se debe revisar el indicador químico de la
etiqueta de la ampolla, un cambio de color de rosa a marrón confirma que el indicador
biológico ha sido expuesto al proceso de esterilización por vapor, este cambiode color no
implica que el proceso fuera suficiente para conseguir la esterilidad.
Como paso final de este proceso se debe romper e incubar el indicador biológico a 56+/-
2 °C por 48 horas. Luego de este tiempo, la aparición de un color amarillo en el indicador
procesado, demuestra crecimiento bacteriano y por tanto un fallo en el proceso de
esterilización, si no hay cambio de color, el proceso de esterilización fue adecuado.
Finalmente se debe realizar un control por lote de medio preparado, en el cual se debe
tomar aproximadamente el 1% del total de los medios preparados, se deben llevar a
incubación a 37°C por 24h. Luego de este tiempo se debe comprobar si hay o no
crecimiento de microorganismos de acuerdo al tipo de medio (caldo o agar), los medios
de cultivo esterilizados, no deben mostrar crecimiento de microorganismos en lo absoluto.
Valoración de la calidad de los medios de cultivo (productividad y selectividad)

La productividad es la capacidad que tiene un medio de cultivo para favorecer o sustentar
el desarrollo de un microorganismo y la selectividad es la propiedad de un medio de
cultivo de suprimir el crecimiento de un microorganismo interferente o indeseado.
Evaluación mediante pruebas semicuantitativas de productividad y selectividad
Medios de cultivo solidos selectivos (Método ecométrico)

El análisis ecométrico establece la eficiencia con la cual un medio de cultivo sirve para
recuperar una cepa, mediante la comparación que se realiza entre el medio a evaluar y un
medio control. Esta técnica evalúa tanto la sensibilidad de los medios a la colonización por
105
los microorganismos buscados (productividad) como también la resistencia a la
colonización por las cepas que interfieren (selectividad). Un parámetro útil para interpretar
los resultados ecométricos es el índice de crecimiento absoluto (ICA).
Inicialmente se deben dejar las cajas con los medios preparados a 55ºC por algunos
minutos, seguidamente se deben dividir las cajas de un espesor de 4 mm secas, en
cuatro cuadrantes y marcar de manera distintiva.
El siguiente paso es emplear los cultivos de cepas deseadas (target) y no deseadas o

interferentes (no target) en fase estacionaria. Una vez marcadas las cajas, se deben
tomar muestras de las cepas, utilizando técnicas bacteriológicas básicas, con un asa
calibrada de 10 microlitros y trazar sobre la superficie del medio 5 estrías paralelas en cada
cuadrante y una estría central. Se deben Incubar las placas en posición invertida
dependiendo de los tiempos y temperaturas necesarias para las respectivas cepas
seleccionadas para evaluar los medios.
Finalmente se debe asignar un valor de 0,2 a cada estría y de 1 a la estría central; multiplicar
por el número de estrías en las cuales se observa crecimiento y determinar el Índice de
Crecimiento Absoluto; si hay crecimiento en las cinco (5) de los cuatro cuadrantes y en la
central, el ICA es igual a 5. Se considera que un medio de cultivo selectivo es productivo,
si el ICA de las cepas target es mayor o igual a 3,0. Respecto a la selectividad, solo se
deben utilizar medios en los cuales las cepas no target en medios selectivos tengan un ICA
menor o igual a 2.0. y el ICA de las cepas deseadas no debe serinferior a 3,0
Medios de cultivo líquidos selectivos

Para la productividad se deben seleccionar tubos con 10 ml de caldo a valorar se deben
inocular cultivos deseados en fase estacionaria en cantidades de 10 UFC (unidades
formadoras de colonias) a 100 UFC y cultivos de microorganismos no deseados en
cantidades mayores a 1000 UFC. Se debe incubar a temperatura y tiempo requeridos por
los medios y por la cepa deseada. Concluido el tiempo de incubación, se debe remover
10 microlitros del medio de cultivo mixto, seguidamente sembrar en caja de agar del
medio selectivo específico para microorganismos deseados, incubar a temperatura ytiempo
requeridos para el medio de cultivo y la cepa deseada, finalizado el tiempo de incubación,
se precisa observar las cajas en las cuales haya crecimiento de la cepa deseada. La
productividad del caldo evaluado es satisfactoria si al menos 10 UFC del microorganismo
target hayan crecido sobre la caja de agar selectivo.
Para la selectividad se deben seleccionar tubos con 10 ml de caldo a valorar, inocular con
cepas de microorganismos no deseados en fase estacionaria en cantidades superiores a
1000 UFC, se debe mezclar, luego incubar a temperatura y tiempo requerido por los
106
medios de cultivo a evaluar. Finalizado el tiempo de incubación se deben remover 10
microlitros y realizar una posterior siembra en agar no selectivo, luego incubar a
temperatura y tiempo requerido por el medio de cultivo. Terminada la incubación, se debe
observar la inhibición de crecimiento en las cajas. La selectividad del caldo evaluado es
satisfactoria, si no hay crecimiento de las cepas no target en el agar no selectivo.
107
Referencias
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108
Capítulo 9. Control de microorganismos
Un antimicrobiano o antibiótico es una sustancia producida en el metabolismo de

organismos vivos, principalmente hongos y bacterias, que posee la capacidad de actuar
sobre otros microorganismos (virus, bacterias, hongos y parásitos) inhibiendo su
crecimiento o destruyéndolos.
Según su origen, los antimicrobianos pueden ser:

• Naturales: Sintetizados por organismos vivos, ej. Penicilina, Cloranfenicol.
• Semisintéticos: Obtenidos por modificación química de antibióticos naturales, ej.

Ampicilina.
• Sintéticos: Generados mediante síntesis química en condiciones de laboratorio, ej.

Sulfamidas.
La determinación de la sensibilidad a los agentes antimicrobianos es una de las principales

funciones de un laboratorio de enfermedades infecciosas. Esta función se vuelve de
especial relevancia en una época como la actual, en la que las resistencias alos agentes
antimicrobianos son elevadas y existe una gran discusión sobre la utilización de antibióticos
en los animales. Por ello, es fundamental que el laboratorio pueda aportar la información
necesaria para llevar a término un tratamiento adecuado.
El principal objetivo de cualquier prueba de sensibilidad antimicrobiana es predecir cuál

será el resultado de un tratamiento. En muchas ocasiones los resultados se expresan, para
un patógeno aislado y analizado, de forma cualitativa: como “sensible” (en cuyo casose
supone que un tratamiento “estándar” con aquel compuesto producirá la curación),
“resistente” (el antimicrobiano examinado no será eficaz en aquella patología) o
“intermedio” (la efectividad de aquel compuesto dependerá de su localización o de la
dosificación utilizada).
Un segundo objetivo de las pruebas de sensibilidad antimicrobiana es la de obtener series

históricas que permiten predecir el comportamiento de un tratamiento cuando éste se hace
de forma empírica.
Cuando se indica un tratamiento antibiótico es importante una evaluación que incluya el

tipo de infección, los condicionantes de gravedad, la identificación y características del
109
agente causal y los factores del hospedador y del antibiótico que se pretende utilizar. La
complejidad del tratamiento contempla todas las relaciones que pueden existir entre el
germen, el antibiótico y el paciente. Para que un antimicrobiano sea eficaz debe alcanzar
concentraciones suficientes en el lugar de infección lo que condiciona su elección, la dosis
y la vía de administración.
El antibiograma es la prueba microbiológica que se realiza para determinar la

susceptibilidad de una colonia bacteriana a un antibiótico o grupo de antibióticos. El
antibiograma permite definir para cada antibiótico, si la bacteria es sensible (antibiótico
eficaz), medianamente sensible (antibiótico eficaz en ciertas condiciones) o resistente
(antibiótico ineficaz). La importancia de realizar un antibiograma radica en que todos los
antibióticos no son eficaces contra todas las bacterias y el antibiograma ayuda al médico
en la elección del antibiótico que hay que prescribir, por ende permite determinar el
antibiótico más eficaz en caso de una infección bacteriana.
La información que proporciona el antibiograma tiene una gran repercusión clínica y

epidemiológica puesto que, por una parte, condiciona y guía la elección del tratamiento
antimicrobiano ante un proceso de naturaleza infecciosa, y por otra puede utilizarse como
estrategia para evitar el uso de determinados antimicrobianos de espectro excesivamente
amplio en determinados casos o favorecer el uso de otros con un adecuado perfil de
actividad e impacto ecológico. Por tanto, es una herramienta de gran importancia en la
utilización de antibióticos, es de resaltar que los métodos de detección de la susceptibilidad
de un microorganismo se realizan siempre después de que este, ha sido plenamente
identificado en género y especie.
Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos

Existen diferentes métodos:
Difusión: Las técnicas de difusión emplean discos de papel impregnados con una solución
estandarizada de antibiótico que se disponen sobre la superficie de un medio sólido
previamente inoculado en su superficie con una suspensión bacteriana. Tras un período de
incubación de 18 a 24 h, el diámetro del halo formado está en relación con el grado de
sensibilidad del microorganismo. Otra técnica de difusión es el E-test, el cual utiliza tiras de
plástico impregnadas con un antibiótico en concentraciones decrecientes.Al contacto de
la tira con el agar, el antibiótico se difunde e impide el crecimiento del microorganismo.
Después de la incubación se observa una zona de inhibición en forma deelipse.
110
a) b)
Figura 9.1 Antibiograma por difusión en agar: (a) Antibiograma por difusión con discos en el que
se observa la presencia de halos de inhibición. (b) Antibiograma por E-test en el que se observa
una elipse de inhibición. Fuente: Anales de Pediatría Continuada. 2009;7(4):214-7
Dilución: Las técnicas de dilución determinan la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)

utilizando un medio líquido (dilución en caldo) o un medio sólido (dilución en agar) para
disolver las diferentes concentraciones del antimicrobiano. La CMI es la dilución más baja
de antimicrobiano en la que no se observa crecimiento bacteriano. La dilución en caldo
suele realizarse en micro método (microdilución), en paneles multipocillos, y es el sistema
mayoritariamente adoptado por los sistemas automáticos comerciales para determinar la
sensibilidad a los antimicrobianos. En estos sistemas, la lectura de los valores de CMI y la
interpretación de resultados se realizan de forma automática.
Sin crecimiento CMI = 4 ug/mL
64 32 16 8 4 2 1 0,5
Figura 9.2 CMI (Concentración mínima inhibitoria) 4 ug/mL es la mínima cantidad de un antibiótico
que es capaz de impedir el crecimiento de un microorganismo.
111
Detección enzimática: en ocasiones se detectan enzimas que son las que confieren
resistencia. Las bacterias expresan enzimas capaces de crear cambios en la estructura
del antibiótico haciendo que este pierda su funcionalidad.
Prueba de sensibilidad por difusión en agar con discos (método Kirby

Bauer)
Este método parte del principio en el que el antibiótico contenido en un disco se va a difundir
por el medio de cultivo en el cual se deposite, produciendo un gradiente de concentración,
según se aleje del disco, la concentración va descendiendo. La distancia en la que se inhibe
el crecimiento del microorganismo inoculado en el medio se denomina halo de inhibición, se
mide en milímetros.
La metodología que se sigue es la que se describe a continuación:
Se deben tomar de 4 a 5 colonias del microorganismo de interés; y se hacen crecer en

caldo (BHI) durante 2 o 4 horas, ajustando posteriormente el inoculo al 0,5 de la escala de
McFarland preparado con 0.5 ml. de BaCl2 al 1% y 99.5 de una solución de H2SO4. Se
ajusta la turbidez obtenida agregando solución salina hasta que se obtenga una semejante
a la del patrón. La escala nefelométrica de McFarland es el patrón de turbidez más utilizado
en el laboratorio de microbiología, para determinar la intensidad de lamultiplicación en los
medios de cultivo líquidos.
Esta multiplicación se manifiesta en el medio líquido por un aumento de las partículas

(bacterias) que se oponen al libre paso de la luz, causando nubosidad u opacidad en el
medio. Cuanto mayor sea el número de las bacterias, mayor será la opacidad del medio de
cultivo. Esta suspensión se debe inocular, en un tiempo inferior a 15 – 20 minutos mediante
un hisopo escurrido por toda la placa con agar Müeller-Hinton.
El agar Mueller-Hinton es un medio nutritivo sólido, no selectivo, que está compuesto por
infusión de carne, peptona ácida de caseína, almidón, agar y agua destilada. Este medio
permite un excelente desarrollo microbiano de la mayoría de las bacterias de crecimiento
rápido. Debido a sus características resulta ser ideal para el estudio de la susceptibilidad
a los antibióticos, proporcionando resultados confiables y reproducibles. Por ello, el agar
Mueller-Hinton es el medio de cultivo aceptado por Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI) y European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, para la
ejecución de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana por el método de difusión en disco
de Kirby Bauer.
Seguidamente se deben agregar los discos antes que transcurran 15 minutos (utilizando
pinzas estériles o un dispensador de discos), estos discos llevan una determinada
112
concentración de cada antibiótico y deben estar separados uno de otro, al menos 15 mm
de distancia. Finalmente, la lectura se realiza tras la incubación en aerobiosis de 18-24
horas. Inmediatamente se miden los halos de inhibición en milímetros. Se debe tener en
cuenta que los medios de cultivo no estén en mal estado, que tengan buen ajuste de pH,
volumen adecuado de la placa, buena conservación de los discos y que no haya demora
en la inoculación.
La interpretación de los resultados del antibiograma (sensible, intermedio o resistente) se

realiza en función de los valores establecidos por diferentes entidades como el Clinical and
Laboratory Standards Institute en Estados Unidos, el European Committee on Antimicrobial
Susceptibility Testing en Europa y la Mesa Española de Normalización de la Sensibilidad y
Resistencia a los Antimicrobianos. Estos comités determinan y establecen puntos de corte
basados en propiedades microbiológicas, farmacocinéticas y de eficacia clínica, para definir
la sensibilidad (éxito terapéutico) o resistencia de las diferentes especies bacterianas a
cada antimicrobiano.
Limpieza y desinfección
La limpieza se define como el proceso de remover, a través de medios mecánicos y/o
físicos, el polvo, la grasa y otros contaminantes de las superficies, equipos, materiales,
personal, etc. Este proceso, junto con un adecuado proceso de desinfección, es
indispensable para controlar la presencia de los microorganismos en el ambiente. Para
realizar una limpieza adecuada se deben considerar el tipo de acción del agente utilizado,
las condiciones requeridas para aplicar la solución limpiadora y el tiempo de contacto
necesario para que ésta ejerza su efecto.
Características de un desinfectante ideal

• Actividad antimicrobiana. Debe ser capaz de matar a los microorganismos. A
baja concentración debe tener un amplio espectro de actividad antimicrobiana.
• Solubilidad. Debe ser soluble en agua u otros solventes, en la proporción

necesaria, para su uso efectivo.
• Estabilidad. Durante el almacenamiento los cambios en sus propiedades deben

ser mínimos y no deben causar una pérdida significativa de su acción germicida.
• No debe ser tóxico para el hombre ni los animales.
• Homogeneidad. La preparación debe ser uniforme en composición, de manera

que los ingredientes activos estén presentes en cada aplicación.
• No se debe combinar con materiales orgánicos extraños.
113
• Debe ser tóxico para los microorganismos a la temperatura ambiente, para que
al usar el agente no sea necesario elevar la temperatura más allá de la que se
encuentra normalmente en el lugar donde se va a utilizar.
• Capacidad para penetrar, esto no es necesario si se requiere sólo una acción

superficial.
• No debe ser corrosivo, ni teñir el material que se trate.
• Capacidad desodorante. Desodorizar mientras desinfecta es una propiedad

deseable. Idealmente el desinfectante debe ser inodoro o tener un olor agradable.
• Capacidad detergente.
• Disponibilidad. Debe estar disponible en grandes cantidades a un precio razonable.
• Actuar en un tiempo relativamente corto.

Entre los principales grupos hay los compuestos fenólicos, los alcoholes, los halógenos
como el yodo, cloro y los compuestos clorado ,metales pesados y compuestos cuaternarios
de amonio.
Métodos de esterilización
Agentes físicos
• Calor húmedo: El calor en forma de vapor saturado a presión proporciona
temperaturas mayores que la de ebullición. La esterilización en autoclave emplea
vapor saturado a 15 lbs de presión cuya temperatura es de 121ºC, por 15 minutos
contados a partir del momento en que el material alcance los 121ºC. El calor húmedo
es un método de esterilización el cual usa la coagulación de proteínas, lo que es
causado por la rotura de los puentes de hidrógeno que son los que mantienen a las
proteínas en su forma tridimensional, las proteínas por lo tanto regresan a su
estructura secundaria, se coagulan y se convierten en proteínas no funcionales.
• Calor seco: Funciona deshidratando las células y destruye los microorganismos por
oxidación de sus constituyentes. La esterilización se realiza en hornos, usualmente
a 160-170ºC por un período de 2 a 4 horas.
114
• Incineración: la incineración es un proceso de eliminación de desechos que cobra
importancia cuando no hay interés en que queden restos o partículas del material
destinado para este método, es una técnica de valorización energética en la que,
mediante una combustión controlada, se transforma la fracción orgánica de los
residuos en materiales inertes y gases (cenizas, CO2 y agua) se utiliza para la
destrucción de animales de laboratorio y otros materiales infectados a ser
desechados, por lo general los residuos clasificado como de riesgo biológico, así
como reducir el peso y el volumen de lo deseado respecto a las medidas originales.
• Radiación ultravioleta: El fundamento de la luz UV radica en que los ácidos

nucleicos y las proteínas absorben la radiación ultravioleta, esa absorción causa
modificaciones químicas, entre ellas, la formación de dímeros de timina los cuales
ocasionan lecturas erróneas del código genético, produciendo mutaciones que
impiden funciones vitales de los microorganismos, por lo tanto, éstos mueren.
Agentes químicos
La mayoría de los agentes de este tipo suelen tener propiedades alquilantes. Un agente
alquilante es cualquier sustancia química que añadirá un grupo alquilo a otra molécula
dentro reacción química conocida como alquilación. Es simplemente la adición de una
cadena de alquilo a otra molécula, en este caso con el fin de desestabilizar la estructura
celular desde la composición de los grupos químicos de proteínas y ácidos nucleicos de
bacterias, hongos y virus, la diferencia de uno y otro radica en lo especificidad de las
moléculas a las cuales se unen.
Gaseosos
• Óxido de etileno: Mata a las células porque actúa como un agente alquilante.
Destruye rápidamente células vegetativas y espora. Se usa en esterilización de
materiales termosensibles, instrumentos y equipos de gran tamaño.
• Formaldehido: Agente alquilante, se combina con grupos NH2, COOH y SH en los

ácidos nucleicos y proteínas, Su uso clínico es generalmente comodesinfectante y
esterilizante. Es bactericida, esporicida y virucida.
No gaseosos
• Glutaraldehido: Cuando se usa al 2% en soluciones alcalinas, actúa como agente
esterilizante por sus propiedades alquilantes, posee una alta actividad
antimicrobiana, bactericida y esporicida además es fungicida, virucida y activo
contra micobacterias.
Valoración de desinfectantes
Valoración de hipoclorito de sodio
115
Deben prepararse diluciones a partir de hipoclorito de sodio comercial, La dilución es un
procedimiento mediante el cual se disminuye la concentración de una solución,
generalmente, con la adición de un diluyente. Para preparar una dilución se toma un
determinado volumen de la solución concentrada, y se lleva a un recipiente, añadiéndose
diluyente hasta al alcanzar el volumen calculado para la solución diluida.
Las concentraciones pueden variar dependiendo de las intenciones de uso, pero

generalmente se puede encontrar al 5%. El volumen final deseado (Vd) debe escogerse
dependiendo del volumen de trabajo, además de que las concentraciones finales pueden
expresarse en muchísimas unidades de medida, las más comunes en microbiología son el
porcentaje (%) y las partes por millón (ppm). Debe tenerse en cuenta que una dilución de
hipoclorito de sodio al 5% equivaldrá a 50000 ppm.
Preparación de hipoclorito de sodio en concentraciones utilizadas en la desinfección

de áreas y limpieza de material orgánico.
Para la preparación de las diluciones de hipoclorito de sodio, aplique la siguiente formula:
V = Cd x Vd
Cc
Dónde:
Vd: volumen deseado
Cd: concentración deseada
Cc: concentración conocida
Ej: Si se desea preparar 1L (1000ml) de solución de hipoclorito de sodio al 0,5% o 5.000ppm

a partir de hipoclorito de sodio comercial al 5% o 50.000 ppm. Se procedecomo sigue:
V= 0,5% x 1.000 ml= 100 ml
5%
Tomar una probeta graduada y medir 100 ml de hipoclorito de sodio comercial al 5%, luego
agregar este volumen a un frasco tapa rosca que contiene 900 ml de agua para obtener un
volumen final de 1L - 1.000 ml, de una dilución 0,5%, rotular y disponer parasu uso.
Evaluación con inoculo bacteriano

Se deben tomar 5 tubos tapa rosca estériles por cada dilución de desinfectante y se
dispensa en cada uno de ellos 9 ml de la dilución respectiva. A partir de cultivos bacterianos
en fase estacionaria en caldo BHI, se toman alícuotas de 0.1 ml y se dispensan en cada
tubo de las respectivas diluciones del desinfectante, es necesario
116
cronometrar tiempo de exposición a partir del momento exacto de adición del cultivo al
desinfectante, para lo cual en cada dilución se deben medir: 1, 5, 10, 15 y 20 minutos de
exposición. Transcurridos los tiempos, con un asa bacteriológica se realizan siembras por
estrías en cajas de agar nutritivo a partir de cada uno de los tubos inoculados en las
respectivas diluciones del desinfectante, se lleva a incubación por 24 horas a 37°C; Como
criterio de evaluación se considera que el desinfectante es eficiente, si no hay crecimiento
en el agar nutritivo, a partir de la mayor dilución con máximo tiempo de exposición.
117
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118
Capítulo 10. Bioseguridad en el
laboratorio de microbiología
La bioseguridad es el conjunto de normas y procedimientos que garantizan el control de los

factores de riesgos químicos, físicos, orgánicos, psicológicos, ambientales, biológicos,
ergonómicos y de seguridad. Estos, atentan contra las personas que trabajan en el
laboratorio, los pacientes, visitantes y el ambiente. La bioseguridad se fundamenta
esencialmente en la prevención de condiciones peligrosas para las personas o de daños a
las instalaciones del laboratorio que pueden causar accidentes y, además, en reducir a un
nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulación de material peligroso.
Para prevenir los riesgos en el laboratorio, es necesario desarrollar un programa de

bioseguridad que debe considerar aspectos fundamentales como la identificación detodos
los riesgos de acuerdo a cada actividad desarrollada en el área, la elaboración de guías
prácticas de trabajo y el diseño e implementación de un programa de capacitación.
Los riesgos se clasifican según su origen en físicos, químicos, biológicos y los dependientes
de factores humanos. Cuando se presenta uno o varios de ellos, pueden ocurrir accidentes
de diversa trascendencia. El riesgo físico está relacionado con los agentes físicos a los
que están expuestos los trabajadores, como son, el calor, lasradiaciones, la electricidad,
los objetos en movimiento o que interfieren con este, los traumatismos y las condiciones del
ambiente de trabajo. El riesgo químico está dado por la exposición a sustancias químicas,
por lo que se hace necesario que el personalexpuesto conozca los riesgos asociados a la
manipulación de los químicos, sus efectos tóxicos y las rutas de exposición. Es necesario
que las fichas de seguridad de estos productos - Medical Security Data Sheets, MSDS por
sus siglas en inglés, sean conocidas por las personas pues ellas describen los riesgos
asociados a su uso. El riesgo dependiente de factores humanos es el riesgo psicosocial,
que incluye el estado físico ypsicológico del trabajador, así como su capacidad intelectual,
aptitud, habilidad para el trabajo y entrenamiento laboral. El riesgo biológico es el derivado
de la exposición o manipulación de agentes biológicos, que ocasiona la infección del
personal expuesto. Incluye el uso de objetos cortopunzantes contaminados con fluidos
corporales, los derrames o salpicaduras, la inhalación de aerosoles con microrganismos y
la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas.
Durante el trabajo diario en el área de microbiología se dan situaciones que representan un

riesgo potencial, por lo que la observación de unas prácticas seguras por parte de
119
cada uno de los integrantes del equipo de trabajo, determina su propia seguridad, así como
la del resto de personas que están en el laboratorio y los pacientes que utilizan sus
servicios.
Principios de la bioseguridad
Universalidad: Se asume que toda persona es portadora de algún agente infeccioso hasta
no demostrar lo contrario. Las medidas de bioseguridad son universales, es decir deben
ser implementadas en todas las personas a quienes se les tome muestra.
Barreras de protección: Para evitar el contacto directo entre personas o entre personas
y objetos potencialmente contaminados o peligrosos se deben utilizar barreras químicas,
físicas o mecánicas.
Medidas de eliminación de material contaminado: Establece los dispositivos y
procedimientos adecuados para depositar y desechar sin riesgo los materiales utilizados en
la atención de los pacientes y eliminación de muestras biológicas, para proteger a los
individuos y al ambiente.
Autocuidado: Hace referencia a las prácticas y decisiones que asume un trabajador
expuesto, para cuidar de su salud, relacionadas con el cumplimiento de normas de
bioseguridad y uso adecuado de equipos y elementos de protección.
Clasificación de los microorganismos por grupos de riesgo

Un agente biológico es cualquier microorganismo, cultivo celular, animal, planta o producto
de estos, capaz de producir cualquier tipo de infección, alergia o toxicidad en humanos,
animales u otros seres vivos.
Los microorganismos como principal fuente de riesgo biológico han sido clasificados
internacionalmente por la Organización Mundial de la salud (OMS) en cuatro grupos de
riesgo I, II, III, IV, de acuerdo con el nivel relativo de patogenicidad para humanos adultos
y saludables.
GRUPO 01 GRUPO 02
Poco probable de causar enfermedad enser Puede ser un peligro para los trabajadores,
humanos sanos y animales. con poca probabilidad para que sepropague
a la comunidad. Existe profilasis y
Ejemplos: Staphylococcus epidermidis, tratamiento.
Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus
lactis, Sacharomyces cerevisiae, Ejemplos: Bordetella pertussis, Clostridium
Penicillium roqueforti. botullinum, Clostridium tetani,
Corynebacterium diphthriae, Listeria
monocytogenes, Aspergillus spp, Candida
spp, Cryptococcus neoformans, Adenovirus,
120
Ascaris lumbricoides, Criptosporidium spp.
GRUPO 03 GRUPO 04
Puede causar enfermedad grave en el Pueden causar enfermedad grave que pone
hombre y representar un peligro para los en peligro la salud del trabajador, muy
trabajadores, con riesgo de propagación a probable que se propague. No hayprofilaxis
la comunidad. Existe profilasis y ni tratamiento eficaz.
tratamiento. Ejemplos: Virus de la Viruela, Virus de la
fiebre hemorrágica de Crimea (Congo),
Ejemplos: Bacillus anthracis, Brucella, Virus de Marburg, Virus Ébola.
Escherichea coli (verotoxigénica),
Mycobacterium tuberculosis, Blastomyces
dermatitidis, Histoplasma capsulatum,
Paracoccidioides brasiliensis, Virus de la
Hepatitis B, Virus de la Hepatitis C, Virus de
la Hepatitis D, VIH
Fuente: Organización Mundial de la Salud.
Niveles de contención
La base de la bioseguridad es la contención, término utilizado para describir los métodos
que hacen seguro el manejo de materiales infecciosos y cuyo propósito es reducir al mínimo
la exposición del personal del laboratorio, otras personas y el entorno a agentes
potencialmente peligrosos.
Cuatro elementos básicos concurren para que suceda un accidente por agente biológico:
Un huésped susceptible, un agente infeccioso, una concentración suficiente de éste y una
ruta de transmisión apropiada. Este último es el que mejor se puede controlar en el
laboratorio.
Los microorganismos pueden ingresar a través de la boca, piel, ojos y pulmones. Por la
boca, al comer, beber, fumar, transferir reactivos o material biológico con pipetas sin utilizar
ningún tipo de dispositivo mecánico; o por transferencia indirecta a través de los dedos o
utensilios contaminados. Por la piel, por inoculación accidental con una aguja hipodérmica
u otros instrumentos cortopunzantes o de vidrio, cortaduras o rasguños. A través de los
ojos, por salpicaduras de materiales infecciosos; transferencia indirecta de
microorganismos con los dedos contaminados. Por los pulmones, por inhalación de
microorganismos transportados por el aire en forma de aerosoles.
Los niveles de contención se fundamentan en los siguientes elementos de seguridad

biológica: técnica microbiológica, las barreras primarias o equipo de seguridad y las
barreras secundarias o diseño de las instalaciones. La combinación de estos elementos
121
debe enfocarse en el tipo de procedimientos que se realiza, las vías de transmisión de los
agentes infecciosos y la función o actividad del laboratorio.
Técnica microbiológica. El elemento más importante para contener los riesgos biológicos
es el seguimiento estricto de las prácticas y técnicas microbiológicas estándares. En el
laboratorio es necesario el desarrollo de procedimientos estrictos de rutina, que
especifiquen los pasos que se deben adoptar para reducir la exposición del personal a
riesgos biológicos, físicos y químicos.
Barreras primarias o equipo de seguridad. Son la primera línea de defensa cuando se

manipulan materiales biológicos que pueden contener agentes patógenos y van
encaminadas a la protección del trabajador. Incluye el uso de prendas de protección
personal como batas, guantes, mascarilla, calzado cerrado y dispositivos o aparatos como
las cabinas de seguridad biológica, contenedores cerrados para centrifugación, dispositivos
para manipulación de pipetas, homogeneizadores, que garantizan la seguridad. También
se incluye en este tipo de barreras la inmunización con vacunas para generar cierto grado
de resistencia a una enfermedad infecciosa. De acuerdo con el procedimiento a realizar y
el patógeno a manipular se determina el uso de elementos de protección específicos.
Barreras secundarias o diseño de las instalaciones. Las barreras secundarias sirven

para proteger tanto al personal de laboratorio como al que se localiza en otras áreas, así
como también a personas de la comunidad frente a posibles escapes accidentales de
agentes infecciosos. Las barreras secundarias hacen referencia al diseño y características
de las instalaciones, relacionadas con la disposición de mecanismos de descontaminación
de los materiales y del ambiente, tales como autoclaves y flujo de aire dirigido. El diseño de
las instalaciones comprende 3 tipos de infraestructura: laboratorio básico, laboratorio de
contención y laboratorio de contención máxima.
Categorización de los laboratorios según el nivel de bioseguridad

El nivel de seguridad (Biosafety Level, BSL), hace referencia a las condiciones bajo las
cuales los agentes biológicos pueden comúnmente manipularse de forma segura. A nivel
internacional, los laboratorios que manipulan material biológico se clasifican en cuatro
niveles de bioseguridad según las combinaciones de prácticas y técnicas de laboratorio,
equipos de seguridad e instalaciones. Cada combinación es específica para los
procedimientos llevados a cabo, las vías de transmisión documentadas o sospechadas de
los agentes infecciosos, y la función o la actividad del laboratorio. Los niveles 1 y 2
corresponden a laboratorios básicos, mientras que los niveles 3 y 4 son de contención alta
y máxima, respectivamente.
122
Laboratorio BSL1. Es el nivel de seguridad establecido para los agentes biológicos del
grupo I, los cuales tienen poca probabilidad de causar enfermedad en humanos sanos y
animales. Se implementa en los laboratorios de práctica de universidades o instituciones
académicas donde se emplean cepas no patógenas.
Laboratorio BSL2. Es nivel de seguridad estipulado para agentes biológicos del grupo 2,
que son peligrosos y pueden causar enfermedad en los trabajadores y deben ser
manipulados por profesionales del laboratorio o personal especializado.
Laboratorio BSL3. Este nivel es dispuesto para manipular agentes biológicos del grupo
3, los cuales son capaces de causar enfermedad grave y propagarse a la comunidad. El
mayor riesgo que se presenta es la infección adquirida por aerosoles y fluidos biológicos,
por lo cual la principal medida establecida para el control es el uso de cabinas de
seguridad. Además, el material debe ser manipulado por personal calificado en una zona
con infraestructura que mantenga una presión de aire negativa para impedir que los agentes
nocivos escapen al ambiente.
Laboratorio BSL4. Es el nivel especificado para el procesamiento de patógenos

clasificados como grupo 4, capaces de producir enfermedad grave, carecen de profilaxis y
tratamiento eficaz. Proporciona mayor protección al trabajador y deben estar sometidos a
control por autoridades sanitarias.
La bioseguridad como ejercicio práctico

Todo laboratorio de microbiología está obligado a desarrollar y aplicar un manual de
procedimientos que describa los riesgos que se hallarán o puedan producirse, y que
describa los métodos destinados a eliminar la exposición a estos riesgos. Por su lado, el
personal que trabaja en el laboratorio debe conocer los riesgos especiales y está obligado
a cumplir las prácticas y procedimientos establecidos.
Uso de elementos de protección personal.

Uso de guantes de látex. Disminuyen el riesgo de contaminación por las manos, aunque
no reemplazan el lavado adecuado de las manos ni el cumplimiento de las normas de
asepsia y antisepsia. En caso de ruptura, los guantes deben ser retirados de inmediato, y
previo lavado de las manos deben ser cambiados. Para el desarrollo normal de los
procedimientos los guantes deben quedar ajustados a la mano. Si el procedimiento a
realizar tiene alto riesgo de exposición se debe utilizar doble guante. Para el personal de
oficios varios y de manejo de residuos, los guantes deben ser más tipo industrial, por ser
más resistentes. Cualquier tipo de guante no protege frente a cualquier producto químico,
la selección del modelo debe estar acorde con el riesgo al que se está expuesto.
123
Uso de mascarilla buconasal y protectores oculares. Protegen de contaminación
accidental con saliva o cualquier otro tipo de secreción por la mucosa oral, nasal y oftálmica.
De igual forma, la mascarilla impide que gotitas de saliva o secreciones nasales del personal
de salud contaminen al paciente. En el caso de manejar muestras detuberculosis se debe
utilizar mascarilla de alta eficiencia.
Uso del gorro. Evita que el trabajador de la salud se contamine por salpicaduras y además
evita la contaminación del paciente con los cabellos del trabajador.
Gorro Mascarilla Buconasal

Y protectores Oculares
Guantes de
látex
Figura 10.1 Trabajador con los elementos de protección personal más usuales.
Cabinas de seguridad biológica CSB

Proporcionan protección al trabajador, al ambiente y al material de trabajo, usando barreras
o cortinas de aire en flujo laminar producidas por un sistema impulsor, y en el paso del aire
circulante a través de filtros HEPA. Las CSB se clasifican según protejan al trabajador,
producto y medio ambiente, en tres categorías, clase I, clase II y clase III.
124
Figura 10.2 Cabina de Flujo laminar tipo I
Cabinas de clase I. Son cámaras cerradas con una abertura al frente para permitir el
acceso de los brazos del operador. Proporciona protección al trabajador y medio ambiente,
pero tienen la desventaja de no proteger el material de trabajo, lo que hace posible su
contaminación. Permiten manipular agentes biológicos de los grupos 1, 2 ó 3.
Cabinas de clase II. A diferencia de las de clase I, protegen al producto de la

contaminación además del operario y su entorno, gracias a la filtración HEPA previa del
aire que circula por el interior de la cabina en sentido vertical. Existen cabinas de clase II
de 4 tipos, A, B1, B2 y B3, según sus características de construcción, flujo de aire y sistema
de extracción. Son equipos que permiten el manejo de agentes biológicos de los grupos 1,
2 ó 3.
Cabinas de clase III. Son recintos herméticos con presión negativa que aísla
completamente su interior del entorno. Constituyen el máximo nivel de seguridad, que
permite trabajar con microorganismos altamente infecciosos y realizar procedimientos de
alto riesgo. Permiten el manejo de agentes de los grupos 1, 2, 3 ó 4.
125
Figura 10.3 Cabina de Flujo laminar tipo IV
Prácticas generales de seguridad en el laboratorio

• Registro de datos de las personas que trabajen en el laboratorio, que incluya
contacto propio y de terceros para casos de emergencia, seguro de salud y de
riesgo laboral, padecimiento de alguna condición física o médica permanente o
transitoria, que aumente su susceptibilidad a riesgos del laboratorio.
• Información de las medidas de seguridad correspondientes a todas las personas que

trabajen en el laboratorio, participen, o no, en procedimientos donde se involucren
agentes de riesgo.
• Prevenir la exposición de mujeres embarazadas que laboran en ambientes

hospitalarios, a factor de riesgo de transmisión parenteral. En caso de ser necesario,
debe ser reubicada en áreas de menor peligro.
• Disposición visible de protocolos para emergencias y accidentes.
• Señalización del laboratorio con la restricción del acceso y la clasificación

correspondiente según el tipo riesgo.
• Manejo de todo paciente como potencialmente infectado. Las normas universales

deben aplicarse con todos los pacientes independientemente del diagnóstico.
• Prohibición estricta de ingestión de alimentos o bebidas dentro de las áreas de

trabajo y almacenamiento de alimentos en las neveras y equipos del laboratorio
destinados a la refrigeración de sustancias contaminantes o químicos.
126
• Limpieza permanente del laboratorio, acorde al protocolo correspondiente. Evitar
materiales no relacionados con el trabajo como decoración, plantas, fotos, etc.
• Acceso a una ducha de seguridad y a un lavaojos de emergencia.
• Inventario actualizado de productos químicos que incluya las fichas de seguridad.
• Ubicación de equipos y/o tomas eléctricas lejos de fuentes de agua, agentes

corrosivos o inflamables.
• Disposición de materiales de escritorio y libros en sitios diferentes de los mesones

de trabajo. El papel contaminado es de difícil esterilización o desinfección.
• Recolección de los materiales, reactivos, equipos, al finalizar una tarea u operación

para evitar acumulaciones innecesarias.
• Condiciones confortables de temperatura, iluminación y ventilación de los sitios de

trabajo.
• Identificación con la señal correspondiente, en caso de tener dentro del laboratorio

algún tipo de fuente de radiación.
• Sujeción firme de los guardianes para desechar las agujas de forma segura dentro
del recipiente, halando la jeringa, sin usar la otra mano.
• Mantenimiento de todo equipo que requiera reparación técnica, previa desinfección

y limpieza por parte del personal encargado del mismo. El personal del área de
mantenimiento debe cumplir las normas universales de prevención y control del
factor de riesgo biológico.
• Accionamiento con el pie, la rodilla o el codo del lavamanos, en las áreas de alto
riesgo biológico.
• Restricción del ingreso a las áreas de alto riesgo biológico al personal no autorizado,
a quien no utilice los elementos de protección personal necesarios y a niños.
• Ubicación de los trabajadores sometidos a tratamiento con inmunosupresores en

áreas sin riesgo biológico.
127
• Disponibilidad de recipientes seguros, de material irrompible y cierre hermético,
preferiblemente la tapa de rosca para manipular, transportar y enviar muestras. Las
gradillas a su vez se transportarán en recipientes herméticos de plástico o acrílico
que detengan fugas o derrames accidentales. Además, deben ser fácilmente
lavables. En caso de contaminación externa accidental del recipiente, éste debe
lavarse con hipoclorito de sodio a 1000 partes por millón y secarse.
• Deposito del material patógeno en las bolsas de color rojo, rotuladas con el símbolo
de riesgo biológico.
• Esterilización del material contaminado antes de desecharlo.
• Disposición de sustancias inflamables en sitios idóneos destinados para su

almacenamiento.
• Instalación de extintores en lugar visible
Prevención y control
Control de riesgos químicos
Este tipo de riesgos se asocian a accidentes durante la manipulación y almacenamiento de

estos compuestos y también con el desconocimiento de los reactivos que pueden contener
agentes químicos y de su peligrosidad. La exposición a los compuestos químicos puede
producir efectos agudos o crónicos en función de la toxicidad del agente químico, la dosis
absorbida y la vía de entrada al organismo: por inhalación (vía principal), dérmica (a través
de las mucosas o piel intacta), digestiva o percutánea. Dentro del Manual de Seguridad del
laboratorio, debe existir un apartado de gestión de productos químicos, que incluya la lista
de todos los productos químicos presentes en el laboratorio, así como un registro de su
almacenamiento con referencia a su nivel de peligrosidad.
Control de riesgos físicos y psicosociales
• Ruido. El límite permitido es de 80 decibeles, cuando es superior a 85 decibeles se

debe aplicar medidas de protección.
• Iluminación. En lo posible, la iluminación debe ser natural, complementada con

iluminación artificial. La iluminación de los lugares de trabajo deberá tener
características como: uniformidad, niveles y contrastes adecuados a las exigencias
visuales de la actividad.
128
• Riesgo por contacto térmico. Se debe usar pinzas o guantes térmicos con los
materiales y equipos que puedan producir quemaduras.
• Riesgo eléctrico. Los tomacorrientes deben estar en número suficiente y

convenientemente distribuidos para evitar instalaciones provisionales.
• Radiaciones no ionizantes. Se debe evitar o reducir la exposición a radiaciones,

de manera que los riesgos se eliminen en su origen o se reduzcan al nivel más
bajo posible.
• Riesgo relacionado con la ergonomía. El diseño del puesto de trabajo debe seguir
las recomendaciones según que el trabajo de laboratorio se realice de pie o
sentado. Para el diseño del puesto de trabajo en equipos de cómputo y otras
pantallas debe tenerse en cuenta la distancia visual óptima, altura e inclinación del
teclado; la existencia de silla regulable.
• Riesgo psicosocial. Para la prevención del estrés, en lo posible debe hacerse

cambio de tarea o de horario de trabajo o en su defecto hacer ejercicios pararelajar
la musculatura del cuello, espalda y brazos.
Control del riesgo biológico

Buenas prácticas de manipulación
Además de las siguientes disposiciones, incluidas en las normas generales para el manejo
de muestras biológicas, es necesario adicionar las medidas acordes con el nivel de
contención establecido:
• El transporte de las muestras en el laboratorio debe siempre debe realizarse, en

cajas herméticas o neveras transportables, de paredes rígidas, resistentes y de
fácil desinfección.
• Uso obligatorio de la bata, pantalones largos elaborados en tela antifluido y zapatos

cerrados.
• Colocarse delantal plástico en aquellos procedimientos en que se esperen

salpicaduras, aerosoles o derrames importantes de sangre u otros líquidos
orgánicos.
• En ningún caso utilizar la ropa y elementos de trabajo fuera del laboratorio.
129
• Llevar a la lavandería en bolsa plástica roja, la ropa contaminada con sangre,
líquidos corporales u otro material orgánico.
• Para trabajar en el laboratorio, siempre utilizar guantes y protección ocular u otros

elementos de protección específicos según el procedimiento a realizar.
• Desechar los guantes luego de utilizarlos; antes de tocar otro objeto limpio como
celular, computador, manija de la puerta, entre otros.
• Lavar las manos con soluciones antisépticas como jabón después de terminar cada
procedimiento, al cambiar de tarea y al salir del laboratorio.
• Realizar desinfección y limpieza a las superficies, elementos, equipos de trabajo, al

final de cada procedimiento y al finalizar la jornada de acuerdo con el protocolo
establecido.
• El material reutilizable debe ser empacado para su esterilización.
• Los desechos biológicos y el material contaminado deben ser eliminados en

contenedores especiales de acuerdo con la normatividad de gestión de residuos
vigente.
Ante el fracaso de las medidas de contención y ocurrencia de un accidente biológico,

debe notificarse de inmediato al jefe del laboratorio o persona responsable, y seguir los
protocolos de actuación establecidos para estos casos.
Prevención de la transmisión por vía aérea
Durante la realización de los diferentes procesos del laboratorio de microbiología se

generan aerosoles con que contienen microorganismos, que pueden poner en riesgo la
salud de quienes laboran en él, por lo que deben tomarse medidas como:
• Uso de mascarilla
• Empleo de tubos de seguridad y centrifuga hermética para centrifugar las muestras

biológicas o suspensiones que pueden contener microorganismos.
• Utilización de cabinas de seguridad para realizar procedimientos en los que se

producen aerosoles como apertura y cierre de envases, llenado de recipientes,
maceración o agitación vigorosa.
130
• La disposición de líquidos o fluidos con pipetas o jeringas debe hacerse de manera
lenta.
• La apertura de la incubadora para sacar cultivos en proceso debe hacerse en un

solo procedimiento; de igual forma debe realizarse la incubación de nuevos cultivos.
Prevención de la transmisión parenteral, cutánea y por mucosas
La transmisión parenteral de microorganismos se presenta por la lesión con objetos

cortopunzantes contaminados con material biológico y la transmisión por piel y mucosas se
da por derrames y salpicaduras. Por la frecuencia de su ocurrencia se deben implementar
las siguientes medidas que ayudan a prevenir su presentación:
• Ante la existencia de herida, independientemente del tamaño, cubrirla con

esparadrapo o curita.
• Manejar con estricta precaución los elementos cortopunzantes y desecharlos en los

guardianes ubicados en cada servicio. Evitar su traslado de un recipiente a otro.
• Abstenerse de doblar o partir manualmente hojas de bisturí, cuchillas, agujas o

cualquier otro material cortopunzante.
• Nunca reutilizar el material contaminado como agujas, jeringas y hojas de bisturí.
• En caso de ruptura del material de vidrio contaminado con sangre u otro líquido
corporal los vidrios se deben recoger con escoba y recogedor; nunca con las manos.
• Se recomienda no utilizar lentes de contacto en el laboratorio.
• En caso de accidente de trabajo con material cortopunzante hacer el reporte

inmediato.
• Para evitar cortes accidentales, es preferible el uso de material plástico.
• El uso de agujas hipodérmicas queda restringido a la aspiración de líquidos de viales

con cápsula perforable y a la extracción de fluidos biológicos de animales de
experimentación.
Prevención de la transmisión por vía oral
131
La transmisión por vía oral se produce por ingestión accidental o por contaminación de
alimentos o bebidas en el laboratorio. Por esta razón como prevención:
• Pipetear con dispositivos destinados para este propósito.
• Está prohibido comer, beber, aplicarse cosméticos o fumar dentro del laboratorio.
• Evitar el almacenamiento de comida y bebidas en neveras, estufas o cualquier otro

lugar dentro del laboratorio.
• Es obligatorio el lavado de manos antes de cambiar de actividad, abandonar el

laboratorio o de ingerir alimentos.
Procedimientos de desinfección en el laboratorio de microbiología

Desinfectantes de superficies y limpieza de material orgánico:
El cloro es el desinfectante universal, activo frente a todos los microorganismos; junto con
los compuestos clorados se usan en desinfección de material orgánico y de superficies, en
la lavandería, para tratamiento de agua y de algunos desechos. En general, el cloro se
utiliza en forma de hipoclorito sódico, con diversas concentraciones de cloro libre,
disponible en forma líquida como hipoclorito de sodio o sólida como hipoclorito de calcio.
Su uso está limitado por su efecto corrosivo, su inactivación por materiales orgánicos y su
relativa inestabilidad. El compuesto activo que se libera es el ácido hipocloroso de potente
actividad oxidante e inhibidor de la actividad de las proteínas. Su actividad germicida
depende de la concentración del compuesto. De menor a mayor concentración es activo
contra bacterias, hongos, virus, micobacterias y esporas bacterianas.
Comercialmente el hipoclorito de sodio se encuentra disponible en diferentes

concentraciones que por lo general oscilan entre 5% equivalente a 50000 partes por millón-
ppm y 6.5% equivalente a 65000 partes por millón-ppm; concentración que usualmente es
la base para obtener diluciones con diferentes concentraciones de acuerdo a la necesidad.
El cloro y los compuestos clorados se usan en desinfección de superficies en la lavandería,
para tratamiento de agua y de algunos desechos.
Algunas concentraciones de hipoclorito de sodio utilizadas con frecuencia para la

desinfección son: agua a 0,2 ppm; desinfección de manos a 50 ppm; camillas, mesones y
camas 200ppm; y para desinfección de material orgánico 5.000ppm.
132
Otros desinfectantes utilizados en el laboratorio con menor frecuencia que el hipoclorito,
son los compuestos de amonio cuaternario, yodo, formaldehído y glutaraldehído (Ver la
preparación de hipoclorito de sodio en el capítulo de control de microorganismos).
Inactivación de material biológico potencialmente peligroso: Cuando se utiliza para la

inactivación de sangre, la concentración de hipoclorito de sodio debe ser de 0,5% o 5000
ppm; a 0,1% o 1000 ppm tiene efecto contra hongos, protozoos, micobacterias y
endosporas bacterianas; a 0,02% o 200ppm y 0,01% o 100 ppm destruye virus y formas
vegetativas de bacterias.
Procedimiento para limpieza y desinfección en derrame de sangre u otros líquidos

corporales sobre superficies de trabajo: Cubrir el material derramado con papel
absorbente y aplicar sobre y sobre la superficie circundante una solución desinfectante de
hipoclorito de sodio a 5000ppm, dejar actuar durante 30 minutos; después retirar este
material y descartar en la caneca destinada para este tipo de residuo, de acuerdo con el
procedimiento establecido, luego limpiar nuevamente la superficie con desinfectante a la
misma concentración y finalmente hacer limpieza con agua y jabón. El personal encargado
de realizar dicho procedimiento debe utilizar guantes, mascarilla y bata.
Procedimiento para limpieza y desinfección por derrame de caldo de cultivo

bacteriano positivo en el área de trabajo: Cubrir el material derramado con papel
absorbente y aplicar sobre este una solución desinfectante de hipoclorito de sodio a
200ppm dejar actuar por 30min, luego retirar este material y descartar en la caneca
destinada para este tipo de residuo. Desinfectar el área.
Medidas en caso de emergencia

A continuación, se relacionan las medidas a seguir en caso de que ocurran los siguientes
accidentes:
Derrame de material biológico sobre el cuerpo:
• Remover la ropa inmediatamente.
• Lavar vigorosamente el área expuesta con agua y jabón por un minuto.
• Reportar el incidente a la persona encargada del laboratorio o práctica.
• Buscar atención médica si es necesario.
• La ropa contaminada debe ser colocada en una solución desinfectante antes de ser
lavada.
133
Salpicaduras en los ojos con materiales contaminados con material biológico:
• Lavar inmediatamente el globo ocular e interior de la superficie del párpado con

abundante agua durante 15 minutos aproximadamente. Abrir el ojo para asegurar
efectivamente el lavado, comenzando por los párpados.
• Buscar atención médica inmediatamente.

Cortadas menores y heridas por pinchazo:
• Lavar vigorosamente la herida con agua y jabón por varios minutos.
• Aplicar un antiséptico adecuado.
• Buscar atención médica inmediatamente.
Otros aspectos de la bioseguridad en el laboratorio

Además de las normas para la prevención del riesgo biológico, hacen parte de la
bioseguridad las normas para el almacenamiento de compuestos químicos peligrosos, la
seguridad frente a agentes físicos como la electricidad, ruido accidentes, malas posturas
que conducen a lesiones ergonómicas y por movimientos repetitivos y el estrés psicosocial.
Simbología utilizada de acuerdo con los procedimientos de seguridad y

bioseguridad establecidos.
Las siguientes son señales de uso habitual en el laboratorio.
134
Figura 10.4 Símbolo internacional de Riesgo Bioógico. (Extraido del Manual de Bioseguridad del
ISP, pág 36)
Figura 10.5 Etiquetas para sustancias biológicas de categoría A (UN 3245), tales como sustancias
infecciosas (A) o microorganismos genéticamente modificados (B). Etiqueta para sustancias
empaquetadas en hielo seco (UN 1845) (C)
135
Referencias
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Manual de bioseguridad para los laboratorios clínicos de Microbiología, Citología y Biología

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Ena Luz Torres Arroyo Lisy Gracia Herrera Eduardo Thorrens Romero Rossana Villegas Gracia

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LISY GRACIA HERRERA

ENA LUZ TORRES ARROYO

Fondo Editorial de la Universidad de Córdoba

Manual de Introducción a la Microbiología

Primera edición 2021

Capítulo 1. Microscopía ...................................................................................................... 7

Ena Luz Torres Arroyo. Bacterióloga y Laboratorista Clínico. Especialista en Microbiología

Rossana Villegas Gracia. Bacterióloga. Magister en Microbiología y bioanálisis énfasis

Lisy Gracia Herrera, Bacterióloga. Especialista en Microbiología médica. Magister en

El laboratorio de microbiología es el lugar en el cual se manejan y estudian los

Instrucciones para reproducir la

del Manual B) Abrir el link

El microscopio es un instrumento que permite observar estructuras con tamaño inferior a

La microscopía se define como el uso de un microscopio para ampliar el tamaño de objetos

En la mayoría de los microscopios de luz, el lente del objetivo cercano a la muestra

Componente Características y Funciones

Base o pie Parte inferior en la cual se apoya el microscopio, soporta

Brazo o columna Junto con la base constituyen el soporte del instrumento.

Revolver Constituido por una semiesfera que posee una serie de

La platina Placa cuadrada, soporte horizontal donde se colocan las

Carro mecánico Sistema de dos pinzas ubicado encima de la platina, que

Tubo o cabezal Cilindro que soporta los oculares en la parte superior y el

Tornillo macrométrico Localiza la imagen y permite hacer un enfoque grueso,

Tornillo micrométrico Su precisión le permite hacer el enfoque adecuado o enfoque

Componente Características y Funciones

Oculares Aumentan la imagen real proyectada por el objetivo, 10, 40 o

Objetivos Constituyen un sistema óptico formado por una o varias lentes

Componente Características y Funciones

Condensador Sistema de lentes convergentes ubicados debajo de la platina

Fuente de luz Proporciona la luz necesaria para la observación de la

Diafragma Dispositivo colocado inmediatamente debajo de la platina, con

Filtro Disco de vidrio mate o de algún color ubicado sobre un anillo

En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura filamentosa denominada

Tubo de observación Cuerpo del microscopio

Figura 1.1 Partes del microscopio

Cámaras y Utilizadas para obtener una representación exacta del

Cámaras digitales La microfotografía permite preservar lo observado al

Cámaras de video Con la videomicroscopía se capturan imágenes en

Filtros y Transforman el microscopio de campo claro en un

Microscopio vertical. Es el microscopio convencional y de uso más común, que posee la

Microscopio invertido. Su estructura es inversa a la del microscopio convencional,aunque

Microscopio estereoscópico. Este microscopio proporciona una imagen estereoscópica,

Microscopio quirúrgico. Es un microscopio empleado en microcirugía porque proporciona

Microscopios fotónicos especiales. Permiten la observación de células vivas o muestras

Los rayos de luz que Ocular

Figura 1.2 Microscopio de contraste de fases

Microscopio de fluorescencia. La fluorescencia es un fenómeno físico por el cual ciertas

Fuente de Luz Exitada

Filtro Exitado Espejo divisor de

Figura 1.3 Principio del microscopio de florescencia

Microscopio de campo oscuro. El microscopio de campo oscuro se fundamenta en el

En este microscopio el condensador no permite que la luz pase directamente a través de la

Filtro de luz de día

Figura 1.4 Microscopio de campo oscuro

Microscopio electrónico. El micoscopio electrónico usa electrones en lugar de luz para

Existen dos tipos de microscopio electrónico, el microscopio electrónico de transmisión

Imagen sobre una pantalla

Figura 1.6 Microscopio electrónico de Barrido

Microscopios fotónicos especiales: Permiten la observación de células vivas o muestras

Pasos para la observación de muestras en el microscopio compuesto

• Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.

• Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya en posición) o colocar el de 10x.