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Cromatografa de Lquidos

Elba Rojas Escudero

ERE

Ab o Ad ???

Temario
Fundamentos
Definiciones bsicas Aspectos tericos

Instrumentacin
Elementos bsicos Columnas Inyectores Detectores y sistemas acoplados

Anlisis
cualitativo y cuantitativo

Cromatografa de lquidos
Mtodo fsico de separacin La muestra se distribuye entre dos fases
Fase estacionaria: slido o lquido Fase mvil: lquido o mezcla de lquidos

Elucin
La muestra se aplica al principio de la columna como una banda fina El eluyente tiene menor afinidad por la fase estacionaria que los solutos Los solutos avanzan por el sistema a velocidades diferentes, menores a la de la fase mvil Los solutos se separan en bandas que eluyen al final de la columna

Cromatografa

Gas Columna

Lquido Plano

CLS

CLL

CFE

CII

CE

CCF CP

CPG

CFG

Tipos de CL
PM < 2000 Cromatografa de intercambio inico Adsorcin: lquido-slido Particin: lquido-lquido Cromatografia en fase normal Cromatografia en fase inversa PM > 2000 Cromatografia de exclusin por tamao

Requisitos de la muestra
Soluble en la fase mvil Limpia No debe reaccionar con ningn componente del sistema cromatogrfico

HPLC ideal para muestras con:


Presin de vapor baja Compuestos inicos Compuestos de peso molecular elevado Compuestos Termolbiles

Instrumentacin
Fase mvil Bomba de alta presin Gradiente de elucin

Muestra

Inyector

Control de temperatura

Columna

Detector

Registrador

Fase mvil
Disolventes grado cromatogrfico Agua de 18 m Baja viscosidad No vlatil Miscibilidad Filtrada Sin oxgeno disuelto (degasificada)

Fase mvil
Flujo = F = gasto en volumen del eluyente por unidad de tiempo . Se determina a la salida de la columna a temperatura ambiente (mL/min)

H = f (v)

Cromatografa

FM FE Inyector Detector

Proceso Cromatogrfico
La fase mvil fluye, arrastrando consigo los solutos Los solutos se reparten entre ambas fases

Fase estacionaria Muestra

Fase mvil

Cromatografa de lquidos
Se realiza en columna Separacin por adsorcin y particin Diversidad de tcnicas en funcin de la muestra Anlisis cualitativo y cuantitativo Separaciones analticas y preparativas Anlisis de mezclas relativamente complejas

Fase estacionaria (columna)


Tubo de acero inoxidable Dimensiones Longitud: 30, 50, 75, 100, 150, 300 mm Dimetro: 2.1, 3.9, 5, 7.8 mm Tamao de partcula: 3, 5, 10 m Forma de la partcula: irregular o esfrica

Dimensiones de columna
L

la

di dp

Fase estacionaria (columna)


Empaque Slica gel, C8, C18, Ciano, Amino, Resinas, Polmeros Carga de Carbn 5-20 % w/w Intervalo de pH = f (FE) Lmite de presin de trabajo Compatible con la fase mvil

Fase estacionaria

Soportes de la FE

Permeacin o exclusin

Cuidados de la columna
Instalacin Introduccin de muestras limpias Contaminacin por fase mvil o muestra Almacenarla y guardarla de forma adecuada Lavarla despus de utilizarla con disoluciones reguladoras de pH

Precauciones
No exceder la presin de trabajo Cambios bruscos de presin Intervalo de pH adecuado No utilizar H+ y OH- concentrados Filtrar la muestra y la fase mvil w de la muestra=f (dimensiones de la columna)

Cromatografa
Fase Normal FE polar FM No-polar Fase Inversa FE No-polar FM polar

Cromatografa de fase inversa


FE Slica qumicamente modificada con grupos no-polares: hidrocarburos saturados: C18 octadecil, C8 octil, C4 tetrametil, C2 dimetl FM Mezclas: agua/disolventes orgnicos H2O +(CH3OH, THF, CH3CN)

Cromatografa de fase inversa


Efecto solvofbico fuerte:
Parte apolar de la molcula del soluto es mayor % C en la FE es mayor Polaridad de la FM es alta (mayor % de H2O)

Fases estacionarias
Fases impregnadas
Cubren uniformemente el soporte Insolubles en la FM Compatibles con el detector El flujo de la FM no debe ser elevado

NO son Estables

Fases estacionarias
Fases qumicamente unidas phases) (Bonded

Unidas al soporte por enlaces covalentes Mayor eficiencia que las Fases impregnadas Costo elevado Son estables

Cromatografa de fase inversa


Ventajas
Reproducibilidad en las separaciones Estabilidad de la FE (pH 7) Mezclas: acuosos/orgnicos +(CH3OH, CH3CH2OH, CH3CN)

H2O

Fuerza del eluyente

Viscosidad del eluyente

Polaridad

Polaridad

Detectores
Indice de refraccin Ultravioleta-Visible Fluorescencia Electroqumico Radioactividad Infrarrojo Espectrmetro de masas

Instrumentacin
Fase mvil Bomba de alta presin Gradiente de elucin

Muestra

Inyector

Control de temperatura

Columna

Detector

Registrador

Elucin

Problema general la elucin

de

Gradiente de elucin

Gradiente de elucin

Elucin con alta presin

Elucin

Equipo con gradiente de elucin

Proceso Cromatogrfico
El lecho cromatogrfico puede ser abierto (placa) o cerrado (columna) La fase mvil fluye a lo largo del lecho cromatogrfico en contacto con la fase estacionaria

Proceso Cromatogrfico
Las mleculas de soluto en fase estacionaria se estancan Las mleculas en fase mvil avanzan con ella
Mm m m m m M

Proceso Cromatogrfico
La velocidad del soluto vara inversamente con la afinidad por la fase estacionaria

Separacin de los solutos


Los componentes con constantes de reparto diferentes, se separarn

Mm m m m
M M M

M M

Separacin de los solutos

H = f (v)

Ensanchamiento de banda

Ensanchamiento de banda

la

Transferencia de masa en la FE

Ensanchamiento de banda

la

Transferencia de masa en la FM movimiento

Ensanchamiento de banda

la

Transferencia de masa en la FM estancada

H= f (ensanchamiento de la banda)
HL = 2 DM / v k 2 vt a HS = 2 1+k HD = vdp2 / DM HM = HF + HD (1- + k)2 dp2v 30(1-)(1+k)2DM

HF = 2dp

HSM =

H = f (ensanchamiento de la banda)
H=L/N H = HL + HS + HM + HSM H = HS + HM + HSM

Ventajas
Anlisis de compuestos inicos, de alto peso molecular Diversidad de columnas y detectores Formacin de derivados pre-columna y post-columna Separaciones con control de pH Separaciones preparativas

Limitantes
Muestras relativamente limpias Solubilidad de la muestra en la fase mvil Viscosidad de la fase mvil Dimensiones de la columna Presin de trabajo Intervalo de pH Utilizar un filtro (pre-columna)

Cromatografa de Lquidos

Formacin de derivados

ERE

Derivados
Fuera de lnea En lnea Pre-columna Post-columna

Equipo para la formacin de derivados


FM FE Inyector Reactor Detector

FM FE Inyector Reactor Detector

Derivados

Derivados

Cromatografa de Lquidos

Aplicaciones

ERE

CCF - CLAE

FE = f (dimetro interno)

Diferente

Cambio de

Aplicacin

Aminas

Aplicacin

Fluorescencia

Polar - No polar

Qu sucedi ???

Sensibilidad

Sensibilidad

Peso molecular

Propiedades = f (PM)

Oligosacridos

Oligoglucosa

Ejemplos
Campo Frmacos Mezclas tpicas Antibiticos, sedantes, esteroides, analgsicos Bioqumica Amincidos, protenas, carbohidratos, lpidos Alimentos Edulcorantes, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos Contaminantes Pesticidas, herbicidas, PCB, fenoles Qumica Drogas, venenos, alcohol en forense sangre, narcticos