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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD Escuela de Ciencias Agrcolas Pecuarias y del Medio Ambiente Contenido didctico del

l curso Cultivo de Tejidos 203024

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA


ESCUELA DE CIENCIAS AGRCOLAS, PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE ESPECIALIZACIN EN BIOTECNOLOGA AGRARIA

CULTIVO DE TEJIDOS

PATRICIA ANDREA RODRIGUEZ BURGOS Biloga, Magster en Microbiologa Actualizado en 2009 por: DIANA ANGLICA CARVAJAL BERNAL Biloga, Magister en Biotecnologa Molecular Revisado en 2013 por: CARLOS PATIO TORRES Ing. Agrnomo, M.Sc. Ph.D.

BOGOT 2013
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INDICE DE CONTENIDO

LISTADO DE TABLAS .............................................................................................. 5 LISTADO DE GRFICOS Y FIGURAS ..................................................................... 6 ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO ...................... 6 INTRODUCCIN ...................................................................................................... 7 JUSTIFICACIN ....................................................................................................... 9 INTENCIONALIDAD FORMATIVA .......................................................................... 10 CONTEXTO TERICO ........................................................................................... 12 METODOLOGA GENERAL.................................................................................... 13 SISTEMA DE EVALUACIN................................................................................... 14 GUA DE ACTIVIDADES......................................................................................... 15 CONTENIDO DIDCTICO UNIDAD 1..................................................................... 16 CONTENIDO DIDCTICO UNIDAD 2 ..................................................................... 20 CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES..................................................................... 23 CAPITULO 1: Principios, metodologas y tcnicas 1 ........................................ 23 Introduccin............................................................................................. 23 Leccin 1: Historia del cultivo de tejidos vegetales .................................. 23 Leccin 2: Consideraciones bsicas para el establecimiento y/o planeacin de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales ................ 24 Leccin 3: Medios de cultivo ................................................................... 28 Leccin 4: Propagacin in vitro ............................................................... 34 Leccin 5: Callognesis .......................................................................... 36 CAPITULO 2: Principios, metodologas y tcnicas 2 ........................................ 40 Introduccin............................................................................................. 40 Leccin 6: Cultivo de anteras y polen ...................................................... 40 Leccin 7: Obtencin y cultivo de protoplastos ........................................ 41 Leccin 8: Cultivo de meristemos ............................................................ 44 Leccin 9: Cultivo de embriones y de vulos ........................................... 46 Leccin 10: Variacin somaclonal ........................................................... 49 CAPITULO 3: Aplicaciones Prcticas............................................................... 52 Introduccin............................................................................................. 52 Leccin 11: Bioestadstica aplicada al cultivo de tejidos vegetales .......... 52 Leccin 12: Cultivo de especies econmicamente importantes ............... 54 2

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Leccin 13: Transgnesis........................................................................ 57 Leccin 14: Mejoramiento gentico ......................................................... 62 Leccin 15: Aplicaciones en bancos de germoplasma ............................ 64 Actividades de Autoevaluacin de la UNIDAD 1 .............................................. 66 Fuentes Documentales de la Unidad 1 ............................................................ 67 CULTIVO DE TEJIDOS ANIMALES ........................................................................ 68 CAPITULO 4: Principios, metodologas y tcnicas 1 ........................................ 68 Introduccin............................................................................................. 68 Leccin 16: Introduccin a la tcnica del cultivo celular ........................... 68 Leccin 17: Medios de cultivo ................................................................. 69 Leccin 18: El laboratorio de cultivo de tejidos ........................................ 73 Leccin 19: Tipos de cultivos .................................................................. 75 Leccin 20: Aislamiento de clulas para cultivo....................................... 77 CAPITULO 5: Principios, metodologas y tcnicas 2 ........................................ 82 Introduccin............................................................................................. 82 Leccin 21: Contaminacin ..................................................................... 82 Leccin 22: Caracterizacin y Autenticacin ........................................... 84 Leccin 23: Cuantificacin celular ........................................................... 87 Leccin 24: Transfeccin......................................................................... 91 Leccin 25: Clulas madre ...................................................................... 94 Leccin 26: Cultivos celulares de insectos .............................................. 98 CAPITULO 6: Ingeniera de Tejidos ............................................................... 101 Introduccin........................................................................................... 101 Leccin 27: Materiales en ingeniera de tejidos ..................................... 101 Leccin 28: Fundamentos de la ingeniera de tejidos ............................ 104 Leccin 29: Biomateriales ..................................................................... 107 Leccin 30: Aplicaciones y perspectivas ............................................... 110 Actividades de Autoevaluacin de la UNIDAD 2 ............................................ 115 Fuentes Documentales de la Unidad 2 .......................................................... 116

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LISTADO DE TABLAS

TABLA 1.1 COMPARACIN DE EFECTOS ENTRE AUXINAS Y GIBERELINAS ....................... 33 TABLA 2.1 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL TRABAJO EN CULTIVOS IN VITRO .................. 69 TABLA 2.2 PRINCIPALES CARACTERSTICAS Y APLICACIONES DE LAS LNEAS CELULARES MS COMNMENTE USADAS EN BIOTECNOLOGA. ............................................... 78 TABLA 2.3 ESPECIES FUENTE PARA EL AISLAMIENTO Y ESTABLECIMIENTO DE LNEAS CELULARES ....................................................................................................................... 79 TABLA 2.4 COMPARACIN DE LAS TCNICAS DE AUTENTICACIN CELULAR.................... 85 TABLA 2.5 COMPARACIN DE LOS MTODOS DE TRANSFECCIN EN CLULAS ANIMALES .......................................................................................................................... 91 TABLA 2.6 ALGUNOS DE LOS POLMEROS QUE PUEDEN SER USADOS EN INGENIERA DE TEJIDOS, BASADOS EN ANTIGUOS DISPOSITIVOS BIOMDICOS ............................................. 103 TABLA 2.7 CLASES DE BIOMATERIALES .................................................................... 109

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LISTADO DE GRFICOS Y FIGURAS

FIGURA 1.1 DIFERENTES REAS DE UN LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS. ..................... 25 FIGURA 1.2 CMARA DE FLUJO LAMINAR. ............................................................................ 26 FIGURA 1.3 ESQUEMA DE UNA CMARA DE FLUJO HORIZONTAL ............................................. 28 FIGURA 1.4 SUSTANCIAS QUE SE AADEN CON FRECUENCIA A LOS MEDIOS DE CULTIVO PARA INDUCIR EL CRECIMIENTO Y DESARROLLO VEGETAL. ............................................ 29 FIGURA 1.5 RESPUESTAS GENERADAS EN LOS CULTIVOS IN VITRO POR LAS AUXINAS Y CITOCININAS. ............................................................................................................. 32 FIGURA 1.6 PRINCIPIOS DEL CULTIVO DE TEJIDOS Y ALGUNAS VAS DE MULTIPLICACIN CLONAL. .................................................................................................................... 35 FIGURA 1.7 CALLOS DE CRISANTEMO. ................................................................................ 36 FIGURA 1.8 REPRESENTACIN ESQUEMTICA DEL CULTIVO DE CALLO. .................................. 39 FIGURA 1.9 PROCESO GENERAL PARA LA OBTENCIN DE PLANTAS HAPLOIDES O DIHAPLOIDES. ............................................................................................................ 41 FIGURA 1.10 PROTOPLASTOS AISLADOS DE ARABIDOPSIS THALIANA ..................................... 42 FIGURA 1.11 PROCEDIMIENTO PARA AISLAR Y CULTIVAR PROTOPLASTOS .............................. 43 FIGURA 1.12 SISTEMA DE PROPAGACIN POR CULTIVO DE MERISTEMOS O YEMAS ................. 45 FIGURA 1.13 PRODUCCIN DE PLANTAS LIBRES DE VIRUS A PARTIR DE CULTIVO DE MERISTEMOS. ............................................................................................................ 46 FIGURA 1.14 CULTIVO DE EMBRIONES DE CEBADA Y DE PALMA ............................................. 47 FIGURA 1.15 OBTENCIN DE VARIANTES SOMACLONALES DE PASTO LLORN, ERAGROSTIS CURVULA (SCHRAD.) NEES A PARTIR DEL CULTIVO DE INFLORESCENCIAS. ..................... 51 FIGURA 1.16 SUPERFICIE MUNDIAL DE CULTIVOS BIOTECNOLGICOS. ................................... 57 FIGURA 1.17 TRANSFERENCIA DEL DNA-T DE UN PARSITO A CLULAS VEGETALES. ............. 59 FIGURA 1.18 SISTEMA DE DOS PLSMIDOS PARA CREAR UNA PLANTA TRANSGNICA. ............. 60 FIGURA 1.19 BIOBALISTICA ................................................................................................ 62 FIGURA 2.1 ESQUEMA DE LA FILTRACIN AL VACO Y ALGUNAS UNIDADES DE FILTRACIN. ..... 72 FIGURA 2.2 DIAGRAMA DE FLUJO DE AIRE EN UNA CABINA DE CLASE II. ................................. 74 FIGURA 2.3 DIAGRAMA DE FLUJO DE AIRE EN UNA CABINA CLASE III. ..................................... 75 FIGURA 2.4 TIPOS DE CULTIVOS. ........................................................................................ 76 FIGURA 2.5 ESQUEMATIZACIN DEL MTODO DE OBTENCIN DE FIBROBLASTOS DE POLLO..... 80 FIGURA 2.6 ESQUEMATIZACIN DEL MTODO DE OBTENCIN DE HEPATOCITOS DE RATA. ....... 81 FIGURA 2.7 CLULAS INFECTADAS CON MICOPLASMA Y TEIDAS CON HOECHST 33258. ........ 84 FIGURA 2.9 CARIOTIPO HUMANO CON TINCIN TRIPSINA-GIEMSA. ......................................... 86 FIGURA 2.10 ELABORACIN DE UNA CURVA DE CRECIMIENTO. .............................................. 89 FIGURA 2.11 FORMACIN DE UN LIPOSOMA Y SU ENDOCITOSIS. ............................................ 92 FIGURA 2.12 MICROINYECCIN .......................................................................................... 93 FIGURA 2.13 ESTRATEGIA DE OBTENCIN DE UN CULTIVO DE CLULAS MADRE DE EMBRIN. .. 96 FIGURA 2.14 ESTRATEGIA DE OBTENCIN DE UN CULTIVO DE CLULAS MADRE ADULTAS ........ 98 FIGURA 2.15 PASOS PARA LA PREPARACIN DE UN CULTIVO CELULAR DE INSECTOS .............. 99 FIGURA 2.16 DESARROLLO DE BIOMATERIALES POLIMRICOS PARA INGENIERA DE TEJIDOS. 104 FIGURA 2.17 TIPOS DE ADHESIN CELULAR. ...................................................................... 107 FIGURA 2.18 PIEZAS QUE PUEDEN IMPLANTARSE EN EL ORGANISMO HUMANO ..................... 108 FIGURA 2.19 APLICACIN DE LA INGENIERA DE TEJIDOS CON CLULAS AUTLOGAS. ........... 111 5

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ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO

El contenido didctico del curso acadmico: Cultivo de Tejidos fue diseado inicialmente en el ao 2007 por la biloga Patricia Andrea Rodrguez Burgos, Magster en Microbiologa, docente de los programas de especializacin de la UNAD, ubicado en el CEAD de Pitalito. Patricia es Biloga con M.Sc. en Microbiologa. Se ha desempe como tutora de la UNAD en el 2007 y ha sido docente de diversas universidades. El contenido didctico ha sido actualizado una sola vez: en el ao 2009, desarrollada por la biloga Diana Anglica Carvajal Bernal, M.Sc. en Biotecnologa Molecular, quien se desempea actualmente como tutora de la UNAD en el CEAD Jos Celestino Mutis. La versin del contenido didctico que actualmente se presenta tiene como caractersticas el ajuste a los lineamientos dados por la universidad para el material de soporte para los cursos de la modalidad virtual.

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INTRODUCCIN
El curso de CULTIVO DE TEJIDOS pertenece al Programa de Especializacin en Mejoramiento y Biotecnologa Agraria, adscrito a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Abierta y a Distancia (UNAD). Corresponde al campo de formacin de profundizacin, es de carcter electivo y tiene dos (2) crditos acadmicos. El curso busca dotar a los estudiantes de la especializacin de habilidades en la comprensin de conceptos y tcnicas en cultivos de tejidos vegetales y animales as como de los aportes, aplicaciones y potencialidades de estas herramientas a la hora de formular investigaciones e iniciativas en el rea de la biotecnologa agraria. El cultivo de tejidos es una herramienta de gran utilidad en la biotecnologa. En los vegetales, las tcnicas de cultivo de tejidos se han convertido en herramientas poderosas para el mejoramiento de las plantas, y para lograr avances en fitopatologa, gentica, fisiologa y en otras disciplinas. Las tcnicas de regeneracin de plantas han permitido limpieza de plagas y enfermedades, disminucin del tiempo necesario para produccin de nuevas variedades, propagacin rpida de lneas superiores, implementacin de bancos de germoplasma en pequeos espacios y a costos mnimos, propagacin masiva de especies en peligro de extincin y la preparacin y puesta a punto de plantas para transformacin gentica, lo que ha contribuido significativamente al progreso de la agricultura. Por su parte, las tcnicas de cultivo de rganos y clulas animales han posibilitado el estudio de ciertos procesos celulares tales como: replicacin y transcripcin del DNA, sntesis proteica, metabolismo energtico, nutricin, infecciones virales, transformacin maligna, accin de drogas, toxicidad, secrecin de productos especializados, desarrollo embrionario, y para tcnicas de modificacin gentica, seleccin clonal, reconstruccin tisular, transgenesis entre otras, desde el mbito biomdico hasta la obtencin de especies y razas animales mejoradas. El curso est dividido en dos unidades didcticas, que se describen a continuacin. La primera unidad didctica consta de 3 captulos y un total de 15 lecciones, y trata los aspectos concernientes al cultivo de tejidos vegetales. En esta unidad se estudian los principios fundamentales de la micropropagacin vegetal, incluyendo su historia y las ltimas tendencias en mejoramiento gentico, dado que el cultivo de tejidos vegetales se constituye en un puente para llevar las manipulaciones genticas del laboratorio al campo. Se abordan temas como: principios para el establecimiento de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, tcnicas aspticas, cultivo de protoplastos, de meristemos, de embriones y polen, variacin somaclonal y transgnesis entre otros. La segunda unidad didctica
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consta de 3 captulos y 15 lecciones. Esta unidad trata de introducir al estudiante en el rea del cultivo de tejidos animales. En esta unidad se expone el cultivo de tejidos desde el punto de vista del cultivo celular, estudiando las principales tcnicas y usos, finalizando con los ltimos avances en ingeniera de tejidos. Se tratan temas como: cultivos primarios, mantenimiento de lneas celulares, hibridomas, cultivos en tres dimensiones, cultivos de alta densidad, lneas inmortales, tejidos artificiales. El curso se desarrollar bajo la metodologa de educacin a distancia, donde el estudiante es el mayor responsable de su proceso de aprendizaje y por esto debe planificar el tiempo de dedicacin para su trabajo independiente, teniendo en cuenta que durante el proceso tambin tiene a su disposicin vas de acompaamiento por parte del tutor y actividades de trabajo en pequeo grupo colaborativo. De esta forma el aprendizaje es dinmico y participativo, al contar con varios actores de flujo de conocimiento: el acompaamiento del tutor y las interacciones y aportes de los compaeros El estudiante encontrar en la Gua didctica toda la informacin necesaria para que relacione secuencial y peridicamente su aprendizaje terico (basado en el modulo) con su aprendizaje experiencial, el cual desarrollar con la ejecucin y anlisis de los ejercicios descritos en la Gua de Actividades. Los Criterios de evaluacin que debern tener presentes tanto el estudiante, como tutores y docentes, es el establecido en el reglamento estudiantil. En especial se consideran los enfoques estratgicos complementarios de autoevaluacin, coevaluacin y heteroevaluacin. Para lograr con xito la culminacin de este curso, el estudiante consultar la bibliografa propuesta para garantizar el acceso a toda la informacin necesaria y as responder a las exigencias acadmicas del curso. Es importante resaltar que una vez se finalice la labor de aprendizaje el estudiante podr relacionar y comprender artculos o trabajos experimentales que tengan que ver con el rea de cultivo de tejidos y cultivos celulares, y los usos potenciales de estas herramientas en su desempeo como especialistas en biotecnologa agraria. El cultivo de tejidos vegetales y animales, entendido como el proceso de hacer crecer clulas y tejidos en condiciones de laboratorio se ha constitu ido en una herramienta esencial en muchos campos del conocimiento, como el anlisis de respuestas celulares a factores ambientales, expresin gentica, desarrollo de anticuerpos, desarrollo de organismos genticamente modificados, cultivo de virus, micropropagacin de plantas, mejoramiento gentico y en general temas relacionados con la biotecnologa tanto animal como vegetal. El curso de Cultivo de Tejidos aportar al estudiante la comprensin y aplicacin de diferentes postulados biolgicos y de manipulacin in vitro, necesarios para un mejor desempeo profesional, integrando de manera compacta y funcional, los conocimientos bsicos y fundamentales de estas herramientas.
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JUSTIFICACIN
El cultivo de tejidos es una herramienta de gran utilidad en la biotecnologa. Estas tcnicas se basan en la "totipotencialidad celular", capacidad intrnseca en las clulas vegetales y de factible induccin en las clulas animales, dadas en cultivos in vitro. As se obtiene la propagacin rpida y masiva de plantas idnticas a la original a partir de cualquier parte aislada de la planta en el caso de tejidos animales, la propagacin de lneas celulares especficas. En los vegetales, las tcnicas de cultivo de tejidos se han convertido en herramientas poderosas para el mejoramiento de las plantas, y para lograr avances en fitopatologa, gentica, fisiologa y en otras disciplinas. Las tcnicas de regeneracin de plantas han permitido limpieza de plagas y enfermedades, disminucin del tiempo necesario para produccin de nuevas variedades, propagacin rpida de lneas superiores, implementacin de bancos de germoplasma en pequeos espacios y a costos mnimos, propagacin masiva de especies en peligro de extincin y la preparacin y puesta a punto de plantas para transformacin gentica, lo que ha contribuido significativamente al progreso de la agricultura. Por su parte, las tcnicas de cultivo de rganos y clulas animales han posibilitado el estudio de ciertos procesos celulares tales como: replicacin y transcripcin del ADN, sntesis proteica, metabolismo energtico, nutricin, infecciones virales, transformacin maligna, accin de drogas, toxicidad, secrecin de productos especializados, desarrollo embrionario, y para tcnicas de modificacin gentica, seleccin clonal, reconstruccin tisular, transgnesis entre otras, desde el mbito biomdico hasta la obtencin de especies y razas animales mejoradas. El curso de Cultivo de Tejidos aportara al estudiante la comprensin y aplicacin de diferentes postulados biolgicos y de manipulacin in vitro, necesarios para un mejor desempeo profesional, integrando de manera compacta y funcional, los conocimientos bsicos y fundamentales de estas herramientas. Permitir por una parte la familiarizacin de los conceptos al tener la oportunidad de experimentar con modelos pedaggicos (Talleres de Cultivos de Tejidos) que posibilitarn la aplicacin de modelos y mtodos de cultivo de tejidos en la produccin de plantas y animales mejorados.

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INTENCIONALIDAD FORMATIVA

Formulacin de Propsitos 1. Generar en el estudiante la comprensin de los conceptos generales mediante el anlisis de las herramientas de cultivo de tejidos y su aplicacin en problemas cientficos. Crear en el estudiante la capacidad de solucin de los problemas agrarios mediante la aplicacin de conceptos cultivo de tejidos, con fines biotecnolgicos. Incentivar en el estudiante el sentido investigativo a travs del desarrollo de competencias que le permitan formular y comprender investigaciones en las que est implicado el uso de cultivo de tejidos.

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Formulacin de Objetivos 1. Adquirir el conocimiento terico necesario, acerca de las tcnicas de cultivo de tejidos vegetales y animales, para ser aplicados a nivel de propagacin, mejoramiento gentico y conservacin. Desarrollar la capacidad investigativa planeando, analizando y discutiendo potenciales resultados de una investigacin especfica durante el desarrollo del curso

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Formulacin de Competencias Cognitivas El estudiante consigue tener slidas bases y conocimientos acerca de los temas principales del curso de Cultivo de Tejidos, con nfasis en las principales aplicaciones que pueden beneficiar los sistemas agropecuarios. Posee inters y
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es competente en la investigacin cientfica en el rea del Cultivo de Tejidos y particularmente aquella que se relaciona con los sistemas agropecuarios. Profundiza en los aspectos de su inters particular en el rea del cultivo de tejidos aplicados a las ciencias agropecuarias. Comunicativas Interpretativas: El estudiante desarrolla de habilidad de sustentar efectivamente aspectos relacionados con el cultivo de tejidos, considerando los ltimos avances en las aplicaciones de esta herramienta. Argumentativas: El estudiante adquiere una actitud crtica hacia las aplicaciones de la tcnica de cultivo de tejidos que pueden beneficiar la produccin en sistemas agropecuarios, as como es capaz de defender su opinin con relacin a las prcticas que sustentan el estudio del Cultivo de Tejidos. El estudiante aplica el mtodo cientfico, a travs de habilidades de sntesis, anlisis, deduccin, y planteamiento de hiptesis. Defiende el compromiso adquirido como estudiante, tomando una posicin responsable, honesta y activa frente a situaciones cotidianas en su entorno social. Propositivas: El estudiante es capaz de cuestionar, proponer aplicaciones de cultivo de tejidos, temas de investigacin y discutir procedimientos sobre estudios en Cultivo de Tejidos. Promueve un ambiente sano protegiendo su entorno, tomando decisiones responsables y procurando el bienestar social.

Formulacin de Metas 1. El estudiante se apropiara del conocimiento sobre las bases biolgicas y fsico-qumicas necesarias para el desarrollo de cultivos In vitro, mediante el estudio y discusin de artculos cientficos. El estudiante estar en capacidad de plantear investigaciones biotecnolgicas que requieran las tcnicas de cultivos celulares y de tejidos. El estudiante tendr la capacidad de analizar los conceptos de cultivos In vitro, aplicados al mejoramiento gentico para proponer nuevas alternativas de investigacin El estudiante reconocer, analizar e interpretar conceptos y tcnicas de cultivo de tejidos en la investigacin biotecnolgica agrcola, obteniendo una mirada crtica y actualizada de estas investigaciones.
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CONTEXTO TERICO

En las ltimas dcadas se han desarrollado tcnicas que posibilitan el estudio de las plantas y de los animales a escala celular y molecular. Estas nuevas tcnicas conocidas colectivamente como biotecnologa, se han convertido en herramientas poderosas para el mejoramiento de las plantas y de los animales, y para lograr avances en patologa, gentica, fisiologa y en otras disciplinas, lo que ha contribuido significativamente al progreso de la agronoma. El rea de cultivo de tejidos se ha convertido en la base para desarrollar y poder aplicar las tcnicas para la transformacin gentica de organismos y brinda la fundamentacin prctica para avanzar en estudios de biologa celular. En la medida en que se conozcan los procesos celulares que controlan los fenmenos de desdiferenciacin y diferenciacin celular, crecimiento y cmo influyen la nutricin y los reguladores de crecimiento en el nivel celular, se podr avanzar aun ms en su entendimiento y control, posibilitando de esta manera mayor entendimiento de la biologa celular para futuras aplicaciones biotecnolgicas. Este curso est dedicado al cultivo de tejidos de vegetales y animales, temticas que permitirn que el estudiante de postgrado conozca y profundice en el rea de las tcnicas de propagacin celular, sus aplicaciones en manipulacin gentica y mejoramiento y perspectivas de futuras aplicaciones.

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METODOLOGA GENERAL

Teniendo en cuenta que con este modulo, el estudiante desarrollar habilidades para analizar los principios fsicos, qumicos y biolgicos de los cultivos de tejidos en vegetales y animales adems de sus aplicaciones, podr plantear temas de investigacin en desarrollo biotecnolgico haciendo uso de estas herramientas, comprendiendo en toda su extensin la aplicabilidad y ventajas o desventajas de las mismas. En tanto que para la actualizacin de sus conocimientos, es necesario que, adicional a la teora, se realicen ejercicios de anlisis y lecturas complementarias; los cuales garantizaran una mayor y mejor asimilacin y comprensin de las temticas estudiadas. As mismo estn definidos espacios, para el control, validacin y discusin de dichas prcticas y ejercicios (lo mismo que de los componentes tericos) en tutoriales, reuniones de pequeos grupos colaborativos, grupos de curso y en una socializacin final del proyecto de semestre. La funcin de estas actividades de interactividad pedaggica, ser la de orientar, clarificar y cualificar procesos, tanto tericos, como prcticos, con el nimo tanto de coadyuvar en la operacionalizacin cognitiva del estudiante, como de posibilitar procesos de seguimiento evaluativos (formativos) y finalmente valorativos del aprendizaje. Para que el estudiante pueda desempearse adecuadamente en este proceso, recibir como recursos, artculos cientficos sobre temas especficos y una lista de problemas para ejercitar los conocimientos adquiridos. El estudiante encontrar en la Gua Didctica toda la informacin necesaria y pertinente para que relacione permanente y secuencialmente su aprendizaje terico (basado en el mdulo) con el procedimiento de aprendizaje experiencial, los cuales encontrar descritos con precisin en la Gua de Actividades. Recibir la informacin precisa de tiempos, materiales, procedimientos, etc. que le permitan no slo realizar sus ejercicios de manera oportuna y pertinente, sino que le indicarn cmo y cundo elaborar y/o presentar los informes y sustentaciones que constituirn las evidencias para la evaluacin de su proceso. En este sentido se definen los mecanismos y requisitos especficos para acceder tanto a los momentos de interactividad pedaggica ya mencionados, como a los medios y mediaciones tecnolgicas a las que tendr acceso y necesidad. Entre los apoyos tcnicos y tecnolgicos relevantes para este proceso, el estudiante requerir especficamente del uso computadores y lecturas complementarias el cual permitir una mayor celeridad y apropiacin del proceso de aprendizaje y de sus resultados
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SISTEMA DE EVALUACIN

Los Criterios de evaluacin que debern tener presentes tanto el estudiante, como tutores y docentes, es el establecido en el reglamento estudiantil. En especial se consideran los enfoques estratgicos complementarios de autoevaluacin, coevaluacin y heteroevaluacin. Como se mencion en la metodologa general se llevarn a cabo procesos de seguimiento evaluativos (formativos) y finalmente valorativos del aprendizaje. Como mecanismos de evaluacin se cuenta con la heteroevaluacin y autoevaluacin. En trminos generales se evaluarn las actividades de tipo individual descritas en la metodologa, en pequeos grupos colaborativos y los de socializacin. De todas quedara constancia en el Portafolio Personal de Desempeo (PPD).

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GUA DE ACTIVIDADES

Situaciones de reconocimiento El estudiante podr relacionar las diferencias, requerimientos bsicos y respuestas a factores ambientales que podr encontrar en cualquier tipo de cultivo in vitro, se generar interrogantes como: Cules son los requerimientos mnimos para el crecimiento celular? Qu tipos celulares son los adecuados para un estudio especfico? En sus respuestas el estudiante estar en capacidad de entender que existen diferentes mtodos de cultivos de tejidos y celulares que permiten la obtencin de animales y plantas en laboratorio con potencialidad para ser manipulados.

Situaciones de profundizacin El estudiante conceptualizar que los factores bioticos y abioticos presentes en un medio de cultivo pueden ser manipulados y controlados para la obtencin de lneas celulares especificas o respuestas celulares deseadas segn los objetivos de investigacin. Adems analizar el manejo de estas metodologas para futuros proyectos o lneas de investigacin de su inters.

Situaciones de transferencia El estudiante estar en capacidad, de proponer hipotticamente una investigacin en el rea de biotecnologa agraria en la cual sea necesario emplear herramientas de cultivos de tejidos. Tambin realizar talleres y anlisis de artculos para realizar la identificacin de sus conocimientos.

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CONTENIDO DIDCTICO UNIDAD 1

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Nombre de la Unidad Introduccin

CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES En esta unidad se presentarn los principios bsicos de la micropropagacin vegetal, desde su historia hasta las ltimas tendencias en mejoramiento gentico, dado que el cultivo de tejidos vegetales se constituye en un puente para llevar las manipulaciones genticas del laboratorio al campo. Se abordan temas como: principios para el establecimiento de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, tcnicas aspticas, cultivo de protoplastos, de meristemos, de embriones y polen, variacin somaclonal y transgnesis entre otros. El cultivo de tejidos vegetales puede ser definido como un grupo muy heterogneo de tcnicas que presentan en comn el hecho de que un explante se cultiva aspticamente en un medio artificial de composicin qumica definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. La historia del cultivo de tejidos, las necesidades bsicas de un laboratorio que se dedique a estas tcnicas, los medios nutritivos de cultivo e iniciaremos el estudio de la propagacin in vitro sern tratados en esta unidad. Adems, se estudiarn los diferentes sistemas de cultivo que existen para la micropropagacin vegetal como son el cultivo de anteras y polen, la obtencin de protoplastos, el cultivo de meristemos y el cultivo de vulos; tambin se tendr en cuenta la variacin que se da en los materiales sometidos a cultivo in vitro y las potencialidades de esta. Se revisarn las aplicaciones del cultivo de tejidos tales como la micropropagacin o clonacin in vitro de plantas, la obtencin de materiales mejorados mediante seleccin in vitro u otras tcnicas y la conservacin de germoplasma vegetal mediante criopreservacin o almacenamiento en condiciones de mnimo crecimiento, as como gracias a las tcnicas de ingeniera gentica, ha sido posible la transferencia directa de genes a las plantas. Las tcnicas de cultivo de tejidos vegetales se han convertido en unas herramientas imprescindibles para el mejoramiento de las plantas, y para lograr avances en fitopatologa, gentica, fisiologa y en otras disciplinas. Las tcnicas de regeneracin de plantas permiten la limpieza de plagas y enfermedades, la disminucin del tiempo necesario para 17

Justificacin

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produccin de nuevas variedades, la propagacin rpida de lneas superiores, la implementacin de bancos de germoplasma en pequeos espacios y a costos mnimos, as como la propagacin masiva de especies en peligro de extincin y la preparacin y puesta a punto de plantas para transformacin gentica, lo que ha contribuido significativamente al progreso de la agricultura. De esta manera se ha convertido en una herramienta clave para el buen desarrollo de la seguridad alimentaria mundial. Intencionalidades Formativas Entender el desarrollarlo de los mtodos en cultivo de tejidos, los avances que se han logrado en cuanto a la formulacin de medios nutritivos y la micropropagacin. Analizar los principales sistemas de cultivo de tejidos y clulas vegetales, y las consecuencias que acarrea el cultivo in vitro en las condiciones genticas de las plantas. Comprender las principales aplicaciones del cultivo de tejidos mostrando el aporte que estas tcnicas han dado para el desarrollo de la biotecnologa agrcola. Principios, metodologas y tcnicas Historia del cultivo de tejidos vegetales Consideraciones bsicas para el establecimiento y/o planeacin de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales Medios de cultivo Propagacin in vitro Callognesis Principios, metodologas y tcnicas 2 Cultivo de anteras y polen Obtencin y cultivo de protoplastos Cultivo de meristemos Cultivo de embriones y de vulos Variacin somaclonal Aplicaciones prcticas Bioestadstica aplicada al cultivo de tejidos vegetales

Denominacin de captulo 1 Denominacin de Leccin 1 Denominacin de Leccin 2

Denominacin de Leccin 3 Denominacin de Leccin 4 Denominacin de Leccin 5 Denominacin de captulo 2 Denominacin de Leccin 6 Denominacin de Leccin 7 Denominacin de Leccin 8 Denominacin de Leccin 9 Denominacin de Leccin 10 Denominacin de captulo 3 Denominacin de Leccin 11

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Denominacin de Leccin 12 Denominacin de Leccin 13 Denominacin de Leccin 14 Denominacin de Leccin 15

Cultivo de importantes Transgnesis

especies

econmicamente

Mejoramiento gentico Aplicaciones en bancos de germoplasma

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CONTENIDO DIDCTICO UNIDAD 2

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Nombre de la Unidad Introduccin

CULTIVO DE TEJIDOS ANIMALES En esta unidad se expondr el cultivo de tejidos desde el punto de vista del cultivo celular, estudiando las principales tcnicas y usos, finalizando con los ltimos avances en ingeniera de tejidos. Se tratarn temas como: cultivos primarios, mantenimiento de lneas celulares, hibridomas, cultivos en tres dimensiones, cultivos de alta densidad, lneas inmortales, tejidos artificiales. Los cultivos de clulas animales tienen aplicacin, como tcnicas nicas o complementarias de otras, en un gran nmero de lneas de investigacin. De esta forma han sido fundamentales para numerosos avances cientficos alcanzados en distintas ramas de las ciencias biomdicas y biolgicas. As por ejemplo, las tcnicas de cultivo celular permiten el estudio de las propias clulas, su metabolismo, el control del ciclo celular, la modulacin de la expresin gnica, el cultivo de virus, la clonacin y el estudio de numerosos aspectos relacionados con el cncer y su diagnstico, por citar slo algunos ejemplos. La ingeniera de tejidos es una disciplina de diseo y construccin de rganos y tejidos para restaurar la funcin de tejidos perdidos, basada en los principios de la biologa molecular del desarrollo y morfognesis, guiada por la bioingeniera. La ingeniera de tejidos es un rea multidisciplinaria que integra principios de ingeniera y de ciencias de la vida, para el desarrollo de sustitutos biolgicos, biomimticos o bioinspirados para la restauracin, reparacin, regeneracin, reemplazo, modificacin y ensamblaje de tejidos u rganos funcionales. Las tcnicas de cultivo de rganos y clulas animales han posibilitado el estudio de ciertos procesos celulares tales como: replicacin y transcripcin del DNA, sntesis proteica, metabolismo energtico, nutricin, infecciones virales, transformacin maligna, accin de drogas, toxicidad, secrecin de productos especializados, desarrollo embrionario, y para tcnicas de modificacin gentica, seleccin clonal, reconstruccin tisular, transgnesis entre otras, desde el mbito biomdico hasta la obtencin de especies y razas animales mejoradas.

Justificacin

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Intencionalidades Formativas

Conocer los antecedentes del desarrollo de los cultivos celulares y comprender las exigencias fisiolgicas necesarias para el establecimiento de cultivos de tejidos animales. Entender las principales limitantes en los cultivos celulares, los mtodos para su reconocimiento y cuantificacin, y analizar algunas de las aplicaciones del cultivo celular. Presentar la disciplina de la ingeniera de tejidos como una nueva rea de investigacin que an tiene mucho que aportar. Principios, metodologas y tcnicas 1 Introduccin a la tcnica del cultivo celular Medios de cultivo El laboratorio de cultivo de tejidos Tipos de cultivos Aislamiento de clulas para cultivo Principios, metodologas y tcnicas 2 Contaminacin Caracterizacin y Autenticacin Cuantificacin celular Transfeccin Clulas madre Cultivos celulares de insectos Ingeniera de Tejidos Materiales en ingeniera de tejidos Fundamentos de la ingeniera de tejidos Biomateriales Aplicaciones y perspectivas

Denominacin de captulo 4 Denominacin de Leccin 16 Denominacin de Leccin 17 Denominacin de Leccin 18 Denominacin de Leccin 19 Denominacin de Leccin 20 Denominacin de captulo 5 Denominacin de Leccin 21 Denominacin de Leccin 22 Denominacin de Leccin 23 Denominacin de Leccin 24 Denominacin de Leccin 25 Denominacin de Leccin 26 Denominacin de captulo 6 Denominacin de Leccin 27 Denominacin de Leccin 28 Denominacin de Leccin 29 Denominacin de Leccin 30

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CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

CAPITULO 1: Principios, metodologas y tcnicas 1

Introduccin El cultivo de tejidos vegetales puede ser definido como un conjunto muy heterogneo de tcnicas que presentan en comn el hecho de que un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser clulas, tejidos u rganos) se cultiva aspticamente en un medio artificial de composicin qumica definida y se incuba en condiciones ambientales controladas. En este captulo veremos la historia del cultivo de tejidos, las necesidades bsicas de un laboratorio que se dedique a estas tcnicas, los medios nutritivos de cultivo e iniciaremos el estudio de la propagacin in vitro.

Leccin 1: Historia del cultivo de tejidos vegetales Desde hace ms de 100 aos, en las investigaciones de fisiologa vegetal se ha utilizado la tcnica de cultivo de tejidos, rganos y clulas vegetales, que consiste en cultivar en medios nutritivos adecuados y en forma asptica, pices de raz y de tallo, primordios de hoja, primordios o partes inmaduras de flores, frutos inmaduros, rganos aislados, embriones maduros o inmaduros, segmentos de rganos de tallo y hoja y algunas veces ovarios, vulos, anteras y polen. Los primeros intentos en esta tcnica fueron realizados por Sacks (1860) y Knops (1861), quienes observaron que los principales nutrientes de las plantas superiores eran sustancias inorgnicas, y prepararon una solucin nutritiva que las contena. En 1922, Haberlandt y Kotte cultivaron pices radiculares de chcharo y maz en un medio enriquecido con sales orgnicas, glucosa, peptona, asparagina y varios aminocidos, partiendo de la idea de obtener condiciones alimenticias semejantes al del floema. Con la misma idea, Robbins (1922) enriquece el medio de cultivo con glucosa, agar y sales inorgnicas para el cultivo de pices radiculares de varias especies. El trabajo pionero fue el de White (1934) con cultivo de pices de raz de tomate (Licopersicum esculentum) en un medio lquido conteniendo sales inorgnicas, extracto de levadura y sacarosa, en donde obtuvo un crecimiento activo.
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1937 White descubre la importancia de la vitamina B para el crecimiento de las races, importancia que comparte con la auxina AIA (cido indolactico). Nobecourt y Gautheret en Francia, al igual que White en Estados Unidos (1939), reportan un crecimiento indefinido en tejido de raz, donde se observa la formacin de callosidades sembradas en un medio semislido. Caplin y Steward (1948) dieron a conocer el efecto tan pronunciado que ejerce la leche de coco en clulas aisladas de races de zanahoria, donde observaron crecimiento de clulas diferenciadas. Aos ms tarde, usando la leche de coco en combinacin con 2, 4D promueven la divisin celular en especies cuyo desarrollo fue muy difcil. Murashige y Skoog (1962) desarrollaron un medio nutritivo con el que lograron un crecimiento rpido en tejidos de tabaco. En la actualidad, las sales inorgnicas de ese medio de cultivo se usan con bastante xito en casi todas las especies. Desde el ao 1970 se ha realizado un gran nmero de investigaciones enfocadas a estudios de embriognesis, organognesis, hibridacin, diferenciacin, fitopatologa, citologa, mutagnesis, produccin de metabolitos secundarios y ms recientemente, estudios de transformacin gentica y mejoramiento asistido por marcadores moleculares.

Leccin 2: Consideraciones bsicas para el establecimiento y/o planeacin de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales En la planeacin y organizacin de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales deben tomarse en cuenta, principalmente, las condiciones de asepsia en las que se debe trabajar, as como su funcionalidad por lo cual se puede dividir en reas separadas segn las funciones que se desarrollen en el laboratorio (Figura 1.1). Un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales no es muy distinto de cualquier otro laboratorio de investigacin; la diferencia principal estriba en las condiciones de asepsia que se requieren, entendindose como asepsia el conjunto de mtodos destinados a preservar de grmenes infecciosos a los cultivos in vitro. Para lograr un buen control asptico en un laboratorio de este tipo, el trabajo debe realizarse en diferentes reas o salas separadas. En la sala de lavado se lleva a cabo la limpieza de la cristalera, que puede incluir adems de una lavadora de cristalera, una estufa u horno para el secado de la misma, o en su defecto un fregadero amplio. Debe tener agua caliente y fra, y es aconsejable que posea agua de muy buena calidad, puede ser de desionizador y/o destilador. En esta sala se puede instalar el autoclave para esterilizacin y tambin puede contar con un lavadero destinado solamente para el material contaminado, el cual se lleva a la zona de lavado una vez ha sido pasado por el autoclave de material contaminado.

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UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD Escuela de Ciencias Agrcolas Pecuarias y del Medio Ambiente Contenido didctico del curso Cultivo de Tejidos 203024 BAO OFICINA ALMACN LAVADO PREPARACION ESTERILIZACIN TRANSFERENCIA OBSERVACIN Y EXAMEN

TERAPIA Y CONTROL
FITOSANITARIO

INCUBACIN IN VITRO CRECIMIENTO IN VIVO (INVERNADERO) CRECIMIENTO IN VIVO (CASA DE MALLA)

CUARENTENA IN VIVO

Figura 1.1 Diferentes reas de un laboratorio de cultivo de tejidos. Fuente: Roca y Mroginski, 1993

En la sala de preparacin de medios y material vegetativo se prepararn los medios de cultivo que sern utilizados en las diferentes fases de desarrollo de los inculos, al igual que el material vegetativo del cual se tomar el inoculo seleccionado. Debe contar con espacio para gabinete, en los cuales se guardara el material de vidrio y de plstico adems de los reactivos. Debe contar con equipos como: balanza gramera y analtica, cronmetro, potencimeto (medicin de pH), refrigerador, congelador, e instalacin de gas. Tambin puede contar con incubadora o cmara de crecimiento. En la sala de siembra y diseccin se deben tener los mximos cuidados de asepsia, para lo cual se emplean cmaras de flujo laminar de aire (Figura 1.2), utensilios estriles, cubrebocas, cubrecabezas y aire filtrado en la sala; adems se debe contar con filtracin, microscopio estereoscpico, lupa con lmpara, instalacin elctrica, instalacin de gas, gabinetes, instrumentos de diseccin, lmpara de luz ultravioleta. Las cmaras de flujo laminar deben ubicarse en un lugar alejado de las puertas, con un mnimo de corriente de aire, para prolongar la vida til de los filtros. En la sala de incubacin deben tenerse muy en cuenta las instalaciones elctricas, pues las diferentes fases del crecimiento de los inculos necesitarn diferentes fotoperiodos, temperatura, intensidad lumnica, etctera. No deben faltar: Aire acondicionado y filtrado, control de temperatura, anaqueles para incubacin que preferentemente deben construirse en seis niveles, con 50 cm entre cada nivel. Es conveniente la colocacin de los balastros de los bombillos fuera de la sala, un reloj por nivel, termostatos separados para temperatura de da
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y de noche, apagado automtico de temperatura de emergencia para cada sala, lmparas de 2.4 m de longitud, cuando sea posible de luz fra o Gro Lux para 1 000 y 3 000 lux (usar 1 lmpara/60 cm de ancho del anaquel por 1 000 lux), lmparas Power Groove para 10 000 y 30 000 lux (usar 1 lmpara/60 cm de ancho del anaquel por 10 000 lux), y fotoperiodo programable. Esta rea debe contar tambin con un espacio para cultivos en agitacin y para cultivos estticos en oscuridad. Debido al calor generado, pueden necesitarse algunos ventiladores extra en el cuarto o sala. Las reas de siembre e incubacin idealmente son las ms alejadas de la entrada y flujo de personas para tratar de evitar contaminaciones.

Figura 1.2 Cmara de flujo laminar. Fuente: Pierik, 1993

En el almacn se guardan los reactivos y la cristalera en existencia. El material debe mantenerse en condiciones de baja humedad relativa y en un lugar no caliente y de preferencia oscuro. El rea de observacin y examen debe contar con microscopios, estereoscopios, lupas y el material o mobiliario necesario para realizar las observaciones peridicas de los cultivos, tanto en medios semislidos como en lquidos. Cuando el laboratorio se dedica a la produccin de material elite o produccin de material certificado, debe poseer el rea de cuarentena. En esta rea se debe proteger a las plantas de los insectos, debe estar separada de las dems reas pero cercana al rea de control fitosanitario. En el rea de control fitosanitario se realizan las pruebas (serolgicas, moleculares, biolgicas o microbiolgicas) necesarias para comprobar la sanidad vegetal, principalmente de las enfermedades causadas por virus, bacterias y hongos.

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Tambin conocida como rea de crecimiento, en el invernadero se lleva a cabo el endurecimiento de las plantas, el cual se puede realizar gradualmente en macetas o bandejas. Las condiciones del invernadero son importantes, pues es en este lugar donde las plantas se pueden recontaminar o sufrir daos por insectos, roedores, etctera. Lo ms adecuado e indispensable en un invernadero sera: Regulacin de luz, tanto en intensidad como en fotoperiodo, regulacin de temperatura, control de humedad, pisos de concreto, aire filtrado, exclusin de insectos (mosquiteros), sistema de nebulizacin, fertilizacin e irrigacin automtica, rea de almacenamiento para los implementos del invernadero, mezclas de suelos estriles. Tcnicas de esterilizacin y manipulacin aspticas En un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales las condiciones de esterilidad son de fundamental importancia porque todos los medios empleados contienen nutrientes, los cuales facilitan el crecimiento de muchas bacterias y hongos. El crecimiento abundante de ellos arruinara el crecimiento de los tejidos vegetales, el cual es mucho ms lento. Por lo tanto, el material vegetativo se desinfesta superficialmente antes de iniciar un cultivo in vitro, y todo el manejo de los tejidos se hace en condiciones aspticas en una cmara de flujo laminar de aire, en reas especficas para este propsito. Todos los medios, instrumentos y recipientes de cultivo deben esterilizarse para matar las clulas vegetativas, esporas y otras estructuras reproductivas de los microorganismos causantes de la contaminacin de los cultivos. El mtodo ms comn de esterilizacin es el de vapor hmedo, empleando autoclaves que actan con vapor a presin. En los laboratorios grandes las autoclaves son automticas o semiautomticas, elctricas o de gas, y las hay de tipo horizontal o vertical (Figura 1.3). Generalmente el tiempo empleado para una buena esterilizacin es de 15 minutos a una presin de 15 lb/in 2 (1 kg/cm2) y a una temperatura de 120-121C. Algunos constituyentes termolbiles del medio de cultivo, como vitaminas, reguladores de crecimiento, urea, etc., deben ser esterilizados empleando un filtro millipore, pues el tipo de membranas de estos filtros retiene a los microorganismos, logrndose un filtrado estril. El material vegetativo contiene en su superficie una abundante microflora que debe ser eliminada por medio de una desinfeccin antes del corte del inculo. En general se usan soluciones de hipoclorito, de calcio o de sodio, en concentraciones de 0.1 a 2 y 2 a 10%. Usualmente, antes de poner el material vegetativo en contacto con el agente desinfectante, se sumerge en etanol al 70% durante 30 segundos, con lo cual se eliminan las grasas de las hojas y se permite una mejor penetracin del agente. La mayora de los blanqueadores comerciales contienen un agente humectante, pero se recomienda emplear unas gotas de alguno de ellos como detergente lquido, por ejemplo "Tween". Los agentes

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desinfectantes son posteriormente eliminados por varios lavados con agua destilada y esterilizada. El trabajo se realiza en un rea estril, proporcionada por una cmara de flujo laminar de aire que se ubica en un rea independiente, y es esterilizada previamente con luz UV. Una cmara de flujo laminar es un receptculo en forma generalmente prismtica con una nica cara libre (la frontal) que da acceso al interior, donde est la superficie de trabajo. La esterilidad de la zona de trabajo se consigue al circular en el interior de la cmara una corriente de aire que ha sido microfiltrada. Para evitar que el aire del exterior pueda entrar en la cmara de flujo sin pasar previamente por los filtros, la presin interior es ligeramente superior a la presin exterior, con lo cual el aire siempre circula de dentro hacia fuera y nunca al revs. Existen dos tipos de cmaras de flujo laminar: cmaras de flujo horizontal y cmaras de flujo vertical. En las primeras el flujo se produce desde el fondo de la cmara hasta el frente, de forma que las partculas se mueven horizontalmente a la superficie de trabajo (Figura 1.9). En las segundas, el flujo se produce desde el techo hacia la superficie de trabajo de forma que las partculas se mueven perpendicularmente a ella.

Figura 1.3 Esquema de una cmara de flujo horizontal Fuente:


http://www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtual/Micropropa/Micvegetal.htm

Leccin 3: Medios de cultivo El crecimiento y desarrollo in vitro de una planta est determinado por factores complejos como la constitucin gentica de la planta, los nutrientes (agua, macro y micro-elementos, y azcares), los factores fsicos (luz, temperatura, pH, concentraciones de O2 y CO2) y algunas sustancias orgnicas como reguladores,
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vitaminas, etc. La constitucin gentica es un factor decisivo, pero no es uno los factores que puedan ser estandarizados en laboratorio. Los nutrientes son esenciales para el crecimiento y desarrollo de la planta y los factores fsicos influyen prcticamente en todo tipo de procesos: absorcin de agua, evaporacin, fotosntesis, respiracin, crecimiento, floracin, etctera. El cuarto factor son las sustancias orgnicas al que pertenecen los reguladores. Los reguladores, en particular las auxinas y citocininas, regulan el desarrollo de los rganos (regeneracin) sobre partes de plantas (explantes), cultivados in vitro. La regulacin del crecimiento y desarrollo de una planta es un proceso complicado, que depende del genotipo y del medio ambiente, y las interacciones entre genotipo, nutrientes, reguladores y factores ambientales. Un explante, aislado in vitro que crece y se desarrolla, necesita muchas sustancias (figura 1.4). Las sustancias orgnicas, y mezclas poco definidas y extraas de sustancias que las plantas necesitan in vitro, no son necesarias en el cultivo in vivo, es decir, una planta in vitro es hetertrofa.

Figura 1.4 Sustancias que se aaden con frecuencia a los medios de cultivo para inducir el crecimiento y desarrollo vegetal. Fuente: Pierik, 1993

En trminos bsicos, para el cultivo in vitro se necesitan: agua, macro y micro-elementos, azcar como fuente de carbono, y frecuentemente dos grupos de reguladores (auxinas y citocininas). En la actualidad los medios nutritivos se hacen casi siempre a partir de una mezcla de sustancias sintticas. La eleccin de un medio depende de la especie con la que se trabaja, la edad de la planta, la edad del rgano, el tipo de rgano que se cultiva, entre otros. Cuando las necesidades nutritivas de una planta no son conocidas, se puede utilizar la mezcla
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de macro- y micro-nutrientes de Murashige y Skoog (1962), siempre que la planta no sea sensible a una alta concentracin salina. Composicin Agua. Representa el 95% del medio, debe ser destilada, y en el caso de trabajar con protoplastos, clulas o meristemos, se debe utilizar agua bidestilada. Para asegurarse de que se produce un agua destilada de buena calidad, y de forma eficaz, se debe limpiar el aparato de destilacin de forma peridica, para evitar los depsitos sobre las paredes, antes de su uso el destilador debe aclararse con agua desionizada. En los ltimos aos se ha utilizado tambin agua purificada por osmosis inversa; este sistema se combina con otros mtodos como desionizacin, destilacin y filtracin. El mejor lugar para almacenar el agua son recipientes de polietileno. Gelificantes. Cuando se trabaja con medios semislidos, debe utilizarse un gelificante para darle la consistencia adecuada. Este debe ser no reactivo y no digerible por el tejido vegetal. Los gelificantes ms utilizados son el agar y el Gelrite (marca comercial de Merk). El agar es un derivado de un alga marina que aunque se trata de un producto natural, se lava y purifica durante su elaboracin. Generalmente se utiliza a una concentracin de 0,6-0,8%. Cuando se cultivan protoplastos o clulas aisladas se utiliza un agar de gran pureza como la agarosa. El Gelrite es un agente gelificante altamente purificado. Se puede usar a una concentracin de aproximadamente la mitad de la que se usa para el agar; para el cultivo de tejidos vegetales se recomienda una concentracin del 0,2%. Fuente de carbono. Los tejidos in vitro tienen una capacidad fotosinttica muy baja o nula, por lo que se les debe proveer de una fuente de carbono orgnico. Generalmente se usa una concentracin de 1-5% de sacarosa. Tambin se pueden utilizar glucosa y fructosa. La sacarosa (azcar) que se vende en los supermercados resulta generalmente adecuada pues se trata de un producto purificado. La sacarosa adems de servir como fuente de carbono, tiene un papel importante como regulador osmtico del medio de cultivo. Nutricin mineral. Despus de los azcares, los minerales constituyen el grupo ms importante de sustancias nutritivas en el cultivo in vitro. Existe una gran cantidad de posibilidades para las mezclas de macro y micronutrientes, siendo uno de los ms usados el de Murashige y Skoog (1962). Los macroelementos que pueden ser incluidos en los medios son N, P, K, Ca, Mg, S, y microelementos son Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I, que deben estar en una proporcin adecuada segn la planta elegida. Generalmente se utilizan soluciones madre concentradas para la preparacin de los medios nutritivos, las cuales se deben almacenar a temperatura ambiente en la oscuridad.

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Vitaminas. Se pueden usar dos vitaminas, la tiamina (vitamina B1) que parece ser la nica realmente necesaria para el desarrollo de las plantas, y el mioinositol (una vitamina B). Otro factor que se debe tener en cuenta es el pH. Se supone que el pH en el rango 5,0-6,5 es apto para el crecimiento, con un mximo alrededor de 6,0. El pH vara con el autoclavado, si se parte de un pH en el rango 5,0-7,0, generalmente sufre un descenso de 0,3-0,5 unidades. Preparacin Los medios nutritivos se deben preparar como se indica a continuacin: Se coloca un matraz sobre la unidad calefactora. Si se quiere preparar 600 ml de medio nutritivo, se deben calentar 550 ml de agua. Se aade la cantidad de azcar necesaria (mientras se realiza esta operacin, se debe retirar el matraz de la manta calefactora). Aadir los macro y micro-nutrientes y luego las auxinas y/o citocininas u otros componentes. Mezclar las sustancias bien, hasta su completa disolucin y hacer hervir el medio. Aadir el agar necesario, utilizando un embudo, teniendo cuidado de que despus de cada adicin no se formen grumos o espuma. Tambin se puede mezclar previamente en un vaso, el agar con agua fra, y posteriormente aadir esta mezcla al medio. El agar no se debe aadir al agua, cuando sta est hirviendo, ya que, en este caso, se puede producir un recocido del medio de efectos negativos. Se ajusta el pH (con papel tornasol o potencimetro) y se lleva al volumen final. Con este medio se llenan los recipientes elegidos. Reguladores de crecimiento vegetal El trmino "regulador del crecimiento vegetal", define a los compuestos orgnicos distintos de los nutrientes, que en pequeas cantidades estimulan, inhiben o modifican procesos fisiolgicos en las plantas. El crecimiento en las plantas es un proceso dinmico, complejo y est rigurosamente controlado; actualmente se reconoce que la mayor parte (si no la totalidad) de la actividad fisiolgica de las plantas est mediada por los reguladores del crecimiento, los cuales son sustancias mensajeras, la mayora de las veces activas en muy pequeas cantidades, y que pueden influir en mltiples procesos, totalmente distintos al mismo tiempo y en partes diferentes de la planta. Los reguladores de crecimiento vegetal se clasifican en cinco tipos bsicos dependiendo de su estructura qumica y su efecto fisiolgico: los promotores del crecimiento incluyen a auxinas, citocininas y giberelinas; los inhibidores del crecimiento como el cido abscsico; y el etileno. Tambin se han aislado y estudiado otras substancias, que podran ser consideradas como reguladores, como por ejemplo las poliaminas, jasmonatos, cido saliclico y los brassinoesteroides.

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Auxinas. Las auxinas son un grupo de compuestos derivados comnmente del triptfano, sintetizados por generalmente por los pices, y estn implicados en varios eventos relacionados al crecimiento y diferenciacin celular. En muchos casos, estas otras sustancias son ndoles, muy relacionados qumicamente con el AIA (cido indol actico). De forma natural, las concentraciones ms altas de auxinas se encuentran en los pices de crecimiento. Se ha comprobado que las auxinas actan de modo diverso en el crecimiento por alargamiento celular, como es incrementando el contenido osmtico de la clula y la permeabilidad al agua, reduciendo la presin de la pared o aumentando la sntesis de RNA, protenas especficas (enzimas) y aun de la misma pared, lo que provoca un aumento en la plasticidad de la pared celular, que trae como consecuencia su extensin y con ello un crecimiento por alargamiento. Actualmente se conocen y utilizan varios compuestos sintticos con actividad auxnica, como los cidos fenoxiacticos, que son utilizados como herbicidas. Otro ejemplo de auxina artificial es el 2,4diclorofenoxiactico (2,4-D), el cido naftalenactico (ANA) y el cido 4-amino3,5,6-tricloropiridin-2-carboxlico (Picloram). Citocininas. Las citocininas generalmente son derivados de la adenina y son sintetizadas en tejidos jvenes y races. Poseen dos propiedades tiles en el cultivo de tejidos vegetales: estimulan la divisin celular y rompen la latencia de las yemas axilares hacindolas brotar. Las citocininas, combinadas con auxinas, estimulan la divisin celular en plantas, interactuando en la determinacin de la ruta que seguir la diferenciacin celular. Las respuestas que pueden esperarse de un tejido ante un balance de auxinas/citocininas se muestra en la figura 1.5, pero pueden presentarse variaciones notables entre especies y tejidos. En general, las citocininas estn ampliamente difundidas en las plantas. Las citocininas naturales ms comunes son la zeatina, la isopentiladenina (2iP) y el ribsido de zeatina. Las citocininas sintticas benciladenina (BA) y cinetina (6furfuril-aminopurina) son las ms utilizadas en los cultivos in vitro.

Figura 1.5 Respuestas generadas en los cultivos in vitro por las auxinas y citocininas. Fuente: Martin et al, 1999

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Giberelinas. Las giberelinas son un grupo de reguladores del crecimiento, formadas de diterpenos. La primera giberelina purificada y estructuralmente identificada fue el cido giberlico (GA3); posteriormente se han aislado todas las dems (ms de 40), tanto de plantas superiores como de hongos. Las giberelinas se encuentran presentes en muchas partes de las plantas, pero se encuentran principalmente en las reas de crecimiento activo, como en embriones o tejidos meristemticos. La elongacin producida por las giberelinas no es igual a la producida por las auxinas, ni actan de la misma forma en diferentes partes de la planta. Pero se pueden obtener resultados sinrgicos al hacer aplicaciones de los dos reguladores al mismo tiempo. En la tabla 1.1 se realiza una comparacin de los principales efectos producidos por estos reguladores de crecimiento.

T ABLA 1.1 COMPARACIN DE EFECTOS ENTRE AUXINAS Y GIBERELINAS

EFECTOS PRINCIPALES
Transporte polar Estimula la formacin de callo Estimula el alargamiento celular Estimula la iniciacin radicular Retarda la abscisin foliar Estimula el crecimiento de plantas de tipo enano Estimula la germinacin de las semillas Inhibe las yemas laterales Induce partenocarpia en frutos Fuente: Hurtado, 1987.

AUXINAS
S S No S S No No S s

GIBERELINAS
No No S No No S S No s

cido abscsico (ABA). Es un compuesto derivado del cido mevalnico y se caracteriza por inhibir muchos fenmenos de crecimiento en las plantas superiores. La biosntesis del ABA tiene lugar en frutos, semillas, races, hojas y tallos. Este regulador est implicado en numerosos procesos de gran importancia en el desarrollo de los vegetales, como: regulacin de la apertura estomtica, dormicin de yemas y semillas, abscisin de hojas y frutos, inhibicin de la sntesis de RNA y protenas, inhibicin del crecimiento de muchas partes de la planta (hipoctilos, radculas, hojas, races, etc).
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Leccin 4: Propagacin in vitro Propagacin clonal in vitro Actualmente el cdigo oficial de la nomenclatura de las plantas cultivadas define la palabra clon como: "un conjunto genticamente uniforme de individuos (que pueden ser de naturaleza quimrica) originalmente derivados de un solo individuo mediante propagacin asexual; por ejemplo, por medio de estacas, divisiones, injertos o apomixis obligada. Los individuos propagados a partir de la mutacin perceptible de una yema forman un cultivar diferente de la planta progenitora". Existen varias vas generales para realizar la multiplicacin clonal, entre ellas estn: Multiplicacin de brotes de yemas terminales, axilares o laterales. La organognesis directa. Formacin de brote adventicio o de raz en el explante de un rgano extrado de una planta. La organognesis indirecta. La formacin del brote adventicio o de la raz ocurre en este caso en el callo. La embriognesis somtica. Los embriones pueden formarse directamente en explante primario, o indirectamente de las clulas cultivadas en suspensin o en un medio semislido Los rganos de perennidad, formados en cultivos aspticos. Como microtubrculos en papa y ame. El microinjerto El cultivo de embriones y esporas

En la figura 1.6 se muestra esquemticamente algunas de estas vas y tambin puede apreciarse que la respuesta de un tejido al cultivo in vitro depende de la interaccin entre el explante, el medio y las condiciones del cultivo. La propagacin in vitro se puede dividir en cinco etapas, que pueden sobrelaparse entre s, las cuales son: iniciacin o establecimiento, multiplicacin (de brotes), enraizamiento, endurecimiento (adaptacin paulatina a condiciones de invernadero), y etapa inicial, que comprende la seleccin de la planta madre y la seleccin de una modalidad de pretratamiento para volver funcional la estrategia que se adopte.

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Figura 1.6 Principios del cultivo de tejidos y algunas vas de multiplicacin clonal. Fuente: Martin et al, 1999

Micropropagacin El concepto original de cultivo de tejidos vegetales se ha extendido modernamente para abarcar tanto el cultivo asptico de tejidos como el de clulas y rganos, dentro de un grupo de tcnicas que se fundamentan en varios principios. Entre estos principios, los ms importantes son la plasticidad y la totipotenciaIidad celular. Las plantas deben adaptarse a muchas condiciones ambientales, debido a su naturaleza ssil y sus largos tiempos de vida. Esta plasticidad les permite a las plantas modificar su metabolismo y desarrollo de acuerdo a las necesidades impuestas por el ambiente. Es as como tienen la capacidad de iniciar divisin celular en cualquier tejido (a partir de unas pocas clulas o una pequea parte del tejido), y regenerar rganos completos. Se llama explante al rgano, tejido o segmento de tejido vegetal que va a ser utilizado para iniciar un cultivo. Existen diferentes factores que determinan el xito en los sistemas de micropropagacin, como son la eleccin del explante, la eleccin del medio y condiciones del cultivo y las condiciones aspticas. El estado
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fisiolgico de la planta que dona el explante (planta madre) influye significativamente en su capacidad morfogentica. Asimismo, se ha observado que la edad fisiolgica del explante tiene gran influencia en la morfognesis. Se sabe que mientras ms joven y menos diferenciado est el tejido que se va a sembrar, mejor ser la respuesta in vitro. El medio de cultivo junto con el explante determinarn las respuestas que se obtendrn del mismo, por lo cual es un paso muy importante la eleccin del medio ms adecuado. Tambin es crucial considerar las condiciones fsicas del cultivo (luz, fotoperiodo, temperatura y humedad) pues contribuyen a la respuesta que se obtenga del explante.

Leccin 5: Callognesis Se le denomina tejido calloso a una masa amorfa de clulas vegetales poco diferenciadas y de rpida proliferacin. En condiciones naturales este tejido aparece como un mecanismo de cicatrizacin cuando se presentan heridas o en tumores (agallas) inducidos por organismos fitopatgenos. La aparicin natural de tejido calloso se da como consecuencia de un cambio en los niveles endgenos de reguladores del crecimiento, principalmente auxinas y citocininas. Se puede definir el callo en cultivo de tejidos como un tejido obtenido por medio del aislamiento de rganos o tejidos diferenciados, los cuales posteriormente son llevados a una desdiferenciacin celular, presentando estas clulas una proliferacin continua, acelerada y de apariencia desorganizada, que da origen a una masa amorfa de tejido. Esta masa celular puede presentar diferentes tipos morfolgicos, los cuales varan segn la apariencia externa, textura y composicin celular, pero por lo general son heterogneos en su composicin celular. La coloracin de este tejido tambin vara, aun derivando de la misma especie (se pueden presentar callos que carecen de pigmentacin, mientras otros pueden ser de diferentes tonos de verde, amarillo, caf o rojo) (figura 1.7). El tipo y grado de pigmentacin est influenciado por factores nutricionales y ambientales, y se manifiesta por la presencia de clorofila, carotenos, antocianinas, etc.

Figura 1.7 Callos de crisantemo. A. Callo amarillo embriognico. B. Callo friable blanco. C. Callo friable rojo. D. Callognesis y caulognesis. Fuente: Teixeira da Silva y Fukai, 2003.

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El callo est generalmente constituido por una alta proporcin de clulas en las que las vacuolas son predominantes, similares a las clulas del parnquima; el callo tambin contiene pequeas zonas de clulas en divisin. Estas zonas de divisin de clulas diferenciadas o desdiferenciadas generalmente se presentan dando origen a las masas amorfas de tejido aparentemente desorganizado. Una de las propiedades importantes del tejido calloso es la llamada friabilidad, esta se puede definir, como la tendencia de las clulas a separarse unas de otras, por cual un callo friable es aquel que se disgrega con facilidad. Desde el punto de vista morfognico, la caracterstica ms importante del callo es la totipotencialidad de sus clulas, ya que, en general, con un manejo adecuado de las condiciones nutricionales, hormonales y ambientales, tienen la capacidad de desarrollar brotes, races, embriones, etc., los cuales pueden llegar a formar plntulas completas. Un serio problema asociado con este tejido es el dao o modificacin de la citologa nuclear de las clulas durante el cultivo. Se pueden presentar aberraciones cromosmicas, mutaciones puntuales y diferentes tipos de ploidas, as como irregularidades cariocinticas. Estas anormalidades generalmente se incrementan conforme aumenta la edad de cultivo, adems de que la proporcin con la que se presentan tales cambios est relacionada con la composicin del medio y con la especie vegetal con la que se est trabajando; sin embargo, los cambios cromosmicos pueden ocurrir a partir del inoculo inicial. Esta inestabilidad cromosmica es el obstculo principal en la utilizacin del callo en estudios de gentica y fitomejoramiento vegetal. Induccin del tejido calloso La induccin del callo a partir de una porcin vegetal sucede cuando el inoculo ya estril se pone en contacto con un medio de cultivo que induzca y mantenga un crecimiento y una divisin celular continuas. Dependiendo del inoculo, la proliferacin del callo se puede iniciar casi a partir de cualquier rgano vegetal (hoja, raz, polen, embriones, semillas, etc.) o sus partes. En general, los callos derivados de embriones y plntulas tienen un mayor potencial para la morfognesis. Tambin es importante el estado fisiolgico y la edad de la planta donadora del callo, siendo recomendable utilizar plantas jvenes y con crecimiento activo, aunque se pueden obtener buenos resultados con plantas adultas. El tamao y la forma del inoculo generalmente no son cruciales, aunque es recomendable utilizar fragmentos de tejidos que contengan gran nmero de clulas (5.0 a 10.0 mm2), pues con ello se incrementa la posibilidad de xito en el cultivo. Por s mismos los vegetales tienen un potencial endgeno para la formacin del callo, pues en su medio natural, al sufrir una lesin en un rgano, sta es reparada por este tejido. De especie a especie se presenta una variacin en esta
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capacidad, misma que se refleja en la respuesta in vitro a la induccin del callo, encontrndose as tejidos para los que la induccin del callo necesita de una auxina o un regulador del crecimiento relacionado; otros requieren slo una citocinina o un suplemento, tanto de auxina como de citocinina, o bien, slo responden en presencia de extractos de complejos naturales en el medio. En general, las auxinas y los reguladores del crecimiento ms usados en la iniciacin y mantenimiento del cultivo de callo son el cido indol-3-actico (AIA), cido naftalen actico (ANA) y el cido 2, 4-diclorofenoxiactico (2,4-D), encontrndose para cada especie, una auxina o un regulador del crecimiento y una concentracin ptima para la induccin y mantenimiento del callo. Mantenimiento del tejido calloso Por lo general, el callo toma de 3 a 8 semanas para alcanzar el tamao suficiente para efectuar un subcultivo, transfirindose en ste pequeas piezas de tejido (50 a 150 mg) a medio nuevo. Es importante transferir fragmentos de tejido visiblemente sano (sin contaminacin por hongos ni bacterias, sin necrosis, etc.), y cuando est establecido, es necesario cambiarlo a medio nuevo con una frecuencia que vare de 2 a 6 semanas, ya que la falta de transferencia lleva irremediablemente al debilitamiento, intoxicacin y muerte del tejido. Esto es debido a que el crecimiento y la multiplicacin celular son tan intensos que provocan el gasto de los nutrientes del medio, y la acumulacin de metabolitos de desecho celular puede llegar a ser tan alta que se vuelven txicos para el tejido. Un callo puede formar brotes, races, embrioides, etc., o simplemente continuar proliferando como callo, dependiendo de las cantidades relativas de auxinas y citocininas suministradas. Cuando la proporcin de citocininas con respecto a las auxinas es mayor se inician yemas de brote. Proporciones similares de los dos grupos hormonales pueden producir el incremento del callo; un balance a favor de las auxinas inducir el inicio de primordios radiculares. Esto es norma general, pero no siempre se cumple. Por otra parte, los efectos sinergticos de las hormonas pueden ser modificados por otros factores, como son los constituyentes del medio (azcar, vitaminas, aminocidos, etc.) y las condiciones fsicas (iluminacin, consistencia del medio, etc.), aunque siempre se manifestar como factor dominante el balance hormonal. El cultivo del callo se puede dividir en las etapas siguientes (figura 1.8): a) Induccin, donde las clulas del inculo inicial comienzan su crecimiento. b) Proliferacin celular y aumento de masa celular. c) Induccin de la diferenciacin, donde se obtienen meristemos, tanto apicales como radiculares, embrioides, tejido vascular, etc.
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d) Envejecimiento y prdida de la capacidad de crecimiento acelerado.

Figura 1.8 Representacin esquemtica del cultivo de callo. Fuente: Pierik, 1993 (modificado)

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CAPITULO 2: Principios, metodologas y tcnicas 2

Introduccin La utilizacin de cultivos de tejidos in vitro tiene aplicaciones en estudios bsicos de fisiologa, gentica, bioqumica, produccin de compuestos tiles, incremento de la variabilidad gentica, propagacin, obtencin de plantas libres de patgenos y conservacin de germoplasma. Es necesario conocer las metodologas por las cuales se pueden realizar estas actividades, teniendo en cuenta que la eleccin del tipo de explante y el sistema de cultivo que se emplee son factores cruciales. En el presente capitulo continuaremos estudiando los diferentes sistemas de cultivo que existen para la micropropagacin vegetal como son el cultivo de anteras y polen, la obtencin de protoplastos, el cultivo de meristemos y el cultivo de vulos; tambin se tendr en cuenta la variacin que se da en los materiales sometidos a cultivo in vitro y las potencialidades de esta.

Leccin 6: Cultivo de anteras y polen Una de las aplicaciones ms interesantes del cultivo de tejidos vegetales es la generacin de plantas haploides mediante el cultivo de anteras y polen mediante la induccin de la embriognesis a partir de microesporas o de granos de polen inmaduros. Al contener la mitad del nmero cromosmico, las plantas haploides pueden emplearse en programas de fitomejoramiento para seleccionar caractersticas deseables, o bien, para desarrollar lneas homocigticas para la produccin de hbridos en especies incompatibles entre s. Los granos de polen de las angiospermas son el producto del proceso llamado microesporognesis, que abarca toda la secuencia del desarrollo, desde la clula madre hasta la maduracin del grano de polen. Para la obtencin de plantas haploides pueden utilizarse como explantes las anteras completas o bien las microsporas aisladas. Existen diferentes factores que determinan la respuesta de estos tejidos as como la eventual regeneracin de plantas a partir de ellos. En cuanto al estado fisiolgico y edad de la planta donadora de las anteras o microsporas, las plantas madre deben ser vigorosas y estar libres de cualquier tipo de estrs ambiental o problema fitopatolgico. Salvo en muy raras ocasiones, el polen maduro no responde al cultivo, por lo que debe ser colectado en cierto estadio de desarrollo antes de su maduracin. Por lo general el polen colectado durante la primera divisin mittica de las microsporas uninucleadas es el que tiene una mayor capacidad de desarrollo in vitro. Se recomienda as mismo realizar un pretratamiento, el ms recomendable es con fro, es decir, colocar los botones a 5-8C por 7-10 das. Este tratamiento con fro
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tiene un efecto sincronizador en el desarrollo del polen lo cual resulta benfico al momento de obtener el cultivo. Para la induccin de la embriognesis pueden cultivarse directamente las anteras aisladas en un medio con agar o en un medio lquido, provocndose la embriognesis dentro de la antera, o puede aislarse el polen de la antera, mecnica o naturalmente, y se cultiva en un medio lquido. Las plntulas haploides emergen de las anteras cultivadas entre tres y ocho semanas despus. En la figura 1.9 se muestra el procedimiento general para la obtencin de plantas haploides o dihaploides. Se ha establecido que la clula generativa es la ms importante para la andrognesis. Es importante determinar el nmero cromosmico de las nuevas plantas formadas, ya que dependiendo del desarrollo que haya conducido a la formacin de embrioides puede existir una variacin considerable en los niveles de ploida. Se pueden originar plantas diploides heterocigticas a partir de tejido de antera o a partir del desarrollo de las clulas madre de la microespora.

Figura 1.9 Proceso general para la obtencin de plantas haploides o dihaploides. Fuente: Martin et al, 1999.

Leccin 7: Obtencin y cultivo de protoplastos El protoplasto es la unidad homeosttica bsica de la clula en la que no est involucrada la pared celular (Figura 1.10). El aislamiento y fusin de protoplastos es importante en el cultivo de tejidos vegetales, ya que permite
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estudios de fitomejoramiento y de hibridacin somtica, as como estudios bsicos de embriologa vegetal. Una de las caractersticas que hacen importante el cultivo de protoplastos es que, por estar aislado del conjunto de clulas, cada protoplasto puede ser usado como un sistema celular individual. Los protoplastos han sido aislados a partir de mltiples especies y de casi todas las partes vegetales, siendo la mejor fuente las hojas en estado juvenil y con un crecimiento activo.

Figura 1.10 Protoplastos aislados de Arabidopsis thaliana Fuente: http://genetics.mgh.harvard.edu/ausubelweb/labmembers/index.html

La operacin fundamental en el aislamiento de los protoplastos es la remocin de la pared celular sin causar dao. Para ello existen en la actualidad dos mtodos, el mecnico y el enzimtico. En el mtodo mecnico se sumerge el tejido en una solucin hipertnica, provocando plasmlisis, se secciona el tejido y se liberan los protoplastos. As se evita el dao metablico causado por el uso de enzimas, pero se obtiene una cantidad pequea de protoplastos, adems de que se segregan desechos citoplsmicos de las clulas daadas por el corte. El procedimiento ms usado para aislar protoplastos es el mtodo enzimtico, y consiste en tratar al tejido con una mezcla de enzimas degradantes de la pared, que en general son celulasas, hemicelulasas y pectinasas, con estabilizadores osmticos. Presenta varias ventajas como son la de obtener un mayor nmero de protoplastos por unidad de tejido y el impedimento de que las clulas se rompan, como sucedera con el mtodo mecnico, con lo cual se evita la intoxicacin causada por los desechos de la degradacin celular. Despus del aislamiento los protoplastos son suspendidos en medios de cultivo apropiados (generalmente lquidos) para mantener su viabilidad e integridad estructural. Estos medios de cultivo estn constituidos por los mismos elementos que los cultivos celulares normales; sin embargo, es necesario adicionarles estabilizadores osmticos, como azcares alcohlicos (manitol y/o
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sorbitol). En la figura 1.11 se presenta un mtodo general para el aislamiento y cultivo de protoplastos.

Figura 1.11 Procedimiento para aislar y cultivar protoplastos Fuente: Martin et al, 1999

Los protoplastos son muy utilizados en una tcnica denominada fusin de protoplastos en donde se produce un hbrido somtico cuando se fusionan las membranas de dos o ms clulas. Se puede dar por fusin espontnea, que se presenta durante la fase de aislamiento, pudiendo presentarse clulas alodiploides aun antes de la fusin inducida, y se presenta cuando el aislamiento se efectu durante el proceso de divisin, siendo ms probable cuando stos provienen de cultivos celulares con una divisin rpida. La fusin inducida por su parte requiere de un agente inductor, como nitratos, mezclas de sales, soluciones de polietilnglicol, gelatina, fosfolpidos, etc. Una de las razones por las que los protoplastos libres en el medio no se fusionan es la polaridad de la membrana, por lo que existe una repulsin entre clula y clula. Un requerimiento primario para la fusin es la reduccin de este rechazo para que los protoplastos se acerquen entre s y las membranas celulares entren en contacto ntimo. De todos los agentes inductores de la fusin, el polietilnglicol (PEG) es el ms usado, e induce, en altas concentraciones, una adhesin tan fuerte de agregados celulares que estas clulas pierden su forma esfrica, aprecindose alargadas y constreidas.

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Las clulas hibridas obtenidas de la fusin pueden ser cultivadas e inducidas a la divisin, regenerndose plantas a partir de ellos. Pero debido a que las clulas verdaderamente hbridas crecen mezcladas con las dems clulas, es necesario valerse de herramientas genticas y/o de biologa molecular para identificarlas. La tcnica de fusin de protoplastos fue muy prometedora en sus comienzos, pero fue desplazada por las tcnicas de ingeniera gentica que permiten la transferencia de material gentico con mayor control. An as, el aislamiento y cultivo de protoplastos sigue siendo un campo importante dentro del cultivo de tejidos vegetales.

Leccin 8: Cultivo de meristemos En los primeros estadios del desarrollo embrionario vegetal la divisin celular tiene lugar en todo el organismo, pero a medida que el embrin se desarrolla y se transforma en una planta adulta la adicin de nuevas clulas se restringe a ciertas partes de la misma, mientras que el resto de la planta se especializa en otras actividades especficas. Estos grupos de clulas que retienen su actividad embrionaria durante toda la vida de la planta se denominan meristemos. Los meristemos incluyen meristemos de raz, de tallo (principales y laterales) e intercalares, as como tambin el engrosamiento de meristemos primarios y meristemos secundarios, como lo son el felgeno y el cambium. El meristemo apical de tallo da lugar a diversos tipos de clulas, tejidos y rganos. Los meristemos apicales han sido los inculos ms efectivos para la produccin de plantas completas en una amplia gama de cultivos econmicamente importantes. Si se cultivan en un medio adecuado, los meristemos pueden regenerar plntulas completas ms rpidamente que los tejidos de otras fuentes; las plantas regeneradas usualmente retienen las caractersticas genticas de los progenitores, lo que se debe a la naturaleza diploide de las clulas meristemticas. Adems, dado que los meristemos son tejidos no diferenciados, entonces el paso de desdiferenciacin celular se obvia en estos casos y se va directamente a la diferenciacin celular (figura 1.12). Algunas de las ventajas de este tipo de cultivo son: - Es un sistema ideal para la propagacin clonal, pues ofrece la mxima estabilidad gentica. - El sistema es relativamente sencillo y muy similar en todas las especies vegetales y no requiere demasiada experimentacin para hallar las condiciones adecuadas, sin embargo el crecimiento puede ser lento. - Al combinarlo con otras tcnicas (termo o quimioterapia) permite la obtencin de plantas libres de patgenos.
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Es el sistema ideal para la conservacin in vitro de germoplasma. Y algunas de las principales desventajas son:

- Alta sensibilidad a la esterilizacin superficial, donde los tejidos pueden resultar lesionados. - En las plantas leosas, los meristemos producen gran cantidad de compuestos fenlicos que pueden afectar el medio y las condiciones de cultivo. Se puede presentar vitrificacin.

Figura 1.12 Sistema de propagacin por cultivo de meristemos o yemas Fuente: Martin et al, 1999

El cultivo de meristemos se ha empleado ampliamente por propagadores comerciales, debido al potencial morfogentico que tienen los meristemos y otros tejidos de la planta en la produccin masiva de brotes de especies econmicamente importantes. La multiplicacin masiva produce material vegetal in vitro por la iniciacin de brotes adventicios, bulbos, tubrculos, embriones asexuales o por crecimiento de brotes de yemas axilares a partir de meristemos. En muchas especies es deseable producir plantas libres de virus, hongos y bacterias, para ser liberadas comercialmente, lo cual puede lograrse con tratamientos con calor de varios rganos in vitro, o de plantas compuestas, as como con la aplicacin de productos qumicos. Actualmente la alternativa de ms
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xito es el cultivo de meristemos apicales combinada con termoterapia, o aplicacin de altas temperatura, y la quimioterapia, o aplicacin de productos qumicos al medio de cultivo. En la figura 1.13 se muestra un esquema representativo de cmo se puede llevar a cabo un programa de produccin de plantas libres de virus a nivel comercial. La seleccin de la planta madre es muy importante, ya que las plantas que se van a obtener son idnticas al progenitor (propagacin asexual). Si la planta madre se encuentra enferma, sera deseable conocer el virus especfico presente, pues as las condiciones de cultivo varan, aplicndose termoterapia, quimioterapia o simplemente cultivo de meristemos. El tamao del inoculo tambin es importante, pues se tienen meristemos que miden de 0.01 a 0.1 mm de dimetro, y pices de tallo que miden de 0.1 a 3.0 mm de dimetro; generalmente el nmero de plntulas libres de virus producidas es inversamente proporcional al tamao del meristemo o pice cultivado.

Figura 1.13 Produccin de plantas libres de virus a partir de cultivo de meristemos. Fuente: Hurtado, 1987. (modificado)

Leccin 9: Cultivo de embriones y de vulos El cultivo de embriones consiste en el aislamiento y crecimiento, in vitro, en condiciones estriles, de un embrin inmaduro, con el fin de obtener una planta viable (Figura 1.14). Existen dos tipos de cultivo de embriones. El cultivo de embriones inmaduros que se originan en semillas no acabadas de madurar, y que se utiliza sobre todo para impedir el aborto embrionario (muerte prematura del embrin), y obtener una planta viable. Este tipo de cultivo es difcil, en parte porque se necesita una ardua diseccin, y tambin porque se necesita un medio
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nutritivo complejo. El cultivo de embriones maduros que se encuentran en semillas maduras es un tipo de cultivo relativamente fcil, y se utiliza para eliminar la inhibicin de germinacin de las semillas. Suele ser suficiente en estos casos el uso de un medio nutritivo simple, con agar, azcar y minerales. Debido a que los embriones son a veces difciles de diseccionar se pueden realizar cultivos de ovario o de vulos, cuyo medio de cultivo es mucho menos complicado que el que se necesita para el cultivo de embriones. Recientemente se ha introducido el trmino ms general, de cultivo de embriones en vulos, en lugar de cultivos de vulo, ovario y vulo fertilizado.

Figura 1.14 Cultivo de embriones de cebada y de palma Fuente: Pierik, 1993 y http://www.cesaf.uchile.cl/cesaf/n11/2.html

Los factores de los que depende el desarrollo de una planta viable, a partir de un embrin, incluyen: 1. Genotipo y estado de desarrollo del embrin en el momento del aislamiento: Cuanto ms desarrollado est un embrin in vivo, ms fcil resulta su cultivo in vitro. 2. Las condiciones de crecimiento de la planta madre: La mejora del desarrollo de la planta madre, en condiciones controladas en un fitotrn, generalmente produce un mejor desarrollo del endospermo, y, por consiguiente, mejor crecimiento de los embriones aislados. 3. Composicin del medio nutritivo: Los embriones inmaduros tienen unas necesidades mucho ms crticas, en cuanto a la composicin del medio nutritivo, que los embriones maduros. Sin embargo, tanto los embriones maduros como los inmaduros necesitan macro y microelementos, y azcar. Los embriones maduros se cultivan generalmente sobre un medio con sacarosa al 2-3%; mientras que los
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embriones inmaduros tienen un mejor comportamiento con concentraciones ms elevadas (8-12%). 4. Factores ambientales: En algunas ocasiones, las necesidades de oxgeno de los cultivos de embriones son superiores a las concentraciones que normalmente se encuentran en el aire. A veces los embriones aislados necesitan ser cultivados en la oscuridad, durante 7-14 das, pudiendo luego ser transferidos a la luz, para permitir la formacin de clorofila. Normalmente se utiliza una temperatura relativamente alta (22-28 C) para el crecimiento y un tratamiento de fro (4 C) puede ser necesario para romper la dormicin. Aplicaciones del cultivo de embriones Las aplicaciones prcticas ms importantes del cultivo de embriones se indican a continuacin: 1. Eliminar la inhibicin (absoluta) de germinacin de las semillas en algunas especies. 2. Germinacin de semillas de plantas parsitas: la cual resulta imposible in vivo sin la presencia del husped. 3. Acortar el ciclo de mejora: Existen muchas especies que presentan dormicin seminal, la cual frecuentemente se localiza en la cubierta de la semilla y/o en el endospermo. Aislando los embriones se puede producir una germinacin inmediata. 4. Produccin de haploides: Como se estudi en la leccin de cultivo de anteras, es posible obtener plantas haploides a travs del cultivo de vulos y ovarios. En algunos caso, inclusive es posible la obtencin de haploides al realizar cruces hbridos, pues en estos cruces uno de los juegos de cromosomas es eliminado dado que son incompatibles, as el embrin hibrido es haploide de una de las especies involucradas en el cruce, pero este embrin sobrevive solo gracias al cultivo in vitro, de lo contrario sera abortado. 5. Prevencin del aborto embrionario como resultado de incompatibilidad: En el caso de cruces interespecficos, intergenricos, y en el caso de cruces por ejemplo entre diploides y tetraploides, el endospermo puede no desarrollarse o hacerlo muy pobremente. El resultado es el aborto embrionario in vivo, que puede ser evitado exclusivamente por el cultivo de embriones. El cultivo de embriones se emplea tambin en los cruces entre diploides y tetraploides (que producen triploides con un endospermo muy poco desarrollado).

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6. Propagacin vegetativa: Los embriones se utilizan como un material inicial, para la propagacin vegetativa, por ejemplo en las Gramneas y Conferas. Los embriones responden muy bien, debido a que se trata de un material juvenil.

Leccin 10: Variacin somaclonal Es un hecho que ocurren modificaciones genticas en las clulas y los tejidos cultivados in vitro. Muchas de estas modificaciones se manifiestan como mutaciones heredables a las progenies de las plantas regeneradas. Este fenmeno se conoce como variacin somaclonal. Las observaciones hechas indican que esta variacin, que se recupera en las plantas regeneradas, resulta tanto de las diferencias genticas que preexisten en las clulas somticas del explante como de efectos inducidos por los componentes del medio de cultivo. A diferencia de otros procesos de variacin gentica, se ha encontrado variacin somaclonal en la progenie del 15% de las plantas regeneradas; la tasa de ocurrencia de mutaciones espontneas, por ejemplo, es slo de una en un milln. La variacin somaclonal es superior tambin al mejoramiento por mutaciones inducidas puesto que en las plantas regeneradas que derivan de clulas individuales, la ocurrencia de mosaicos es mnima. La regeneracin de plantas acta como un filtro que elimina casi todos los cambios deletreos. Es necesario entender los mecanismos que dan lugar a la inestabilidad gentica durante el cultivo de tejidos, por razones de orden prctico. En primer lugar, la variacin somaclonal es deseable para aumentar la ocurrencia de variabilidad en el mejoramiento de plantas; es adems importante donde la uniformidad de las plantas obtenidas del cultivo de tejidos sea esencial, como en la micropropagacin rpida; es importante, en tercer lugar, para la conservacin del germoplasma in vitro. Varios anlisis han revelado un amplio espectro de eventos mutacionales que ocurren durante el cultivo de tejidos. Son ellos, por ejemplo, los mutantes que obran como clsicos mutantes mendelianos; los cambios genticos que afectan caracteres controlados por familias multigenicas y que influyen en determinados rasgos polignicos; y los cambios que resultan de la aparicin de elementos trasponibles. La poliploida y la aneuploidia, por su parte, son variantes que ocurren frecuentemente a consecuencia de reordenamientos cromosmicos, tales como duplicaciones, deficiencias, traslocaciones, y otros intercambios. El origen de la variacin no siempre es claro, y puede diferir entre una planta y otra. El reordenamiento cromosmico es considerado el principal mecanismo que genera la variacin somaclonal; puede deberse tambin a un
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entrecruce (crossing over) somtico, a un intercambio de cromtidas hermanas, a una alteracin de los nucletidos por metilacin, a una perturbacin de la replicacin del DNA por culpa de un depsito de nucletidos alterados, o tambin al silenciamiento o activacin de genes por mutaciones ocurridas en regiones no codificadas. Uno de los mayores beneficios de la variacin somaclonal es la obtencin de variabilidad gentica en cultivares agroeconmicament tiles, la cual se ha obtenido tradicionalmente recurriendo a la hibridacin. Los somaclones pueden enriquecerse durante el cultivo in vitro con las siguientes caractersticas: resistencia a enfermedades y a herbicidas, y tolerancia al estrs qumico o ambiental. Adems, la introgresin de genes de cultivares silvestres en especies cultivables es posible a juzgar por el reordenamiento de cromosomas observado hasta ahora en las plantas regeneradas in vitro. En la figura 1.15 se muestra un resumen del proceso de seleccin de somaclones de pasto llorn del cual se seleccionaron plantas promisorias por su potencial como forrajeras. Niveles de deteccin de la variacin somaclonal Detectar y analizar los distintos niveles de modificaciones genmicas generadas por cultivo in vitro reviste inters desde un punto de vista prctico, ya que estas podran ser fuentes de material para seleccionar caracteres de inters y desde un punto de vista terico, ya que pueden posibilitar la realizacin de estudios bsicos acerca de la variacin y el posible control de la misma. 1. Marcadores morfolgicos: Se realizan exmenes visuales y se utiliza un analizador de imgenes para observar la diferenciacin entre fenotipos normales y aberrantes de plantas regeneradas. 2. Marcadores fisiolgicos: A nivel fisiolgico, es posible detectar y seleccionar variaciones en cultivo de clulas y tejidos por presentar resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas, sales, diferencias de crecimiento en condiciones de pH variables, entre otros.

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Figura 1.15 Obtencin de variantes somaclonales de pasto llorn, Eragrostis curvula (Schrad.) Nees a partir del cultivo de inflorescencias. A) Formacin de callos, B) Evidencia de morfognesis en masa de callo. C) Clulas embriognicas y D) embriones somticos de los callos. E) Embriones bipolares y F) organognesis observadas en los callos. G) Plntula completa. H) Plantas frtiles llevadas a campo (I). J) Cromosomas en el pice radical de la planta donadora de explante. K) Cromosomas de una regenerante primaria (R0) obtenida a partir de la anterior L) Isoenzimas de peroxidasas de las descendientes de la planta R0, mostrando variacin. M) Idem anterior, pero malato deshidrogenasas. Fuente: Echenique et al, 2004.

3. Marcadores citogenticos: El estudio del cariotipo permite detectar cambios en el nmero y estructura de los cromosomas. 4. Marcadores bioqumicos: Entre los marcadores bioqumicos utilizados para analizar progenies de plantas regeneradas pueden mencionarse las isoenzimas, cuya variacin se puede detectar mediante patrones electroforticos. 5. Marcadores moleculares: Los marcadores moleculares presentan varias ventajas a la hora de detectar inestabilidad gentica debido a su amplia cobertura del genoma ya que no son influenciados por el ambiente ni por los estados fenolgicos de las plantas. Solamente para mencionar algunos de los marcadores utilizados para medir la variacin somaclonal, estn: los RAPDs y los AFLPs.

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CAPITULO 3: Aplicaciones Prcticas

Introduccin Entre las aplicaciones del cultivo de tejidos se pueden mencionar la micropropagacin o clonacin in vitro de plantas, la produccin de compuestos naturales de alto valor, la obtencin de materiales mejorados mediante seleccin in vitro u otras tcnicas y a la conservacin de germoplasma vegetal mediante criopreservacin o almacenamiento en condiciones de mnimo crecimiento. Por otro lado, el cultivo de tejidos vegetales, junto con las tcnicas de ingeniera gentica, han hecho posible la transferencia directa de genes a las plantas. Esto ltimo ha abierto una inmensa gama de posibilidades tanto para el mejoramiento de las plantas cultivadas, como para la obtencin de nuevos productos a partir de ellas. Leccin 11: Bioestadstica aplicada al cultivo de tejidos vegetales La bioestadstica (la estadstica aplicada a problemas biolgicos) es muy til, pues por medio de ella se pueden recolectar datos, ajustndolos lo mejor posible a la realidad, eliminando o reduciendo todas las fuentes de error, aplicando el mtodo cientfico (observacin, experimentacin, hiptesis, prueba de error y deduccin), las matemticas y los principios y leyes de las probabilidades. En general, las tcnicas estadsticas ms empleadas en experimentos llevados a cabo en laboratorios de cultivo de tejidos vegetales son las que se refieren a los modelos de diseos experimentales, los modelos de regresin lineal (simple o mltiple) y las tcnicas usadas en estadstica no paramtrica. Los modelos de diseos experimentales se utilizan en la planeacin de experimentos donde se estudian variables cualitativas y cuantitativas, las cuales proporcionan una cantidad mxima de informacin concerniente al problema en investigacin. El diseo de un experimento es la secuencia completa de pasos que aseguran que los datos apropiados se obtendrn de modo que permitan un anlisis objetivo que conduzca a deducciones vlidas con respecto al problema establecido. Esta definicin implica que la persona que lo formule debe entender claramente los objetivos de la investigacin propuesta. En la mayora de los experimentos se involucran varios tratamientos; en estos casos el investigador estar interesado en las comparaciones especficas entre las medias del tratamiento. Para realizar estas comparaciones entre medias existen varios mtodos: la diferencia mnima significativa (DMS), la prueba de Duncan y la prueba de Tukey.

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Los diseos experimentales bsicos que se utilizan en el cultivo de tejidos vegetales son el diseo completamente al azar y el diseo de bloques completos al azar; cada uno puede utilizarse con arreglos factoriales. Diseo completamente al azar En este, los diferentes tratamientos son asignados aleatoriamente a todas las unidades experimentales. El requisito para este diseo es que las unidades experimentales sean homogneas y las ventajas son: el anlisis de datos es simple, pueden utilizarse diseos no balanceados, el nmero de repeticiones esta limitado nicamente por el nmero de unidades experimentales disponibles y hay una cierta tolerancia a la prdida de datos. La manera de analizar estadsticamente los datos de un experimento de este tipo es el anlisis de varianza (ANOVA). En ste se prueba una hiptesis nula (Ho) que postula que el efecto de todos los tratamientos es igual, contra una hiptesis alternativa (Ha) que postula que al menos uno de los tratamientos es estadsticamente diferente al resto de ellos. El resultado final da un valor de F que nos permite aceptar o rechazar la hiptesis nula. Si en el ANOVA se rechaza la hiptesis nula, esto nos dice nicamente que estadsticamente al menos uno de los tratamientos es diferente, pero no nos da ningn dato sobre la relacin entre los tratamientos. Para comparar los tratamientos unos con otros, se utilizan pruebas complementarias como la diferencia mnima significativa (DMS), la prueba de Duncan y la prueba de Tukey las cuales son sencillas y pueden ser consultadas en cualquier texto de estadstica. Algunos ejemplos tpicos de la aplicacin del diseo completamente al azar en el cultivo de tejidos vegetales son: Se desea conocer el efecto de diferentes niveles de reguladores de crecimiento sobre el nmero de brotes producidos por segmentos nodales de una especie vegetal X. Se prueban medios bsales con una concentracin fija de un regulador de crecimiento con el fin de determinar cul de ellos promueve una mayor formacin de races en segmentos de tallo de una especie vegetal Y. En estos casos, los explantes son homogneos. El ANOVA nos indicara si hay al menos un tratamiento diferente, y la DMS u otra prueba similar, cul de ellos es el mejor y cules son iguales o diferentes entre s. Las fuentes de variacin son nicamente los tratamientos y el error experimental. Diseo de bloques al azar Cuando se tienen unidades experimentales que no son homogneas, se debe recurrir al diseo de bloques al azar. Para ello se deben reunir entre s las
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unidades experimentales parecidas para formar con ellas grupos llamados bloques. Luego, los tratamientos deben asignarse al azar dentro de cada bloque. En este diseo las fuentes de variacin son los tratamientos, los bloques y el error experimental. El ANOVA nos indica si hay efecto entre los diferentes tratamientos y los diferentes bloques. Un ejemplo de un experimento de bloques al azar sera el siguiente: se desea probar el efecto de seis combinaciones de IBA y AIA en la produccin de brotes adventicios en hoja, cotiledn e hipocotilo de tomate. En este caso, se forman los bloques, uno con cada tipo de explante, y luego se asignan al azar los seis tratamientos dentro de cada bloque. Cuando se desea probar la posible interaccin entre dos o ms factores, debe recurrirse a un experimento de tipo factorial, que puede realizarse sobre un diseo completamente al azar o sobre uno de bloques al azar. Por ejemplo, se desea conocer el efecto de cuatro auxinas y tres temperaturas de incubacin en el enraizamiento de segmentos de tallo de manzano. El diseo debe probar el efecto de las auxinas, el efecto de las temperaturas y la posible interaccin entre las diferentes auxinas con las temperaturas de incubacin. ste sera un experimento factorial con diseo completamente al azar. Suponiendo que en ese mismo ejemplo se quisieran probar al mismo tiempo tres variedades de manzano, se podra tratar entonces de un experimento factorial con diseo de bloques al azar, siempre y cuando se formara un bloque con cada variedad. El anlisis de este tipo de experimentos suele resultar ms complicado y se sugiere evitarlos substituyndolos de ser posible por una serie de experimentos ms sencillos. En ocasiones lo que se desea evaluar es la posible relacin entre una o ms variables dependientes con una sola variable independiente. Por ejemplo, el aumento de biomasa y la produccin de pigmentos (variables dependientes) en tejido calloso, en relacin con los niveles de auxina (variable independiente) en el medio de cultivo. En este caso se utiliza el procedimiento estadstico conocido como regresin. La regresin puede ser lineal o no lineal dependiendo de la relacin entre las variables y puede ser simple o compuesta dependiendo del nmero de variables que se prueban.

Leccin 12: Cultivo de especies econmicamente importantes El cultivo de tejidos no slo permite la produccin masal de plantas, sino que tambin posibilita el estudio y caracterizacin de la biologa del desarrollo de las mismas. Dependiendo del objetivo planteado es posible clonar individuos utilizando cultivo de pices o meristemos, o bien buscar aumentar la variabilidad gentica por medio del cultivo de callos, suspensiones celulares o protoplastos (vistos en lecciones anteriores).

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La tcnica de micropropagacin es una excelente herramienta que ha sido ampliamente utilizada para la propagacin a gran escala de especies econonmicamente importantes, ya que no slo permite la obtencin de miles de individuos a partir de un genotipo elite seleccionado, sino que tambin permite la multiplicacin de plantas raras o en peligro de extincin, resguardando la estabilidad gentica de las mismas. Algunos gneros y especies de plantas ornamentales que se han cultivado in vitro a partir de diferentes explantes son: - Cultivo de meristemos: Ghypsophyla, Chrysantemum, Maranata sp., Gladiolus, Iris sp., Pelargonium, Saintpaulia spp. - pices: Diphaenbachia, Daphne L., Dracaena sp., Gerbera sp., Mammillaria sp.,Rosa L., Iris sp. - Yemas o segmentos nodales: Dianthus, Bignoniaceae, Nierembergia, Jacaranda mimosifolia, Bougainvillea, Blandfordia sp., Anthurium sp. Bromeliaceas, Maranta sp., Campanula sp., Daphne L., Dracaena sp., Gerbera sp., Mammillaria sp., Mediocactus coccineus, Zinnia elegans, Rosa L., Gardenia, Chrysantemum, Gladiolus, Impatiens, Iris sp., Saintpaulia spp. - Pecolos: Rhododendron Chrysantemum. sp., Anthurium sp., Gerbera sp.,

- Discos de hojas: Rhododendron sp., Bromeliaceas. Begonia sp., Gardenia. Chrysantemum, Saintpaulia spp. - Lmina: Saintpaulia spp. - Escamas: Lilium - Bulbos o Segmentos de bulbos: Sego lily, Narcissus - Rizomas: Cymbidium - Cotiledones: Zinnia elegans. - Semillas: Cattleya sp., Mammillaria sp., Orchidea, Saintpaulia spp. - Embriones inmaduros: Alstroemeria sp., Orchidea spp. - Anteras: Saintpaulia spp. - Segmentos de ptalos: Chrysantemum. - Segmentos de inflorescencia: Chrysantemum, Saintpaulia spp.. La lista precedente es apenas una muestra de la gran diversidad de explantes que se utilizan para la multiplicacin in vitro de plantas.

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En plantas de importancia para la agricultura tropical tambin se han realizado grandes esfuerzos, como algunos ejemplos tenemos: - Yuca: eliminacin de virus (mosaico africano de la yuca ACMD, virus del mosaico comn de la yuca CCMV, Mosaico caribeo CMD y virus X de la yuca CsXV principalmente) por termoterapia de tejidos apicales y posterior micropropagacin de los materiales libres de virus. Y propagacin in vitro de clones de yuca que poseen caractersticas deseables. - Papa: para eliminacin de patgenos (virus, hongos y bacterias) se ha empleado el cultivo de meristemos y para la produccin de semilla certificada. - Pltano: mejoramiento y eliminacin de patgenos por cultivo de meristemos. - Frutales: en ctricos se ha realizado con xito microinjertacin para obtener material libre de virus. - Arroz: mejoramiento por cultivo de anteras y callognesis. - Caa de azcar: variabilidad somaclonal e induccin de mutantes para obtener nuevas variedades, tambin se ha empleado cultivo de meristemos apicales y axilares, cultivo de anteras y cultivo de protoplastos. El cultivo de meristemos es uno de los mtodos ms eficaces para la eliminacin de virus, ms an si se lo combina con termoterapia y/o mtodos qumicos; es de gran aplicacin en el campo de los cultivos intensivos tanto ornamentales como hortcolas. Como la mayora de los cultivos se multiplican asexualmente, las enfermedades virales suelen ser un problema importante. La eleccin errnea de un material, por error o desconocimiento, provocara la diseminacin de estas enfermedades, con las consecuentes prdidas econmicas. El cultivo in vitro tambin puede ser fuente de variabilidad gentica. La produccin de plntulas por regeneracin a partir de callos, suspensiones celulares o protoplastos, puede dar origen a individuos que presentan algn rasgo diferente respecto de la planta madre. Esto tambin puede lograrse utilizando mutgenos durante el cultivo in vitro asociados con una presin de seleccin conferida por factores tales como pH, salinidad, toxinas y baja temperatura. Las plantas regeneradas luego de estos tratamientos pueden mostrar caractersticas que difcilmente se puedan obtener por otra va. La induccin de variantes somaclonales tiene especial significado en la floricultura debido a la constante bsqueda de nuevas variedades, seleccionndose las variantes prometedoras y estables e incorporndolas a los programas de mejoramiento.
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Leccin 13: Transgnesis El reciente surgimiento de las tcnicas de ingeniera gentica de plantas ha abierto una gama muy amplia y prometedora de posibilidades para el mejoramiento gentico de las especies cultivadas por el hombre, creando lo que se supone ser una nueva revolucin en la agricultura. El nacimiento de estas tcnicas ha sido posible gracias a dos hechos fundamentales. El desarrollo de la llamada tecnologa del DNA recombinante que da la posibilidad de aislar, manipular y transferir genes, y por otro lado, el avance de los sistemas de cultivo de tejidos vegetales discutidos en los captulos anteriores, que dan la posibilidad de controlar hasta cierto punto los procesos morfogenticos in vitro y regenerar plantas completas partiendo de una sola clula. La transformacin gentica de plantas consiste en introducir al genoma de stas nueva informacin gentica que les confiera caractersticas diferentes. La fuente de esta nueva informacin puede ser cualquier organismo vivo por lo que no existen barreras taxonmicas cuando se utiliza esta metodologa, siendo el nico requisito el que la informacin a introducir est colocada bajo el control de seales reguladoras reconocibles por la planta. Esta metodologa ha pasado ya de ser utilizada nicamente con fines de investigacin a tener una aplicacin prctica inmediata en la agricultura. Para el ao 2006 se reportaron 22 pases con cultivos transgnicos (recientemente llamados cultivos biotecnolgicos) ,102 millones de hectreas cultivadas en todo el mundo y mas de 10 millones de agricultores que los emplean (Figura 1.16).

Figura 1.16 Superficie mundial de cultivos biotecnolgicos. Fuente: James, 2006. Situacin global de los cultivos transgnicos 2006. ISAAA http://www.agrobio.org/admin/documentos/biotecnologia/0//Situacion%20global%20de%20los%2 0cultivos%20%20GM%20comercializados%202006.pdf

El proceso que se sigue para obtener una planta transgnica consta de dos fases: Primero se introduce la informacin gentica a una o varias clulas mediante
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sistemas que se discutirn ms adelante, y posteriormente se regenera una planta completa a partir de cada clula transformada. De acuerdo a esto, la recuperacin de plantas transformadas depende de la frecuencia de introduccin de los nuevos genes a las clulas vegetales, y de la capacidad de estas clulas para formar plantas completas bajo los sistemas de cultivo in vitro. El objetivo final de esta tcnica desde un punto de vista prctico, es la introduccin de nueva informacin que le confiera ventajas a la planta, y por lo tanto, la haga ms productiva. Sin embargo, al introducir esta nueva informacin, o bien durante las fases previas que se requieren para el desarrollo de los sistemas de transformacin, es muy conveniente la introduccin simultnea de genes que produzcan fenotipos claramente identificables en las plantas transformadas para ser utilizados a manera de marcadores. Estos genes (llamados marcadores de seleccin) suelen codificar para enzimas que confieren resistencia a algn antibitico o herbicida que normalmente mata o retarda el desarrollo de tejidos no transformados, por lo que resulta relativamente sencillo seleccionar aquellos tejidos que han sido transformados. Otro tipo de genes llamados reporteros, producen actividades enzimticas especficas en los tejidos transformados que son fcilmente detectables y cuantificables. De los tipos de genes antes mencionados, algunos de los ms utilizados son: aacC3 y aacC4, que confieren resistencia a gentamicina; cat, resistencia a cloranfenicol y actividad enzimtica detectable; Gfp (Green Fluorescent Protein), protena verde fluorescente, que emite fluorescencia al ser excitada con luz de 470 nm; gus, con actividad enzimtica detectable; hpt, que confiere resistencia a higromicina; y nptll, confiere resistencia a kanamicina y neomicina, y tiene actividad enzimtica detectable. Tambin se han desarrollado sistemas alternativos interesantes de seleccin positiva; en este caso la seleccin no se basa en la eliminacin de las clulas no transformadas al aplicar un agente selectivo, sino que se dan las condiciones para que solo las clulas que han adquirido el gen forneo puedan desarrollarse. Por lo que respecta a los sistemas de transformacin gentica pertenecen bsicamente a dos tipos, aqullos que se valen de procesos biolgicos para la introduccin del DNA y aqullos que lo hacen por medios fsicos. Sistemas biolgicos Agrobacterium tumefaciens es una bacteria fitopatgena aerobia Gram negativa que causa el trastorno conocido como "agalla de la corona" que afecta a muchas especies de dicotiledneas. Esta enfermedad se caracteriza por la produccin de tumores en el tejido vegetal atacado. De manera natural, el mecanismo de patogenicidad se basa en la transferencia de informacin gentica al genoma de la planta infectada. Esta informacin se localiza en un megaplsmido (alrededor de 200 Kb) llamado plsmido Ti (inductor de tumores) dentro del cual se encuentra una regin conocida como DNA-T (DNA transferible) que es el que se inserta y expresa en el genoma de la planta. Los productos de la
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expresin de este DNA en la planta son enzimas involucradas en la biosntesis de auxinas, citocininas y opinas. Adems de estos genes, el DNA-T contiene las llamadas secuencias borde, que son secuencias de 25 pb muy similares entre s (repeticiones directas imperfectas) que delimitan al DNA-T y son imprescindibles para su transferencia. Estos bordes son los nicos elementos en cis que se requieren para la transferencia del DNA-T al genoma de la planta. A diferencia de otros elementos genticos mviles, el DNA-T no codifica por s mismo a los productos que permiten su transferencia, stos estn codificados por otra regin del mismo plsmido Ti, llamada regin vir o de virulencia. La regin vir contiene 6 operones, y los genes dentro de la misma poseen un sistema de regulacin muy fino y slo se expresan en presencia de compuestos excretados por clulas vegetales heridas. Los compuestos fenlicos producidos por la clula vegetal herida como la acetosiringona, cido sinapnico o cido cafeico atraen por quimiotaxis a la bacteria y luego inducen la expresin de los genes vir (figura 1.17).

Figura 1.17 Transferencia del DNA-T de un parsito a clulas vegetales. Fuente: Lehninger et al, 2004 (modificado)

Una caracterstica muy importante del DNA-T es que sus genes pueden ser cortados y substituidos por otros sin que esto afecte al sistema de transferencia. De esta forma se construyen los llamados plsmidos desarmados, los cuales no inducen la aparicin de tumores pero s permiten la transferencia de otras caractersticas deseables. Existen dos tipos fundamentales de vectores para transformacin con A. tumefaciens; el primero de ellos lo constituyen los llamados vectores cointegrativos, en los que la informacin gentica a introducir a la planta se cointegra al plsmido Ti, por lo que el DNA-T y la regin vir se encuentran en
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un mismo megaplsmido. El otro tipo de vectores son los llamados binarios, en los cuales los productos de la regin vir actan en trans, ya que el DNA-T se encuentra en un plsmido y la regin vir en otro ya sea silvestre o desarmado (Figura 1.18).

Figura 1.18 Sistema de dos plsmidos para crear una planta transgnica. Fuente: Lehninger et al, 2004 (modificado)

La forma en la que se realiza la transformacin gentica mediante este sistema es cocultivando a los explantes vegetales con una cepa de A. tumefaciens modificada de acuerdo a las caractersticas que se quieran introducir. Despus de este cocultivo se procede a la regeneracin de plantas a partir de los tejidos vegetales presuntamente transformados. Usualmente al tiempo de la regeneracin se aplica una presin de seleccin de acuerdo a los marcadores utilizados para favorecer el desarrollo de los tejidos transformados en detrimento de los que no lo estn.
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Agrobacterium rhizogenes es otra bacteria cuyo mecanismo de patogenicidad est basado en la transferencia de genes al genoma de la planta infectada. En este caso el trastorno que produce es conocido como raz pilosa, por el aspecto que tiene la planta infectada. Esta bacteria posee un plsmido llamado Ri que se asemeja al plsmido Ti de A. tumefaciens. Los virus son otro sistema biolgico natural para la transferencia de material gentico en plantas. Este sistema presenta algunos inconvenientes como por ejemplo el hecho de que la mayora de los virus vegetales son de RNA. A pesar de lo anterior, subsiste la investigacin tendiente a la utilizacin de algunos virus para la transferencia de genes a plantas, como es el caso del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV) y el Virus del Enanismo del Trigo (WDV). Sistemas fsicos La transformacin de protoplastos es un mtodo donde la remocin de la pared celular elimina la mayor barrera que impide la entrada de la nueva informacin gentica, y as los protoplastos vegetales son clulas ideales para la introduccin de DNA extrao. Por otro lado, al tratarse de clulas individuales y al poder cultivarse en altas densidades se facilita enormemente el proceso de seleccin. Desgraciadamente, la obtencin y manipulacin de protoplastos son muy complicadas y en muchas especies se carece de sistemas para la regeneracin de plantas completas a partir de ellos. En cuanto a la introduccin de DNA extrao en protoplastos, el mtodo ms comn es el que se basa en un tratamiento con polietilenglicol, pero actualmente es poco utilizado debido a la aparicin de sistemas ms eficientes y a la dificultad para trabajar con protoplastos. Otro mtodo para la transformacin de protoplastos es la electroporacin, basado en una permeabilizacin reversible de la membrana causada por la aplicacin de un impulso elctrico fuerte y de muy corta duracin. Esta tcnica es por lo general ms eficiente que la primera, pero al igual que sta tiene la desventaja de que la expresin de los genes introducidos suele ser transitoria ya que la frecuencia de integracin al genoma es muy baja. La transformacin mediante bombardeo con microproyectiles o biobalstica se basa en bombardear al tejido vegetal con microproyectiles de oro o de tungsteno (cubiertos con el DNA a introducir) y acelerados a alta velocidad de tal manera que penetren la pared celular y eventualmente lleguen al ncleo, todo esto sin llegar a matar a la clula bombardeada (figura 1.19). Una de las mayores ventajas de este sistema es que no est restringido a un rango de hospederos naturales como Agrobacterium, por lo que con su uso fue posible la transformacin de monocotiledneas como el maz. Los mtodos ms utilizados son la transformacin con Agrobacterium y el bombardeo con partculas. Uno de los factores que limitan la aplicacin de ambos sistemas es la necesidad de regenerar el tejido transformado mediante organognesis o embriognesis somtica, lo cual con algunas especies es al menos hasta
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el momento muy difcil. Una alternativa es la transformacin de meristemos, los cuales resultan sencillos de regenerar en prcticamente todas las especies. La principal desventaja es la produccin de quimeras debido a que las plantas formadas no tienen un origen unicelular.

Figura 1.19 Biobalistica Fuentes: http://www.ptf.okstate.edu/helios.html y http://www.xtec.es/~jcarrasc/transgenicas.htm

Leccin 14: Mejoramiento gentico El fitomejoramiento consiste en la introduccin de caractersticas tiles en las plantas por medio de tcnicas tradicionales como las de Mendel, que son dispendiosas y consumen mucho tiempo para seleccionar y establecer las caractersticas deseables en un cultivar; pero actualmente, gracias a la tecnologa del DNA recombinante, se ha podido introducir en los cultivares caractersticas que antes era imposible de lograr. El cultivo de tejidos vegetales se ha convertido en el eje sobre el cual giran las nuevas tecnologas de mejoramiento gentico de las plantas y un mejor conocimiento de los procesos genticos y fisiolgicos de estas. Como se ha visto, es posible mediante el uso de diferentes estrategias la introduccin de genes extraos en el genoma de una planta y la regeneracin de plantas completas que expresen y sean capaces de transmitir a la progenie las caractersticas adquiridas. Cuando se habla de aplicaciones prcticas de esta tecnologa, es necesario buscar genes que confieran caractersticas deseables y hagan ms productivo un cultivo. Algunas de las caractersticas que se podran manipular mediante la transformacin gentica y el cultivo de tejidos son las siguientes: 1. Resistencia a virus: Una de las aplicaciones ms estudiadas de la ingeniera gentica de plantas. Sin duda, el sistema que ha dado mejores resultados hasta el momento es la basada en la insercin en el genoma de la planta del gen que codifica para la protena de la cpside del virus contra el que se
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desea dar proteccin. Con esta metodologa se han logrado obtener plantas resistentes a virus fitopatgenos como TMV, AIMV, TSV, CMV y PVX. 2. Resistencia a insectos: Bacillus thuringiensis es una bacteria del suelo que produce una protena insecticida que ha sido utilizada por muchos aos como un pesticida biolgico seguro contra varias plagas de insectos. Con el desarrollo de la ingeniera gentica de plantas fue posible aislar e insertar en el genoma de diferentes plantas este tipo de protenas insecticidas dando como resultado plantas resistentes en mayor o menor medida al ataque de ciertos grupos de insectos, lo cual es, sin duda alguna, una caracterstica agronmica de gran valor. Por otro lado, se ha explorado tambin la posibilidad de utilizar algunas protenas inhibidoras de proteasas y amilasas presentes en algunas semillas para conferir resistencia contra el ataque de insectos. 3. Resistencia a hongos: La manipulacin gentica en plantas presenta opciones para conferir resistencia ante el ataque de hongos; para esto se ha visto la posibilidad de utilizar genes como el de la quitinasa o la glucano endo-1,3-Bglucosidasa, cuyos productos actan sobre las paredes celulares de los hongos. 4. Resistencia a herbicidas: Actualmente se encuentra muy extendido el uso de herbicidas en el control de las malezas que compiten con las plantas cultivadas; sin embargo, estos pesticidas suelen daar tambin en mayor o menor medida a stas ltimas. Una de las aplicaciones explotadas ha sido la insercin de genes que confieren resistencia a herbicidas, lo cual permitir al agricultor un mejor sistema para el control de malezas sin daar con esto al cultivo. En este sentido, se han generado plantas resistentes a glifosato, sulfonilureas, imidazolinonas, fosfinotricina, bromoxinilo y triazina. 5. Cambios en la calidad y fisiologa de maduracin del fruto: La calidad nutricional de los frutos o semillas, es otra propiedad que puede ser modificada. En este caso la estrategia ms obvia es la insercin de genes que codifican para protenas de alto valor nutritivo y que puedan compensar de algn modo las deficiencias en cuanto a aminocidos esenciales de la planta en cuestin. Otras caractersticas tambin pueden ser manipuladas, como por ejemplo el con tenido y balance de cidos grasos o azcares. Otro aspecto de gran inters es la manipulacin de la fisiologa de maduracin del fruto que puede lograrse alterando las vas metablicas del etileno o bien las enzimas involucradas en procesos asociados como por ejemplo las que tienen que ver con el ablandamiento del fruto. 6. Alteracin de la resistencia al estrs ambiental: El estrs ambiental es sin duda uno de los factores que ms limitan la produccin agrcola. Recientemente se ha vislumbrado la posibilidad de alterar la resistencia al estrs ambiental de las plantas cultivadas mediante la insercin de genes especficos.
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Como vemos, el advenimiento de nuevas tcnicas moleculares y de ingeniera gentica de plantas ha facilitado el anlisis gentico de caracteres de inters agronmico y la seleccin asistida por marcadores moleculares.

Leccin 15: Aplicaciones en bancos de germoplasma Sin duda, uno de los problemas ms serios que enfrenta actualmente la humanidad es la rpida desaparicin de especies animales y vegetales debido al mal uso que desde hace mucho tiempo se les ha dado a los recursos naturales, as como a las presiones derivadas de la sobrepoblacin en la mayora de las regiones del planeta. Actualmente la conservacin del germoplasma vegetal debe verse como una actividad que nos permita preservar nuestro patrimonio de la biodiversidad. De all surge la necesidad de conservacin de especies silvestres amenazadas, muchas de las cuales an no son conocidas en cuanto a sus propiedades y posible aprovechamiento. Por otra parte, se requiere un esfuerzo importante para conservar aquellos genotipos de plantas cultivadas que actualmente se ven amenazados al haberse dejado de utilizar por haber sido substituidas por variedades mejoradas. De hecho, las tendencias actuales del fitomejoramiento, como la seleccin sobre la base de la uniformidad y para fines muy definidos, han llevado a la prdida de una cantidad considerable de germoplasma vegetal. Las plantas cultivadas se pueden agrupar de acuerdo a su uso como germoplasma en los siguientes tipos: 1. Cultivares modernos. Genotipos muy productivos, adaptados a regiones de reducida extensin y caractersticas ecolgicas bien delimitadas, generalmente vulnerables ante las plagas o cambios ambientales. Actualmente no estn amenazadas, pero pueden ser substituidos en cualquier momento. 2. Cultivares caducos. Genotipos que ya no son utilizados por haber sido desplazados por otros mejorados. 3. Cepas reproductoras. Genotipos que nunca llegaron a utilizarse de manera intensiva pero que sirvieron de progenitores de los cultivares modernos. 4. Razas locales o cultivares criollos. Selecciones locales de especies cultivadas en muchas regiones que tienden a substituirse por cultivares modernos. 5. Formas silvestres de especies cultivadas. 6. Especies silvestres relacionadas con las cultivadas.

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De los tipos anteriores, a excepcin del primer grupo, todos estn en peligro inmediato de desaparecer o ya han desaparecido. Por ejemplo, a principios de siglo se cultivaban en la India unos 30 000 genotipos diferentes de arroz, mientras que en la actualidad se cultivan alrededor de 50 variedades. En Turqua existan unas 100 variedades de betabel, pero actualmente slo se cultiva una, importada de Alemania. En Latinoamrica se ha perdido la mayora de los cultivares criollos de maz y otras especies al ser substituidos. El hecho de que un cultivar sea substituido por otro puede considerarse como normal o incluso benfico, ya que las nuevas variedades presentan muchas ventajas, pero lo que debe evitarse es la prdida total de la variabilidad gentica existente cuando se substituyen los materiales criollos con las variedades mejoradas. Por citar slo un ejemplo, Zea diploperennis, especie silvestre relacionada con el maz, es resistente a 4 de las 7 principales plagas que daan a este cultivo, por lo que tiene un enorme inters para el mejoramiento del maz. Sin embargo esta especie ya se haba dado por extinta en 1920 y afortunadamente fue redescubierta en 1978. Los biotecnlogos vegetales no slo se han preocupado por el problema de la conservacin del germoplasma, sino que han establecido alternativas prometedoras para contribuir a solucionarlo. En ese sentido, se han desarrollado algunos sistemas de conservacin in vitro de germoplasma vegetal. La conservacin a mediano plazo, tambin conocida como almacenamiento en condiciones de crecimiento mnimo, que consiste en mantener el material in vitro de tal manera que se retarde su crecimiento con la finalidad de incrementar lo ms posible el tiempo entre subcultivos; esto puede lograrse incubando a baja temperatura, usando medios pobres en nutrientes, utilizando osmticos para reducir la disponibilidad de agua, o con inhibidores del crecimiento. La conservacin a largo plazo utiliza el mtodo llamado criopreservacin, que consiste en conservar los tejidos congelados a temperaturas extremadamente bajas (usualmente -196 C) por tiempo indefinido. En general, las ventajas de la conservacin in vitro de germoplasma vegetal son las siguientes: Altos ndices de multiplicacin. A partir de poco material almacenado puede generarse un nmero ilimitado de plantas en relativamente poco tiempo. Los costos de mantenimiento son realmente muy bajos debido a que el mantenimiento requerido es mnimo. El material almacenado est completamente libre de patgenos. Los bancos de germoplasma in vitro no pueden ser afectados por fenmenos ambientales. El material puede intercambiarse incluso a grandes distancias de manera muy fcil y sin restricciones fitosanitarias. La variacin gentica del material es mnima si se elige el sistema de cultivo adecuado (meristemos o yemas).
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Actividades de Autoevaluacin de la UNIDAD 1

En esta seccin usted evaluar diversos aspectos de la actividad acadmica desarrollada en la unidad. Esta actividad tiene una valoracin cualitativa de acuerdo a la siguiente escala: No satisfactorio, Satisfactorio, Supera lo esperado. En cada punto adems de asignar la categora correspondiente, dar una breve explicacin de su respuesta.

Autoevaluacin de su trabajo individual. Usted describir de manera cualitativa cual fue su rol como estudiante y su desempeo en el desarrollo, entrega y responsabilidad en las actividades de trabajo individual y colaborativo.

Evaluacin del desempeo de los compaeros de grupo de trabajo colaborativo. Debe indicar si hubo participacin de sus compaeros, si el grado de compromiso en el desarrollo de trabajos colaborativos fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado de cada uno de ellos justificando su apreciacin

Evaluacin del material usado en la actividad de la unidad: Debe indicar y justificar si el material empleado para el desarrollo de esta unidad fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado.

Desempeo del rol del tutor. Debe dar su autoevaluacin del tutor respecto a compromiso, responsabilidad, calidad, pertenencia, atencin al estudiante, retroalimentacin de trabajos y relaciones interpersonales.

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Fuentes Documentales de la Unidad 1 Caas, M. (1993). Metodologas in vitro de Vegetales. Bucaramanga. Ediciones Universidad Industrial de Santander. Doyle, A., Griffiths, J.B. (1998). Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. New York. John Wiley and Sons. Echenique, V., Rubinstein, C., Mroginski, L. (2004). Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal. Buenos Aires. Ediciones INTA. Helgason, Ch. D., Millar, C.l. eds (2005). Basic Cell Culture Protocols. Methods in Molecular Biology No 290. Totowa. Humana Press. Hurtado, D., Merino, M.E. (1987). Cultivo de Tejido Vegetales. Mxico. Editorial Trillas. Lentini, A., Martinez, C., Roca, W. (1997). Cultivo de anteras de arroz en el desarrollo de germoplasma. Palmira. Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT. Lodish, H., Baltimore, D., Berk, A., Lawrence, S., Matsudaira, P., Darnell, J. (2004). Molecular Cell Biology. Fisfth edition. New York. Scientific American Books. Montoya, D., Sastoque, L.A. (2004). Biotecnologa para no biotecnologos: memorias. Bogot. Universidad Nacional de Colombia. Perea, M. ed. (2001). Biotecnologa agrcola: un enfoque hacia el mejoramiento de plantas. Bogot. Editora Guadalupe Ltda. Perez, E.M., Ramirez, R., Nuez, H.G., Ochoa, N. (1999). Introduccin al Cultivo de Tejidos Vegetales. Mxico. Ediciones Universidad Autnoma de Aguascalientes. Pierik, R.L.M. (1990). Cultivo in vitro de las Plantas Superiores. Madrid. Ediciones Mundi-Prensa. Roca, W., Mroginski, L.A. (1991). Cultivos de Tejidos en la Agricultura. Fundamentos y Aplicaciones. Palmira. Centro Internacional de Agricultura Tropical CIAT.

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CULTIVO DE TEJIDOS ANIMALES

CAPITULO 4: Principios, metodologas y tcnicas 1

Introduccin El cultivo de tejidos animales ha tenido un gran desarrollo en los ltimos cien aos, gracias al desarrollo de la tcnica asptica y al conocimiento acumulado acerca de la fisiologa, el metabolismo y los requerimientos nutricionales de las clulas. En este capitulo se estudiarn las bases de este desarrollo y se profundizar en las metodologas y requerimientos bsicos para la implementacin y establecimiento de cultivos celulares.

Leccin 16: Introduccin a la tcnica del cultivo celular En la actualidad, pueden cultivarse en el laboratorio clulas procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos diferentes. Los objetivos al principio fueron el estudio de las clulas, su crecimiento, requerimientos para su crecimiento, cmo y cuando dejan de crecer. Estos estudios an tienen gran inters cientfico, por ejemplo, en investigaciones relacionadas con el ciclo celular, control de crecimiento en clulas tumorales y modulacin de expresin gentica. Otra rea de gran inters se centra en la biologa del desarrollo. Dado que el cultivo celular es adecuado para el estudio del desarrollo y diferenciacin, las lneas celulares que conservan la capacidad de diferenciarse in vitro son objeto de intensos estudios. Por ltimo existen cierto tipo de investigaciones que no podran realizarse sin el cultivo de clulas, como los trabajos en transgnesis. Teniendo lo anterior en mente, es necesario conocer tambin las ventajas y desventajas al trabajar con cultivos in vitro (las cuales se resumen en la tabla 2.1), por lo que se deben tomar con precaucin la validez de los resultados obtenidos in vitro respecto a lo que pueda observarse in vivo. Sin embargo actualmente se estn realizando gran cantidad de estudios de validacin de modelos in vitro dentro del desarrollo de los mtodos alternativos a la experimentacin animal.

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T ABLA 2.1 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL TRABAJO EN CULTIVOS IN VITRO VENTAJAS


Control preciso del medio ambiente pH, temperatura, presin osmtica, O2, CO2, hormonas, factores de crecimiento, etc

DESVENTAJAS
Tcnica sensible Crecimiento celular lento, problemas de contaminacin, mtodos especializados y personal altamente capacitado Inestabilidad Las lneas celulares continuas pueden tornarse inestables (dotacin cromosmica). Necesidad de tcnicas especiales para mantener la estabilidad. Cantidad y costo El costo de produccin de 1g de tejido en cultivo es 10 veces mayor al obtenido del animal. Limitacin en produccin. Validez del modelo in vitro Prdida de la organizacin espacial del tejido origen. Prdida de interacciones celulares. Ausencia de componentes sistmicos implicados en homeostasis in vivo.

Caracterizacin y homogeneidad Las clulas de una lnea continua son homogeneas en morfologa y composicin, se pueden obtener replicas idnticas.

Economa En el uso de reactivos o drogas que deben estar en contacto con las clulas. Orden de miligramos. Motivaciones ticas Alternativa vlida en muchas ocasiones para evitar el sacrificio de animales de investigacin.

Leccin 17: Medios de cultivo Para cultivar clulas in vitro, el ambiente debe ser lo ms parecido posible al esperado in vivo. Son factores ambientales importantes el substrato sobre el que crecen las clulas, el medio que las rodea y la temperatura. La composicin completa de un medio que permita el crecimiento en cultivo de clulas de mamfero puede parecer muy complejo y existe gran nmero de distintos medios disponibles pero, bsicamente, cualquier medio de cultivo est constituido por un medio nutriente mnimo tamponado e isotnico que contiene sales inorgnicas, una fuente de energa y aminocidos, adems de varios suplementos. Para la mayora de las lneas celulares los suplementos son relativamente pocos, el principal de los cuales es el suero o un sustituto del suero. La seleccin y preparacin del medio adecuado es un aspecto importante del cultivo celular. Los distintos tipos de medio se caracterizan por sus diferencias en los componentes bsicos, como los aminocidos y las sales, y en su concentracin. El medio basal de Eagle (BME) es uno de los medios definidos como originales. Se utiliza normalmente para clulas adherentes (formadoras de
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monocapas) como las clulas HeLa y algunas clulas primarias. Posteriormente se han desarrollado otros medios a partir del BME, como el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), el que consiste en medio BME con una mayor cantidad de vitaminas y aminocidos y se emplea para una amplia gama de lneas celulares de mamfero. El medio esencial mnimo (MEM) se desarroll para clulas de mamfero formadoras de monocapa con mayores exigencias que las satisfechas por el BME. Se utiliza de forma generalizada, principalmente para clulas primarias de mamfero, pero tambin para muchas lneas celulares establecidas. En la composicin de muchos medios de cultivo se incluyen altas concentraciones de Ca2+ y Mg2+ pues estos cationes divalentes son necesarios para la adherencia de protenas situadas sobre las clulas formadoras de monocapa, pero los medios para el cultivo de clulas en suspensin no necesitan concentraciones tan elevadas. Para permitir el crecimiento celular, los medios bsicos precisan la adicin de suplementos como la glutamina y el suero. La glutamina es la fuente principal de carbono para la mayora de las clulas en cultivo y genera precursores para posteriores biosntesis y para la produccin de protenas. Tambin acta, junto con la glucosa (y a veces con el piruvato sdico), como fuente de energa mediante la ruta del ciclo de Krebs. El suero contiene una mezcla importante pero poco definida de compuestos favorecedores del crecimiento (por ej., polipptidos, hormonas, lpidos, metales traza). Se ha producido un suplemento similar al suero, sin embargo, el suero sigue siendo utilizado por la mayora de los que trabajan con cultivos celulares, normalmente en forma de suero fetal bovino. Los medios carentes de suero son cada da ms utilizados. El medio Iscoves suele utilizarse como base para la preparacin sin suero; se trata de una modificacin del DMEM al que se aaden suplementos (por ej., albmina srica bovina, transferrina y lpidos de semilla de soja). El medio Iscoves fue desarrollado para el cultivo de clulas hibridas y linfocitos murinos. Entre los nuevos medios sin suero se encuentran el AIM V de Gibco y el Medio sin suero y sin protenas para hibridomas de Sigma. Sin embargo, el empleo de medios sin suero para distintos tipos celulares necesita de la adicin de suplementos extra especficos para las clulas empleadas que, en muchos casos, no se han determinado con precisin. Preparacin de Medios Para la correcta preparacin de medios de cultivo es crucial tener una fuente de agua de muy alta calidad, tipo bidestilada o tridesdilada y desionizada. Existen sistemas automatizados de purificacin de agua como Millipore incluyen una filtracin por carbn, una desionizacion de alta calidad y una filtracin. Las botellas o frascos para contener medio deben ser del tipo fabricado por Schott o Pyrex, con marcas indicadoras del contenido y tapas de rosca para boca ancha, y
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deben estar perfectamente lavadas, sin restos de detergente. As mismo, se debe emplear una cabina de flujo laminar para garantizar un ambiente libre de contaminantes. Medios lquidos: Las botellas con agua pura se esterilizan en autoclave. Se debe disponer de soluciones esterilizadas por filtracin (filtro de 0,2 m), de: 1M NaOH, 1M HCl y bicarbonato 7.5% y agua pura estril. Debe aadirse la cantidad necesaria del medio concentrado 10X a la botella que contiene agua. Antes de completar el volumen final de la dilucin se debe ajustar la concentracin final de bicarbonato dependiendo del medio y el pH. En este momento se aade agua pura hasta alcanzar el volumen final requerido, teniendo en cuenta el volumen de glutamina y antibiticos que falten por aadir. El medio puede conservarse en esta etapa a 2-4C o bien se aaden los suplementos. Medios en polvo: La reconstitucin de los medios en polvo requiere una esterilizacin por filtracin, excepto si se utiliza medio en polvo esterilizable en autoclave. Las unidades y sistemas de filtracin van desde los simples filtros que se colocan sobre la botella, hasta los sistemas de presin positiva que incorporan vasijas de presin y filtros de gran capacidad (Figura 2.1). Como primer paso se llena un recipiente grande hasta el 80-90% del volumen final deseado con agua estril bi o tridestilada o desionizada, se pone en agitacin con un agitador magntico, mientras se aade lentamente el medio en polvo. A continuacin se aade el bicarbonato sdico y se ajusta el pH. Si se utiliza un sistema de filtracin con presin positiva, el pH debe ajustarse a 7,0. Si el medio es muy rojo, es necesario aadir cido (en forma de 1M HCl). Por ltimo, debe aadirse agua pura, hasta alcanzar el volumen final deseado. Puede llevarse a cabo una prueba de esterilidad colocando las botellas con medio en una estufa a 37C durante toda la noche y despus se conservan a 2-4C. Antes de utilizar el medio, hay que aadir los suplementos. Medios esterilizables en autoclave: Solo un reducido nmero de medios se presentan en forma esterilizable en autoclave en la actualidad; esto es posible gracias a la no inclusin de los elementos termolbiles, que se aaden despus de la esterilizacin. El polvo se disuelve en agua pura y se ajusta a pH 4,5 (necesario para estabilizar la solucin durante la esterilizacin en autoclave, pero el pH exacto debe comprobarse en las instrucciones que acompaan al medio). Aadiendo agua pura se alcanza el volumen final (con excepcin del volumen necesario para el tampn que se aade despus de la esterilizacin), se dispensa y se esteriliza a 121C, 103,5 kPa durante 15 min. Tras la esterilizacin, se aade la solucin tampn de forma asptica y se reajusta el pH a un valor de 7,0-7,2. Para determinar los volmenes precisos, se deben seguir las instrucciones del fabricante.

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Figura 2.1 Esquema de la filtracin al vaco y algunas unidades de filtracin. Fuente: http://www.biophysica.com/filter.htm, http://docencia.udea.edu.co/cen/tecnicaslabquimico/02practicas/practica07.htm

Suplementos Despus de preparar el medio bsico, deben aadirse otros suplementos, que incluyen: L-glutamina: aminocido imprescindible para las clulas en cultivo. Se encuentra en forma lquida estril o en polvo. El polvo debe reconstituirse con agua bi o tridestilada, se filtra con un filtro desechable en alcuotas y se conserva a -20C. La glutamina en solucin es lbil y tiene una vida media relativamente corta, especialmente a 37C. El medio al que se haya incorporado glutamina debe conservarse de forma rutinaria a 4C, hasta 2 semanas. Antibiticos: son utilizados por muchos laboratorios. Algunas clulas pueden resultar afectadas negativamente por los antibiticos, pero la gentamicina, penicilina y estreptomicina son aditivos frecuentes en los cultivos celulares. Las concentraciones activas habituales son: penicilina 100 unidades/ml; estreptomicina 100 g/ml; y gentamicina 50 g/ml. Suero: el suero todava se utiliza, a pesar de la creciente popularidad del medio sin suero. Habitualmente se emplea a una concentracin del 10% (v/v). El suero fetal bovino es el ms utilizado, aunque debido a las diferencias entre lotes resulta interesante comprobar la eficacia de un suero nuevo sobre el crecimiento celular. En el caso de algunos tipos celulares, pueden emplearse otros tipos de suero, como el de ternero recin nacido, de caballo o humano. Hepes: El Hepes es un sistema alternativo de tampn que puede utilizarse en un sistema cerrado, es decir, sin CO2. Los medios con Hepes normalmente contienen 25 mM de Hepes.
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Leccin 18: El laboratorio de cultivo de tejidos Un laboratorio de cultivo celular debe contar con una infraestructura bsica en la cual se disponga de reas independientes para llevar a cabo la preparacin y esterilizacin de medios y reactivos, un espacio independiente para el proceso de lavado y preparacin de material y un rea destinada exclusivamente al trabajo con cultivos celulares. Dentro de la infraestructura fsica bsica se debe contar con sistemas de refrigeracin y congelacin, incubadoras, centrfugas, balanzas, microscopios y cabinas de flujo laminar. Adicionalmente, se debe disponer de un buen suplemento de material plstico y de vidrio y con sistemas de esterilizacin apropiados para los diferentes tipos de reactivos y material utilizados. La atmsfera del laboratorio de cultivo celular debera encontrarse a una presin ligeramente superior a la del exterior para evitar la entrada de aire que pudiera contaminar los cultivos, adems de contar con buena iluminacin. Autoclaves y hornos de aire caliente Estos equipos se utilizan para eliminar contaminantes potenciales (por ejemplo bacterias) del material empleado en el cultivo celular, como botellas, instrumentos de vidrio o agua para los medios. Las autoclaves pueden ser de muchos tipos pero sus principios bsicos son los mismos. Una vez se cierra el autoclave, se introduce vapor en el sistema, ya sea de forma directa desde una fuente externa o bien mediante agua hirviendo desde una fuente interna. La temperatura y la presin aumentan hasta el nivel seleccionado, normalmente 121C y 15 lb/in2 (103,5 kPa) y se mantiene durante 15 min. Las bacterias, hongos y sus esporas, virus y micoplasmas no sobreviven a esas condiciones, ya que se desnaturalizan protenas. Por otro lado, los hornos de aire caliente son equipos que calientan el aire interior hasta una temperatura dada (180C) y la mantienen durante el tiempo requerido (1 hora para condiciones de esterilizacin). La inactivacin por calor seco tiene menor eficacia y se necesita una temperatura ms alta y un mayor tiempo que los requeridos cuando se utiliza una autoclave. Cabinas para cultivo celular Las cabinas garantizan la existencia de un ambiente controlado para el cultivo de tejidos. En el diseo de las cabinas se consideran dos principios: proteger el cultivo celular del operador (es decir, mantener un ambiente estril) y proteger al operador del cultivo celular (en situaciones de riesgo de infeccin potencial), y se pueden clasificar en: Cabinas de flujo laminar: no ofrecen proteccin al operario, pues al aire estril fluye desde el interior. No se deben emplear en cultivos que representes riesgo potencial a los seres humanos.

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Cabinas de Clase I: ofrecen proteccin al operario y en menor medida al cultivo celular. El aire fluye desde el frontal abierto (pasado el operario) sobre el cultivo celular, y sale por la parte alta de la cabina. Estas cabinas estn en reas de trabajo estriles especialmente diseadas (es decir, el aire estril es absorbido al interior de la cabina), y los usuarios utilizan un vestuario especial de proteccin. Cabinas de Clase II: ofrecen proteccin al operario y al cultivo celular. El aire filtrado entra atravesando el techo de la cabina, desciende sobre el cultivo celular y recorre la zona inferior del rea de trabajo (Figura 2.2). Adems, entra aire desde la mitad abierta del frontal pasado el operario y desciende a travs de la rejilla situada delante de la zona de trabajo. Cabinas de Clase III: Se emplean para trabajar con organismos altamente patgenos. En ellas, el trabajador est separado del material de trabajo por una barrera fsica completa (figura 2.3). Esto se logra normalmente mediante la sustitucin del frontal abierto por vidrio o perspex, con un par de guantes protectores de alta resistencia incorporados, a travs del cual se accede a la zona de trabajo.

Figura 2.2. Diagrama de flujo de aire en una cabina de Clase II. Fuente: Morgan & Darling, 1995

Incubadoras La mayora de los distintos tipos de clulas animales necesitan para su crecimiento ptimo una temperatura de 37C en un medio a pH 7,0-7,2. La naturaleza de los subproductos del metabolismo celular tiende a convertir el medio en ms acido de lo deseable, por lo que se utiliza un sistema tampn que puede
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ser con un aporte de CO2 y bicarbonato, o si se prefiere usar incubadoras secas y sin gas, se emplean sistemas tampn alternativos como el cido morfolinopropano sulfnico (Mops) o el cido N-2-hidroxietilpiperacina-N'-2-etanosulfonico (Hepes).

Figura 2.3 Diagrama de flujo de aire en una cabina Clase III. A. Soporte para los guantes. B. Ventana. C. Filtro HEPA de salida. D. Filtro HEPa de entrada. E. Doble puerta. Fuente: http://web.princeton.edu/sites/ehs/biosafety/livevirusworker/decontamination.htm

Leccin 19: Tipos de cultivos En cultivo de tejidos animales se puede hablar de tres tipos: cultivo de rganos, explantes primarios y cultivos celulares. En la figura 2.4 se ilustran los tres tipos de cultivos y sus diferentes modos de cultivo. 1. Cultivo de rganos: Implica que la arquitectura caracterstica del tejido in vivo se mantiene al menos en parte. Para ello el rgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y al que puede liberar los desechos y en el que mantiene su estructura tridimensional, en general esfrica. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello una buena rplica del tejido de origen, pero por el contrario no permite su propagacin pues el crecimiento, de producirse, se limita a la periferia y es debido fundamentalmente a los tipos celulares embrionarios. 2. Explantes primarios: Fragmentos de tejidos o de rganos que se adhieren a una superficie y en la que proliferan solamente las clulas de la periferia del explante.

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3. Cultivo celular: Supone una disgregacin celular ya sea por medios enzimticos o mecnicos. La suspensin celular se puede cultivar como una monocapa adherente o en suspensin en el medio de cultivo. Este tipo de cultivo permite su propagacin, aumentando notablemente la masa celular del cultivo a lo largo de las generaciones. Como caracterstica negativa se pierde la hetereogeneidad celular de partida, la poblacin se hace uniforme y homognea. En la actualidad los cultivos celulares son los ms empleados fundamentalmente por la posibilidad de propagacin, as como por las ventajas en la cuantificacin, caracterizacin y repetibilidad de las muestras. A fin de compensar la ausencia de interacciones heterotpicas se realizan desde hace unos aos cultivos mixtos con importantes xitos.

Figura 2.4 Tipos de cultivos. A. cultivo de rganos sobre un disco de filtro o sobre una rejilla de acero inoxidable en medio de cultivo. B. Cultivo de explantes en frasco y representacin del crecimiento perifrico. C. Desagregacin enzimtica y mecnica para generar una suspensin celular que formar una monocapa. Fuente: Freshney y Vunjak-Novakovic, 2006

Tipos de cultivos celulares Las lneas celulares se pueden dividir en dos tipos principales: adherentes (clulas en monocapa) y no adherentes (clulas en suspensin). Las clulas adherentes se fijan al material plstico de un frasco o placa y por tanto tienen que desprenderse de esa superficie antes de utilizarlas. Las clulas adherentes derivan de rganos como el msculo, hgado, clulas nerviosas, rin, etc. Las clulas en suspensin normalmente no se fijan a la superficie del recipiente de
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cultivo. Las caractersticas de las clulas en cultivo (in vitro) suelen depender de su procedencia en el animal (in vivo). Por ejemplo, prcticamente todos los cultivos en suspensin derivan de clulas inmunitarias o de precursores de las mismas; in vivo circulan por el torrente sanguneo y no tienden a fijarse (como los linfocitos B y T). Las clulas que crecen en cultivo, ya sean adherentes o en suspensin, suelen clasificarse en primarias, inmortales o transformadas. Las clulas primarias son aquellas recientemente aisladas y por lo general tienen una duracin limitada en cultivo. Las clulas inmortales y las transformadas presentan ambas la propiedad de crecer de forma ilimitada en cultivo. Las lneas celulares transformadas son clulas que derivan de tumores o que han sido manipuladas de algn modo y presentan un nuevo fenotipo transformado. Normalmente, se utiliza el medio RPMI1640 para el cultivo de clulas en suspensin y el DMEM para lneas adherentes. Lneas celulares continuas Las lneas celulares continuas estn formadas por clulas que se diferencian gentica y morfolgicamente de las clulas de las cuales se originaron. Pueden provenir de clulas que se derivan de tumores o de un proceso de transformacin de un cultivo primario mediante transfeccin con oncogenes, o con tratamiento con carcinognicos, por lo que les confiere un nuevo fenotipo. Este tipo de cultivo tiene la caracterstica de crecer de manera indefinida. Tambin, las clulas animales son capaces de secretar protenas funcionalmente activas, gracias al correcto empaquetamiento y las modificaciones post-transcipcionales necesarias para ello, que no se obtienen en sistemas bacterianos ni de levaduras. En la tabla 2.2 se hace un resumen de las principales lneas celulares empleadas en investigaciones biotecnolgicas.

Leccin 20: Aislamiento de clulas para cultivo Para el aislamiento y manipulacin de clulas se deben seguir protocolos estrictos y tcnicas de asepsia. En el caso de eleccin de una lnea celular se debe tener en cuenta que tipo celular es de inters para la investigacin, tipos de tejidos o especies ptimas, grado de homogeneidad necesitado, longevidad de la lnea, caractersticas estructurales y funcionales para su mantenimiento. La principal razn para utilizar lneas celulares es que su manejo es ms sencillo que el de las clulas primarias, pues crecen continuamente y puede obtenerse un mayor nmero de clulas, tambin son ms fciles de obtener y existe una informacin relativamente abundante sobre ellas. En la tabla 2.3 se muestran algunas fuentes de clulas con sus ventajas y desventajas.

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T ABLA 2.2 PRINCIPALES CARACTERSTICAS Y APLICACIONES DE LAS LNEAS CELULARES MS COMNMENTE USADAS EN BIOTECNOLOGA . LNEA CELULAR
CHO dhfr-

CARACTERSTICAS
Clulas ovricas de hamster chino; morfologa epitelial Clulas de tejido ovrico de pupa de Spodoptera frugiperda; rpido crecimiento, alto nivel de expresin de protenas Lnea celular de Drosophila melanogaster Rin de mono verde africano Embrin de ratn, inhibicin por contacto, morfologa de fibroblastos Carcinoma de cerviz humano, morfologa epitelial Mieloma de ratn Rin de mono Lneas celulares inmortales (NSO, Sp2/0-Ag14)) Lneas hibridas estables que retienen las caractersticas de inmortalidad de los mielomas y los diferentes patrones plasmticos de fusin celular Clulas de pulmn de feto humano, morfologa de fibroblastos, clulas diploides, Fibroblastos de rin de hamster sirio Rin de perro cocker spaniel, morfologa epitelial Tumor de pituitaria de rata WistarFurt Lnea celular de rin de embrin humano transformada

APLICACIONES
Produccin de protenas recombinantes Protenas recombinantes empleando el sistema de expresin de baculovirus, insecticidas Protenas recombinantes: 1 antitripsina Para soportar el crecimiento de virus recombinantes SV40 Produccin de IGF-1 Estudios virales Produccin de anticuerpos recombinantes CD4-Ig Vacunas virales: polio, virus hemorrgicos Usadas para producir hibridomas y anticuerpos recombinantes

Sf9

Schneider-2 COS1/COS7 NIH/3T3 Hela J558L Vero Mieloma

Hibridoma

Produccin de anticuerpos monoclonales

WI-38 BHK 21 MDCK

Vacunas virales - rhinovirus Vacunas virales, enzimas Virus animales (SVEV, VSV, vacunas, adenovirus, reovirus, infecciones caninas por hepatitis) Produccin de hormonas de crecimiento y prolactina Aislamiento y transformacin

GH3 293

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T ABLA 2.3 ESPECIES FUENTE PARA EL AISLAMIENTO Y ESTABLECIMIENTO DE LNEAS


CELULARES

ESPECIE
Humano

VENTAJAS
Pertinencia e importancia en el mbito biomdico Rpida disponibilidad Barato Fuente de manipulaciones Disponibles en estados tempranos de desarrollo Barato Fuente para manipulacin de tejidos Tamao Barato Rpida disponibilidad

DESVENTAJAS
Disponibilidad Longevidad limitada principalmente para clulas normales Limitado para clulas normales. Muchas lneas transformadas presentan cambios cariotpicos Citogentica compleja Virus endgenos Longevidad limitada para clulas normales Cambios cariotpicos Infeccin viral con diarrea viral bovina

Roedores

Aves

Bovinos

Ahora bien, en el caso en el que no existan cepas celulares caracterizadas, ni disponibles comercialmente o en bancos celulares, se deber optar por realizar cultivos primarios o secundarios de corto tiempo, y en este caso se debe plantear todo el procedimiento, desde la eleccin del modelo animal, el tipo celular, la tcnica de obtencin (embriones, tejido sanguneo o biopsia), el medio y condiciones de cultivo. A continuacin veremos los principales mtodos a la hora de aislar clulas para cultivos primarios. Cultivo primario Las clulas primarias se consideran ms similares a las clulas in vivo. Las clulas pueden aislarse a partir de sangre completa, rganos (hgado, corazn, rin, etc.) u organismos completos (embriones de pollo). Cada tejido, rgano u organismo presenta sus propios problemas particulares. La diversidad de las preparaciones y orgenes de las clulas es muy alta. Los cultivos celulares primarios son generalmente ms complejos en relacin con sus requisitos de crecimiento que las lneas celulares establecidas. La gama de suplementos requeridos por las distintas clulas primarias para satisfacer su crecimiento es enorme y entre ellos se encuentran los factores de adherencia, colgeno (tipos I, II y IV), fibronectina y gelatina, y poli-L-lisina. Entre las hormonas y los factores de crecimiento se encuentra la insulina, factor de crecimiento II similar a la insulina (IGF-II), interleucina-2 (IL-2), interleucina-3 (IL3), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrofagos (GM-CSF), suplemento para crecimiento de clulas endoteliales (ECGS), hormona
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paratiroidea, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento de epidermis (EGF), hormona estimulante de los folculos (FSH), factor de crecimiento de nervios (NGF), estrgenos y testosterona. Cada tipo de clula primaria requiere su propia mezcla de factores particulares. Las lneas celulares primarias humanas crecen durante un tiempo variable pero finito en cultivo; tras ese tiempo, entran en senescencia y mueren. Algunos tipos celulares humanos son fciles de conseguir, como la sangre humana que puede obtenerse de voluntarios (linfocitos y monocitos), o de cordn umbilical (linfocitos del cordn, clulas endoteliales venosas y clulas musculares lisas). En ocasiones, puede disponerse de otros tipos celulares, como los de prepucio (fibroblastos) y piel (fibroblastos). Sin embargo, muchos otros tipos celulares son imposibles de obtener excepto en circunstancias excepcionales (por ejemplo, hgado, rin, bazo, tiroides, pncreas normales). Ejemplos de cultivos celulares primarios se esquematizan a continuacin (Figuras 2.5 y 2.6). El primero tiene poca necesidad de factores de adherencia o de suplementos promotores del crecimiento (fibroblastos de embrin de pollo). Y el otro tipo celular no prolifera en cultivo (hepatocitos de rata).

Aislamiento de Fibroblastos de Pollo


10 12 embriones de pollo (Huevos frtiles 10 das de incubacin) Desinfeccin superficial con etanol 70% Rompimiento del huevo por el polo ancho y extraccin del embrin Separacin de la cabeza y el cuerpo del embrin Extraccin de rganos inertes Lavados de los embriones Trituracin en trozos pequeos Adicin de tripsina y agitacin suave Obtencin de lquido sobrenadante Centrifugacin: Las clulas se encuentran en el pellet Filtracin de la solucin celular en tamiz de 200 m Centrifugacin y resuspensin en medio de cultivo Conteo y siembra en frascos con medio de cultivo (DMEM + suero, u otros medios bsicos)
Adicin de solucin salina de Hank y suero fetal

En presencia de solucin salina de Hank

En solucin salina de Hank En presencia de solucin salina de Hank Digestin enzimtica y mecnica

Hasta 30 pases o subcultivos

Figura 2.5 Esquematizacin del mtodo de obtencin de fibroblastos de pollo.

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Aislamiento de Hepatocitos de Rata
Perfusin del hgado con medio sin Ca +EDTA Segunda perfusin con medio + colagenasa + iones Ca Disecacin del hgado de la cavidad abdominal Traspaso de hgado a tampn de bicarbonato + CaCl2 1mM Trocear el hgado con tijeras Retirar la suspensin celular y filtrar (tamiz de 100 m) Centrifugacin (50g x 5) Las clulas de inters se encuentran en el pellet Mltiples lavados de las clulas por centrifugacin Ultimo lavado en el medio elegido para el cultivo Cultivo en medio + suero + antibiticos y/o aa Recambios diarios de medio

Determinacin de viabilidad con azul de tripano Formacin de una monocapa

Figura 2.6 Esquematizacin del mtodo de obtencin de hepatocitos de rata.

Recomendaciones bsicas para el aislamiento de clulas Los cultivos celulares deben ser monitoreados con frecuencia, por ejemplo el color del medio puede indicar cambios de pH, un color amarillo puede indicar una concentracin muy alta de CO2, o bien un sobrecrecimiento de las clulas; un medio de color rojo/prpura intenso indica un aporte de gas inadecuado, ya sea porque las tapas de los frascos no fueron debidamente aflojadas o porque el suministro de CO2 se ha terminado; por otra parte si el medio esta turbio, es probable que haya una contaminacin. Los cultivos adherentes deben ser examinados con un microscopio invertido con ptica de contraste de fases. Las clulas adherentes deben expandirse en forma de tapiz sobre el soporte de plstico. Normalmente, las clulas son inhibidas por contacto y dejan de crecer al hacerse confluentes, es decir cuando no hay substrato entre ellas. Habitualmente, las clulas deben subcultivarse antes de que sean totalmente confluentes. Las clulas en suspensin no deberan verse adheridas al sustrato normalmente (aunque en algunos casos puede inducirse su adhesin) y las clulas sanas aparecen redondeadas y con membranas lisas, a diferencia de las clulas adherentes. La elaboracin de una curva de crecimiento permite familiarizarse con la concentracin celular relativa y su correspondiente grado de confluencia tanto para clulas adherentes como para clulas en suspensin.
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CAPITULO 5: Principios, metodologas y tcnicas 2

Introduccin Los cultivos de clulas animales tienen aplicacin, como tcnicas nicas o complementarias de otras, en un gran nmero de lneas de investigacin. De esta forma han sido fundamentales para numerosos avances cientficos alcanzados en distintas ramas de las ciencias biomdicas y biolgicas. As por ejemplo, las tcnicas de cultivo celular permiten el estudio de las propias clulas, su metabolismo, el control del ciclo celular, la modulacin de la expresin gnica, el cultivo de virus, la clonacin y el estudio de numerosos aspectos relacionados con el cncer y su diagnstico, por citar slo algunos ejemplos.

Leccin 21: Contaminacin Si la contaminacin se define como un componente en el sistema del cultivo celular que ejerce un impacto negativo en el cultivo o en su uso, los contaminantes de un cultivo celular se pueden agrupar en tres categoras: fsicos, qumicos y biolgicos. Las fuentes y consecuencias de la contaminacin son nicas para cada tipo celular y para cada contaminante. Algunas recomendaciones esenciales para la tcnica bsica de manipulacin estril incluyen el empleo de pipeteadores y pipetas automticas; el trabajo se debe realizar en un ambiente estril, en una cabina de flujo laminar o en el rea de influencia de un mechero bunsen, manteniendo el orden dentro de la cabina; los recipientes abiertos deben mantenerse tan poco tiempo como sea posible; ante cualquier duda limpiar con alcohol 70 % o flamear el material que pueda estar contaminado si no es reemplazable, o reemplazarlo si es posible. De todas formas las precauciones a tomar son muchas y la nica forma de aprender es practicar bajo supervisin. A continuacin se listan los tres diferentes tipos de contaminacin que se pueden presentar as como algunas recomendaciones para evitarlas. 1. Contaminantes fsicos. Son fenmenos externos que afectan al cultivo celular, tales como: temperatura, radiacin, irradiacin y vibracin. La exposicin del medio, de los componentes del medio y de los cultivos celulares a la radiacin, irradiacin y temperaturas extremas pueden elicitar respuestas metablicas en los cultivos celulares, como la sincrona del ciclo celular, reduccin de la tasa de crecimiento y muerte celular. Para evitar el impacto del medio ambiente fsico en los cultivos celulares, por ejemplo, se debe ubicar las incubadoras en un lugar donde la temperatura permanezca razonablemente constante, alejadas de equipos que puedan crear vibracin como las centrifugas. El medio, los componentes del
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medio y los cultivos celulares pueden ser guardados en sitios especficos del laboratorio en donde se minimice la exposicin a la luz y a temperaturas extremas entre otros. Los medios no se deben guardar en neveras que tengan puertas de vidrio o translucidas, ni cerca de radioistopos. 2. Contaminantes qumicos. La contaminacin qumica puede provenir de diversas fuentes, y no siempre da como resultado un efecto negativo como la toxicidad, se podra dar el caso de que el contaminante estimule el crecimiento si uno de los elementos del medio o el suplemento llegara a estar contaminado con un factor estimulante como una hormona. Sin embargo, uno de los contaminantes qumicos ms probables o comunes son los residuos de jabn o detergente, que quedan en el material despus del lavado. Las fuentes de contaminacin qumica pueden ser los contenedores y materiales de plstico, los reactivos (deben ser de la ms alta pureza), el agua (puede contener impurezas como iones de metales, compuestos orgnicos, endotoxinas bacterianas), el suero (existe muchas variacin entre lotes) y los suplementos. Los nutrientes esenciales como los aminocidos pueden ser txicos para un cultivo celular si se presentan en concentraciones que exceden el rango ptimo para el crecimiento celular. 3. Contaminantes biolgicos. La contaminacin biolgica de un cultivo celular puede ser el resultado de un nico organismo que se introduce al cultivo y es capaz de replicarse. Esta contaminacin puede ser en forma de otras lneas celulares, insectos, artrpodos, protozoarios, mohos, levaduras, virus, bacterias y micoplasmas. Existen muchos test y tcnicas para determinar los diferentes tipos de contaminacin biolgica. Para confirmar la identidad de una lnea celular se pueden realizar anlisis cariotpicos y de isoenzimas. Se pueden realizar tests de esterilidad de los medios para detectar bacterias y hongos. Para detectar contaminacin por micoplasmas se necesita de una batera mayor de ensayos adems del test de esterilidad. Existen varios ensayos in vitro e in vivo para determinar si una lnea celular determinada se encuentra libre de virus contaminantes. Estos procedimientos incluyen el empleo de anticuerpos de hamsters, ratas y ratones, ensayos de transcriptasa reversa, hemaglutinacin y ensayos de hemabsorcin. La identificacin de un contaminante biolgico es crucial a la hora de validar resultados. En general el empleo de una buena tcnica asptica y test de control de calidad para prevenir la contaminacin por micoplasmas pueden prevenir la contaminacin por cualquier otro contaminante biolgico. Las especies ms comunes de micoplasmas que se han encontrado en cultivos de clulas humanas son: Mycoplasma orale, M. fermentans y M. salivarium. Los micoplasmas alteran el metabolismo del cultivo celular, activando una cascada de eventos metablicos que dan como resultado niveles alterados de protenas y de sntesis de RNA y DNA. En general la contaminacin por micoplasmas puede generar mltiples cambios en la lnea celular que inevitablemente ocasionaran errores en los experimentos.
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Como prevencin y control, el primer paso es determinar la existencia de la contaminacin. Para esto se deben eliminar los antibiticos del cultivo celular para determina la existencia de contaminacin bacteriana o por micoplasmas. Se debe seguir una tcnica asptica muy rigurosa y que todo el personal encargado del manejo de los cultivos la siga. Los reactivos y medios deben ser de la mejor calidad y su preparacin debe ser muy cuidadosa. Se deben tener cultivos maestros preferiblemente congelados y que estn certificados de estar libres de contaminantes. Para que en el caso de encontrar contaminacin, se puedan reemplazar los cultivos. Para la deteccin de contaminantes biolgicos existen mtodos directos e indirectos. En los mtodos directos se emplean lneas celulares, que hacen crecer en medios con todos los suplementos a excepcin de los antibiticos y por un tiempo prolongado para permitir el crecimiento del contaminante. Despus se evala el crecimiento de la lnea celular y se hacen extracciones que se pueden revisar al microscopio o con colorantes especiales como el Hoechst 33258, que permiten evaluar la presencia de micoplasmas (Figura 2.7). En los mtodos indirectos se encuentran: La PCR (reaccin en cadena de la polimerasa), tinciones de fluorocromos de DNA, ELISA, pruebas de DNA, microscopia electrnica y ensayos bioqumicos. Los mtodos indirectos detectan concentraciones de 10 4 micoplasmas por ml, pero estos mtodos varan en su capacidad de detectar un amplio rango de especies.

Figura 2.7 Clulas infectadas con micoplasma y teidas con Hoechst 33258. Las clulas presentan fluorescencia extranuclear debida a la presencia del DNA de micoplasmas en el citoplasma. Fuente: Doyle & Griffiths, 1998.

Leccin 22: Caracterizacin y Autenticacin La investigacin y desarrollo con lneas celulares requiere de un conocimiento preciso de la pureza y la especie del origen de la lnea celular que se emplear en la investigacin. Esto se puede lograr con el monitoreo constante de
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la lnea para evaluar la posible contaminacin con otras clulas y para determinar las caractersticas que autentican la lnea celular. Debido a los mltiples desarrollos de la investigacin farmacutica, biomdica y biotecnolgica, el conocimiento y certificacin de una lnea celular es de gran importancia para todas las conclusiones y resultados que se deriven de estas investigaciones. En la tabla 2.4 se hace una comparacin gruesa de las caractersticas de las tcnicas de autenticacin ms comunes.

T ABLA 2.4 COMPARACIN DE LAS TCNICAS DE AUTENTICACIN CELULAR Anlisis citogentico


Determinacin de especie Rpida identificacin de una lnea celular Deteccin de variacin en una lnea celular Reconocida por autoridades regulatorias a : ampliamente usado b?: bajo consideracin
a

Anlisis por isoenzimas

Perfiles de DNA fingerprinting

Anlisis citogentico La examinacin del contenido cromosomal de una lnea celular es un mtodo directo de confirmar la especie de origen de la lnea celular, y para determinar si existen aberraciones en el nmero y morfologa de los cromosomas. Para preparar un cultivo para un anlisis citogentico, este debe ser incubado con colcemid (o colchicina) por 2 horas aproximadamente, suspendido, centrifugado, resuspendido en solucin hipotnica y fijado en una solucin de metanol-cido actico (carnoy). Las clulas fijadas son goteadas en lminas portaobjetos para obtener cromosomas en metafase. Las lminas se pueden teir con una variedad de tcnicas, cada una de las cuales aporta informacin diferente. Estas tcnicas incluyen la tincin con Giemsa, bandeo con tripsina-Giemsa, tincin con mostaza de quinacrina, bandeo C, bandeo con Hoechst 33258, Bandas G-11, y FISH. La tincin de metafases con Giemsa se emplea para contar el nmero de cromosomas y determinar la ploidia. Se deben examinar al menos 100 metafases
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por cultivo. El bandeo con tripsina-Giemsa permite asignar todos los cromosomas al cariotipo (Figura 2.8). Otros mtodos de tincin tienen aplicaciones ms especficas. Por ejemplo, la mostaza de quinacrina muestra rpidamente la presencia del cromosoma Y humano. El bandeo C, localiza los centrmeros, mientras que el Hoechst 33258 y el bandeo G-11 se emplean para estudios particulares de hbridos interespecies.

Figura 2.8 Cariotipo humano con tincin tripsina-Giemsa. Se muestran los cromosomas normales y los marcadores cromosomales. Fuente: Mather & Barnes, 1998.

La tcnica FISH es particularmente poderosa, es un mtodo altamente especializado empleado para reunir el anlisis citogentico con determinacin de la ploidia, aneuploidia, identificacin de marcadores cromosomales, deteccin de deleciones y deteccin de fragmentos de cromosomas especie-especficos en clulas hibridas. El FISH es particularmente usado en el anlisis de translocaciones cuando el segmento translocado no se puede determinar por las tcnicas comunes de bandeo. Anlisis por isoenzimas El anlisis por isoenzimas es usado para la determinacin de lneas celulares y para la deteccin de contaminantes en una lnea dada. Las isoenzimas son enzimas que exhiben polimorfismos inter e intraespecies, y cada especie posee un patrn de movilidad electrofortica definida para sus isoenzimas. Este
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mtodo ofrece la facilidad de ser rpido y ser altamente sensible. Ciertas protenas analizadas isoenzimticamente pueden sufrir modificaciones posttranscripcionales, las cuales varan con el tipo celular. Esto ofrece una caracterstica adicional y es que pueden servir como marcadores del tipo de tejido origen en un estado de desarrollo dado. DNA fingerprinting El mtodo de DNA fingerprinting se basa en la existencia de regiones de secuencias dispersas e hipervariables repetidas en tandem a lo largo del genoma. Polimorfismos en estas regiones le otorgan a las especies la existencia de mltiples alelos diferentes, cada uno poseedor de una secuencia repetida en tandem con sus propias caractersticas. Las secuencias con varias repeticiones de un tamao de 15 pb se conocen con el nombre de minisatelites (o VNTRs por variable number of tandem repeats). Las secuencias son repeticiones en tandem ms cortas (1 a 5 pb) se conocen como microsatelites (o STRs por short tandem repeats). Se han descrito muchos mtodos para el DNA fingerprinting de lneas celulares. Uno de estos involucra el anlisis por RFLPs (restriction fragment length polymorphism) y la tcnica de Southern blot usando multilocus de sondas VNTRs, que se unen a diferentes regiones hipervariables distribuidas en distintos cromosomas. Otra alternativa es el empleo del anlisis por RFLPs de un solo locus polimrfico (SLP) y las sondas que detectan un nico VNTR polimrfico de un nico loci. Otro mtodo rpido para la obtencin de DNA fingerprinting en lneas celulares humanas involucra la amplificacin por PCR de locus polimrficos o de mltiples VNTRs o SRTs, el procedimiento se conoce como AmpFLP (amplified fragment length polymorphism).

Leccin 23: Cuantificacin celular A la hora de realizar estudios comparativos y en muchos de los pasos del cultivo celular es necesario cuantificar la poblacin celular. Clsicamente, este conteo se realiza en un microscopio con una cmara de conteo (hemocitmetro) y en presencia de un colorante vital (por ejemplo, el azul de tripano) para distinguir las clulas viables de las muertas. Pero estas tinciones llegan a ser subjetivas y el conteo no da una idea de la relacin tamao/masa. Tambin existen contadores automatizados de clulas (clulas totales) en cultivos celulares que no forman agrupaciones en las suspensiones celulares. Otro mtodo que se emplea es el conteo de ncleos luego de disolver los citoplasmas, mtodo usado generalmente en los cultivos que forman agrupaciones celulares, en las cuales las clulas son inaccesibles (por ejemplo en matrices) o en donde es difcil la tripsinizacin de los substratos. Si la viabilidad es el factor importante a medir, se puede emplear la
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tcnica de contar las clulas que son capaces de dividirse empleando el mtodo del ndice mittico. Cuando el conteo directo no es posible, como en una monocapa o en clulas inmobilizadas en matrices, se deben tomar medidas indirectas. Ejemplos de esto son el consumo de glucosa y oxigeno, o de otros metabolitos como cido lctico, cido pirvico y dixido de carbono. Un parmetro ampliamente usado es la medicin de la concentracin de lactato deshidrogenada, ya que sta es liberada al medio a medida que las clulas mueren. Conteo con hemocitometro La cmara Neubauer, tambin conocida como hemocitmetro, consta de un cubreobjetos de cuarzo y un portaobjetos de un grosor mayor a los de uso comn. En la parte superior del portaobjetos se encuentran cuatro canales longitudinales y uno transversal central. En la parte superior e inferior del canal transversal estn grabadas dos rejillas de 9 mm2 de superficie, las cuales estn a su vez subdivididas en una cuadrcula ms pequea. Usando el objetivo de 10X de un microscopio ptico, se enfoca de forma que en el campo se cubra un cuadrado cuya rea corresponda a 1 mm2. El rea del cuadro central es de 1 mm 2 y se encuentra subdividida en 25 cuadrados. Una vez se ha contado el nmero de clulas de uno de estos cuadrados, el nmero de clulas en 1 ml de suspensin es ese valor multiplicado por 104. Para realizar el conteo celular se debe preparar una suspensin homognea de clulas mediante agitacin suave del frasco de cultivo. Se extrae un pequeo volumen de la suspensin y se mezcla con suavidad con un volumen igual de tripano azul al 0,5% (w/v) en un tubo pequeo. Para determinar la viabilidad del cultivo celular, puede repetirse el recuento sin utilizar azul de tripano y se comparan las dos cifras para obtener el porcentaje de clulas vivas. Curva de crecimiento Es importante elaborar una curva de crecimiento para determinar las caractersticas de crecimiento de las clulas que se estn cultivando. Son sencillas de realizar y dan informacin sobre la frecuencia de los pases, adems de que permiten predecir el nmero de clulas viables disponibles para necesidades futuras. Las clulas en suspensin deben diluirse a 1 x 10 5/ml y subcultivarse a tres frascos en el da 0. Cada uno de esos cultivos debe contarse diariamente, durante al menos 5 das. Se debe anotar la concentracin celular y el tiempo en horas. Las clulas adherentes deben subcultivarse a 1 x 10 5 para una placa de 90 mm. Se preparan tres cultivos para cada da durante 5 das, es decir, cultivos que se inician en el da 0. Esto se debe a que las clulas adherentes tienen que tripsinizarse, por lo que, cada cultivo solo puede emplearse una vez. De nuevo, durante 5 das se cuentan tres cultivos diarios, y se registra la concentracin
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celular y el tiempo en horas. En la figura 2.9 se ilustra la elaboracin de curvas de crecimiento de clulas adherentes y en suspensin.

Figura 2.9 Elaboracin de una curva de crecimiento. A. para clulas en suspensin y B. para clulas adherentes. Fuente: Morgan & Darling, 1995

Las curvas de crecimiento se pueden realizar utilizando papel estndar para graficas pero es ms sencillo emplear papel semilogartmico (es suficiente con dos o tres ciclos). El grfico puede presentar una fase de eclipse inicial en la que el crecimiento celular es escaso, y posteriormente la concentracin se incrementar de forma logartmica (fase exponencial), apareciendo en forma de lnea recta. Tras varios das, la tasa de incremento celular se frena y en ocasiones ya no aumenta (fase de meseta) e incluso puede comenzar a disminuir. La figura 2.10 presenta un ejemplo de una curva de crecimiento tpica. El tiempo de duplicacin del cultivo, una vez calculado para una lnea celular, permite predecir la concentracin celular probable en cualquier momento futuro. Las clulas deben subcultivarse antes de que alcancen una concentracin en la que se frene el crecimiento, por lo que es importante determinar las curvas de crecimiento de todas las lneas celulares.

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Figura 2.10 Curva de crecimiento tpica de un cultivo celular Fuente: Morgan & Darling, 1995

Ensayo MTT Es un mtodo colorimtrico sensible y de cuantificacin, se emplea para determinar viabilidad, proliferacin y activacin celular. Este ensayo est basado en la capacidad de la enzima mitocondrial deshidrogenasa que en las clulas vivas convierte el substrato amarillo hidrosoluble 3-(4,5-dimetiltiazol -2) -2-5dimetil bromuro tetrazolium (MTT) en un producto de formazan de color azul oscuro, cuya cantidad es directamente proporcional al nmero de clulas vivas. Ensayo del Rojo Neutral (NR) El rojo neutral (3-amino-7-dimetil-2.metilfenazina hidrocloridrato) es soluble en agua, es un colorante supravital que se acumula en los lisosomas de las clulas viables. La acumulacin de NR en los lisosomas ocurre por la unin de NR a las cargas acidas fijas, as como a los polisacridos en la matriz de los lisosomas. En las clulas daadas o muertas el NR no es retenido en las vacuolas citoplasmticas y la membrana citoplasmtica no acta como una barrera para mantener el NR dentro de la clula. Ensayo LDH La medicin de lactato deshidrogenasa (LDH) de los sobrenadantes de un cultivo da un valor cuantitativo de la prdida de viabilidad celular. La actividad de LDH puede ser medida como la reduccin de piruvato a lactato. La reduccin es seguida por la oxidacin de NADH a NAD+ la cual puede ser seguida espectrofotomtricamente a 360 nm.
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Leccin 24: Transfeccin La transfeccin es la introduccin de DNA extrao en clulas eucariotas receptoras, en trminos generales es la contrapartida de las tcnicas de transformacin en clulas procariotas. Una clula transfectada representa el resultado de la combinacin de disciplinas que van de la biologa molecular, la microbiologa y la biologa celular hasta el cultivo celular. Las tcnicas de transfeccin celular, han permitido en gran medida, ampliar los conocimientos acerca de la regulacin gnica y de la funcin de las protenas en los sistemas celulares. Actualmente se emplean en gran nmero de aproximaciones experimentales, en la generacin de animales transgnicos, en la seleccin de lneas celulares modificadas, entre otras. Los mtodos de transfeccin se pueden clasificar en qumicos, fsicos y biolgicos. Los mtodos qumicos se basan en la formacin de complejos que las clulas sean capaces de adquirir e incorporar, bien sea directamente mediante la ruta endoctica (fosfato clcico, DEAE dextrano) o a travs de las membranas (lipofeccin). Los mtodos fsicos se basan en hacer entrar las molculas a las clulas por la fuerza, para esto existen tcnicas especializadas como la microinyeccin y la electroporacin. Los mtodos biolgicos se valen de vectores virales (transduccin) y de vectores bacterianos (bactofeccin). En la tabla 1.6 se encuentran resumidas algunas ventajas y desventajas de los mtodos de transfeccin.
T ABLA 2.5 COMPARACIN DE LOS MTODOS DE TRANSFECCIN EN CLULAS ANIMALES MTODO
Transfeccin qumica

VENTAJA
Altamente efectivo en cultivos celulares Sin limitaciones en tamao de transgen Relativamente simple Rpido y repetible Alta eficiencia en la transferencia Sin limitaciones en tamao de transgen No dependiente del tipo celular Disponible para aplicaciones clnicas Alta eficiencia en la transferencia de genes Posibilidad de marcaje clulaespecfico

DESVENTAJA
Limitado en trminos de aplicaciones clnicas Algunas formulaciones son costosas Dependencia del tipo celular

Transfeccin fsica

Requerimiento de instrumentos especializados Clonaje complejo Costoso Necesita condiciones de bioseguridad Se puede provocar respuesta inmune en mamferos Necesita condiciones de bioseguridad Se puede provocar respuesta inmune en mamferos No se ha estudiado completamente

Transduccin (vectores virales)

Bactofeccin (vectores bacterianos)

Alta eficiencia en la transferencia de genes

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Mtodos qumicos Estos mtodos tienen como ventaja, frente a los otros mtodos, su simplicidad, facilidad de produccin y su relativa baja toxicidad. 1. Mtodo del fosfato clcico: Se realiza una mezcla de DNA con iones calcio, con una subsiguiente adicin de fosfato a la mezcla y la presentacin de la solucin final a las clulas en cultivo. En esta situacin co-precipitan el DNA y los iones calcio formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las clulas. La eficiencia de transfeccin puede ser mayor al 50% dependiendo del tipo celular y del tamao y calidad del precipitado que se forma. 2. Mtodo del DEAE dextrano: Los polmeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las molculas de DNA a travs de interacciones electrostticas formando complejos. Cuando estos complejos son adicionados a las clulas, se unen la membrana plasmtica que est cargada negativamente y son internalizados por endocitosis. La eficiencia de la transfeccin por este mtodo es alta, reportndose eficiencias mayores al 80%. 3. Lpidos catinicos: Se basa en la formacin de un complejo entre lpidos catinicos y DNA el cual tiene afinidad por la membrana y as ocurre la entrada del DNA en el citosol (figura 2.11). Existen un gran nmero de lpidos que se emplean en lipofeccin, aunque existe una estructura consenso de un lpido catinico sinttico, a partir de la cual se han diseado muchas variantes (por ej. DOTMA). Se obtienen buenas eficiencias de entre el 70 y el 90% de las clulas de la placa.

Figura 2.11 Formacin de un liposoma y su endocitosis. Fuente: http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/fpintro.html

4. Polmeros catinicos: Los polmeros catinicos son un grupo de molculas altamente solubles en agua. Algunos de los polmeros catinicos
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usados en transfeccin son polilisina, espermitina e histona. Como en el caso de los lpidos catinicos se forman complejos con el DNA. Los complejos formados entre el polmero y el DNA se llaman poliplexos, que cuando son adicionados a las clulas en cultivo, son tomados por las clulas. Comparados con los lpidos cationes, la mayor desventaja que presentan es la relativamente alta toxicidad. Mtodos fsicos Estos mtodos se basan en la introduccin mecnica de molculas al interior de la clula. 1. Microinyeccin directa: Es una tcnica muy efectiva aunque laboriosa. Es el mtodo que se emplea en la introduccin del DNA recombinante en las clulas embrionarias en el proceso de obtencin de animales transgnicos. Permite la introduccin mecnica de soluciones en el interior de la clula mediante una micropipeta que se controla con la ayuda de un micromanipulador bajo un microscopio (Figura 2.12).

Figura 2.12 Microinyeccin Fuente: http://transgenese.crchul.ulaval.ca/knockout.htm

2. Electroporacin: La electroporacin es una tcnica que se basa en la aplicacin de un elevado voltaje a las clulas durante un periodo de tiempo muy corto, tiempo durante el cual las clulas despolarizan sus membranas y se forman pequeos orificios por los que penetran las molculas (protenas, DNA,...). Esta tcnica se aplica a millones de clulas a la vez y habitualmente se obtienen eficiencias de entrada de las molculas del 100% de las clulas que sobreviven (centenares de miles a millones).

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Transduccin La transduccin se puede definir como el proceso de transferencia gentica desde una fuente donadora a una clula receptora mediante partculas virales, que pueden ser bacterifagos u otros agentes virales. Un ejemplo de lo anterior es la transfeccin mediada por retrovirus. Los retrovirus son virus cuyo material gentico est compuesto por RNA. La transferencia de genes mediada por vectores retrovricos aprovecha la capacidad del virus para infectar a la clula hospedadora e integrarse en su genoma al mismo tiempo que se impide que el virus se replique en la clula infectada. Bactofeccin La transferencia de plsmidos de DNA a clula eucariotas mediada por bacterias o bactofeccin, es una tcnica reciente y novedosa en la cual una bacteria transportadora de un plsmido es introducida a la clula a transformar, posteriormente libera el plsmido y es parcial o totalmente destruida. Este mtodo no es ampliamente usado pero se hacen esfuerzos para mejorar los resultados obtenidos a travs de ella. Mediante esta metodologa se ha logrado expresar en las clulas transfectadas protenas antgenos, toxinas y enzimas.

Leccin 25: Clulas madre La capacidad de multiplicarse es inherente a toda clula viva. Sin embargo, en organismos complejos como los mamferos, integrados por una gran variedad de clulas, esta capacidad se manifiesta de muy diversas formas y con grados distintos. En este sentido, las llamadas clulas madre se definen por ser capaces de dividirse generando nuevas clulas madre y, adems, poder diferenciarse, en el curso de su multiplicacin, lo que da lugar a distintos tipos celulares. As ocurre con las clulas madre ms conocidas, las de la mdula sea, que son las encargadas de originar diariamente en el organismo, tipos celulares tan dispares como los glbulos rojos, los leucocitos o las plaquetas mediante el proceso biolgico conocido como hematopoyesis. No obstante, existen otras muchas clulas madre, tanto en los tejidos del organismo adulto como, especialmente, en el embrin a lo largo de las diferentes etapas de su desarrollo. La facultad de multiplicacin y diferenciacin de las clulas madre, independientemente del grado en que la posean, se puede materializar no slo en el organismo adulto o embrionario, sino tambin en cultivos en condiciones de laboratorio. Por ello se han desarrollado metodologas para cultivar clulas madre de manera controlada, para inducir su diferenciacin con el objeto de generar tipos celulares distintos, que pudieran servir para la regeneracin de tejidos u rganos daados por procesos patolgicos. Al menos en teora, son muchas las
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enfermedades cuyo tratamiento podra beneficiarse del empleo de esta terapia celular, si bien conviene aclarar que nos encontramos en los primeros estadios de este tipo de investigaciones y que an queda mucho por conocer. Est bien establecido que no todas las clulas madre tienen el mismo potencial de generacin de tipos celulares distintos, lo que permite diferenciar entre clulas madre totipotentes, pluripotentes y multipotentes. 1. Clulas madre totipotentes: Se dan slo en fases muy tempranas del desarrollo embrionario y son capaces de generar cualquier tipo celular. Adems son capaces de generar las membranas y tejidos, como la placenta, que soportan el desarrollo del feto, por lo que seran capaces de originar un organismo completo, y de ah que se les otorgue la propiedad de la totipotencia. 2. Clulas madre pluripotentes: En fases posteriores del desarrollo embrionario las clulas del embrin pierden el carcter totipotente y solamente pueden producir clulas madre de tipo pluripotente, capaces de originar cualquier tipo de clulas del organismo adulto, pero no de generar un organismo completo. Existe un caso muy especial de clulas madre pluripotenciales provenientes de estadios tardos del desarrollo embrionario. Son las llamadas clulas madre germinales y se pueden obtener a partir de las clulas primitivas de las crestas germinales de fetos abortados. 3. Clulas madre multipotentes: Las clulas madre se pueden encontrar en algunas localizaciones en el organismo adulto siendo capaces, en determinadas condiciones, de generar algunos tipos celulares. Su plasticidad es menor por lo que poseen una cierta multipotencia. De acuerdo con lo anterior, conviene resaltar que las clulas madre pueden proceder del embrin (clulas madre embrionarias) o del organismo adulto (clulas madre adultas). Las primeras son las responsables de generar los ms de doscientos tipos celulares distintos presentes en el organismo adulto. A lo largo del desarrollo embrionario existe una gradacin en cuanto a la posible potencialidad de generacin de tipos celulares por parte de las mismas, que va de la totipotencia a la pluripotencia en diverso grado. Por el contrario, las segundas cumplen una funcin biolgica determinante al ser las responsables del recambio de las clulas daadas en el mismo y, por lo tanto, de la preservacin de la integridad y la funcin del tejido en que se encuentran. Las clulas madre embrionarias se caracterizan por su capacidad de multiplicacin indefinida, que les permite adems generar una progenie de clulas especializadas de muy distintos tipos. No estn diferenciadas a trmino, sino que, tras completar un proceso de divisin y dependiendo del ambiente en que se produce su multiplicacin, las clulas hijas pueden permanecer como clulas
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madre o iniciar un proceso de diferenciacin. La posibilidad de conocer los procesos que gobiernan la diferenciacin celular, para generar tal variedad de fenotipos celulares, es la base del inters cientfico de los estudios con clulas madre embrionarias. Slo a partir de ese conocimiento cabe pensar en dirigir estos procesos para originar cultivos celulares, o cultivos de tejidos in vitro, que pudieran sustituir in situ a los tejidos daados por procesos patolgicos, desarrollando las correspondientes aplicaciones mdicas de estas investigaciones. Hay varias fuentes de obtencin de clulas madre embrionarias pluripotentes. La primera de ellas son los teratocarcinomas o carcinomas embrionarios que no tienen un origen estrictamente embrionario. Se trata de tumores gonadales que contienen una amplia variedad celular, representativa de las clulas derivadas de las tres capas celulares que forman un embrin. La segunda fuente de obtencin son los embriones generados por fecundacin de un vulo con un espermatozoide. Se han cultivado clulas madre embrionarias procedentes de blastocistos de ratn y de blastocistos humanos. Las clulas as cultivadas parecen tener la capacidad de poder mantenerse en cultivo indefinidamente. Tambin es posible obtener clulas pluripotentes a partir de tejidos de fetos abortados. Si se quiere obtener un cultivo o lnea celular de clulas madre embrionarias (figura 2.13), el proceso comienza aislando, con tcnicas de microciruga, la masa celular interna del embrin. Esta masa de clulas se coloca sobre un soporte de vidrio o plstico donde existe un lquido rico en los nutrientes que necesitan las clulas para multiplicarse y crecer. Conforme las clulas van dividindose y aumenta su nmero, se va repitiendo el proceso. As al final se obtiene una lnea celular de clulas embrionarias.

Figura 2.13 Estrategia de obtencin de un cultivo de clulas madre de embrin. Fuente: www.smartplanet.es/articulos.php?id=9-4-4

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Se ha abordado la posibilidad de emplear clulas madre embrionarias para llevar a cabo tratamientos de enfermedades en animales de experimentacin. Utilizando un modelo animal, se ha puesto de manifiesto cmo las neuronas dopaminrgicas, derivadas de clulas madre embrionarias, pueden funcionar adecuadamente en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Tambin se ha descrito la correccin de la diabetes en ratones con diabetes experimental con clulas productoras de insulina derivadas de cultivos de clulas madre embrionarias. Conviene destacar que todos estos experimentos se consideran preliminares, requieren la inmunodepresin de los ratones para evitar los problemas de rechazo inmunitario y son objeto de controversia. En cuanto a las clulas madre adultas, existe en el adulto una generacin de clulas con una cierta plasticidad. Son stas las clulas somticas que merecen el nombre de clulas madre adultas. stas dan lugar a clulas especializadas mediante la generacin de otras con especializacin intermedia llamadas progenitoras. Las clulas progenitoras estn determinadas para originar un tipo celular concreto, en funcin de la situacin en la que se encuentran en relacin con clulas vecinas. Por ejemplo, las clulas progenitoras del intestino estn situadas en la base de las criptas intestinales. Estas clulas se dividen con gran frecuencia pero permanecen como un grupo de reserva para dar lugar a clulas del intestino. Por tanto, las clulas madre adultas no poseen el grado de indefinicin funcional de las clulas madre embrionarias debido al ambiente celular vecino. El conjunto de tejidos adultos conocidos en donde se encuentran clulas madre se incrementa de forma continua. Actualmente incluye la mdula sea, sangre perifrica, cerebro, columna vertebral, pulpa dental, vasos sanguneos, msculo esqueltico, epitelio de la piel y del sistema digestivo, cornea, retina, hgado y pncreas. Las clulas madre adultas son escasas dentro de los tejidos que las albergan siendo sta una de las razones que hacen difcil su identificacin, aislamiento y purificacin. Por ejemplo, en la mdula sea una de cada diez mil clulas es madre hematopoytica. En cuanto al cultivo de clulas madre adultas en condiciones de laboratorio, resulta difcil, hasta ahora, mantenerlas en condiciones de proliferar en estado indiferenciado durante largos periodos de tiempo. No obstante existen ya excepciones, como las clulas precursoras mesenquimticas de la mdula sea, que se pueden mantener en crecimiento durante ms de ciento veinte generaciones. En la figura 2.14 se esquematiza el mtodo para la obtencin de un cultivo de clulas madre adultas de un ratn.

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Figura 2.14 Estrategia de obtencin de un cultivo de clulas madre adultas Fuente: www.smartplanet.es/articulos.php?id=9-4-4

Finalmente, tambin existen las llamadas clulas madre fetales, que se obtienen del cordn umbilical y poseen caractersticas similares a las clulas madre adultas. En el siguiente link se puede observar una grabacin de la obtencin de clulas madre fetales en una institucin colombiana pionera en la investigacin en clulas madre: http://www.bancodecelulas.com/p-vmuestra.htm

Leccin 26: Cultivos celulares de insectos El establecimiento de lneas celulares de insectos y arcnidos se ha hecho rutinario, mientras que las de invertebrados de otros taxones no han producido lneas celulares de mayor xito. Hasta hoy da, se han establecido ms de 400 lneas celulares de cerca de 100 especies de insectos que representan las especies econmicamente ms importantes. Los factores para desarrollar un cultivo celular de insectos son complejos. El primero de ellos, es el tamao reducido, que en las especies de insectos ms pequeos hace casi imposible el logro de un cultivo celular. Otro problema es que los insectos generalmente se encuentran en medios relativamente sucios o expuestos a muchos agentes potenciales de contaminacin. Este problema se puede solucionar al mantener un cultivo o una colonia de insectos bajo condiciones controladas. Otro punto a considerar para el desarrollo de lneas celulares de insectos es el medio de cultivo. Aunque comercialmente existen formulaciones de medio para insectos como: Grace, TC-100 , ExCell 401, SF-900 e Insect-Xpress, dada la cantidad de especies y lneas celulares que se pueden obtener, todava existen limitantes a este respecto y para cada cultivo en especial se deben hacer ensayos hasta logar la mejor formulacin y los suplementos necesarios como pptidos o suero.
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En general para iniciar cultivos primarios se recomienda contar con clulas embrionarias, para lo cual disponer de una colonia de insectos es el medio ms sencillo. Por ejemplo los huevos se pueden desinfectar con una solucin de etanol al 70%, seguida por enjuagues con agua destilada estril. A continuacin los huevos pueden ser disgregados fsicamente con un homogenizador en medio de cultivo, y las clulas en suspensin se transfieren a una placa de cultivo con medio para que inicien una monocapa. Otro mtodo para la obtencin de clulas embrinicas es el tratamiento con soluciones clorinadas con una posterior disgregacin celular a travs de mtodos enzimticos (tripsina, colagenasa, hiluronidasa y elastasa) y mtodos fsicos. En la figura 2.15 se muestra el esquema de un procedimiento de obtencin de clulas embrionarias de insecto.

Figura 2.15 Pasos para la preparacin de un cultivo celular de insectos Fuente: Vlak et al, 2002.

El crecimiento de las clulas de insectos es lento. Durante las primeras semanas de crecimiento se debe ir reemplazando el medio, pero se deben recobrar por centrifugacin las clulas que pudieron ser extradas en el medio viejo. Los cultivos se deben monitorear en microscopio invertido de contraste de fases. Cuando el cultivo alcanza el 80% de confluencia se puede realizar un subcultivo. Para desprender las clulas del plato de cultivo en el procedimiento de subcultivo, se puede emplear la fuerza mecnica (bombeo) de una pipeta, el
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enfriamiento del cultivo a 4C durante 20 minutos seguido de bombeo con pipeta, tratamientos enzimticos, o un rayador de clulas, que no es ms que un tubo estril diseado para estos propsitos. De la misma manera que cualquier otro cultivo celular, en los cultivos de insectos de debe tener precaucin de la contaminacin y muy especialmente de la contaminacin cruzada con otras lneas celulares. En la autenticacin de lneas celulares de insectos se emplea comnmente el anlisis por DNA fingerprinting y especialmente el anlisis por isoenzimas. Dado que el anlisis cariolgico en insectos es complejo ya que algunas especies presentan diferentes ploidias, incluso haploida (himenpteros) este anlisis no es rutinario para caracterizar lneas celulares de insectos, aunque no se descarta que el cultivo celular se pueda emplear como una herramienta para el anlisis cariotpico de insectos. Adems de la autenticacin celular, las lneas deben ser monitoreadas peridicamente para contaminantes, el primer mtodo para esto es el no empleo de antibiticos en el medio, de esta forma si un agente bacteriano llega a penetrar en el cultivo podr desarrollarse y ser detectado rpidamente. Para otros contaminantes como virus y micoplasmas existen test comerciales, y es recomendable chequear los cultivos peridicamente. Por estas razones el importante mantener un stock congelado de las lneas celulares que se manejen, para que en el caso de hallar contaminantes en el cultivo se pueda retomar el cultivo desde el stock. Los cultivos celulares de insectos se utilizan, comnmente, como sustratos para el aislamiento e identificacin de arbovirus. Sin embargo, existe en la actualidad una amplia gama de aplicaciones de esta tcnica en investigaciones biomdicas y tecnolgicas, entre las cuales sobresalen: la expresin de genes exgenos a partir de molculas de DNA recombinante para el anlisis de procesos genticos de regulacin, los cuales son difciles de medir en el organismo entero; los estudios de cocultivos con parsitos; los estudios de entomopatgenos, reguladores del crecimiento o de compuestos bioqumicos usados contra insectos; la deteccin y dosis de entomopatgenos o sus toxinas de muestras ambientales; la respuesta hormonal in vitro; la fisiologa celular, y el aislamiento y la caracterizacin de bioinsecticidas.

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CAPITULO 6: Ingeniera de Tejidos

Introduccin La ingeniera de tejidos es una disciplina de diseo y construccin de rganos y tejidos para restaurar la funcin de tejidos perdidos, basada en los principios de la biologa molecular del desarrollo y morfognesis, guiada por la bioingeniera. La ingeniera de tejidos es un rea multidisciplinaria que integra principios de ingeniera y de ciencias de la vida, para el desarrollo de sustitutos biolgicos, biomimticos o bioinspirados para la restauracin, reparacin, regeneracin, reemplazo, modificacin y ensamblaje de tejidos u rganos funcionales.

Leccin 27: Materiales en ingeniera de tejidos La investigacin en el trasplante de rganos se ha beneficiado con el uso de las tcnicas de cultivo celular y de tejidos. En las dcadas pasadas se han dado grandes avance en el campo de los trasplantes principalmente por las nuevas tcnica quirrgicas y los agentes inmunosupresores. Desafortunadamente, todos los procedimientos de trasplante tienen un problema comn: la demanda de tejidos viables u rganos de donadores excede la oferta. Este problema se ha pronunciado cada vez ms, debido al crecimiento de la poblacin y a que los tratamientos frente a las enfermedades cada vez son mejores y as se producen ms candidatos para el trasplante de rganos o reparacin de tejidos. De este modo, el trasplante o la transfusin se han convertido en la nica esperanza de vida para muchos pacientes. Los dilemas ticos alrededor de la disponibilidad del trasplante de rganos humanos son frecuentemente debatidos. Una posible solucin a las deficiencias de rganos y tejidos es el desarrollo de mtodos mejorados para la ingeniera de tejidos. En ingeniera de tejidos, los substitutos de rganos y tejidos son construidos en el laboratorio (por ejemplo por combinacin de clulas vivas con componentes artificiales) para su subsecuente introduccin en un paciente. La ingeniera de tejidos es una disciplina en evolucin, razn por la cual una definicin precisa de esta disciplina es difcil de dar, pero se puede describir como: La aplicacin de principios y mtodos de ingeniera y ciencias de la vida a travs del entendimiento fundamental de la relacin entre estructura y funcin en tejidos normales y patolgicos para el desarrollo de substitutos biolgicos con el fin de restaurar, mantener o mejorar la funcin del tejido.

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Como en el desarrollo de nuevas drogas y rganos artificiales, el diseo de nuevos mtodos para ingeniera de tejidos puede ser mejorado con el uso de materiales sintticos que son integrados con componentes biolgicos de una forma racional. Frecuentemente, estos materiales son polmeros. Actualmente para los reemplazos implantables de cartlago, hgado, o tejidos nervioso se emplean combinaciones de polmeros sintticos y clulas vivas. Varios nuevos polmetros se han desarrollado desde 1930, incluyendo poliamidas, poliesteres y polietileno. El uso de polmeros como material biomdico se ha expandido recientemente. Como en el empleo de catteres, materiales empleados en dilisis, marcapasos, corazones artificiales, bombas para extraer los excesos de lquido cerebroespinal entre otros. Actualmente, muchos dispositivos mdicos involucran biomateriales polimricos (Tabla 2.6). Polmeros muy variados en presentaciones y formas son introducidos a pacientes alrededor del mundo cada da. Muchos de estos son comunes: catteres, capas de marcapasos y lentes de contacto. En algunos casos, estos polmeros artificiales han permitido el paso de tecnologas revolucionarias, como la cadera artificial y el corazn totalmente artificial. An as, todava falta mucho trabajo por ejemplo la cadera artificial es un reemplazo plido del material natural, y los pacientes no sobreviven por largos periodos de tiempo con los corazones artificiales. El desarrollo de mejores materiales y vas de empleo de estos traer mejoras en la salud humana. El entendimiento de los mecanismos moleculares de la interaccin celular con materiales sintticos ha avanzado rpidamente. Este conocimiento ha dado herramientas para un desarrollo ms racional de materiales y el rol de estos materiales en el reemplazo de tejidos y en la regeneracin. Se pueden considerar las interacciones celulares con polmeros desde varios niveles de complejidad (Figura 2.16). En una dimensin se pueden estudiar, caractersticas tales como la adhesin celular y la propagacin. En dos dimensiones se pueden considerar la forma y la orientacin de las clulas, tambin como los patrones de migracin celular y crecimiento y la respuesta de las clulas a los gradientes de superficie. Las estructuras en tres dimensiones dan la oportunidad de estudiar la interaccin celular.

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T ABLA 2.6 ALGUNOS DE LOS POLMEROS QUE PUEDEN SER USADOS EN INGENIERA DE TEJIDOS , BASADOS EN ANTIGUOS DISPOSITIVOS BIOMDICOS MATERIAL APLICACIN TPICA
Prtesis de pecho y testiculares Catteres Dispositivos de liberacin de frmacos Vlvulas del corazn Bombas para hidrocefalia Corazones artificiales y dispositivos ventriculares Catteres Marcapasos Vlvulas del corazn Injertos vasculares Prtesis faciales Bombas para hidrocefalia Catteres y suturas Prtesis de cadera Catteres Vlvulas del corazn Prtesis penianas Cemento seo para fijacin de fracturas Lentes intraoculares Dentaduras Lentes de contacto Catteres Membranas de dilisis Suturas Membranas de plasmafresis Bolsas de sangre Envases para cultivo de tejidos Substitutos de sangre Corazones artificiales Piel artificial

Polidimetilsiloxano, elastmeros de silicona (PDMS)

Poliuretanos (PEU)

Poli(tetrafluoroetileno) (PTFE)

Polietileno (PE)

Polisulfona (PSu)

Poli(metil metacrilato) (pMMA)

Poli(2-hidroxietilmetacrilato) (pHEMA)

Poliamidas

Poli(vinil cloruro) (PVC) Poliestireno (PS) Poli(vinil pirrolidona) (PVP) Poli(etilen teraftalato) (PET) Colgeno

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Figura 2.16 Desarrollo de biomateriales polimricos para ingeniera de tejidos. Los biomateriales para ingeniera de tejidos son caracterizados por evaluacin de adhesin celular y propagacin (Nivel 1), migracin y crecimiento celular (Nivel 2), y agregacin celular y organizacin de tejido (Nivel 3). Fuente: Saltzman, 2004

Leccin 28: Fundamentos de la ingeniera de tejidos En general en el cultivo de tejidos hay varios tipos de investigacin, que se enfocan en estudios de: 1. Actividad intracelular: enfocados a la replicacin y transcripcin del DNA, sntesis de protenas, metabolismo tanto energtico como de medicamentos, ciclo celular y la apoptosis. 2. Flujo intracelular: de RNA, translocacin de complejos receptores de hormonas, el transporte en la membrana, y flujo de calcio. 3. Interaccin con el ambiente: infeccin, citotoxicidad, carcinognesis, la accin de medicamentos. 4. Interaccin clula-clula: morfognesis, cintica de la proliferacin celular, cooperacin metablica, adhesin celular y movilidad. 5. Gentica: anlisis del genoma en condiciones normales patolgicas, manipulacin gentica, transformacin e inmortalizacin. y

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6. Productos y secreciones celulares: estudios relacionados con biotecnologa, diseo de biorreactores, cultivo de productos celulares. Existen varios conceptos o fundamentos a tener en cuenta en el estudio de la ingeniera de tejidos, como son el crecimiento y diferenciacin celular, la mecnica celular y tisular, y la adhesin y migracin celular. Crecimiento celular y diferenciacin La expansin en tamao de una regin de tejido, frecuentemente llamada crecimiento, es crtica para el desarrollo embrinico y para la reparacin de tejidos. El crecimiento de un tejido generalmente ocurre por el incremento en el nmero de clulas, pero a lo largo de la vida puede ocurrir a travs de otros mecanismos; por ejemplo, incremento en el volumen celular o extracelular. El crecimiento en un rgano o tejido puede involucrar mltiples mecanismos, pero en general, la proliferacin celular (por divisiones secuenciales) es el mecanismo ms importante para el crecimiento de un tejido. La divisin celular y la proliferacin celular son muy importantes para el crecimiento de un tejido. De acuerdo a como se de la divisin celular, si es para el desarrollo o la reparacin de un rgano, las clulas se diferenciarn en fenotipos que son esenciales para la funcin del tejido maduro. Agentes solubles (citocininas, factores de crecimiento, hormonas, etc.) influencian la tasa de crecimiento y el patrn de diferenciacin de las clulas. Las interacciones receptor-ligando son esenciales en la regulacin de la divisin celular y en la diferenciacin. El cultivo celular por fuera de los organismos vivientes (in vitro) es una herramienta poderosa de la biologa moderna. En muchos casos, el crecimiento celular in vitro y la diferenciacin pueden ser controlados y analizados para determinar el factor de crecimiento limitante. Este anlisis es mucho ms difcil de realizar en clulas creciendo in vivo, debido al mayor nmero de elementos desconocidos o impredecibles. Mecnica celular y de tejidos La mecnica es una rama de la fsica que tiene que ver con la accin de las fuerzas sobre la materia. En la ingeniera de tejidos se puede encontrar la mecnica en varios escenarios. Frecuentemente, las propiedades mecnicas de los materiales biolgicos de reemplazo deben replicar el tejido normal, por ejemplo: el uso limitado de un tejido de hueso desarrollado que no puede soportar la presin que si soporta su contraparte natural. Adems, las propiedades mecnicas de las clulas y de las adhesiones clula-clula pueden determinar la arquitectura de un tejido durante el desarrollo. Este fenmeno puede ser explotado, dado que la forma final de los tejidos desarrollados por ingeniera de
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tejidos depende de las fuerzas encontradas durante su ensamblaje y maduracin. Finalmente, los mecanismos de las clulas individuales (y las interacciones moleculares que las restringen) son determinantes importantes del crecimiento celular, del movimiento y de la funcin de un organismo. Adhesin celular La superficie externa de una clula consiste en una bicapa de fosfolpidos que lleva una cubierta rica en carbohidratos llamada glicoclix. Los grupos ionizables del glicoclix, como el cido silico contribuyen a dar carga negativa a la superficie celular. Muchos de los carbohidratos que forman el gricoclix estn unidos a protenas asociadas a membrana. Cada uno de estos componentes (bicapa fosfolpida, cubierta rica en carbohidratos, protenas asociadas a membrana) poseen diferentes caractersticas fisicoqumicas y abundancia, por lo tanto cada componente ejerce una influencia en las interacciones celulares con el medio externo a travs de diferentes vas. Las clulas pueden adherirse a las superficies. Desde que el crecimiento y funcin de tejidos derivados de clulas requera estar acompaado de un substrato para su anclaje y propagacin, los eventos alrededor de la adhesin celular se volvieron objetos de estudio fundamental. Adems, las fuerzas de las adhesiones celulares son determinantes importantes para la tasa de migracin celular, la cintica de la agregacin clula-clula y la magnitud de las barreras de tejido para el transporte de clulas y molculas. La adhesin celular es por lo tanto, una consideracin mayor en el desarrollo de mtodos y materiales para la liberacin celular, la ingeniera de tejidos y la regeneracin celular. El mecanismo ms estable y verstil para la adhesin celular involucra la asociacin especfica de las glicoprotenas de superficie, llamadas receptores, y las molculas complementarias en el espacio extracelular, llamadas ligandos. Los ligandos pueden existir libremente en el espacio extracelular, pueden estar asociados a la matriz extracelular o pueden estar unidos a la superficie de otra clula (Figura 2.17). La adhesin clula-clula puede ocurrir por adhesiones homoflicas de receptores idnticos en diferentes clulas, por uniones heteroflicas por un receptor y un ligando expresados en la superficie de diferentes clulas, o por asociacin de dos receptores con una conexin intermediaria. La adhesin clulamatriz generalmente ocurre por uniones heteroflicas de un receptor y un ligando anclado a un elemento insoluble en la matriz extracelular.

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Figura 2.17 Tipos de adhesin celular. Fuente: Saltzman, 2004

Migracin celular La migracin celular es crucial para la vida de los organismos unicelulares o multicelulares. La migracin en organismos unicelulares puede ocurrir con flagelos o cilios (ej: E. coli o un paramecio), o a travs de movimientos lentos sobre superficies (como lo hace la ameba). En los organismos multicelulares, la migracin de una poblacin celular particular es a menudo un componente de un comportamiento multicelular complejo que incluye la invasin tumoral y metstasis, embriognesis, angiognesis y respuesta inmune. En ambos casos, la velocidad y patrones de migracin son determinados por la naturaleza de las clulas y por qumicos presentes en el medioambiente. Dado que la migracin es crtica para la formacin o regeneracin de tejidos, un claro entendimiento de la dinmica de la migracin celular puede conllevar a mejores capacidades para el diseo de materiales y procesos para la ingeniera de tejidos.

Leccin 29: Biomateriales Los biomateriales se pueden definir como materiales biolgicos comunes tales como piel, madera, o cualquier elemento que remplace la funcin de los tejidos o de los rganos vivos. En otros trminos, un biomaterial es una sustancia farmacolgicamente inerte diseada para ser implantada o incorporada dentro del sistema vivo. El desarrollo de biomateriales ha experimentado espectaculares

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avances en los ltimos aos; en la siguiente figura (2.18) se esquematizan las piezas que estn disponibles para reparar el cuerpo humano.

Figura 2.18 Piezas que pueden implantarse en el organismo humano Fuente: www.aecientificos.es/empresas/aecientificos/documentos/Biomateriales.pdf

Debido a que los biomateriales restauran funciones de tejidos vivos y rganos en el cuerpo, es esencial entender las relaciones existentes entre las propiedades, funciones y estructuras de los materiales biolgicos y los biomateriales. El xito de un biomaterial o de un implante depende de tres factores principales: propiedades y biocompatibilidad del implante, condiciones de salud del receptor, y habilidad del cirujano que realiza el implante.

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Los requisitos que debe cumplir un biomaterial son: 1. Ser biocompatible, es decir, no debe provocar rechazo en el organismo. 2. No ser txico, ni carcingeno, y qumicamente inerte y estable (no presentar degradacin en el tiempo). 3. Tener una resistencia mecnica, densidad y peso adecuados. 4. Tener un diseo de ingeniera perfecto; esto es, el tamao y la forma del implante deben ser los adecuados. 5. Ser relativamente barato, reproducible y fcil de fabricar y procesar para su produccin en gran escala. Atendiendo a la naturaleza del material artificial con el que se fabrica un implante, se puede establecer una clasificacin en cuatro grupos: metlicos, cermicos, polimricos y compuestos de ellos; en la tabla 1.8 se muestran algunas de las ventajas, desventajas y aplicaciones para los cuatro grupos de materiales.
T ABLA 2.7 CLASES DE BIOMATERIALES CLASE
Polmeros: Silicn, Tefln, Dacrn, Nylon Metales: 316, 316I.S.S., aleaciones de titanio, aceros de bajo contenido de carbn Cermicas: Oxidos de aluminio, aluminatos de calcio, xidos de titanio, carbonos Compuestos: Cermica-metal, carbn-otro material

VENTAJA
Elsticos, fciles de fabricar, baja densidad

DESVENTAJA
Baja resistencia mecnica, degradacin con el tiempo Baja biocompatibilidad, corrosin en medios fisiolgicos, alta densidad, prdida de propiedades mecnicas con tejidos conectivos suaves Fractura ante esfuerzos de alto impacto, difcil fabricacin, baja resistencia mecnica, inelsticos, alta densidad Carecen de consistencia en la fabricacin del material

EJEMPLO
Suturas, arterias, venas, nariz, orejas, mandbulas, dientes, tendones Fijacin ortopdica: tornillos, clavos, alambres, placas, barras intermedulares, implantes dentales

Resistencia a esfuerzos de alto impacto, alta resistencia al desgaste

Buena biocompatibilidad, resistencia a la corrosin, inerte Buena compatibilidad, inerte, resistencia a la corrosin, alta resistencia a los esfuerzos

Prtesis de cadera, dientes, dispositivos transcutneos

Vlvulas cardiacas, uniones seas, marcapasos

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Los usos quirrgicos de los biomateriales son mltiples, por ejemplo, para implantes permanentes en el sistema esqueltico muscular, para uniones en las extremidades superiores e inferiores o como miembros artificiales permanentes; en el sistema cardiovascular, como corazn, arterias y venas; en el sistema respiratorio, en laringe, trquea y bronquios, diafragma, pulmones y caja torcica; en sistema digestivo, esfago, conductos biliares e hgado; en sistema genitourinario; en los sentidos: lentes y prtesis de crneas, odos y marcapasos cartidos; e implantes cosmticos maxilofaciales. Las propiedades requeridas de un material para aplicaciones mdicas vara de acuerdo con la aplicacin particular. Debemos considerar que las pruebas fisicoqumicas de los materiales para implante in vivo son difciles, si no imposibles. Las pruebas in vitro deben ser realizadas antes del implante. La fabricacin y el uso de los materiales depende de sus propiedades mecnicas, tales como resistencia, dureza, ductibilidad, etctera.

Leccin 30: Aplicaciones y perspectivas Las clulas empleadas en ingeniera de tejidos son de origen animal o humano, pueden ser aisladas de su ambiente natural o manipuladas genticamente. Las clulas empleadas pueden ser: 1. Autlogas: tomadas del individuo que ser el receptor final. 2. Alognicas: tomadas de otro individuo de la misma especie. 3. Xenognicas: clulas provenientes de otra especie. Las clulas autlogas tienen la ventaja de no presentar respuesta inmune (Figura 2.19), pero la desventaja de no poderse cultivar durante largos periodos de tiempo mientras las alognicas si. Por su parte, las alognicas si presentan respuesta inmune la cual es necesario tratar con tratamientos de inmunosupresin, lo cual con el tiempo se puede traducir en problemas graves para el receptor. Las clulas xenognicas se obtienen fcilmente, se logran cultivar durante largos periodos y en grandes cantidades, pero presentan el inconveniente de la respuesta inmune que pueden causar.

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Figura 2.19 Aplicacin de la ingeniera de tejidos con clulas autlogas. Fuente: Stock & Vacanti, 2001

Un tipo de clulas que han trado la atencin de un gran nmero de investigadores son las clulas stem (clulas madre, estudiadas anteriormente) por la capacidad de regenerarse a s mismas y bajo ciertas caractersticas especiales de cultivo se pueden especializar en diferentes tipos de clulas. El nuevo campo de la Ingeniera de tejidos tiene como reto proporcionar opciones que se asemejen a los tejidos naturales tanto funcional como estructuralmente y que puedan ser completamente integrados en el tejido vecino, continuando con el desarrollo despus de la implantacin in vitro. Miles de personas de todas las edades ingresan cada da en hospitales, obligadas por el malfuncionamiento de algn rgano vital. Muchas morirn al faltar donaciones de trasplantes. Pero un nuevo planteamiento, fascinante, podra revolucionar el tratamiento de pacientes urgidos de estructuras vitales nuevas: la creacin de tejidos u rganos artificiales, los llamados neorganos. Un ingeniero de tejidos inyecta o deposita en una herida o un rgano que requiera regeneracin una molcula, por ejemplo, un factor de crecimiento. Esta molcula moviliza las clulas del paciente hacia la herida e insta su transformacin en un tipo celular concreto, que regenere el tejido. Ms ambicioso es el trasplante de clulas, del propio paciente o de un donante, cultivadas de antemano e incorporadas en una estructura tridimensional de polmeros biodegradables, como los que se utilizan para hacer suturas reabsorbibles. La estructura entera se trasplanta a la herida; aqu, las clulas se dividen y reorganizan para formar tejido nuevo. Al mismo tiempo, se van desintegrando los polmeros artificiales, hasta que solo queda formado un producto completamente natural, un neorgano.

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Ingeniera de tejidos de cartlago La ingeniera de tejidos en el rea del cartlago articular surgi por la necesidad de nuevos tratamientos para las lesiones de esta estructura que tiene una escasa capacidad de auto-reparacin, pero ms que repararlo es necesario regenerarlo. Los tratamientos en este sentido incluyen restauracin del tejido, reemplazo con aloinjertos o prtesis, mejoramiento con osteotomas para disminuir esfuerzos, y resecado de la superficie lesionada. La ingeniera de tejidos en el rea del cartlago se centra y especializa en el primer tipo de tratamiento, ya que ofrece nuevas posibilidades en el estudio de procesos de condrognesis y solucin a problemas teraputicos. Desde el punto de vista teraputico en la categora de restauracin, los esfuerzos en cuanto a reparacin de cartlago se centraban en manipular o estimular la respuesta reparativa propia de las clulas, con estmulos elctricos, farmacolgicos (corticoides, cido hialurnico, factores de crecimiento) o con agentes bioactivos (citocininas y biomateriales). Desde el punto de vista regenerativo, los esfuerzos se han orientado a producir una nueva superficie articular transplantando condrocitos, clulas condrognicas (pluripotenciales indiferenciadas) y/o tejidos que tengan el potencial de generar nuevo cartlago. Los biomateriales en la ingeniera de tejidos son entonces ms tiles como matrices que como simples materiales de soporte. Las clulas necesitan una estructura a la cual puedan adherirse, el cual tambin utilizan como medio de transporte dentro del tejido en formacin. Ingeniera de tejidos de piel La ingeniera de tejidos en piel surgi por las limitaciones relacionadas con los autoinjertos, cuyas limitaciones ms importantes incluyen la necesidad de crear un rea donante que trae los dolores de una nueva ciruga, tiene el riesgo de infeccin, cicatrizacin y una baja recuperacin. Una de las alternativas que se han generado, es el cultivo de autoinjertos de piel con los cuales se pueden realizar cubrimientos permanentes de grandes sitios afectados. El problema que presenta esta alternativa es que se necesita mnimo tres semanas de cultivo del injerto. Una alternativa es el uso de injertos alognicos (aquellos tomados de la misma especie pero no propios), estos presentan la ventaja de no necesitar biopsias del paciente, ser fcilmente criopreservados y almacenados. Tambin se est trabajando con matrices extracelulares acelulares, las cuales mantienen la membrana basal intacta (Alloderm ), las cuales son ventajosas al ser inmunolgicamente inertes. Otras membranas empleadas son las preparadas a partir de colgeno y condroitin-6-sulfato, a las cuales se les adiciona una base de silicona (Integra). Entre los anlogos de piel ltimamente reportados se encuentra el EpiDex, el cual es un anlogo generado in vitro a partir de pelo del paciente. Las ventajas que presenta esta alternativa es primero el fcil aislamiento de clulas precursoras para queratinocitos epidermales a partir de
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folculos del cuero cabelludo, segundo la capacidad que presentan estas clulas para proliferar independientemente de la edad del donante de folculos. Como se puede observar, se han realizado varios acercamientos para obtener sustitutos completos de piel. Algunos de los parmetros que se estudian actualmente son la frecuencia de colonizacin versus la infeccin, ya que con esto se pueden determinar pautas en el cultivo y en el tratamiento antibacterial tanto durante como despus de implantado el sustituto. Implantes celulares En 1994, cierto paciente que sufra un dolor intenso y persistente se convirti en uno de los primeros voluntarios sometidos al ensayo de un mtodo teraputico radicalmente nuevo. Mientras yaca anestesiado, el cirujano adoso un tubito de plstico en la columna vertebral. El tubo, sellado, media cinco centmetros de longitud y era fino como alambre de clip; contena clulas de bovino secretoras de una mezcla de analgsicos. De este modo, las secreciones celulares rezumaran a travs de los poros del tubo, para difundirse luego por la medula espinal. Entre tanto, los nutrientes y el oxigeno pasaran del liquido cefalorraqudeo a la capsula, para alimentar a las clulas. El tubito impedira tambin la entrada de macromolculas. Se evitara as que las clulas y los anticuerpos del sistema inmunitario (de un tamao notable ambos) establecieran contacto con las clulas bovinas y las destruyeran al reconocer su carcter forneo. A travs de ese medio se buscaba aliviar el sufrimiento, lo que se consegua al cortar el flujo de seales de dolor que transitaban de la medula a los centros cerebrales de deteccin. El ensayo fue un xito, por lo cual se repiti en otros pacientes y justific la realizacin de una prueba ms ambiciosa, para evaluar por va directa el control del dolor. Este primer ensayo abri las puertas a un nuevo campo de experimentacin, conocido como tratamiento con clulas encapsidadas, terapia biohbrida o inmunoaislamiento. Porque supera limitaciones importantes de los implantes de clulas libres, la terapia de inmunoaislamiento despierta especial atraccin. Lo mismo que las libres, las clulas encapsuladas en membranas se hacen cargo de funciones cruciales que correspondan a las lesionadas o perdidas, pueden suministrar analgsicos y otros elementos "extra" e incluso facilitar la terapia gnica, segregando las protenas codificadas por los genes que se hayan introducido en las clulas. Por el contrario, las clulas libres estn expuestas al reconocimiento del sistema inmune, salvo que procedan de los mismos pacientes. El bloqueo mecnico contra los ataques inmunitarios, que se consigue a travs de la encapsulacin de las clulas insertas dentro de membranas plsticas, hara innecesario el empleo de inmunosupresores, que predisponen a las infecciones, cncer (linfomas) y disfuncin renal. El recurso a clulas animales paliara la
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escasez de donaciones de tejidos. As mismo, las clulas implantadas dentro de un envase plstico pueden retirarse si fuera necesario, tarea mucho ms compleja con las clulas libres. Los sistemas de encapsulacin, aunque polimrficos en su presentacin, incluyen todos los mismos ingredientes bsicos: las clulas (capaces de segregar productos tiles), una matriz donde se unen las clulas y una membrana semipermeable. Estos sistemas se pueden encontrar en forma de micro y macrocpsulas. El formato ms prctico parece ser el de las macrocpsulas preformadas, unas unidades inicialmente vacas que se cargan con la matriz y todas las clulas necesarias para el tratamiento. Algunas macrocpsulas son discos del tamao de una moneda, otras tienen una forma y tamao similares a un ojal. Las macrocpsulas para uso en humanos acostumbran adoptar la forma de un tubo sellado, o capilar, de varios centmetros de longitud y dimetro comprendido entre los 500 y 1000 micrmetros. Su principal limitacin es el nmero de clulas que pueden contener: hasta unos cinco millones en un tubo y entre 50 y 100 millones en un disco u hoja plana. Esas cifras son adecuadas para muchas aplicaciones, pero no para todas. Si se hacen ms largas es ms probable que se doblen, lo que facilita su rotura. En los sistemas de encapsulacin, al principio de usaban clulas primarias, pero debido a su escasez y dificultad de cultivo se empezaron a hacer ensayos de encapsidacin de lneas celulares, cuya utilidad quedo bien clara en las pruebas animales que se comenzaron a realizar en los aos 90. El xito con las lneas celulares abri tambin la puerta a la utilizacin de clulas genticamente manipuladas. En otras palabras, la tcnica de inmunoaislamiento se convirti de la noche a la maana en una nueva va de la terapia gnica. No se ha resuelto todava si las lneas celulares candidatas a encapsulacin deben provenir de animales o de humanos. Las clulas primarias, tomadas directamente de donantes, abran de ser, casi con toda certeza, de animales, ante la escasez de donaciones de tejidos humanos. Algunos investigadores prefieren lneas derivadas de animales porque las clulas que se escapen de un implante, al ser extraas al receptor, se encontraran con una destruccin inmediata por parte del sistema inmunitario.

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Actividades de Autoevaluacin de la UNIDAD 2

En esta seccin usted evaluar diversos aspectos de la actividad acadmica desarrollada en la unidad. Esta actividad tiene una valoracin cualitativa de acuerdo a la siguiente escala: No satisfactorio, Satisfactorio, Supera lo esperado. En cada punto adems de asignar la categora correspondiente, dar una breve explicacin de su respuesta.

Autoevaluacin de su trabajo individual. Usted describir de manera cualitativa cual fue su rol como estudiante y su desempeo en el desarrollo, entrega y responsabilidad en las actividades de trabajo individual y colaborativo.

Evaluacin del desempeo de los compaeros de grupo de trabajo colaborativo. Debe indicar si hubo participacin de sus compaeros, si el grado de compromiso en el desarrollo de trabajos colaborativos fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado de cada uno de ellos justificando su apreciacin

Evaluacin del material usado en la actividad de la unidad: Debe indicar y justificar si el material empleado para el desarrollo de esta unidad fue satisfactorio, no satisfactorio o supera lo esperado.

Desempeo del rol del tutor. Debe dar su autoevaluacin del tutor respecto a compromiso, responsabilidad, calidad, pertenencia, atencin al estudiante, retroalimentacin de trabajos y relaciones interpersonales.

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Fuentes Documentales de la Unidad 2 Doyle, A., Griffiths, J.B. (1998). Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology. New York. John Wiley and Sons. Helgason, Ch. D., Millar, C.l. eds (2005) Basic Cell Culture Protocols. Methods in Molecular Biology No 290. Totowa. Humana Press. Lodish, H., Baltimore, D., Berk, A., Lawrence, S., Matsudaira, P., Darnell, J. (2004). Molecular Cell Biology. Fisfth edition. New York. Scientific American Books. Mather, J., Barnes, D. eds. (1998). Animal Cell Culture Methods. San Diego. Academic Press. Montoya, D., Sastoque, L.A. (2004). Biotecnologa para no biotecnologos: memorias. Bogot. Universidad Nacional de Colombia. Morgan, S.J., Darling, D.C., (1995). Cultivo de Clulas Animales. Zaragoza. Editorial Acribia.

LIBROS ELECTRNICOS Freshney, R. Ian, Vunjak Novakovic, G. (2006). Culture of Cells for Tissue Engineering. Wiley-InterscienceScience.
http://books.google.es/books?vid=ISBN0471741809&id=KkcisIcCS_oC&pg=PA3&lpg=PA3 &ots=2l3U19j1cu&dq=cell+culture&sig=7pwy2SVl7Iw5GBFqpspIVQdjwqg#PPA50,M1

Mitsuhashi, U.N. (2002). Invertebrate Tissue Culture Methods. Springer.


http://books.google.es/books?vid=ISBN4431703136&id=Iqh3ViXuV2YC&pg=PA3&lpg=PA3 &dq=tissue+culture&sig=63I0Jpdw5mbW7MVCsaVZUtBacAg#PPT2,M1

Hubbell, J.A., Plonsey, R. (2003). Tissue Engineering. CRC Press Medical.


http://books.google.es/books?vid=ISBN0849318122&id=TTnATNNaiXwC&pg=RA17PA1&lpg=RA17-PA1&ots=fsns3QjNXm&dq=engineering+tissue&sig=3eQlKx1zxyJXb15IQII4itYyiw#PPP14,M1

Ikada,

Y. (2006). Tissue ElsevierMedical.

Engineering:

Fundamentals

and

Applications.

http://books.google.es/books?vid=ISBN0123705827&id=2IfgV3MQRLkC&pg=PA1&lpg=PA 1&ots=Yf2QqpQO7k&dq=engineering+tissue&sig=nQEC8F_jFavp8qR0vY18gCzgghU#PP R7,M1

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