ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO DE ANTOCIANINAS,

MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA Y

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF ANTHOCYANINS, BY THIN

LAYER CHROMATOGRAPHY AND HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY

Alexis Juárez Mitre, Anali Yahutentzi Morales y Frida Karel Vásquez López
UPIIT-Unidad Profesional Interdisciplinaria en Ingeniería, campus
Tlaxcala, Instituto Politécnico Nacional.

Presentado: 16 de mayo, de 2022

Resumen

Las antocianinas son compuestos que se encuentran regularmente como pigmentos solubles
en agua en colores rojos, azulados o morados en gran parte de las flores, vegetales, cereales
y hojas de algunas plantas. Tienen características de compuestos fenólicos pertenecientes a
la familia de los flavonoides, cada una de estas características nos permiten entender su
conformación estructural.

Se presenta un análisis bibliográfico sobre métodos de separación y propiedades

conformacionales de las antocianinas a través del análisis cromatográfico de estos
compuestos, que facilitan el entendimiento de las mismas. Se exponen diferentes sistemas de
estado estacionario y fase móvil, en el estudio de las diversas muestras de antocianinas,
utilizando las cromatografías de capa fina (TLC) y la cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC).

Palabras Clave: Antocianinas, Cromatografía de alta resolución, cromatografía de capa

fina.

Abstract
Anthocyanins are compounds found naturally as water-soluble pigments in red, blue or
purple colors in most flowers, vegetables, cereals and leaves of some plants. They have
 characteristics of phenolic compounds belonging to the flavonoid family, each of these
characteristics allow us to understand their structural conformation.

A bibliographic analysis is presented on separation methods and conformational properties

of anthocyanins through chromatographic analysis of these compounds, which facilitate the
understanding of these compounds. Different steady state and mobile phase systems are
presented in the study of different anthocyanin samples, using thin layer chromatography
(TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC).

Key words: Anthocyanins, high resolution chromatography, thin layer

chromatography.

1. Introducción
Las antocianinas son los compuestos que dan el color a una diversa cantidad de organismos
vegetales, son uno de los principales colorantes vegetales después de la clorofila (Guerra &
Ortega, 2006) y claro, su composición estructural perteneciente a la familia de los flavonoides,
permite esta característica tan particular.

Como sabemos, gran parte de la industria ocupa colorantes sintéticos para la elaboración de los
productos, sin embargo, gran parte de estos colorantes generan problemas para la salud
(Padilla-Camberos, y otros, 2015), esto es un gran óbice para la industria debido a la pérdida
significativa que generan los daños causados por el producto, en consecuencia, se trata de
buscar métodos y sustancias de origen natural, para la disminución de riesgo del producto en
contacto con la piel. Así mismo, se da pie al estudio de las antocianinas, ya que son productos
generadores de pigmentos muy ocupados por la industria, como lo es el color rojo, y sin
consecuencias a la salud, por lo que se vuelve importante el estudio de estos compuestos y los
métodos de separación para la comprensión de su estructura. Esto nos lleva a los métodos de
cuantificación para el estudio sistemático de estos compuestos, como lo son las cromatografías.

Comprender cada uno de los aspectos mencionados, nos guía a conocer la importancia que
tiene el análisis de las antocianinas, así como la aplicación de la cromatografía TLC y HPLC
en la indagación de diferentes compuestos

2. Antocianinas.

2.1. Estructura y color de las antocianinas.

Las antocianinas están compuestas por una molécula de antocianidinas en forma de aglicona, a
la que se le une un azúcar mediante un enlace glucosídico. La variación entre sus anillos
aromáticos A y B, de manera más frecuente en el B (Astrid-Garzón, 2008), nos forman las
diferentes estructuras de antocianinas, de las cuales, son seis las que se conocen (Figura 1).
 Figura 1. Estructura y sustituyentes de las antocianinas (Wu & Prior, 2005)

Dependiendo de la orientación del grupo hidroxilo (OH) y el grupo metoxilo (OCH3) se

visualizará la gama de colores presentada (Figura 1.), obteniendo una tendencia a colores
azulados en los incrementos de hidroxilación y coloraciones rojizas en las incrementaciones de
metoxilaciones.

Como fue previamente mencionado, las antocianinas dentro de la naturaleza están unidas
mediante un enlace glucosídico a un azúcar y este enlace se da, en mayor medida, en las
posiciones 3 o 5 con mono, di o trisacáridos, lo que aumenta su polaridad (Astrid-Garzón,
2008). Es decir, las antocianinas son moléculas hidrosolubles.

Las diferentes sustituciones glucosídicas y aciladas, producen cambios en la tonalidad de las

antocianinas (Stintzing, Stintzing, Carle, Frei, & Wrolstad, 2002); de esta manera, las
sustituciones glucosídicas (en la posición 5) así como las acilaciones aromáticas, producen un
cambio en la coloración de la antocianina, tendiendo a una coloración púrpura o violeta.

Las antocianinas son fotosensibles, su estabilidad se ve afectada por varios factores como el
pH, temperatura, luz, oxígeno, iones metálicos, etc. (Rodriguez-Saona y Wrolstad, 2001; Kirca
Özkanb & Cemeroglu). De los factores importantes es el pH, debido a que este modifica la
estructura cromófora de la antocianina (Figura 2).
 Figura 2. Estructura de las antocianinas dependiendo el pH (Giusti & Wrolstad, 2001)

2.2 Análisis de antocianinas mediante cromatografía líquida de alta resolución

(HPLC)

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) separa los componentes de una mezcla.
Pueden tener diferentes fases, incluida la fase móvil y la fase estacionaria. En este caso, la fase
móvil actúa como portador de la muestra ya que sus componentes no covalentes se mueven
según sus interacciones.
Estas fases dependen de la naturaleza de los compuestos a determinar. Para las antocianinas,
este método de HPLC es una herramienta importante para la cuantificación y caracterización
de antocianinas individuales, y la columna C-18 se usa más comúnmente para el análisis
cromatográfico de antocianinas.
El método HPLC tiene limitaciones, especialmente para matrices complejas de extractos
crudos y muestras frescas; Esto requiere preconcentración y purificación para el análisis HPLC.
El propósito de la concentración es simplificar el cromatograma para una identificación y
cuantificación más confiables. El paso de purificación es muy importante porque elimina los
componentes que pueden interferir con el análisis de la muestra.
2.3 Análisis de antocianinas mediante cromatografía de capa fina (TLC).

El color y el comportamiento en cromatografía (polaridad) proporcionan datos relevantes para

separarlos y determinar los valores de Rf. Los métodos de fitoquímica, como la cromatografía
en papel (CP), la cromatografía en capa fina (CCP), la cromatografía en columna (CC) y la
cromatografía gas-líquido (CGL), de las cuales las CP-descendente son las más populares, son
económicas y práctica, que utiliza eluyentes como BAW (n-butanol-ácido acético glacial-agua,
4:1:5), BuHCl (n-butanol- ácido clorhídrico 2N, 1:1, fase superior), Forestal (ácido clorhídrico
concentrado-ácido acético glacial-agua, 3:30:10), HCl 1 % (ácido clorhídrico concentrado-
agua, 3:97) y Fórmico (ácido clorhídrico concentrado-ácido fórmico-agua, 2:5:3); la utilización
de varios disolventes ofrece mejores resultados comparativos (Francis, 1982; Gross, 1987;
Harborne, 1967; Harborne et al., 1973; Tanchev y Timberlake, 1969). Para complementar la
 identificación, existen técnicas físicas como la espectrofotometría de UV/VIS, espectrometría
de masas, resonancia magnética nuclear y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC); y
otras menos usadas como polarografía y ESR (Electron Spin Resonance) (Strack y Wray, 1989;
Takeda et al, 1994).

Muestra Fase Fase móvil Compuestos Rf Referencia

estacionaria

n-butanol, ácido Delfinidina 3-

0.14
fórmico y sambubiósido
Flor de agua(10:15:40) (Sangoluisa, Santacruz, &
gel de sílice
jamaica Salvador, 2019)
Cianidina 3
0.2
sambubiósido

Pelargonidina 3-
ramnósido-5- 0.65
Pétalos de metanol, Ácido glucósido (Shimizu-Yumoto ,
guisante de Celulosa acético y agua Ichimura , Hayashi, &
olor (11:5:1) Peonidina 3- Nakayama, 2012)
ramnósido-5- 0.65
glucósido

Cianidina-3-
0.19
monoglucosido
Ácido acético,
HCL y agua (
Celulosa 15:3:82) Glucósido de
Dicentra 0.38 (Fahselt, 1970)
cianidina-3-ramno

Cianidina-3.5-
0.32
diglucósido

pelargonidina 3- 0.43
glucósido,

Taro Celulosa cianidina 3- 0.39

ramnósido glucósido
 Ácido acético, HCl cianidina 3- (GHAN, H. T., KAO-JAO,
y agua ( 15:3:82) glucósido. 0.2 T. H. C., & NAKAYAMA,
T. O. M,1977)

Cianidina-3-
0.45
rutinósido
Calintao de n-butanol 2N,Hcl (Collins , Chang, & Knaak,
gel de sílice
Carolina (1:1) 1969)
Cianidina-3-
0.4
glucósido

Delfinidina -3-
0.16
glucósido

Cianidina-3-
0.29
galactósido
n- butanol, ácido
(ADERSEN & Knaak ,
Arándano rojo Celulosa acético y agua
1985)
(10:15:40) Cianidina-3-
0.45
glucósido

Cianidina-3-
0.3
arabinósido

Tabla 1. Identificación de antocianinas en algunos organismos vegetales mediante TLC

con sus coeficientes de retención (Rf).
Muestra Equipo Columna Fase móvil Temperatu Inyección Antocianinas Referencia
ra

cianidina-3-
Agua ácido (LIN,
galactósido
Piel de No µPBondapa acético y KOEHLER , &
30°C 1.5 µl
manzana Reportado k C-18 metanol SHEWFELT,
cianidina-3-
(71:10:19) 1989)
arabinósido

Pelorgadina 3-
acetilglucósido

Cianidina 3-
(A) ácido rutinósido (da silva ,
trifluoroacétic Escribano-
Hewlett-
o al 0,1 % en Pelorgadina 3- Bailon, Pérez
Packard AQUA
Fresas agua 35°C 20 µl malilglucósido Alonso, Rivas-
1100 C18
(B)acetonitril Gonzalo , &
series Pelorgadina
o de grado Santos-Buelga,
HPLC diglucósido 2007)

Cianidina 3-
malonilglucosil-5-
glucósido

A) agua-ácido
trixuoroacétic
(Mulabagal ,
Chicory o ( 99:9:0.1) cianidin-3-O-(6-
No Wang,
(Achicoria C-18 B) agua- 25°C 25 µl malonil-
Reportado Ngouajio , &
), acetonitrilo- glucopiranósido)
Nair , 2009)
ácido acético
(50.4:48.5:1)

cianidina 3-
A) Ácido glucósido
(USENIK,
Phenomene fosfórico
No cianidina 3- STAMPAR , &
Ciruela x Gemini (0.01M) 25°C 20 µl
reportado rutinósido VERERIC,
C-18 B)metanol
2009)
100% peonidina 3-
glucósido

A) Ácido cianidina-3-
fosfórico en glucósido
piel de (LEE &
No agua 3.5%
Lichi PLRP-S 30°C 20 µl cianidina 3- WICKER ,
Reportado
(Lychee) rutinósido 1991)
B)
acetonitrilo cianidina
 malvidina-3-
acetilglucósido

cianidina 3-
glucósido

A) Ácido cianidina 3-
(Tian , Giusti,
fórmico 10% sambubiosido
Frambues No Waters Stoner, &
y agua 30°C 25 µl
as negras Reportado C18 Schwartz,
B) cianidina 3-
2006)
acetonitrilo rutinósido

cianidina 3-
xilosilrutinósido

Tabla 2. Identificación de antocianinas en algunos organismos vegetales mediante

HPLC.

3. Conclusiones

En esta revisión bibliográfica se muestran las características e importancia de las

antocianinas en la industria, así como una demostración mediante técnicas de cuantificación
de algunas antocianinas presentes en diferentes organismos vegetales; por cromatografía de
capa fina (TLC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) que forman parte de las
herramientas fundamentales para la investigación, cuantificación y separación de estas
moléculas, contemplando características específicas a tratar en el manejo de estas moléculas
por los diferentes tratamientos cromatográficos presentes en esta revisión.
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