|UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

Facultad de Ciencias

Escuela de Química y Farmacia

PROFESOR PATROCINANTE: Dr. Marcelo Muñoz.

INSTITUTO: Ciencias Químicas.

FACULTAD: Ciencias.

ANÁLISIS ESTEREOQUÍMICO DE 3α-ACETOXI-6β-

FENILACETOXITROPANO, CONSTITUYENTE DE ERYTHROXYLUM

HYPERICIFOLIUM

Tesis de grado presentada como

Parte de los requisitos para optar

Al Titulo de Químico Farmacéutico

CAROLINA YESSENIA LIGNAY CÁRDENAS

VALDIVIA-CHILE

2022
 Agradecimientos

Primero que todo agradecer a mi profesor tutor, don Marcelo Muñoz por aceptarme en su

laboratorio, por su paciencia y dedicación, siendo esencial en el término de mi proceso para

ser una profesional.

Agradezco a mis profesores informantes Dr. Alejandro Jerez y la Dra. Sandra Orellana, por

aceptar ser parte de mi comisión y ser parte de mi formación académica.

A mis padres y hermano, por su apoyo incondicional y consejos en esta etapa, por su ayuda

en este proceso de diferentes formas y ser quienes me empujaron a seguir durante este

camino de formación profesional, dedico a ellos mis logro y sacrificios de los cuales fueron

parte.
 Índice

Resumen ........................................................................................................................... 1

Abstract ............................................................................................................................ 2

1 Introducción .............................................................................................................. 3

1.1 Alcaloides de tropano y su farmacología. ..................................................................... 4

1.2 Estereoquímica y enantiómeros ................................................................................... 6
1.3 Técnicas cromatográficas y espectrométricas .............................................................. 8
1.4 Correlación química, método complementario para determinación de configuración
absoluta a través de un precursor.......................................................................................... 13
1.5 Hipótesis ...................................................................................................................... 13
1.6 Objetivos generales ..................................................................................................... 13
1.7 Objetivos específicos ................................................................................................... 14
2 Materiales y Métodos .............................................................................................. 14

2.1 Equipos ....................................................................................................................... 14

2.2 Reactivos ..................................................................................................................... 15
2.3 Métodos. ...................................................................................................................... 16
2.3.1 Hidrogenación de (±)-6β-hidroxi-3-tropinona racémica .................................... 17
2.3.2 Formación del 6β-fenilacetil-3-tropanol con mezcla racémica de tropanodiol.. 17
2.3.3 Purificación de (±) 6β-fenilacetil-3-tropanol racémico....................................... 18
2.3.4 Obtención e identificación de compuestos mediante espectrometría de masas . 19
2.3.5 Formación del 3-acetoxi-6β-fenilacetoxitropano racémica. ............................... 19
2.3.6 Purificación de 3-acetoxi-6β-fenilacetoxitropano. .............................................. 20
2.3.7 Preparacion de productos enantiomericamente enriquecidos ........................... 20
2.3.8 Obtención de Cromatogramas de HPLC acoplada a espectrometría de masas. 21
3 Discusión y Resultados ............................................................................................ 21

3.1 Esterificación de 3α,6β-tropanodiol ........................................................................... 21

3.2 Esterificación de 6β-fenilacetil-3-tropanol ................................................................. 22
 3.3 Análisis cromatográfico de las muestras mediante HPLC acoplado a espectrómetro
de masas ................................................................................................................................. 23
4 Conclusiones ............................................................................................................ 26

5 Referencias bibliográficas ....................................................................................... 28

Resumen

Dentro de la industria farmacéutica existe un gran interés en descubrir nuevos compuestos

químicos, muchos de ellos proporcionados por el reino vegetal. En este tremendo arsenal de

moléculas químicas que nos entrega el medio, se encuentran enantiómeros, moléculas que

poseen una misma fórmula molecular pero la orientación de sus átomos es diferente,

haciendo que su imagen especular no sea superponible. Estos se encuentran comúnmente

como mezclas racémicas, es decir, una mezcla equimolar de cada enantiómero. Por este

motivo es relevante encontrar técnicas que ayuden a diferenciar un enantiómero de otro, ya

que poseen características diferentes, especialmente en el ámbito farmacológico.

El compuesto químico en análisis es 3α-acetoxi-6β-fenilacetoxitropano, un alcaloide de

tropano encontrado en la especie Erythroxylum hypericifolium.

El objetivo del presente trabajo es sintetizar formas racémicas y enriquecidas del

compuesto 3α-acetoxi-6β-fenilacetoxitropano y su posterior análisis cromatográfico,

obteniéndose mediante reacciones de esterificación usando como precursor el producto

comercial 6β-hidroxi-3-tropinona. Para comprobar la formacion del compuesto en cuestion,

se uso la correlación química y técnica de HPLC acoplado a espectrometria de masas.

La obtención de mezclas racémicas y enantioselectivas del 3α-acetoxi-6β-

fenilacetoxitropano fueron posibles mediante las técnicas mencionadas, donde se pudo

determinar mediante análisis cromatográfico la relación entre el orden de elusión y su

enantiómero correspondiente, determinándose que el primero en eluir tiene la configuración

absoluta 1R,3R,5S,6R y el segundo 1S,3S,5R,6S.

1
Abstract

Within the pharmaceutical industry there is great interest in discovering new chemical

compounds, many of them provided by the plant kingdom. In this tremendous arsenal of

chemical molecules provided by the environment, we find enantiomers, molecules that

have the same molecular formula but the orientation of their atoms is different, making

their mirror image not superimposable. These are commonly found as racemic mixtures,

that is, an equimolar mixture of each enantiomer. For this reason it is relevant to find

techniques that help differentiate one enantiomer from another, as they possess different

characteristics, especially in the pharmacological field.

The chemical compound under analysis is 3α-acetoxy-6β-phenylacetoxitropane, a tropane

alkaloid found in the species Erythroxylum hypericifolium.

The aim of the present work is to synthesize racemic and enriched forms of the compound

3α-acetoxy-6β-phenylacetoxytropane and its subsequent chromatographic analysis,

obtained by esterification reactions using as precursor the commercial product 6β-hydroxy-

3-tropinone. To verify the formation of the compound in question, chemical correlation and

HPLC technique coupled to mass spectrometry were used.

The obtaining of racemic and enantioselective mixtures of the 3α-acetoxy-6β-

phenylacetoxytropinone were possible by means of the mentioned techniques, where it was

possible to determine by chromatographic analysis the relationship between the eluting

order and its corresponding enantiomer, determining that the first one in eluting has the

absolute configuration 1R,3R,5S,6R and the second one 1S,3S,5R,6S.

2
1 Introducción

Dentro de los reinos de la naturaleza que contribuyen hasta hoy en disminuir síntomas

y prevenir enfermedades, destaca el reino vegetal. Las plantas, gracias a su maravilloso y

complejo metabolismo, constituyen un verdadero arsenal químico, del cual sólo se conoce

con éxito un tercio, considerando la variedad de especies existentes a nivel mundial, y

aquellas inexploradas hasta hoy (1). Dicho esto, gracias al reino vegetal y su variedad de

compuestos químicos se ha podido mejorar la calidad de vida de muchas personas que

padecen de alguna enfermedad, lo cual, con el avance de la tecnología, ha hecho posible

descubrir nuevos compuestos o metabolitos que las plantas poseen.

El género Erythroxylum incluye aproximadamente 230 especies, distribuidas

principalmente en los trópicos (2). La amplia distribución del género Erythroxylum ha

llevado a las especies de sus miembros a enfrentar diversos climas, presiones de herbívoros

y condiciones de nutrientes del suelo, lo que ha dado como resultado una amplia gama de

adaptaciones. Estos incluyen la evolución de múltiples metabolitos generales y

especializados con potencial nutricional y biomédico. Un depósito tan grande de moléculas

ofrece una oportunidad para el uso de herramientas de "detección" actualizadas que pueden

ayudar a identificar las aplicaciones productivas de este género en muchas vías bioquímicas

(2).

Hoy se sabe que muchos de los compuestos presentes en esta familia son alcaloides de

tropano y en la mayoría son quirales, por lo que identificar y conseguir la estereoquímica de

estos es de gran relevancia para obtener fármacos con menos efectos adversos y que sean

eficaces a la hora de ser administrados a los pacientes. Por ello, se ha hecho relevante

3
buscar nuevos métodos para obtener y analizar compuestos, a fin de determinar el

enantiómero presente.

En el caso del derivado 3α-acetoxi-6β-fenilacetoxitropano, este se ha reportado como uno

de los constituyentes de Erythroxylum hypericifolium. Sin embargo, no se indican valores

de su configuración absoluta (3), debido a la dificultad de obtener muestras de referencia

con estereoquímica conocida, y a la limitada disponibilidad de técnicas de comparación

adecuada. (4)

1.1 Alcaloides de tropano y su farmacología.

Los alcaloides son compuestos naturales que contienen uno o más átomos de nitrógeno. El

nombre se deriva de la naturaleza básica de muchos miembros de este grupo, es decir,

"similar a los alcalinos” (5).

Las estructuras principales de la cocaína y la atropina fueron aclaradas por primera vez por

Willstätter basándose en la degradación química y la síntesis, lo que condujo al

reconocimiento de un nuevo grupo de alcaloides, los alcaloides de tropano (6).

Los alcaloides del tropano, son una clase de compuestos que poseen el esqueleto de 8

azabiciclo [3.2.1] octano (7). Una sustitución α es cuando el sustituyente está por debajo de

la superficie ecuatorial del 8-azabiciclo [3.2.1]octano, y una sustitución β es cuando el

sustituyente está por encima de esta superficie (8).

4
La mayoría de los alcaloides monosustituidos se derivan de la tropina (3-hidroxitropano)

esterificada en la posición C-3. Este último, que contiene 2 centros quirales (C-1 y C-5), es

una molécula simétrica ópticamente inactiva y puede considerarse como un compuesto

meso. La mayoría de los alcaloides de tropano están disustituidos en C-3, C-6 (a menudo

descritos en la literatura como C-3, C-7) o trisustituido en C-3, C-6 y C-7. En la mayoría de

los casos, la notación de derivados disustituidos en 3, 6/7 se ha elegido arbitrariamente sin

tener en cuenta la configuración absoluta de estas dos posiciones (9).

Fig 1. numeración del núcleo del tropano derivados de 3-hidroxitropano (9).

Los alcaloides de tropano provienen de diferentes tipos de plantas, las que producen una

gran variedad de compuestos que poseen esta estructura, como por ejemplo la hiosciamina

y la escopolamina. Así también, se encuentran los alcaloides de la planta de coca

(Erythoxylum coca) como la cocaína, y alcaloides nortropanos polihidroxilados (ATN) que

5
se dan principalmente en Convolvulaceae, Solanaceae, Moraceae, Erythrocylaceae y

Brassicaceae (5).

A pesar de que muchos compuestos compartan esta estructura, estos pueden tener

diferentes acciones fisiológicas. Así es el caso de la cocaína, que manifiesta sus efectos en

la hendidura sináptica inhibiendo la recaptación de dopamina, noradrenalina y serotonina,

mientras que la escopolamina actúa como antagonista competitivo de los receptores

muscarínicos. La ingestión de ambas sustancias puede provocar alucinaciones y efectos

psicoactivos o la muerte (5).

En la farmacia moderna, la hiosciamina, la escopolamina y sus derivados modificados

químicamente se utilizan principalmente como antagonistas de los receptores muscarínicos

de acetilcolina en el tratamiento de los espasmos viscerales (6).

1.2 Estereoquímica y enantiómeros

Uno de los aspectos más interesantes de la química orgánica es el estereoisomerismo. Los

estereoisómeros son compuestos de igual fórmula molecular, que difieren entre sí solo en la

forma en que los átomos están orientados en el espacio. Algunos de estos también

presentan quiralidad, un atributo geométrico consecuencia de esa orientación molecular.

Una molécula presenta quiralidad cuando no puede superponerse a su imagen especular, y

los estereoisómeros resultantes se denominan enantiómeros y poseen la misma energía

interna (10). Por otra parte, una mezcla racémica es una mezcla equimolar de enantiómeros,

donde cada enantiómero de la mezcla gira el plano de polarización de la luz (rotación

6
óptica) en el mismo ángulo, pero en sentido contrario que el otro. De ello se deduce que la

mezcla en igual proporción de ambos enantiómeros no muestra rotación óptica y es por

tanto ópticamente inactiva (11).

Es por esto que, en 1956 Cahn, Ingold y Prelog propusieron un sistema de nomenclatura

(conocido como nomenclatura absoluta), en la cual los sustituyentes se clasifican por orden

de prioridad: 1 > 2 > 3 > 4, de tal manera que, desde un punto de vista opuesto al

sustituyente de menor prioridad, 4, la orientación de 1-2-3 ocurre en el sentido de las

manecillas del reloj o en contrasentido. En el primer caso se asigna el descriptor quiral R y

en el segundo el S, símbolos que provienen de las voces latinas rectus y sinester, que

significan derecha e izquierda, respectivamente (12).

Existe un gran interés en producir enantiómeros puros para las industrias alimentaria y

agroquímica, y en particular para la industria farmacéutica. Hoy en día, hay pruebas claras

de que a menudo solo un enantiómero de un fármaco quiral proporciona el efecto

fisiológico deseado. En muchos casos, el otro enantiómero no tiene ningún efecto o incluso

es dañino. Los organismos reguladores exigen cada vez más que los fármacos quirales se

administren en una forma ópticamente pura (13). Los fármacos quirales

enantiomericamente puros tienen ventajas sobre las mezclas racémicas, ya que se unen

selectivamente con enzimas, hormonas y otras proteínas estereoselectivas. Lo anterior

conduce a una mejor eficacia y disminución de efectos secundarios (14), evitando así una

potencial toxicidad al administrar fármacos racémicos. Cuando se utilizan mezclas no

enantioméricamente puras, las probabilidades de toxicidad y efectos secundarios aumentan

de manera importante, lo que hace imprescindible el control óptico de estos fármacos (14).

Por ejemplo, la talidomida racémica es peligrosa para el feto que lleva una mujer
7
embarazada debido a que su enantiómero (-) es teratogénico; mientras que el enantiómero

(+) se prescribe como seguro. Desafortunadamente, racemiza en el cuerpo, dando lugar a la

antípoda (-), resultando en teratogenicidad en el feto también (15).

1.3 Técnicas cromatográficas y espectrométricas

La determinación de los distintos compuestos que se encuentran presentes en las plantas

requiere de técnicas analíticas que sean eficientes y sensibles al momento de realizar sus

respectivos análisis.

El HPLC, de las siglas en inglés para Cromatografía de Líquidos de Alto Rendimiento, es

la técnica más versátil y utilizada de todos los tipos de cromatografía por elución. Los que

trabajan en el ámbito químico la utilizan para separar y determinar las especies presentes en

muestras de materiales orgánicos, inorgánicos y biológicos, teniendo la ventaja de ser una

técnica independiente de la volatilidad y estabilidad de los compuestos a ser separados

(16). Las razones de popularidad de esta técnica analítica son su sensibilidad, su fácil

adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de

especies no volátiles o termolábiles y sobre todo su gran aplicabilidad a sustancias que son

de primordial interés en la industria farmacéutica. Dichas sustancias pueden ser muestras

biológicas como las proteínas, oligosacáridos, triglicéridos; así como también fármacos

difíciles de analizar tanto cuantitativa como cualitativamente (16).

La técnica de cromatografía líquida se puede dividir en varias clases según el tipo de fase

estacionaria, las interacciones que ocurren entre la fase móvil y la fase estacionaria, y el

8
equilibrio entre ellas. Cuando la fase móvil y la fase estacionaria son líquidas, pueden tener

lugar dos principios de separación; exclusión por tamaño y distribución entre dos líquidos

inmiscibles (fases móvil y estacionaria). La cromatografía de exclusión por tamaño es

aplicable a especies de alto peso molecular. Los lechos cromatográficos están constituidos

por pequeñas partículas poliméricas o de sílice (10 μm) que contienen poros uniformes. Las

moléculas pasan a través de los poros quedando atrapadas en el interior y eliminadas del

flujo de fase móvil. Las moléculas con un tamaño superior al de los poros no se retienen y

se eluyen más rápido por la columna y las partículas más pequeñas que pasan a través de

los poros necesitan más tiempo para eluirse de la columna. Las separaciones por exclusión

de tamaño no involucran interacción química o física entre el analito y la fase estacionaria

(17).

En la cromatografía de distribución, la fase estacionaria utilizada puede ser un líquido

soportado sobre un sólido (pared de la columna u otro soporte sólido) o una especie

orgánica ligada a la superficie del sólido. Los analitos se distribuyen entre las fases en

función de su fuerza de interacción con cada una de las fases, lo que da como resultado la

separación de diferentes componentes de la muestra. La cromatografía de distribución se

puede dividir en dos tipos según la polaridad de las fases móvil y estacionaria. La

cromatografía de partición en fase normal utiliza una fase estacionaria polar y un disolvente

orgánico no polar como fase móvil. Sin embargo, la cromatografía de partición de fase

inversa utiliza una fase estacionaria relativamente no polar y una fase móvil polar (17).

Cuando la fase móvil es líquida y la estacionaria sólida, el fenómeno que se produce es la

adsorción. En la cromatografía de adsorción, la fase estacionaria es un sólido que tiene

lugares activos en la superficie. Este tipo de cromatografía se basa en la interacción directa

9
y reversible de analitos con los lugares activos en la superficie de la fase estacionaria.

Pueden tener lugar tres interacciones diferentes entre los analitos y la fase estacionaria,

adsorción no específica; cromatografía de adsorción, Electrostático; cromatografía de

intercambio de iones y Unión por afinidad biológica; cromatografía de afinidad (17).

Los experimentos típicos de HPLC incluyen varias etapas analíticas, comenzando con el

pretratamiento de la muestra, que comúnmente incluye métodos de limpieza y

extracción. Luego, la muestra se puede introducir en la columna LC donde las moléculas se

separan en función de su tamaño (cromatografía de exclusión por tamaño), afinidad a la

fase estacionaria (cromatografía de afinidad), polaridad (cromatografía de intercambio

iónico) o hidrofobicidad (cromatografía de fase inversa). El tiempo de retención mide el

tiempo entre la inyección de la muestra y la aparición del pico máximo del compuesto

después de la separación cromatográfica. En los análisis de mezclas complejas, es probable

que muchos analitos eluyan al mismo tiempo o en un momento similar y los picos de

compuestos individuales no puedan resolverse mediante LC solamente (18).

Por otra parte, la espectrometría de masas (MS) es una de las técnicas más poderosas para

la detección e identificación de compuestos orgánicos e inorgánicos. Al ser capaz de

proporcionar información estructural y de peso molecular, se utiliza ampliamente en

laboratorios analíticos para investigación académica, desarrollo de productos industriales y

cumplimiento normativo, así como para estudios proteómicos o metabolómicos,

caracterización del ADN, descubrimiento de fármacos, monitoreo ambiental, análisis de

alimentos, análisis forense y seguridad nacional (19).

10
El primer intento de acoplamiento de LC con MS fue descrito por Arpino y cols. en 1974

(20). Los espectrómetros de masas funcionan ionizando moléculas, para luego clasificar e

identificar los iones según su relación masa-carga (m/z). Dos componentes clave en este

proceso son la fuente de iones, que genera los iones, y el analizador de masas, que clasifica

los iones. Para la LC/MS se utilizan habitualmente varios tipos de fuentes de iones. Cada

una de ellas es adecuada para diferentes clases de compuestos. También se utilizan varios

tipos de analizadores de masas. Cada uno de ellos tiene ventajas e inconvenientes en

función del tipo de información que se necesite (21).

Asimismo, existen diferentes métodos de ionización, entre estas se encuentra la APCI,

ionización química a presión atmosférica, que es el segundo método de ionización más

importante cuando se trata del acoplamiento LC-MS. Aquí se usa un nebulizador neumático

seguido de un vaporizador o bloque calentador. El nitrógeno se usa comúnmente como gas

nebulizador y auxiliar (22), en el cual, el eluyente de LC se pulveriza a través de un

vaporizador calentado (normalmente a 250°C - 400°C) a presión atmosférica. El calor

vaporiza el líquido y las moléculas de disolvente en fase gaseosa son ionizadas por

electrones descargados de una aguja de corona. Los iones del disolvente transfieren la carga

a las moléculas del analito mediante reacciones químicas (ionización química). Finalmente,

los iones del analito pasan a través de un orificio de muestreo capilar de muestreo hacia el

analizador de masas (21). (Fig. 2)

Las técnicas de ionización a presión atmosférica como APCI, normalmente generan

moléculas protonadas [M + H]+ (21). Esto se debe a que los átomos de hidrogeno suelen

ionizarse primero; ionizan las moléculas de disolvente, con la eventual formación de

11
moléculas de disolvente protonadas (o grupos), que a su vez transfieren el protón a

moléculas de analito en fase gaseosa (23).

Por otra parte, debido a los procesos de alta energía producidos durante la ionización, es

posible que ocurra cierta fragmentación, que a veces también puede ser útil para la

elucidación estructural (22).

Fig.2 Dibujo esquemático de la fuente de APCI frente a la entrada del MS. 1: pulverizador;

2: gas nebulizador (flecha azul); 3: calentador; 4: gas auxiliar (flecha roja); 5: spray

vaporizado; 6: aguja corona; 7: descarga de corona; 8: gas seco (flecha roja); 9: iones

(puntos rojos); 10: entrada MS (22).

12
1.4 Correlación química, método complementario para determinación de

configuración absoluta a través de un precursor

Este método consiste en transformar el compuesto ópticamente activo en un compuesto de

configuración absoluta conocida mediante reacciones que no impliquen rotura de los

enlaces del centro estereogénico. La correlación química es uno de los métodos apropiados

(24) para este tipo de estudios, por lo que ha sido ampliamente utilizado en conjunto con

otras técnicas de medición espectroscópica.

En el caso de nuestro compuesto de interés 3α-acetoxi-6β-fenilacetoxitropano, este fue

sintetizado a partir de 6β-hidroxitropinona de configuración absoluta conocida, siendo

verificada su formación mediante LC/MS.

1.5 Hipótesis

Es posible la preparación del alcaloide 3-acetoxi-6-β-fenilacetoxitropano a partir del

compuesto tropanodiol. Asimismo, el uso de técnicas HPLC con detección de masas y

determinación de rotación óptica puede permitir su separación enantiomérica y la

determinación de su configuración absoluta.

1.6 Objetivos generales

La preparación de muestras racémicas y enantioméricamente enriquecidas de 3α-acetoxi-

6β-fenilacetoxitropano y su posterior análisis cromatográfico mediante cromatografía

líquida HPLC con detección de masas.

13
1.7 Objetivos específicos

 Preparación de la mezcla racémica de 3α-acetoxi-6β-fenilacetoxitropano a partir de

tropanodiol.

 Aislamiento y purificación de la mezcla racémica 3α-acetoxi-6β-

fenilacetoxitropano.

 Preparación enantioselectiva de 3α-acetoxi-6β-fenilacetoxitropano,

 Determinar del orden de elusión mediante análisis cromatográfico comparativo.

2 Materiales y Métodos

2.1 Equipos

 Autoinyector, SIL-10AD VP.

 Balanza analítica Precisa, modelo XB 220A.

 Bombas, LC-10AD VP y LC-20AT

 Colector de fracciones, FRC-10A.

 Columna ChiralPack AD-H (4.6 μm D.I x 250 mm L. 5 μm de tamaño de partícula)

Diacel Chemical Insdustries, LTD

 Columna semi-preparativa Zorbax Eclipse XDB-C18, (9.4 D.I x 250 mm L, 5 μm

de diámetro de partículas) Agilent Technologies

 Compresor de aire con manómetro

 Espectrómetro de masas Waters Micromass ZQ2000

 HPLC Shimadzu DGU-14A

14
  Placa de agitación magnética con manto calefactor modelo Barnstead

Thermolamyne, Nuova Stir Plate

 Rotavapor Buchi, R-210 sobre un calefactor Buchi, B-491.

 Sistema colector, SCL-10A VP

 Ultrasonicador modelo BRANSON 2510.

2.2 Reactivos

 6β-Hidroxi-3-tropinona 95% IChemical®

 Agua destilada Merck®

 Amoniaco al 25% Merck®

 Cloruro de acetilo. Merck.

 Diclorometano Merck®

 Dietilamina de grado HPLC Merck®

 Etanol Merck®

 Fenilacetil cloruro. Sigma- aldrich.

 Hexano de grado HPLC Merck®

 Hidrógeno gaseoso 99,9% AGA

 Isopropanol de grado HPLC Merck®

 Metanol Merck®

 Óxido de platino hidratado 99,9% Sigma Aldrich®

 Sílica gel 60 (35-70 um) Merck®

 Sulfato de sodio anhidro Merck®

15
  Tamiz molecular, 4 A Sigma Aldrich®

 Trietilamina Merck®

2.3 Métodos.

Síntesis de los compuestos

La síntesis del compuesto 3α-acetoxi-6β-fenilacetoxitropano se realizó usando dos

compuestos de partida por separado, primero como mezcla racémica y luego usando una

muestra enriquecida de tropanodiol.

A continuación, se detallará la síntesis del compuesto por las dos vías mencionadas.

16
Figura 3. Esquema de las reacciones a realizar. Reducción de hidroxitropinona (arriba) y

esterificación regioselectiva de tropanodiol (las dos de abajo).

2.3.1 Hidrogenación de (±)-6β-hidroxi-3-tropinona racémica

En 100 ml de etanol se disolvió 1 gr de (±)-6β-hidroxi-3-tropinona, luego se agregó 10 mg

de oxido de platino (PtO2), previamente hidrogenado por una hora. Luego, la mezcla se

dejo reaccionar en el hidrogenador PARR con una presion de 100 psi de hidrogeno (H2)

durante 7 días.

2.3.2 Formación del 6β-fenilacetil-3-tropanol con mezcla racémica de

tropanodiol.

En un matraz en forma de balón, se agregaron las siguientes sustancias, 5 ml de

diclorometano, 80 mg de tropanodiol racémico, 2 ml de trietilamina, tamiz molecular, 19

gotas de cloruro de fenilacetilo y finalmente se agrega un agitador magnetico.

La mezcla se dejó por 24 horas con agitación magnética, y una vez transcurrido el tiempo

de reacción, se le adicionan 9 gotas más de cloruro de fenilacetilo. La reacción se evaluó

periódicamente mediante espectrometría de masas, esperando hasta obtener una presencia

mayoritaria del ion con 276 m/z, correspondiente al compuesto deseado (Fig. 4.)

17
 Fig. 4. imagen del compuesto (±) 6β-fenilacetil-3-tropanol

2.3.3 Purificación de (±) 6β-fenilacetil-3-tropanol racémico.

Una vez finalizada la reacción, se prosigue a realizar una extracción líquido- líquido donde

en un embudo de decantación se dispondrán las sustancias para poder obtener la separación

de fases. Para esto, la muestra se filtra con la ayuda de una pipeta pasteur y un algodón, se

agregan 20 ml de diclorometano y finalmente se recolecta el líquido en un matraz para

luego ser transferido a un embudo de decantación.

En otro matraz se dispone de 50 ml de agua destilada y se le adiciona gotas de amoniaco al

25%, hasta un pH de 10. Finalmente, se adiciona al embudo y se agita comprobando otra

vez que el pH no haya cambiado y se recolecta en un matraz lo que queda en la fase de

inferior (fase orgánica), realizando posteriormente 3 extracciones con 80 ml de

diclorometano a la fase acuosa que queda en el embudo, asegurándonos así que no quede el

compuesto en la fase acuosa.

Finalizado lo anterior, al líquido extraído se le adiciona sulfato de sodio anhidro, siendo

luego filtrado con una pipeta pasteur y un algodón para posteriormente ser recolectado en

un matraz en forma de balón, la mezcla se llevó a un rotavapor, donde se evaporo el

disolvente.

18
La purificación mediante cromatografía flash en columna, se realizó usando sílica gel y una

fase movil compuesta por 240 ml de diclorometano, 75 ml de metanol y 7,5 ml de

amoniaco al 25%. A la silica gel se le adicionó esta mezcla de disolventes hasta la

formación de un gel, que luego fue agregado a la columna. Luego, se le adicionó presión

con un compresor de aire para que la silica gel pueda comprimirse lo más posible hasta un

volumen constante, comprobándose a través de la medición con una regla. Posteriormente,

se incorpora la muestra disuelta en la fase móvil para luego eluir la columna.

Por último, la muestra se colecta en fracciones de entre 10 y 20 ml, de los cuales se extrae

una pequeña cantidad para ser analizado en el detector de masas y comprobar si el

compuesto que se busca se encuentra presente.

Una vez obtenidos los resultados se eligen las fracciones donde se observa un mayor pick

del compuesto y con menos impurezas para ser concentrados al vacío en el rotavapor.

2.3.4 Obtención e identificación de compuestos mediante espectrometría de

masas

La obtención de espectro de masas fue llevada a cabo mediante la inyección de alícuotas de

la muestra en el espectrómetro de masas Waters Micromass ZQ2000 utilizando rangos

desde 150-400 m/z.

2.3.5 Formación del 3-acetoxi-6β-fenilacetoxitropano racémica.

En un matraz en forma de balón se agrega la muestra que contiene 48,9 mg de 6β-

fenilacetil-3α-tropanol racémico, obtenida del procedimiento descrito anteriormente, 10 ml

19
de diclorometano, 2 ml de trietilamina, 2 gotas de cloruro de acetilo, tamiz molecular y un

agitador magnético, para luego dejar la mezcla reaccionar con agitación magnética por

aproximadamente por 2 horas. Luego de transcurrido este tiempo se adicionan 10 gotas más

de cloruro de acetilo, se deja reaccionar por 24 horas más, evaluando la reacción mediante

la presencia del compuesto de interés, es decir, una masa de 318 m/z (Fig 5.)

Fig 5. Molécula 3-acetoxi-6β-fenilacetoxitropano racemica.

2.3.6 Purificación de 3-acetoxi-6β-fenilacetoxitropano.

La purificación del producto de reacción se realizó usando el mismo procedimiento anterior

de extracción liquido- líquido y posterior cromatografía en columna flash. En este caso, la

fase móvil usada consistió en 240 ml de diclorometano, 15 ml de metanol y 0,5 ml de

amoniaco al 25%.

2.3.7 Preparacion de productos enantiomericamente enriquecidos

Los compuestos enantiomericamente enriquecidos se prepararon usando 6β-

hidroxitropinona con un 60% de exceso de enantiomérico del isómero (1S,5R,6S) y

siguiendo los procedimientos ya descritos.

20
 2.3.8 Obtención de Cromatogramas de HPLC acoplada a espectrometría de
masas.

Se utilizo una columna quiral ChiralPack AD-H (4.6 μm D.I x 250 mm L. 5 μm de tamaño

de partícula) con una interfase o sonda APCI. La fase móvil empleada en este caso fue

hexano/isopropanol (95:5) con dietilamina (0,1%).

3 Discusión y Resultados

3.1 Esterificación de 3α,6β-tropanodiol

La formación del monoéster es el primer paso de la vía de síntesis que lleva a nuestro

objeto de estudio. La formación del compuesto 6β-fenilacetil-3α-tropano se confirmó

mediante espectrometría de masas (fig 6.), donde apareció como ion predominante el de

masa 276 m/z consistente con la forma (M+H+) del monoester 6β-fenilacetil-3α-tropano.

Teniendo en consideración los reportes bibliográficos y experiencias anteriores en el grupo

de investigación, los que señalaban que la posición del OH en el C-6 es considerablemente

más reactiva que la del OH en C-3, no se realizó una confirmación por 1HRMN del

producto.

21
Fig 6. Espectro de masas de síntesis 6β-fenilacetil-3α-tropanol, con una masa de 276 m/z.

3.2 Esterificación de 6β-fenilacetil-3-tropanol

La reacción del cloruro de acetilo (CH3COCl) con el 6β-fenilacetil-3α-tropanol para formar

3α-acetoxi-6β-fenilacetoxitropano fue también confirmada mediante espectrometría de

masas, donde se observa la presencia del ion 318 m/z consistente con el aducto (M+H)+ del

producto acetilado.

Sin embargo, a diferencia del compuesto anterior, la escala de la reacción no permitió una

purificación adecuada del producto como se observa en su espectro de masas, donde

aparecen otros iones diferentes al del producto, pero como se muestra en la sección

siguiente, esto no evito la caracterización de la mezcla racémica con LC-MS

22
 Fig 7. Espectro de masas de síntesis de (±)-3α-acetoxi-6β-fenilacetoxitropano con una

masa de 318 m/z.

3.3 Análisis cromatográfico de las muestras mediante HPLC acoplado a

espectrómetro de masas

Para la obtención de estos cromatogramas se utilizó un HPLC acoplado a un espectro de

masa. La fase móvil empleada en este caso fue hexano/isopropanol (95:5) con dietilamina

(0,1%).

El resultado de la separación enantioselectiva de 3α-acetoxi-6β-fenilacetoxitropano se

puede observar en la fig 8. Como se aprecia para el caso de la mezcla racémica de 3α-

acetoxi-6β-fenilacetoxitropano (Caso A), se obtienen dos picos cromatográficos que poseen

un porcentaje de abundancia similar, pero tienen diferentes tiempos de retención, el primero

con 9,56 minutos y el segundo con 10, 37 minutos. Por otra parte, en el caso de la muestra

23
enriquecida con 3α-acetoxi-6β-fenilacetoxitropano (1S, 3S, 5R, 6S) (Caso B), se observa

mayor presencia de un enantiómero que otro. En este caso, los tiempos de retención son de

9,56 y 10, 31 minutos apareciendo este último al de mayor tiempo de retención en una

proporción considerablemente mayor que el primero en eluir. Sin embargo, debido a la

menor pureza de esta muestra, también se pueden observar otros peacks cromatográficos,

por lo que es difícil realizar una asignación segura.

Por consiguiente, en un tercer análisis se realiza una mezcla entre la muestra de racemato A

y la muestra enriquecida B, en un procedimiento conocido como (Caso C) spike. En este es

posible comprobar que, al adicionarse muestra enriquecida a la mezcla racémica, se observa

un aumento del segundo peack cromatográfico. Esto verifica que la identidad

estereoquímica de los enantiómeros en la mezcla racémica corresponde a 1R,3R,5S,6R para

el primer pico cromatográfico en eluir, y 1S,3S,5R,6S para el segundo.

A)

24
 B)

C)

Fig 8. Cromatogramas HPLC-MS. A) Muestra racémica de 3-acetoxi-6-β-

fenilacetoxitropano. B) Muestra enriquecida de 3-acetoxi-6-β-fenilacetoxitropano. C) Spike

25
4 Conclusiones

Las reacciones de esterificación pudieron ser evaluadas eficientemente mediante la técnica

de espectrometría de masas, donde en una primera etapa fue posible observar la formación

del monoester 6β-fenilacetil-3α-tropano mediante la presencia del ion con masa 276 m/z

correspondiente al aducto protonado [M+H] +. En una segunda etapa, la reacción de

esterificación para la formación de nuestro compuesto de estudio 3α-acetoxi-6β-

fenilacetoxitropano fue también verificada por espectrometría de masas mediante la

presencia del ion con masa 318 m/z correspondiente al aducto protonado [M+H] +. En este

caso, no fue posible obtener una presencia mayoritaria del producto, evidenciando un

menor rendimiento de la reacción, probablemente debido a la menor reactividad del grupo

OH en la posición C-3.

La obtención de cromatogramas mediante la técnica LC/MS para verificar la presencia del

compuesto en estudio 6β-fenilacetil-3α-tropano fue también posible, proporcionando con

ello información de los tiempos de retención de cada enantiómero presente en las muestras.

En el caso A, correspondiente a la mezcla racémica, mostró claramente la presencia de

ambos enantiómeros, con picos de abundancia similares pero diferentes tiempos de

retención. Por otra parte, en el caso B correspondiente a la muestra derivada de la mezcla

enriquecida, se observó una notoria diferencia en abundancia entre ambos picos

cromatográficos, debido a una presencia mayoritaria del diéster derivado del enantiómero

de 6β-hidroxi-3-tropinona en exceso en el precursor original (1S,3S,5R,6S).

En base a las observaciones anteriores, y mediante la realización de una tercera prueba

(spike), fue posible finalmente establecer que el primer pico de cada cromatograma

26
corresponde al enantiómero de 6β-fenilacetil-3α-tropano con configuración absoluta

(1R,3R,5S,6R), y el segundo al enantiómero de configuración absoluta (1S,3S,5R,6S).

Por último, es posible concluir que el método empleado es este estudio corrobora que es

posible sintetizar compuestos utilizando de base un precursor, separar sus enantiómeros y

determinar a través de su orden de elusión una relación con su configuración absoluta, lo

que sería una contribución para futuras moléculas que estén en análisis, por lo tanto,

entregan una importante información que beneficia a muchas áreas de las ciencias.

27
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