RESOLUCIÓN OENO 8/2007

DETERMINACION DE LA LISOZIMA EN EL VINO POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA

RESOLUCION

LA ASAMBLEA GENERAL,

Visto el Artículo 2, párrafo 2 iv del acuerdo fundador de la Organización Internacional de la Viña

y del Vino,

A propuesta de la Subcomisión de Métodos de Análisis

DECIDE completar el Anexo A del Compendio de Métodos Internacionales de Análisis del Vino y
del Mosto con el siguiente método de tipo IV:

Título Tipo de Método

Determinación de la lisozima en el vino por cromatografía IV
líquida de alta resolución

1. Introducción
Es preferible disponer de un método analítico para la lisozima que no esté basado en la
actividad enzimática.

2. Campo de aplicación
Este método admite la cuantificación de la lisozima (mg de proteina/l) presente en vinos
blancos y tintos, independientemente de la actividad enzimática (que podría ser impedida por
desnaturalización parcial o por fenómenos de complejación y coprecipitación) controlable en
la matriz.

3. Definición
La cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) presenta un enfoque analítico basado en la
interacción de tipo estérico, polar o de absorción entre la fase estacionaria y el analito, y no
vinculado, por consiguiente, a la actividad enzimática real demostrada de la proteína.

4. Principio
El análisis se realiza mediante cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) combinando un
detector espectrofotométrico con un detector espectrofluorimétrico. El contenido desconocido
en la muestra de vino se calcula sobre la base del área del pico cromatográfico, utilizando la
metodología del estándar externo.

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5. Reactivo
5.1. Solventes y soluciones de trabajo
Acetonitrilo (CH3CN) “grado HPLC”
Ácido trifluoroacético (TFA)
Agua desionizada “grado HPLC”
Solución modelo: ácido tartárico 1g/l, alcohol etílico 10% V/V, ajustado a pH 3,2 con
tartrato de potasio neutro

5.2. Eluentes
A: CH3CN 1%, TFA 0,2%, H2O= 98,8%
B: CH3CN 70%, TFA 0,2%, H2O= 29,8%

5.3. Soluciones de referencia

De 1 a 250 mg/l de lisozima estándar, disueltos en la solución modelo mediante agitación
continua durante un mínimo de doce horas.

6. Equipo
6.1. Aparato CLAR con sistema de bombeo previsto para efectuar un gradiente de elución
6.2. Instalación para columna con termostato (horno)
6.3. Detector espectrofotométrico asociado a un detector espectrofluorimétrico
6.4. Bucle de inyección, 20 µL
6.5. Columna polímero de fase inversa con los grupos funcionales fenil (diámetro de los
poros= 1 000 Å, límite de exclusión = 1 000 000 Da), Tosoh Bioscience TSK-gel Fenil
5PW RP 7,5 cm x 4,6 mm ID, a modo de ejemplo.
6.6. Pre-columna del mismo material que la columna, Tosoh Bioscience TSK-gel Fenil 5PW
RP Guardgel 1,5 cm x 3,2mm ID, a modo de ejemplo.

7. Preparación de la muestra
Las muestras de vino se acidifican con HCl (10 M) diluido al 1/10 y se filtran con filtro de
poliamida cuyos poros tienen un diámetro de 0,22 µm, cinco minutos después de la adición.
El análisis cromatográfico se lleva a cabo inmediatamente después de la filtración.

8. Condiciones operativas
8.1. Flujo del eluente: 1ml/min
8.2. Temperatura de elución: 30°C
8.3. Detección espectrofotométrica: 280 nm
8.4. Detección espectrofluorimétrica: λ ex = 276 nm; λ em = 345 nm; Gain = 10
8.5. Programa de gradiente de elución

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 Tiempo (min) A% B% gradiente
0 100 0
isocrático
3 100 0
linear
10 65 35
isocrático
15 65 35
linear
27 40,5 59,5
linear
29 0 100
isocrático
34 0 100
linear
36 100 0
isocrático
40 100 0

8.6. Tiempo de retención promedio de la lisozima: 25,50 minutos

9. Cálculo
Se analizan (por triplicado), las soluciones de referencia con las siguientes concentraciones
de lisozima: 1; 5; 10; 50; 100; 200; 250 mg/l. Para cada cromatograma, las áreas del pico
correspondiente a la lisozima se representan mediante un diagrama en función de las
respectivas concentraciones, con objeto de obtener las rectas de regresión linear expresadas
en la fórmula Y= ax+b. El coeficiente de determinación r2 deberá ser superior a 0,999.

10.Características del método

Con vistas a evaluar la adecuación del método al objetivo previsto, se ha llevado a cabo un
estudio de validación, tomando en consideración la linearidad, los límites de detección y de
cuantificación, y la precisión y exactitud del método. Este último parámetro se ha
determinado mediante la definición del nivel de precisión y de exactitud del método.

Rango de Pendiente Coeficiente de LD LQ Repetibilidad (n=5) Reproducibilidad

linearidad de la determinación (mg/L) (mg/L) RSD% (n=5) RSD%
(mg/L) recta (r2) Std1 V.R.2 V.B.3 Std1

UV 5-250 3 786 0,9993 1,86 6,20 4,67 5,54 0,62 1,93

FLD 1-250 52 037 0,9990 0,18 0,59 2,61 2,37 0,68 2,30
Tabla 1: Datos relativos a las características del método : 1
solución estándar ; 2
vino tinto ; 3

vino blanco

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10.1. Linearidad del método
Sobre la base de los resultados obtenidos en el análisis de regresión linear, el método
ha resultado linear en los rangos indicados en la tabla 1.

10.2. Límite de Detección y de Cuantificación

El límite de detección (LD), y el límite de cuantificación (LQ) se calcularon como la señal
equivalente a respectivamente 3 veces y 10 veces el ruido de fondo cromatográfico en
condiciones de trabajo en matriz real (Tabla 1).

10.3. Precisión del método

Los parámetros que se toman en consideración han sido la repetibilidad y la
reproducibilidad. La Tabla 1 indica los valores de estos parámetros (expresados como.%
de desviación estándar de medidas repetidas con diversas concentraciones) constatados
en la solución estándar, en vino blanco y en vino tinto.

10.4. Exactitud del método

Se ha calculado la recuperación porcentual en las soluciones estándar que contienen 5 y
50 mg/l de lisozima, tras la adición de una cantidad conocida de lisozima, tal como se
indica en la siguiente tabla.

[C] inicial Lisozima [C] teórica [C] Dev. Std Recup. %

nominal (mg/l) añadida (mg/l) hallada
(mg/l)
UV 280 nm 50 13,1 63,1 62,3 3,86 99

FD 50 13,1 63,1 64,5 5,36 102

UV 280 nm 5 14,4 19,4 17,9 1,49 92,1

FD 5 14,4 19,4 19,0 1,61 97,7

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Fig.1 Cromatograma de vino tinto que contiene lisozima pura (una solución estándar con un
contenido de 1 000 mg/L de lisozima se agregó al vino para obtener una concentración final de
125 mg/L de lisozima). A: detector UV a 280 nm; B: detector UV à 225 nm; C: detector FLD (λ
ex 276 nm; λ em 345 nm).

11. Bibliografía

Claudio Riponi; Nadia Natali; Fabio Chinnici. Quantitation of hen’s egg white lysozyme in wines
by an improved HPLC-FLD analytical method. Am. J. Enol. Vit., in press.

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