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Revista de Virología General (2013),94,209–219 DOI10.1099/vir.0.047308-0

Tropismo, compartimentación y retención del virus de la

copa del plátano (Nanoviridae)en el vector del pulgón
Pentalonia nigronervosa
Shizu Watanabe1,2y Alberto Bressan1
Correspondencia 1Departamento de Ciencias de Protección Ambiental y Vegetal, Universidad de Hawaii,
Alberto Bresan 3050 Maile Way, Gilmore Hall 96822 Honolulu, Hawaii, EE. UU.
bressan@hawaii.edu
2Departamento de Biociencia Molecular y Bioingeniería, Universidad de Hawaii, Honolulu, HI, EE. UU.

Virus vegetales de las familias.LuteoviridaeyGeminiviridaedependen de vectores hemípteros para la infección de

Recibido el 21 de agosto de 2012
Aceptado el 19 de septiembre de 2012
sus huéspedes. Varias líneas de evidencia han revelado que estos virus son transmitidos por vectores
competentes de manera circulatoria, implicando la entrada en el cuerpo del vector y el cruce de tejidos
epiteliales que forman el tracto alimentario y las glándulas salivales. Similar a los luteoviridos y geminivirus, una
tercera familia de virus vegetales, la familiananoviridae,También se ha informado que son transmitidos por
pulgones de forma circulatoria. Sin embargo, existe evidencia directa limitada de una posible vía de
translocación a través de los pulgones vectores. Aquí, utilizamos experimentos de curso temporal y ensayos de
transmisión junto con PCR en tiempo real y ensayos de inmunofluorescencia en tejidos disecados para examinar
la translocación, compartimentación y retención del virus de la copa del plátano (BBTV) en el vector del pulgón.
Pentalonia nigronervosa.Nuestros resultados indican que BBTV se transloca rápidamente a través del vector
áfido; se internaliza en la parte anterior del intestino medio, donde se acumula y se retiene en concentraciones
superiores a las de la hemolinfa o las glándulas salivales principales. A pesar del gran aumento en la
concentración viral, no hemos podido detectar transcripciones de BBTV con RT-PCR. Cuando los tejidos no
estaban permeabilizados, BBTV se localizó como puntos distintos en la proximidad de la superficie basal de las
células que forman el intestino medio anterior y las glándulas salivales principales, lo que sugiere un proceso
continuo de escape e internalización del virión, respectivamente. Curiosamente, documentamos que esos
órganos pueden tener contacto directo dentro del cuerpo del pulgón, lo que sugiere una posible ruta de
translocación independiente de la hemolinfa.

INTRODUCCIÓN y glándulas salivales se conoce como transcitosis y se inicia

Virus vegetales de las familias.Luteoviridae, Geminiviridaey
Nanoviridaecomprenden virus transmitidos por insectos
hemípteros de manera circulatoria persistente (Hogenhouty
otros, 2008). Durante el proceso de transmisión, los virus
circulantes son ingeridos con la savia de las plantas infectadas,
se internalizan y atraviesan las células intestinales del insecto,
desde donde se translocan al hemocele del vector. Después de
la internalización dentro de las glándulas salivales, los viriones
pueden descargarse en los tejidos vegetales junto con la saliva
producida durante el proceso de alimentación.
El proceso de internalización y retención de virus circulantes varía
entre diferentes combinaciones de vector-virus (Hogenhouty otros,
2008). Por ejemplo, los luteoviridos transmitidos por pulgones se
internalizan a través del intestino posterior y, en algunos casos, del
intestino medio posterior (Gildow, 1993; Gray & Gildow, 2003;
Reinboldy otros,2003) y penetran específicamente en las glándulas
salivales accesorias (Gildow & Rochow, 1980). El proceso de
penetración del virión en las células epiteliales del intestino.
Las cifras complementarias están disponibles en la versión en línea de este documento.
mediante el reconocimiento de receptores específicos, es decir,
proteínas de la superficie celular, a través de los cuales los viriones
pueden iniciar el proceso de unión a la membrana e internalización
(Tamborindeguy y otros,2010). Varias líneas de evidencia indican
que los luteoviridos se internalizan mediante endocitosis mediada
por clatrina (Braulty otros,2007; Gildow, 1982, 1993). Los viriones se
transportan a los compartimentos celulares a través de una vía
endocítica específica (Braulty otros,2007; Gildow, 1982, 1993; Gray y
Gildow, 2003). El proceso de transporte viral a través de diferentes
tejidos epiteliales parece ser muy específico; como consecuencia,
muchos luteoviridos muestran un alto nivel de especificidad de
vector (Gray y Gildow, 2003).
La internalización de los begomovirus (familiaGeminiviridae), como el
virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate (TYLCV), se
produce a través del intestino medio anterior (AMG) y la cámara de
filtración del vector de la mosca blanca.Bemisia tabaci (Ghanim y
Medina, 2007; medinay otros,2006). Las partículas virales parecen
transmitirse a las plantas después de la penetración de las principales
glándulas salivales (PSG) (Ghanim y Medina, 2007; Ghanimy otros,2001;
medinay otros,2006). Se ha descrito un patrón similar de
translocación para otro geminivirus, el virus del rayado del maíz.

047308GRAMOAsamblea General Adjunta 2013Impreso en Gran Bretaña 209

S. Watanabe y A. Bressan

(MSV, géneroMastrevirus)en el vector del saltamontes La información sobre la ruta de translocación de los nanoviridos
Cicadulina mbila (Ammary otros,2009; letóny otros,2002). dentro de los áfidos vectores es limitada y se deriva principalmente
Sin embargo, no hay evidencia del posible mecanismo de evidencia indirecta de ensayos de transmisión en lugar de la
celular implicado en la transcitosis de los geminivirus a visualización directa de los viriones (Anhalt y Almeida, 2008; Franzy
través de las membranas epiteliales del vector. otros,1998; Huy otros,1996). Recientemente, hemos desarrollado
un ensayo de inmunofluorescencia para determinar la localización
Los virus circulantes no se replican en sus vectores (ver la excepción
de BBTV dentro de su vector áfido. Descubrimos que los antígenos
de TYLCV; Czosneky otros,2001; Sinisterra y otros,2005); sin
BBTV se localizaban específicamente en la AMG y en células
embargo, muestran un patrón persistente de transmisión que
específicas que formaban las PSG (Bressan y Watanabe, 2011). En
generalmente dura de varios días a semanas (Czosneky otros,2002;
este estudio, utilizamos experimentos en el tiempo para examinar
Reynaud & Peterschmitt, 1992), lo que indica que los viriones se
la localización y concentración de BBTV en pulgones que se
retienen en el cuerpo del vector mientras aparentemente
alimentaban solo de plantas infectadas (ensayo de absorción) o
experimentan poca o ninguna degradación. Por ejemplo, el MSV y
pulgones a los que se les permitía acceder a tejidos vegetales sanos
otros begomovirus transmitidos por la mosca blanca parecen
después de haber adquirido viriones (ensayo de retención). Los
alcanzar altos niveles de concentración en los AMG del vector
pulgones se diseccionaron individualmente y los intestinos, la
(Ammary otros,2009; Czosneky otros,2002). Aunque los luteoviridos,
hemolinfa y las glándulas salivales se procesaron por separado
como el virus del enrollamiento de la hoja de la papa (PLRV, género
para ensayos de inmunofluorescencia y PCR en tiempo real. Se
polerovirus),se trasladan rápidamente a través de las células
realizaron ensayos de transmisión para examinar en qué medida el
epiteliales del intestino medio posterior, también parecen
BBTV era transmisible por áfidos. Realizamos ensayos de
acumularse dentro de él (Garrety otros,1996). La hemolinfa parece
inmunofluorescencia adicionales para localizar específicamente los
ser un reservorio importante de viriones porque tanto los
antígenos de BBTV en la superficie exterior de los intestinos y las
luteoviridos como los geminivirus pueden detectarse en cantidades
glándulas salivales. Con base en los resultados obtenidos y en la
significativas (Garrety otros,1993; Cazadory otros,1998; Liuy otros,
distribución interna de los tejidos portadores de antígenos de BBTV,
2006; rosally otros,1999). Muchos estudios han reportado unain
proponemos una posible translocación, compartimentación y
vitroInteracción de bacterias endosimbióticas derivadas de GroEL
retención de BBTV a través del pulgón vector.
con virus circulantes. Las interacciones GroEL-virión pueden
prevenir la degradación proteolítica de luteoviridos y geminivirus
en la hemolinfa de sus respectivos vectores (Filichkiny otros,1997;
gottlieb y otros,2010; Hogenhouty otros,2000; moríny otros,1999;
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
van den heuvely otros,1994). Sin embargo, hallazgos recientes
basados en la localización de GroEL en el pulgón del guisante
Adopción e internalización
Acyrtosifón pisumHarris y la reconstrucción tridimensional de la El título de BBTV-S, que contiene un ORF que codifica la proteína de
poliproteína GroEL cuestiona la posible función protectoraen vivo ( cubierta (Vetteny otros,2011), se cuantificó por primera vez en
Bouvainey otros,2011). tejidos de pulgones mediante ensayos de PCR en tiempo real. La
figura 1 (a) representa la concentración media de BBTV-S en
relación con el gen de actina del pulgón, en el intestino, las
Virus de la familia.Nanoviridaedifieren sustancialmente de
glándulas salivales y la hemolinfa de los pulgones que se
ambos virus ssDNA de la familiaGeminiviridaey virus ssRNA de
alimentaron de plantas de banano infectadas durante 1, 2, 3, 4, 7 y
la familiaLuteoviridaecon respecto a la morfología de
16 días. (ensayo de absorción de virus). El título medio de BBTV
partículas, organización genómica y modo de transcripción. Los
aumentó 600, 2750 y 3500 veces en los tejidos intestinales en
nanoviridos son pequeñas partículas icosaédricas sin envoltura
relación con el gen de actina del pulgón del plátano después de 3, 7
que tienen entre 17 y 20 nm de diámetro y contienen moléculas
y 16 días, respectivamente (Fig. 1a). También se observó un
de ADN ss circulares, generalmente monocistrónicas, de
aumento en las concentraciones de BBTV en la hemolinfa y las
aproximadamente 1 kb (Vetteny otros,2011). Los nanoviridos
glándulas salivales, pero en mucha menor medida que en el
tienen un genoma multicomponente que, dependiendo de la
intestino (Fig. 1a). Por ejemplo, la concentración relativa de BBTV en
especie y cepa viral, consta de 6 a 11 componentes de ADN
la hemolinfa aumentó 0,5, 17 y 140 veces después de 3, 7 y 16 días,
encapsulados por separado por una proteína de cubierta única
respectivamente, mientras que en las glándulas salivales aumentó
(Vetten y otros,2011). La familiaNanoviridaeActualmente incluye
1, 17 y 65 veces en el mismo período. intervalos de tiempo (Fig. 1a).
al menos ocho especies virales formalmente reconocidas
agrupadas en dos géneros separados:NanovirusyBabuvirus Debido al rápido aumento de la concentración de BBTV en los
(vetey otros,2005). El virus del amarillo necrótico de la haba tejidos intestinales, examinamos la presencia de transcripciones de
(FBNYV) y el virus de la copa del plátano (BBTV) son las especies ARN en pulgones virulíferos. Aunque fue posible detectar
tipo de los génerosNanovirusybabuvirus, respectivamente. transcripciones virales de BBTV-R en plantas infectadas mediante
Mientras que el FBNYV se transmite por pulgones que RT-PCR, no encontramos niveles detectables de transcripciones de
colonizan cultivos de leguminosas, como el pulgón del caupí. BBTV-R en el ARN aislado de pulgones (Fig. S1, disponible en JGV
Aphis craccivoraKoch, el pulgón del frijolAphis fabaeScopoli y el Online). Este resultado confirma ensayos anteriores realizados por
pulgón del guisante (Katuly otros,1993), el BBTV es transmitido Burns.et al. (1995), quienes no observaron niveles detectables de
específicamente por el pulgón del banano.Pentalonia transcripciones de BBTV en pulgones utilizando ensayos de
nigronervosa (huy otros,1996; Magee, 1940; Wu y Su, 1990). transferencia Northern. Por tanto, el aumento de

210 Revista de Virología General94

 Interacción BBTV-áfido

(a) (b)
400 4000 400 4000

Glándulas salivales
hemolinfa

Tripas (ADN BBTV/ADN actina)

Tripas (ADN BBTV/ADN actina)

300 3000 300 3000

Glándulas salivales, hemolinfa.

Vísceras

Glándulas salivales, hemolinfa.

(ADN BBTV/ADN actina)

(ADN BBTV/ADN actina)

200 2000 200 2000

100 1000 100 1000

1 2 3 4 7 dieciséis 0 2 4 7 12 dieciséis

Tiempo (días) Tiempo (días)

Figura 1.Concentración media ySEde BBTV en el intestino, las glándulas salivales y la hemolinfa del pulgón del bananoP. nigronervosa durante la fase
de captación (a) y retención (b). El ensayo de absorción se realizó permitiendo que ninfas del cuarto estadio se alimentaran de plantas de banano
infectadas con BBTV durante 1, 2, 3, 4, 7 y 16 días. El ensayo de retención se realizó permitiendo que ninfas recién nacidas del primer estadio se
alimentaran y desarrollaran en plantas de banano infectadas con BBTV durante 12 días. Luego, los adultos fueron trasladados a plantas de banano
sanas y sometidos a pruebas de inmunofluorescencia después de 2, 4, 7, 12 y 16 días. El día 0 se probaron los pulgones al final del desarrollo en
plantas infectadas, antes de transferirlos a plantas sanas.

El ADN viral observado a lo largo del tiempo en el pulgón (Fig. 1a) es Las glándulas salivales no mostraron patrones de etiquetado obvios
probablemente el resultado de la absorción e internalización progresiva de los (Tabla 1). Las diferencias en la intensidad del etiquetado de los intestinos
viriones de las plantas infectadas. Seleccionamos una escala de tiempo de y las glándulas salivales concuerdan con los resultados de la PCR en
muestreo para el ensayo de absorción viral que reflejaba aproximadamente el tiempo real (Fig. 1a).
tiempo necesario para que los pulgones se desarrollaran desde ninfas recién
Realizamos experimentos de transmisión para examinar si los viriones
nacidas del primer estadio hasta convertirse en adultos; por lo tanto, la carga
internalizados en el hemocele del pulgón eran transmisibles. Los
viral relativa detectada puede representar una estimación del nivel que los
experimentos de transmisión utilizaron los mismos intervalos de
pulgones pueden ingerir e internalizar durante su desarrollo en la naturaleza.
muestreo que los ensayos de inmunofluorescencia y PCR en tiempo real.
Por lo tanto, los pulgones se recolectaron después de 1, 2, 3, 4, 7 y 16
Paralelamente a la PCR en tiempo real, realizamos ensayos de días de alimentarse de plantas infectadas con BBTV y luego se
inmunofluorescencia para determinar la localización de los antígenos transfirieron a discos de hojas de plátano sanas durante un período de
BBTV. Confirmando los resultados de un estudio anterior (Bressan & acceso a la inoculación (IAP) de 2 días. La tasa de transmisión media fue
Watanabe, 2011), obtuvimos evidencia de marcado en el AMG, pero no de 0,55 después de 1 día de alimentación de plantas infectadas (Fig. 4a),
pudimos identificar los antígenos BBTV en los tejidos del intestino lo que demuestra que BBTV se traslada rápidamente a través de las
anterior, el intestino medio posterior o el intestino posterior (datos no membranas epiteliales y la cantidad relativamente pequeña de BBTV
mostrados). La figura 2 (a) muestra el cambio en la intensidad del detectada con PCR en tiempo real después de 1 día (Fig. 1a ) es, en
etiquetado a lo largo del tiempo en intestinos medios anteriores fijados muchos casos, lo suficientemente grande como para sostener la
con acetona incubados con anticuerpos policlonales, que se detectaron inoculación. La probabilidad de transmisión de BBTV aumentó con el
con un procedimiento de mejora con biotina-estreptavidina. El marcaje tiempo que los pulgones se alimentaban de las plantas infectadas,
del virus se observó en el AMG tan pronto como 1 día después de que el alcanzando tasas de transmisión muy altas (Fig. 4a).
pulgón se alimentara de plantas infectadas; la intensidad del etiquetado
aumentó junto con el tiempo que los pulgones se alimentaron de
plantas infectadas (Fig. 2a). No hubo evidencia de etiquetado en
intestinos disecados de pulgones sanos, que se utilizaron como Retención
controles (Fig. 2a). La cinética del marcaje del virus en el AMG concuerda
Los experimentos de retención se realizaron transfiriendo pulgones
con los ensayos de PCR en tiempo real, lo que revela un gran aumento
virulíferos a plantas de banano sanas, que fueron reemplazadas cada 4
en el ADN de BBTV-S.
días. Para probar si los pulgones pueden haber ingerido partículas
Confirmando investigaciones anteriores (Bressan y Watanabe, virales adicionales como consecuencia de la infección de la planta, en un
2011), no observamos el etiquetado de BBTV en las glándulas experimento separado permitimos que los pulgones sanos se
salivales accesorias (datos no mostrados). Sin embargo, se observó alimentaran conjuntamente con pulgones virulíferos BBTV en una planta
un nivel detectable de etiquetado en los PSG (Fig. 3a), en los que se de banano sana. Después de una alimentación conjunta de 4 días con
observaron puntos distintos. El etiquetado en los PSG se hizo los mismos pecíolos, determinamos la concentración relativa de BBTV en
evidente después de 2 días de alimentación del pulgón en plantas pulgones mediante PCR en tiempo real. Como lo muestra la
infectadas, y observamos un etiquetado más fuerte a medida que comparación con pulgones sanos (no expuestos), no hubo evidencia de
avanzaba el tiempo (Fig. 3a). Sin embargo, el grado de etiquetado que los pulgones sanos expuestos a la alimentación conjunta pudieran
varió entre los pulgones individuales, y una gran proporción de haber ingerido partículas virales (Fig. S2). La figura 1(b) representa

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S. Watanabe y A. Bressan

(a)
Día 1 Dia 2 Día 3 Día 4 Día 7 Día 16 CTL

(b)
Día 0 Dia 2 Día 4 Día 7 Día 12 Día 16 CTL

Figura 2.Localización por inmunofluorescencia de BBTV en el intestino medio anterior del pulgón del banano fijado con acetona.P. nigronervosa
durante la fase de absorción (a) y retención (b) (los detalles sobre los ensayos de absorción y retención se informan en la leyenda de la Fig. 1). Los
antígenos BBTV se marcaron con anticuerpos policlonales de conejo, seguido de amplificación con biotina-estreptavidina y detección con Alexa Fluor
488 (verde). Los núcleos celulares se tiñeron con 49,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; azul). Barras, 100metrometro.

la concentración media de BBTV-S en los intestinos, las glándulas
salivales y la hemolinfa de pulgones disecados que se desarrollaron
como ninfas de primer estadio en plantas infectadas durante 12
días y posteriormente se transfirieron a plantas sanas, de las cuales
se tomaron muestras como adultos después de 2, 4, 7, 12 y 16 días.
También se probaron los pulgones antes de transferirlos a plantas
sanas, denominado día 0 en las figuras 1(b) y 2(b). BBTV se mantuvo
en una alta concentración en el intestino durante al menos 7 días.
Después de 12 y 16 días de que los pulgones se alimentaran de
plantas sanas, el título en los tejidos intestinales disminuyó
significativamente (PAG,0,001; Prueba de Mann-Whitney) (Fig. 1b).
La disminución en la concentración viral media en los tejidos
intestinales no estuvo acompañada de un aumento significativo en
los niveles de ADN de BBTV en el hemocele (hemolinfa y glándulas
salivales) (Fig. 1b), como se observó para el MSV en el vector del
saltamontes.C. mbila (letóny otros,2002).
La figura 2 (b) muestra el patrón típico de etiquetado en AMG fijados con
acetona utilizando anticuerpos policlonales, que se detectaron con un
procedimiento de mejora con biotina-estreptavidina. La cinética del
marcaje viral en los AMG coincidió aproximadamente con los ensayos de
PCR en tiempo real, revelando una disminución en la concentración de
viriones (Fig. 1b). Los antígenos BBTV se detectaron como puntos
distintos en los PSG durante al menos 12 días de alimentación del
pulgón en plantas sanas (Fig. 3b). También examinamos la transmisión
de BBTV por pulgones que se desarrollaron a partir de ninfas del primer
estadio en plantas de banano infectadas durante 12 días y
posteriormente fueron transferidos a plantas sanas. En cuanto a los
ensayos de inmunofluorescencia y PCR en tiempo real, se tomaron
muestras de pulgones a los 0, 2, 4, 7 y 12 días de las plantas sanas y
posteriormente se transfirieron a discos de hojas de plátano durante
una IAP de 2 días. Los pulgones conservaron la capacidad de transmitir
el virus hasta

212 Revista de Virología General94

 Interacción BBTV-áfido

(a) (b)

Fig. 3.Localización por inmunofluorescencia de BBTV en glándulas salivales del pulgón del banano fijadas con acetona.P. nigronervosa durante la
fase de absorción (a) y retención (b) (los detalles sobre los ensayos de absorción y retención se informan en la leyenda de la Fig. 1). Los antígenos
BBTV se marcaron con anticuerpos policlonales de conejo, seguido de amplificación y detección con biotina-estreptavidina con Alexa Fluor 488
(verde), mientras que los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (azul). Las flechas blancas indican el etiquetado del virus. Barras, 100metrometro.

16 días; sin embargo, la probabilidad de transmisión de BBTV
disminuyó con el tiempo (Fig. 4b).
Localización de BBTV en la superficie basal de intestinos
y glándulas salivales.
Los resultados obtenidos mediante PCR en tiempo real y ensayos
de inmunofluorescencia sugirieron fuertemente que los viriones
BBTV se internalizaron en el hemocele a través del AMG. Para
obtener más evidencia para confirmar la translocación de BBTV
desde el intestino medio anterior al hemocele, realizamos ensayos
de inmunofluorescencia en intestinos fijados con
paraformaldehído, tratados o no con Triton X-100 e incubados con
mAb de BBTV. Triton X-100 es un tensioactivo no iónico que
permeabiliza las membranas celulares, permitiendo así que los
anticuerpos accedan al citosol celular. Al omitir Triton X-100,
evitamos que los anticuerpos penetraran las membranas celulares
y, por lo tanto, visualizamos selectivamente antígenos en o cerca de
la superficie basal de los tejidos, probablemente correspondientes a
la lámina basal y el plasmalema basal (Gildow, 1993). En
comparación con la acetona (Fig. 2), el paraformaldehído permitió
una preservación mucho mejor de la
órganos disecados y estructuras celulares (Fig. 5). Cuando se aplicó
Triton X-100, se marcó BBTV en el citoplasma celular que rodea los
núcleos celulares de AMG (Fig. 5a). Sin embargo, cuando se omitió
Triton X-100, se observó el etiquetado como puntos distintos en la
superficie basal de los AMG (Fig. 5b; Tabla 2), lo que sugiere que
algunos viriones cruzaron las células epiteliales. Realizamos
ensayos de inmunofluorescencia similares en las glándulas
salivales. Cuando se aplicó Triton X-100, observamos etiquetado en
la porción de las glándulas salivales correspondiente a las células
principales (Fig. 5a) (Bressan & Watanabe, 2011). No hubo evidencia
de etiquetado dentro de las celdas de cubierta. Cuando se omitió el
tratamiento con Triton X-100, se observó un marcado proximal a la
superficie basal de las células principales, lo que sugiere la
penetración selectiva de los viriones a través de estas células. El
etiquetado era visible como puntos, similar al observado en los
tejidos intestinales (Fig. 5b).
Ruta de translocación
Con la excepción de nuestro estudio anterior (Bressan & Watanabe,
2011), los datos sobre las interacciones BBTV-áfido se han obtenido
únicamente de experimentos de transmisión. BBTV es

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S. Watanabe y A. Bressan

se transmite durante al menos 15 a 20 días después de la

DEl ensayo de retención se realizó permitiendo que ninfas recién nacidas del primer estadio se alimentaran y desarrollaran en plantas de banano infectadas con BBTV durante 12 días. Luego, los adultos fueron trasladados a plantas de
12/14 (0,86)
1/23 (0,04)
adquisición, y hay un período latente detectable estimado en 20 a

Día 16
28 h (Anhalt y Almeida, 2008; Huy otros,1996; Magee, 1940). Al igual
que otros virus de plantas transmitidos de manera circulatoria
persistente, la presencia de un período de latencia en el vector

17/18 (0,94)
puede reflejar la necesidad de que los viriones atraviesen las

5/25 (0,2)
Día 12
membranas celulares de sus vectores (Gray & Gildow, 2003).

banano sanas y sometidos a pruebas de inmunofluorescencia después de 2, 4, 7, 12 y 16 días. El día 0 se probaron los pulgones al final del desarrollo en plantas infectadas, antes de transferirlos a plantas sanas.
Como lo sugieren experimentos de transmisión anteriores (Anhalt y
Almeida, 2008; Magee, 1940) y los resultados de los ensayos de
Ensayo de retenciónD

17/17 (1,00)
9/19 (0,47) transmisión y evolución temporal informados en este estudio, BBTV
Día 7

se transloca rápidamente al hemocele del pulgón. De hecho,

obtuvimos altas tasas de transmisión después de solo 1 día de
Se han informado imágenes de etiquetado en las figuras 2 y 3 para el intestino medio anterior y los PSG, respectivamente. La tabla combina los resultados de dos réplicas.

período de acceso de adquisición seguido de un IAP de 2 días (Fig.

4a). Además de la rápida translocación, BBTV sufre un proceso de
Tabla 1.Detección de BBTV dentro del pulgón del banano,P. nigronervosaen experimentos a lo largo del tiempo mediante el uso de ensayos de inmunofluorescencia

18/18 (1,00)
2/26 (0,08)

acumulación dentro del cuerpo del pulgón, que parece ocurrir

Día 4

principalmente en el AMG (Figs. 1, 2 y 5). Estos resultados son

similares a lo que se ha observado para los viriones PLRV, que se
trasladan rápidamente a través del intestino medio posterior del
pulgón vector.Myzus persicae,sino que también se acumulan en él
16/16 (1,00)
25/9 (0,36)

(Garrety otros,1996).
Dia 2

* El ensayo de absorción se realizó permitiendo que ninfas del cuarto estadio se alimentaran de plantas de banano infectadas con BBTV durante 1, 2, 3, 4, 7 y 16 días.

La detección consistente de ADN de BBTV en la hemolinfa es

dNúmero de órganos disecados etiquetados para el virus sobre el número total de órganos analizados. Las proporciones se indican entre paréntesis.

interesante porque sugiere que los viriones pueden transportarse a

las glándulas salivales a través de la hemolinfa. La evidencia sugiere
23/23 (1,00)
26/12 (0,46)
Día 16

que tanto los geminivirus como los luteoviridos, como TYLCV y

PLRV, interactúan con GroEL producido por bacterias
endosimbióticas hereditarias alojadas dentro de los vectores
(Filichkiny otros,1997; gottlieby otros, 2010; Hogenhouty otros,
16/16 (1,00)

2000; moríny otros,1999; van den heuvely otros,1994).

7/14 (0,5)
Día 7

Recientemente hemos detectado la presencia del endosimbionte

primario del pulgónBuchnera aphidicola dentro del pulgón del
banano, y hemos obtenido la secuencia de un gen que codifica una
supuesta proteína GroEL. Además, mediante un ensayo de
13/15 (0,87)
4/17 (0,24)

transferencia Western, detectamos una BuchneraHomólogo de

Día 4

GroEL en la hemolinfa del pulgón del banano (no publicado). Estos

Ensayo de absorción*

resultados sugieren que BBTV y Buchnera-GroEL derivado coexiste

en la hemolinfa del pulgón del banano y, por lo tanto, puede
16/17 (0,94)

potencialmente interactuar.
26/9 (0,35)
Día 3

Debido a que el ADN del BBTV se detectó por primera vez en la AMG, en
la que alcanzó concentraciones superiores a las de la hemolinfa y las
glándulas salivales (Figs. 1a y 2a), es razonable sugerir que los intestinos
son los órganos a través de los cuales se internalizan por primera vez las
13/19 (0,68)
6/24 (0,25)

partículas virales. Por el contrario, la cinética del ADN de BBTV en la

Dia 2

hemolinfa y las glándulas salivales sigue tendencias temporales

similares a lo largo del tiempo (Fig. 1a). La falta de lagunas temporales
en la detección del ADN del BBTV en la hemolinfa y las glándulas
10/16d (0,62)

salivales puede explicarse por la rápida translocación de los viriones a

0/21 (0.00)
Día 1

través del hemocele del pulgón. Sin embargo, estos datos también
pueden sugerir que los viriones se trasladan a las glándulas salivales
directamente desde la AMG. Es interesante resaltar que (i) las secciones
transversales en serie obtenidas de un pulgón del banano entero
mostraron que las células principales que forman las PSG (pero no las
intestino medio anterior

glándulas salivales accesorias) pueden estar en contacto directo con la

AMG (Fig. S3) y que ( ii) Los antígenos BBTV se marcaron en o cerca de la
superficie tanto de la AMG como de las células principales que forman
PSG

las PSG, lo que sugiere un proceso continuo de infección del virión.

214 Revista de Virología General94

 Interacción BBTV-áfido

(a) (b)
1.00 1.00

Probabilidad de transmisión

Probabilidad de transmisión
0,75 0,75

0,50 0,50

0,25 0,25

3 6 9 12 15 3 6 9 12 15
Tiempo (días) Tiempo (días)

Figura 4.Probabilidad de transmisión del BBTV por pulgón individual del banano,P. nigronervosadurante la fase de absorción (a) y retención (b) (los
detalles sobre los ensayos de absorción y retención se informan en la leyenda de la Fig. 1). Los puntos abiertos informan las tasas de transmisión
observadas. Las curvas proceden de un análisis de regresión logística que expresa la probabilidad de transmisión a lo largo del tiempo.

escape e internalización, respectivamente (Fig. 4). Recientemente, Cicero En conjunto, nuestros resultados sugieren que la translocación del
y Brown (2011) sugirieron la posibilidad de la transferencia directa del BBTV a través de su vector áfido tiene más en común con los virus
virus del enrollamiento de las hojas de la calabaza (génerobegomovirus) vegetales de la familiaGeminiviridae (transmitido por saltamontes,
desde el intestino medio hasta las glándulas salivales de la mosca blanca saltamontes y mosca blanca) que los luteoviridos transmitidos por
B. tabaci. Los autores sugirieron que la translocación del virión puede pulgones. Sin embargo, a diferencia de otros virus circulantes de
ocurrir cuando el intestino de la mosca blanca se extiende hasta su plantas, existe evidencia de que los nanoviridos, como el FBNYV,
posición más anterior en el tórax, haciendo contacto directo con las requieren un factor auxiliar codificado por el virus para la
glándulas salivales. También se ha propuesto una vía similar de transmisión vectorial (Franzy otros,1999), similar a los virus
translocación de virus para los tospovirus (familiaBunyaviridae), que son vegetales del género de transmisión no persistentepotyvirus (Ng y
transmitidos propagativamente por trips (Moritzy otros, 2004). Falk, 2006). Franzet al. (1999) demostró que el supuesto factor
auxiliar mediaba el transporte viral a través del

(a) (b) (C)

PSG Vísceras

Figura 5.Localización por inmunofluorescencia de BBTV en intestinos fijados con paraformaldehído y PSG del pulgón del banano.P. nigronervosa.Los
antígenos BBTV se localizaron utilizando mAb de ratón seguidos de anticuerpos secundarios marcados con Alexa Fluor 555 (rojo). Los núcleos
celulares se tiñeron con DAPI (azul). (a) Tripa o PSG de un pulgón infectado con BBTV tratado con Triton X-100. (b) Intestino o glándula salival
principal de un pulgón infectado con BBTV no tratado con Triton X-100. (c) Intestino o glándula salival principal de un pulgón sano tratado con Triton
X-100. am, intestino medio anterior, pm; intestino medio posterior, cc, células de cubierta; f, intestino anterior; mc, células principales; PSG, glándulas
salivales principales. Barras, 100metrometro.

http://vir.sgmjournals.org 215
S. Watanabe y A. Bressan
Tabla 2.Detección de BBTV dentro del pulgón del banano,P.
nigronervosaque se desarrolló en plantas infectadas con BBTV
durante 12 días
Los controles fueron pulgones recolectados de plantas de banano sanas. Las
imágenes de etiquetado se muestran en la Fig. 5. La tabla combina los
resultados de dos réplicas.
Desprovisto de Triton X-100 Tritón X-100
BBTV CTL BBTV
intestino medio anterior 21/23 (0,91)* 0/23 (0) 8/9 (0,88)
PSG 8/10 (0,8) 0/11 (0) 9/9 (1)
*N° de órganos etiquetados para el virus sobre el total de órganos analizados.
Las proporciones se indican entre paréntesis.
Interfaz hemocele-glándula salival del pulgón del guisante. Sobre la base
de la evidencia de que los viriones purificados no son transmisibles por
pulgones, se ha sugerido que BBTV utiliza la misma estrategia de
transmisión utilizada por FBNYV (Thomas y Dietzgen, 1991). Por lo tanto,
estudios adicionales sobre las interacciones nanoviridos-áfidos pueden
arrojar luz nueva y exclusiva sobre las interacciones entre vectores y
virus.
MÉTODOS
Mantenimiento de pulgones y virus.Una cepa de BBTV recolectada en
agosto de 2007 de una planta de banano infectada en el campo en la isla
de Oahu (Hawái, EE.UU.) fue transmitida por áfidos a bananos
micropropagados en macetas, cv. Williams. El virus se caracterizó con un
TAS ELISA (Agdia Inc.) y ensayos de PCR utilizando pares de cebadores
para la detección de seis componentes del ADN del BBTV (Burnsy otros,
1995) según métodos previamente descritos (Almeiday otros,2009; Xie y
Hu, 1995). La secuenciación de los productos de PCR identificó
secuencias casi idénticas a las de trabajos anteriores (Almeiday otros,
2009; Xie & Hu, 1995) y confirmó que BBTV de grupos hawaianos dentro
del clado Medio Oriente-Pacífico Sur (Huy otros,2007).
Se mantuvo una colonia de pulgones del banano, que se estableció a partir de un
pulgón individual, en plantas de banano sanas en macetas. Las plantas infectadas
con BBTV utilizadas en esta investigación se produjeron transfiriendo entre 20 y 30
pulgones virulíferos a plantas de banano sanas en macetas en una etapa de
crecimiento de seis hojas. Las plantas se podaron en su base 1 mes después de la
inoculación, permitiendo que los hijuelos brotaran y crecieran durante otras 4
semanas. En aquel momento, los retoños presentaban fuertes síntomas de infección
y fueron utilizados para los experimentos.
Ensayos de captación y retención de BBTV.Realizamos experimentos en el
tiempo para analizar el patrón de absorción y retención de BBTV dentro
del pulgón del banano.
Para los ensayos de absorción de BBTV, transferimos ninfas del cuarto estadio de la
colonia de pulgones a plantas infectadas con BBTV. Los pulgones se depositaron en
la base de los pecíolos de las plantas cerca del pseudotallo del que se alimenta el
pulgón del banano (Magee, 1927; Robsony otros,2007) y adquiere fácilmente el virus
(Anhalt & Almeida, 2008; Magee, 1927). Posteriormente se tomaron muestras de los
pulgones después de 1, 2, 3, 4, 7 y 16 días y se procesaron para localización por
inmunofluorescencia, PCR en tiempo real y ensayos de transmisión.
Para los ensayos de retención de BBTV, permitimos que las ninfas recién nacidas del primer estadio
se alimentaran y completaran su desarrollo en plantas de banano infectadas con BBTV.
216
Al final del desarrollo del pulgón, que duró 12 días, los adultos emergentes
fueron transferidos a plantas de banano sanas en macetas. Una vez
transferidos a las plantas sanas, se tomaron muestras de los pulgones a los 2,
4, 7, 12 y 16 días. Además, se tomaron muestras de los pulgones justo antes
de transferirlos a las plantas sanas (designado día 0). Los pulgones
muestreados se procesaron para localización por inmunofluorescencia, PCR
en tiempo real y ensayos de transmisión. Para los ensayos de retención, se
reemplazaron plantas de banano sanas cada 4 días. Realizamos una prueba
separada para examinar si durante estos 4 días los pulgones pudieron haber
readquirido partículas virales de las plantas. Se colocaron juntos pulgones
adultos sanos y infectados con BBTV recién surgidos en los pecíolos de una
CTL planta de banano sana de cinco hojas. Para discriminar los pulgones
infectados con BBTV de los sanos, se marcaron los primeros en sus
0/7 (0)
abdómenes con un mini bolígrafo corrector (LP Sanford, Oak Brook, IL, EE.
0/8 (0)
UU.). Después de 4 días, se recolectaron pulgones de la planta y se extrajo el
ADN de insectos individuales utilizando un mini kit QIAamp DNA (Qiagen). La
concentración de BBTV se cuantificó mediante PCR relativa en tiempo real
como se describe a continuación. Como control se utilizaron pulgones sanos
criados en la colonia de cría. Todos los experimentos se realizaron en un
invernadero con un fotoperíodo de aproximadamente 12 h y un rango de
temperatura de 27±5tuC.
Disección y muestreo de hemolinfa.Los pulgones se diseccionaron bajo un
microscopio estereoscópico esencialmente como se describió anteriormente
(Bressan & Watanabe, 2011). Brevemente, se inmovilizaron pulgones hambrientos
individuales durante 1 h en la superficie de una cámara de disección (Electron
Microscopy Sciences) y se sumergieron en aproximadamente 200metrol PBS (NaCl
137 mM, KCl 2,7 mM, Na 10 mM2HPO4y KH 2 mM2correos4; pH 7,4). Luego se
diseccionaron los pulgones sumergidos en PBS con una cuchilla de acero inoxidable
recubierta de politetrafluoroetileno (Ted Pella Inc.) cortando los cuerpos de los
pulgones detrás de sus ojos compuestos y permitiendo que tanto el conducto salival
como el intestino anterior se separaran de los estiletes.
La hemolinfa liberada tras la decapitación se tomó como muestra con un
capilar de vidrio. La hemolinfa del pulgón del banano es roja, mientras que los
órganos internos son de color blanco translúcido (Fig. S4), lo que permite el
muestreo selectivo de la hemolinfa. La muestra de hemolinfa del capilar se
transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Luego, utilizando pequeños
alfileres, se diseccionó todo el tracto digestivo y las glándulas salivales y se
extrajeron del cuerpo del pulgón, se lavaron varias veces en PBS y se
procesaron para localización por inmunofluorescencia y ensayos de PCR en
tiempo real. Las muestras de hemolinfa se evaluaron únicamente con ensayos
de PCR en tiempo real.
PCR en tiempo real.El ADN se extrajo utilizando un mini kit QIAamp DNA
(Qiagen). Brevemente, los intestinos disecados, las glándulas salivales y la
hemolinfa de tres pulgones se agruparon en tubos de ultracentrífuga
individuales de 1,5 ml que contenían 180metrol tampón de lisis. El
procedimiento siguió las instrucciones del fabricante. El ADN se eluyó con 100
metrol agua ultrapura en tubos de ultracentrífuga limpios de 1,5 ml. Primero
realizamos una PCR de diagnóstico utilizando el par de cebadores CPXI.PRI y
BBTV3C.EXP (Wanitchakorny otros,2000). El ADN extraído de plantas
infectadas y sanas se utilizó como control positivo y negativo,
respectivamente. Utilizamos una PCR relativa en tiempo real para apuntar al
componente genómico S del ADN de BBTV y, como referencia interna, al gen
de actina del pulgón del banano utilizando un procedimiento similar descrito
por Mason.et al. (2008). Los cebadores universales del gen de actina, actina1
(59-CATCT-GCTGGAAGGT-39)y actina2 (59-CTGTACGCCTCCGGTCGTAC-CAC-39)
(boonhamy otros,2002) se utilizaron para obtener un fragmento de
aproximadamente 900 pb del gen de actina del pulgón. El amplicón fue
secuenciado tanto de los 59y 39extremos, y la secuencia se analizó con el
software Primer3 (v. 0.4.0) para diseñar un par de cebadores específicos para
el gen de actina del pulgón del banano, ActPef (59-CGGTGATT-
TCCTTTTGCATT-39)y ActPer (59-GTGTGACGTTGACATCAG-AAAAG-39).De
manera similar, se usó un componente genómico S de BBTV previamente
secuenciado para diseñar el par de cebadores BBTVSf (59-TG-
GGCTAATGGATTGTGGAT-39)y BBTVSr (59-CGCCTGTTTTT-
Revista de Virología General94

GGTCTTCTG-39).Los pares de cebadores se probaron para determinar la
especificidad de la PCR utilizando ADN extraído de plantas y pulgones
infectados y sanos y mediante un análisis de curva de fusión realizado con un
ciclador térmico Rotor-Gene 6000. La PCR se realizó con SYBR Green master
mix (Qiagen), 500 nM de cada cebador y ADN en un volumen final de 20metrol.
Cada muestra de ADN se analizó por duplicado con un termociclador Rotor-
Gene 6000. Para cada muestra analizada, la cantidad relativa de ADN de BBTV
se normalizó con la cantidad de ADN de actina mediante la ecuación: ECt (actina)/
MICt (BBTV), donde mi5la eficiencia de la PCR de un par de cebadores
determinado, yCt5ciclo umbral, que se calculó automáticamente con el
software IQ (Software Rotor-Gene 6000 Series Versión 1.7, Corbett Research).
La eficiencia de la amplificación se determinó mediante regresión lineal
obtenida mediante la amplificación de extractos de ADN diluidos en serie. Los
valores de eficiencia se calcularon con la siguiente fórmula: 10(–1/pendiente).
porque mi5Se logró 2,00 para los pares de cebadores BBTV y actina,
adoptamos una ecuación simplificada, 2Ct (actina-BBTV), para calcular la
abundancia relativa de ADN de BBTV en cada muestra. Para cada momento,
analizamos el ADN extraído de los intestinos, las glándulas salivales y la
hemolinfa de 18 pulgones. Las diferencias en la concentración de ADN de
BBTV entre diferentes fechas de muestreo se evaluaron con una prueba de
Kruskal-Wallis seguida de una prueba de Mann-Whitney para realizar
comparaciones por pares. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el
software SigmaStat Versión 3.5 (San José, CA).
Localización de inmunofluorescencia.La localización de inmunofluorescencia se
realizó en los intestinos y glándulas salivales disecados y fijados con acetona
con un procedimiento de etiquetado con biotina-estreptavidina como se
describió anteriormente (Bressan y Watanabe, 2011). Los portaobjetos se
visualizaron bajo un microscopio de epifluorescencia Olympus BX-51 con una
cámara digital Optronics MacroFire. Para permitir la comparación de muestras
entre los diferentes puntos de tiempo probados, estandarizamos el tiempo de
exposición de la cámara a 300 ms para los AMG y 500 ms para los PSG.
Además, desarrollamos un protocolo de inmunofluorescencia para
determinar selectivamente la localización de los antígenos BBTV en o cerca de
la superficie basal de AMG y PSG. Los órganos se diseccionaron de pulgones
que se alimentaron de plantas infectadas con BBTV durante 12 días o, como
control, de pulgones recolectados de plantas sanas. Se permitió que los
órganos disecados se adhirieran completamente a la superficie de los
portaobjetos y luego se fijaron en PBS que contenía paraformaldehído al 4 %
durante 1 h. Después de un lavado extenso con PBS para eliminar el fijador,
los portaobjetos se incubaron con PBS que contenía Triton X-100 al 1 % o con
PBS solo durante 1 h. Luego, las muestras se incubaron durante una hora
adicional en una solución bloqueadora de PBS con suero de cabra normal al
10 %. Se añadieron mAb de ratón anti-BBTV (Ig/A24876 e Ig/A24877) diluidos
1:200 en PBS y suero de cabra normal al 1 % a los portaobjetos, que se
incubaron durante la noche a 4tuC. Posteriormente, los portaobjetos se
lavaron tres veces en PBS y se incubaron durante 45 minutos con IgG anti-
ratón de cabra conjugada con Alexa Fluor 555 (Invitrogen) diluida 1:500 en
PBS. Los portaobjetos se lavaron tres veces en PBS, se enjuagaron con agua y
se montaron con medio de montaje anti-decoloración ProLong Gold que
contenía DAPI (Invitrogen) para contrateñir los núcleos celulares.
Ensayos de transmisión.La eficiencia de transmisión de BBTV se analizó mediante un
ensayo de disco de hoja como se describió anteriormente (Bressan & Watanabe,
2011). Se tomaron muestras de los pulgones durante los ensayos de absorción y
retención y se transfirieron individualmente a discos de hojas de plátano sanas
durante una IAP de 2 días. Después de eliminar los pulgones, los discos de hojas se
incubaron durante otros 2 días para permitir la replicación del virus. A continuación
se retiraron los discos de hojas de la cámara, se lavaron minuciosamente con jabón
para platos en ambos lados de la hoja y se enjuagaron con agua. El ADN se extrajo
de discos de hojas individuales mediante un procedimiento con bromuro de
cetiltrimetilamonio (Xie y Hu, 1995).
La presencia de BBTV se analizó mediante un ensayo de PCR anidada. Se
realizó una primera ronda de amplificación utilizando 1metrol ADN en 25metro
l mezcla maestra, que contiene 5 pmol de cebadores 73F (59-GGCTTTATC-
http://vir.sgmjournals.org
Interacción BBTV-áfido
CAGAAGACCAA-39)y 73R (59-CCGTATCATGTATATTTGTTT-39)para
detectar específicamente BBTV-S. Los productos de PCR obtenidos de la
primera ronda de amplificación se diluyeron 30 veces y 1metroSe utilizó
1 l del producto diluido en una segunda ronda de amplificación, con una
mezcla maestra que contenía 5 pmol de cada cebador CPXI.PRI y
BBTV3C.EXP (Wanitchakorny otros,2000), para amplificar una proporción
interna de BBTV-S producida por la PCR directa. Las bandas se
visualizaron en gel de agarosa al 1,2 %. Los experimentos de transmisión
se repitieron tres veces.
Detección de transcritos de BBTV en pulgones y plantas.Aislamos ARN de
pulgones sanos o infectados con BBTV y de plantas sanas o infectadas con
BBTV utilizando un kit RNeasy Mini (Qiagen). Antes de la extracción de ARN,
los pulgones que se desarrollaron alimentándose de una planta infectada con
BBTV durante 12 días se transfirieron a una planta de banano sana durante 4
días para limpiar el tracto alimentario (Sinisterray otros,2005). Se trituraron
grupos de 10 pulgones o 20 mg de nervadura central de plátano en un tubo
de 1,5 ml que contenía 350metrol tampón RLT. Las muestras se centrifugaron
a alta velocidad en columnas QIAshredder (Qiagen). Posteriormente, se
realizó la extracción de ARN según las instrucciones del fabricante. Luego, las
muestras se transcribieron de forma inversa utilizando el kit de transcripción
inversa QuantiTect (Qiagen). Los ensayos de PCR se realizaron utilizando
cebadores R2f (59-CC-TTCGAGTTTGGTGCATTT-39)y R2r (59-CGCCATGATATTCT-
CCACCT-39)para amplificar una proporción de 236 pb dentro del ORF del
BBTV-R, que codifica el Rep. maestro. La PCR se realizó en las siguientes
condiciones: desnaturalización inicial a 94tuC durante 2 min, 30 ciclos de
desnaturalización a 94tuC durante 30 s, recocido a 51tuC durante 30 s,
extensión a 72tuC durante 30 s y una extensión final de 5 min a 72tuC. Los
amplicones se visualizaron en gel de agarosa al 1,2 %. El ADN extraído de
pulgones sanos e infectados con BBTV se utilizó como controles positivos y
negativos adicionales, respectivamente.
Glándulas salivales y distribución espacial del intestino medio anterior.
Analizamos la distribución espacial interna de las glándulas salivales y AMG
del pulgón del banano. Brevemente, adultos de pulgón enteros, desprovistos
de apéndices y permeabilizados mediante la perforación del exoesqueleto con
pequeñas agujas de vidrio, se fijaron con glutaraldehído al 4 % en cacodilato
de sodio 0,1 M, pH 7,4, seguido de un lavado en cacodilato de sodio 0,1 M y
luego se fijaron posteriormente. en 1 % OsO4en cacodilato de sodio 0,1 M. Las
muestras se deshidrataron en una serie graduada de etanol, se sustituyeron
con óxido de propileno y se incluyeron en resina epoxi LX-112 (Electron
Microscopy Sciences). Transversal 1metroSe produjeron m secciones a partir
de la cabeza de los pulgones con un ultramicrotomo Ultracut E Reichert-Jung.
Estos se montaron en portaobjetos, se tiñeron con tinción de Richardson y se
observaron con un microscopio compuesto.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue apoyado por el fondo Hatch de la Universidad de Hawaii:
'Insectos vectores de patógenos vegetales en Hawaii', y por el fondo TSTAR:
'Supresión de la transmisión de BBTV mediante la manipulación de la
interacción virus-vector' para AB
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