Universidad de Buenos Aires - Facultad de Medicina

Departamento de Biología Celular e Histología - 1° Unidad Académica

UNIDAD TEMÁTICA H1:

MICROSCOPIA. TÉCNICAS HISTOLÓGICAS. TEJIDO EPITELIAL

OBJETIVOS GENERALES Y ESPECIFICOS

§ Adquirir la habilidad del Manejo del Microscopio Óptico

- Reconocer los componentes ópticos y mecánicos de un microscopio óptico.
- Realizar una correcta iluminación.
- Enfocar correctamente con las distintas lentes objetivo.

§ Comprender el fundamento y la utilidad de las diferentes Técnicas Histológicas.

- Técnica Histológica de Rutina- Hematoxilina y Eosina (H&E): conceptos de Basofilia y Acidofilia.
Reconocimiento de estructuras con y sin afinidad por HyE. Artificios de técnica.
- Técnicas Especiales: fundamento y utilidad. Dicho conocimiento será aplicado a lo largo del curso de la
materia en las respectivas unidades.

§ Interpretar Incidencias de Corte de diferentes estructuras tisulares.

- Definir e Interpretar la incidencia de corte longitudinal, transversal, oblicuo y tangencial.
- Identificar estructuras con diferentes incidencias de corte y justificar.
- Relacionar la imagen bidimensional observada en un corte histológico con la estructura tridimensional
original.

§ Reconocer las Características del Tejido Epitelial en un preparado histológico de rutina.

- Tejido Epitelial de Revestimiento: reconocer morfología celular, clasificar e identificar los distintos tipos
de epitelios.
- Epitelios Glandulares: clasificación y reconocimiento de adenómeros y conductos excretores.
Correlacionar la afinidad tintorial y la ultraestructura con funciones y productos de secreción.

§ Comprender el concepto de Polaridad Celular. Identificar el dominio apical (especializaciones de

membrana), lateral y basal.

§ Identificar la Membrana Basal mediante técnicas especiales relacionando con el fundamento de las mismas.
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PREPARADOS PARA TRABAJAR EN MICROSCOPIO

1) Piel - H&E:

§ Epitelio de Revestimiento Plano Estratificado Queratinizado: epitelio superficial del órgano. Observar un
epitelio formado por varias capas celulares. La morfología de los núcleos va cambiando en los distintos
estratos mientras que las células planas se encuentran en el estrato más superficial. Identificar la
queratinización acidófila en el estrato mas superficial (flecha negra).

• Epitelio de Revestimiento Plano Simple: reconocer una única capa de células epiteliales en contacto con
una luz; identificar los núcleos aplanados en corte longitudinal o esféricos en corte transversal revistiendo
estructuras vasculares (endotelio).

§ Epitelio de Revestimiento Cúbico Biestratificado: puede observarse en los conductos excretores de

glándulas exocrinas sudoríparas. Formado por dos capas de células cubicas con citoplasma intensamente
acidófilo. Estos conductos se observan en distintas incidencias de corte.

§ Epitelio Glandular Exócrino

- Adenómero Tubuloglomerular: glándula sudorípara. (flecha roja)
Reconocer en la dermis múltiples cortes de túbulos en distintas incidencias. Identificar adenómero
revestido de epitelio cúbico simple (flecha negra) y conducto excretor revestido de epitelo cúbico
biestratidicado (flecha blanca). Ambas estructuras presentan células de citoplasma acidófilo siendo el
conducto excretor el de acidofilia mas intensa.
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- Adenomero sacular: glándula sebácea.

Reconocer en relación con un folículo piloso una estructura de morfología sacular la cual corresponde al
adenómero (flecha amarilla). Diferenciar: a) células basales más pequeñas, b) células citoplasma de
aspecto esponjoso con tinción negativa (inclusiones lipídicas) y núcleo central y, c) hacia el centro de la
glándula, células con tinción negativa y núcleo picnótico consecuencia del modo de secreción holocrina.
Reconocer las ramificaciones del adenómero y el conducto excretor pequeño.
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2) Tráquea HyE:

§ Epitelio de Cilíndrico Peudoestratificado Ciliado con Células Caliciformes: epitelio luminal del órgano.
Observar dos tipos de morfología nuclear: núcleos esféricos basales (flecha amarilla) y ovalados de
disposición más apical (flecha blanca). Reconocer los cilios (flecha negra). Reconocer las células
caliciformes (Glándulas Unicelulares de secreción Mucosa; flecha roja).

§ Epitelio Glandular Exócrino – Adenómeros Acinares: en la submucosa del órgano se observan

estructuras de morfología circular con células piramidales de citoplasma acidófilo pálido y células de
citoplasma basófilo menos abundantes que corresponden a adenómeros acinares mixtos. Pueden
observarse los pequeños conductos excretores de dichas glándulas revestidos de epitelio cubico simple
en distintas incidencias de corte.

3) Vejiga - H&E:

§ Epitelio de Revestimiento Estratificado Urotelio (Polimorfo o de transición): epitelio luminal del órgano.
Reconocer los distintos estratos de células y la morfología variable de acuerdo al grado de distensión del
órgano.

En el estrato mas superficial (flecha negra) pueden observarse células con núcleos redondos o aplanados según el
grado de distención de la mucosa. Algunas pueden tener citoplasmas acidófilos pálidos (flecha roja). Las células
intermedias son de aspecto redondeado, con citoplasmas abundantes de tinción pálida que inclusive pueden
mostrar halo claro perinuclear. En el estrato basal se observan células mas pequeñas con núcleos redondos u
ovalados de citoplasma basófilo (flecha blanca).
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4) Glándula Submaxilar - H&E:

§ Glándula Túbuloacinar Compuesta de secreción mucosa, serosa y mixta.

Identificar los tres tipos de adenómeros de morfología acinar (acinos mucoso – flecha amarilla; serosos - flecha
negra y mixtos – flecha blanca ) según la morfología de sus células y la tinción de su producto de secreción.
Identificar los diferentes conductos excretores:
- Intralobulillares Intercalares (epitelio cubico simple, flecha roja) y Estriados (epitelio cilindrico simple,
asteriscos rojos). Ambos próximos a los adenómeros, con células de citoplasma intensamente acidófilo
que pueden observarse en distintas incidencias de corte. El conducto intercalar de un tamaño similar al
adenómero mientras que el estriado es de mayor tamaño y presenta estriaciones basales.

- Extra o interlobulillares: son conductos inmersos en el tejido conectivo entre los lobulillos revestidos por
un epitelio cilíndrico estratificado con células altas de citoplasma intensamente acidófilo (asterisco
negro). A mayor tamaño puede observarse mayor grado de estratificación del epitelio.
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PREPARADOS FIJOS

1) Riñón - H&E:
§ Epitelio plano simple: hoja parietal cápsula de Bowman (flecha amarilla)
Reconocer una única capa de células epiteliales en contacto con una luz; identificar los núcleos aplanados
(flecha roja) en corte longitudinal o esféricos en corte transversal.
Similares caracteristicas de este epitelio pueden observarse en el endotelio de estructuras vasculares.
§ Epitelio cúbico simple (flecha negra): túbulo contorneado distal y túbulo colector.
Reconocer una única capa de células epiteliales en contacto con una luz, con núcleos esféricos en corte
transversal y longitudinal.
§ Epitelio cúbico simple con ribete en cepillo: túbulo contorneado proximal.
Reconocer una única capa de células epiteliales en contacto con una luz, con núcleos esféricos (flecha
blanca) en corte transversal y longitudinal. Identificar las especializaciones de membrana apical de ribete
en cepillo (microvellosidades).

Técnicas Especiales-Preparados Fijos

Tinción de H&E con PAS - preparado fijo de intestino delgado: (puede solicitarse para recorrer)
Mencionar fundamento de la técnica y reconocer estructuras PAS positivas. El fundamento de la técnica se basa en
la reacción (Peryodic Acid Schiff). Esta implica la ruptura de enlaces de las hexosas con Acido Peryódico para
transformar oxidrilos (OH) en aldehídos (C=O) y la posterior coloración de los grupos aldehídos con el reactivo de
Schiff. La utilidad de la técnica es permitir la observacion de estructuras ricas en hidratos de carbono, que no son
identificables con H&E ya que por carecer de carga no interaccionan con colorantes básicos (+) y ácidos (-) .
En este preparado puede observarse estructuras basófilas, acidófilas y elementos tisulares PAS Positivos como las
membranas basales de los epitelios, el glucocálix de la chapa estriada en la membrana apical de los enterocitos y el
citoplasma de células de secreción mucosa denominadas caliciformes.
En la imagen se observan estructuras PAS positivas: membrana basal del epitelio (flecha amarilla), el glucocálix de
especializaciones de membrana apical (flecha blanca) y el citoplasma de células de secreción mucosa (flecha negra).
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Tricrómico de Masson – preparado fijo de corazón de rata:

Utiliza solución de Bouin, hematoxilina férrica, escarlata de Biebrich, fucsina ácida, ácido fosfotungstico o
fosfomolíbdico, verde luz o azul de anilina y solución diferenciadora acuosa de ácido acético glacial. Resultados:
núcleos (azul negruzco), colágeno (azul o verde), citoplasmas, filamentos de citoqueratina, fibras musculares y
eritrocitos (rojo).
En este preparado pueden observarse las fibras colágenas de la matriz extracelular (celeste; flecha blanca), el
citoplasma de las fibras musculares esqueléticas cardíacas (rojo; flecha celeste), núcleos (rojos; flecha negra) y los
eritrocitos (naranja; flecha amarilla). Comparar con H&E.
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Técnica de Sudán - preparado fijo de glándula adrenal:

El fundamento de esta técnica se basa en la impregnación de estructuras con alto contenido lipidico por los
colorantes sudantes que tiene como utilidad poder observar localización y distribución de lípidos en los tejidos.
En este preparado puede observarse la impregnación de las inclusiones lipídicas (flechas blancas) de las células de
la corteza adrenal con Sudan Black.

Técnica de Feulgen – preparado fijo de células de cebolla:

El fundamento de esta técnica esta basado en la ruptura de las pentosas del ADN con Acido Clorhidrico (HCl),
exposición de grupos Aldehidos y posterior interacción de los mismos con el reactivo de Schiff.
En este extendido celular se puede reconocer la cromatina de células en interfase y los cromosomas en las distintas
fases de la mitosis coloreados en rojo magenta.
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Técnica de localización de actividad enzimática – preparado fijo de riñón FAL:

El fundamento de las técnicas enzimáticas esta basado la utilización de cromógenos o fluoroforos para detectar
actividad enzimática. La utilidad es permitir la detección de localización de determinadas enzimas en tejidos
mediante la observación de productos coloreados o emisión de fluorescencia. Esta observación requiere la utilidad
de diferentes microscopios ópticos.
En la imagen se identifica la localización de la enzima fosfatasa alcalina en el ribete en cepillo de los túbulos
contorneados del riñón.

Inmunohistoquímica (IHQ) – preparado fijo de cerebro de rata – GFAP

El fundamento de las técnicas IHQ esta basado en la interaccion de Antígenos-Anticuerpos. Marcando con
Fluoroforos o Enzimas dichos anticuerpos es posible detectar de forma específica presencia y localización de
diferentes componentes tisulares. También otorgan posibilidad de obtener datos cuantitativos (% de células con
inmunomarcacion positiva).
En este preparado puede observarse la expresión de proteínas específicas presentes en los filamentos intermedios
de células gliales.

En la imagen se observan: NF200: inmunomarcación especifica de una proteína presente los axones de las
neuronas (anticuerpo anti-NF200); MAP2: inmunomarcación especifica de una proteína presente las dendritas de
las neuronas (anticuerpo anti-MAP2); GFAP: Inmunomarcación especifica de una proteína presente los astrocitos
(anticuerpo anti-GFAP); S100b: inmunomarcación especifica de una proteína presente los astrocitos (anticuerpo
anti-S100B),
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Impregnaciones Argénticas – Cerebelo Cajal. Hígado Reticular.

El fundamento de estas técnicas se basa en la impregnación de estructuras tisulares con sales de plata o metales
pesados. Dichas sales precipitan sobre determinadas estructuras tisulares y permite observación. Para realizar las
técnicas de impregnaciones es necesario sumergir el taco en el colorante. En este caso el corte y montaje se realiza
posterior a la impregnación del tejido.

- Técnica de Cajal (Cerebelo): se observan neuronas y sus prolongaciones impregnadas con sales de plata
en el cerebelo.
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- Impregnación Argéntica (Riñón): se observan las fibras reticulares (flechas blancas) del tejido conectivo
del riñón impregnadas con sales de plata.

Técnicas Vitales: H&E con infusión de tinta china previa a la fijación– preparado fijo de hígado:
El fundamento de estas técnicas se basa en la infusión endovenosa de colorantes vitales y su posterior circulación
y fagocitosis. La utilidad es detectar macrófagos.

En el preparado se pueden reconocer los macrófagos hepaticos (células de Kupffer; flechas negras) con partículas
de tinta china fagocitadas en su citoplasma.
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Metacromasia – Tráquea con azul de toluidina.

La metacromasia es una propiedad de determinados tejidos (polianiones) y colorantes básicos metacromáticos
(azul de toluidina, azul de metileno) caracterizada por el viraje del color del azul violáceo, típico de la basofilia, al
rojo. Para que ocurra este fenómeno tintorial deben interactuar componentes tisulares y colorantes básicos
metacromáticos.
En el preparado puede observarse la matriz extracelular del cartílago hialino de la tráquea, rica en GAGs
(polianiones) en color rojo luego de interactuar con el azul de toluidina (colorante básico y metacromático).

APARTADO DE MICROSCOPIA

Partes del microscopio óptico (MO)

1. ÓPTICA
§ Objetivos: sistema de lentes biconvexas que proporciona una imagen real, aumentada e invertida del
preparado. Pueden ser secos (si sólo hay interpuesto aire entre éste y el preparado) o de inmersión (si hay
otro medio distinto al aire por ejemplo aceite), su aumento puede ser de 4 o 5 X, 10X, 40X y 100X.
§ Oculares: están ubicados en el extremo superior del microscopio y proporcionan una imagen virtual,
aumentada y derecha del preparado. Su aumento suele ser de 10X.
§ Sistema de iluminación: los microscopios más antiguos (monoculares) presentan un espejo que es necesario
moverlo para hacer incidir la luz de la lámpara de luz de la mesada de trabajo con el fin de poder iluminar la
totalidad del campo. En los más modernos (binoculares) la fuente luminosa está incorporada a la base del
mismo.
a) Condensador: enfoca la luz sobre el preparado proporcionando un cono de luz.
b) Diafragma: limita el haz de luz, eliminando los rayos más desviados.
c) Filtros: seleccionan las longitudes de onda de los rayos que van a incidir sobre el preparado.
2. MECÁNICA
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§ Pie
§ Columna
§ Platina y carro: la platina da soporte a la muestra, presenta un orificio para permitir el paso de la luz y el
carro que permite recorrer el preparado.
§ Tubo
§ Revólver: es un dispositivo giratorio ubicado en la base del tubo que permite intercambiar objetivos
durante la observación.
§ Tornillo macrométrico
§ Tornillo micrométrico

Indicaciones para el correcto uso del microscopio

Iluminación del Campo

Microscopios Monoculares: colocar el espejo para que se proyecte la fuente de luz hacia el condensador. La cara
plana se emplea cuando la fuente luminosa es concreta (lámpara) mientras que la cara cóncava se utiliza cuando
se emplea luz difusa ( luz ambiente).
Microscopios Binoculares: su fuente de luz esta incorporada en la base del microscopio bastará con encender la
luz y regular la intensidad de la iluminación.
IMPORTANTE: observar por el ocular que TODO el campo se encuentre iluminado antes de colocar el preparado.

Enfoque
a) Verificar que el objetivo colocado sea panorámico (4X) o seco débil (10X)
b) Verifique observando por el ocular que el campo se encuentre bien iluminado.
c) Colocar el preparado en la platina con el cubreobjetos hacia arriba y ubicar la zona de la muestra en el campo
iluminado.
d) Acerque el objetivo (4x o 10x) hasta que esté casi en contacto con el preparado hasta que haga tope, esto se
realiza movilizando el tornillo macrométrico, mirando desde AFUERA Y NO POR LOS OCULARES.
e) Observe por el ocular y utilice el tornillo macrométrico. En el microscopio monocular observara que se desplaza
el tubo mientras que en el binocular se desplazará la platina. En ambos casos el preparado se alejara de la lente
objetivo hasta lograr el foco donde se observara la imagen. Para lograr un mejor foco puede mover el tornillo
micrométrico.
f) Luego de recorrer todo el preparado, cambie el objetivo a seco fuerte (40-45x) rotando el revólver y movilice
el tornillo MICROMETRICO hasta obtener foco.
g) Para recorrer el preparado utilice los tornillos del carro. Si necesita realizar foco nuevamente mientras este
observando con el objetivo a seco fuerte SOLO debe utilizar el tornillo micrométrico. En el campo podrá
observar una marca o pelo que se utiliza para señalar las diferentes estructuras tisulares con precisión.
h) Terminada la observación, rotar el revolver y ubicar nuevamente en el objetivo de menor aumento para
retirar el preparado. NUNCA debe retirarse el preparado en seco fuerte (40X) esto podría romper el material de
estudio.

Apartado de Técnicas Histológica de Rutina (H&E)

Técnica: conjunto de pasos realizados en una muestra que permiten preservar sus características para una
correcta observación permitiendo su descripción en condiciones normales y pudiendo determinar situaciones
patológicas. Se denomina muestra histológica cuando se procesa una porción de tejido y citológica cuando se
procesan células obtenidas por raspaje o punción aspirativa.

1. Obtención de la muestra:
a) Biopsias: obtención de muestras de tejidos vivos. Las biopsias se realizan con el paciente bajo sedación o
anestesia y permiten luego de realizada la técnica histológica observar características microscópicas de los tejidos
y diagnosticar condiciones fisiológicas o patológicas de los distintos órganos.
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b) Autopsias: obtención de muestras de material cadavérico.

c) Raspajes: permite la obtención de muestras para observar citología. El material debe ser extendido luego se la
obtención sobre un vidrio rectangular llamado portaobjetos antes de continuar con los pasos de la técnica. Ej:
extendido vaginal.
d) Punción aspirativa: permite observar citología. La muestra se obtiene por aspiración con aguja fina. Similar a
los raspajes la muestras obtenidas por punción requieren la extensión del material sobre el portaobjetos para
continuar con los restantes pasos de la técnica. Ej: sangre, punción de tiroides, punciones de líquidos orgánicos.
La obtención de muestra por raspaje o aspiración con aguja no requiere la sedación previa del paciente.

2.Fijación: Paso fundamental en la técnica que tiene por objetivo preservar la estructura y ultraestructura de los
componentes tisulares de la muestra lo mas similares a cuando están vivos, evitando la autólisis del tejido. Los
fijadores pueden ser físicos ( someter la muestra a cambios de temperatura como frio o calor) o químicos. Dentro
de éstos últimos podemos clasificar fijadores simples y mezclas fijadoras. El más usado es el formol al 10%
(formaldehído al 4%) como fijador simple y el líquido de Bouin como mezcla fijadora. En estos casos como la
muestra se sumerge en el fijador se habla de fijación por inmersión. Cuando la fijación se realiza por perfusión, ésta
precede a la obtención de la muestra que luego recibe una fijación de inmersión de refuerzo.

3. Deshidratación: Es la completa eliminación del agua del tejido para luego poder incluirlo en medios no
hidrosolubles. Se sumerge la muestra en concentraciones crecientes de alcohol (50%, 70%, 80%, 95% y 100%) para
eliminar lentamente el agua y evitar la retracción del tejido.

4. Aclaración: Es la sustitución del deshidratante elegido por una sustancia soluble con el medio de inclusión. El
aclarante o líquido intermediario más utilizado es el xilol.

5.Inclusión: Tiene como objetivo endurecer la muestra para permitir su corte posterior. El medio de inclusión más
usado en MO es la parafina. Para muestras destinadas a microscopía electrónica (ME) se utilizan resinas epoxi. La
inclusión requiere que el tejido este deshidratado e inmerso en un medio liposoluble (xilol) para poder aceptar la
parafina o resinas.

6.Corte y Montaje: Se realiza con instrumentos especiales llamados micrótomos. Éstos varían si el corte es para
MO (secciones de micrómetros, μm, de espesor) o ME (secciones de nanómetros, nm, de espesor). El corte se
coloca sobre un portaobjetos de vidrio (este paso suele denominarse montaje inicial)

7.Desparafinar: se sumerge el portaobjetos con la muestra en xilol para retirar la parafina.

8.Rehidratación: debido a que los colorantes utilizados en la técnica de H y E son hidrosolubles se debe recuperar
la hidratación del tejido. Para realizar este paso se sumerge la muestra en soluciones con concentraciones
decrecientes de alcohol (100%, 95%, 80%, 70%,50%).

9.Coloración: primero se colorea con hematoxilina (carga + ) y luego con eosina ( carga - ). Las cargan de los
colorantes van a interactuar con las respectivas de los componentes tisulares permitiendo que se observan
coloreados.

10.Montaje final: se cubre la muestra ya coloreada con un cubreobjetos de vidrio utiliizando un medio de montaje
(por ej: bálsamo de Canadá sintético). Si el medio de montaje es liposoluble será necesario repetir los pasos 3 y 4
previos al montaje final.

Actividad de Autoevaluación y Discusión

1) Seleccione la afirmación correcta respecto a poder resolutivo (PR)

a) Aumenta modificando la fuente de luz blanca a ultravioleta.
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b) Disminuye utilizando objetivos de inmersión.

c) Disminuye cuando se utilizan microscopios de fluorescencia.
d) Es mayor en microscopios de alto límite de resolución.

2) Señale en qué microscopio se pueden apreciar más detalles.

a. LR:0,4 μm.
b. LR:0,3 mm.
c. LR:0,4 nm
d. LR:0,8 μm

3) Mencione técnica especial para identificar cada uno de los siguientes componentes tisulares. Justifique.
§ Triglicéridos de un adipocito________________________________________________
§ Glicoproteínas de secreción de una célula mucosa_______________________________
§ Peroxidasa de los peroxisomas de un macrófago________________________________
§ ADN de células que proliferan en cultivo_______________________________________
§ Fibras de colágeno de la matriz extracelular_____________________________________

4) Relacione los siguientes términos

Glándula Sebacea Epitelio de revestimiento estratificado
Adenómero Mucoso Secreción holocrina
Epitelio Plano Estratificado Mitosis
Ribete en cepillo Epitelio vascular
Feulgen PAS
Urotelio Absorción
Endotelio Gránulos de Queratohialina

5) Defina Acidofilia y Basofilia. Cite Ejemplos.