1999 - Immobilized Enzymes - Methods and Applications

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Enzimas inmovilizadas: métodos y aplicaciones.

Wilhelm Tischer 1 ∙ Frank Wedekind2
1
Boehringer Mannheim GmbH, Nonnenwald 2, D82372 Penzberg, Alemania.
Correo electrónico: wilhelm.tischer@roche.com
2
Boehringer Mannheim GmbH, Nonnenwald 2, D82372 Penzberg, Alemania.
Correo electrónico: frank.wedekind@roche.com
Las enzimas inmovilizadas se utilizan en síntesis orgánicas para aprovechar al máximo las ventajas técnicas y económicas
de los biocatalizadores basados en enzimas aisladas. La inmovilización permite
separación del catalizador enzimático fácilmente de la mezcla de reacción y puede reducir los costos de
enzimas dramáticamente. Esto es cierto para las preparaciones de enzimas inmovilizadas que proporcionan un rendimiento
general bien equilibrado, basado en rendimientos de inmovilización razonables y baja transferencia de masa.
limitaciones y alta estabilidad operativa. Hay muchos métodos disponibles para la inmovilización que van desde la unión
sobre materiales de soporte prefabricados hasta la incorporación a sistemas in situ.
transportistas preparados. Las fuerzas de unión operativas varían entre interacciones de adsorción múltiples débiles y
uniones únicas a través de una unión covalente fuerte. ¿Cuál de los métodos es el
Lo más adecuado suele ser una cuestión de las aplicaciones deseadas. Es por tanto la intención de
este documento para describir los métodos de inmovilización comunes y las tecnologías de reacción para
Facilitar las aplicaciones adecuadas de enzimas inmovilizadas.
Palabras clave: Inmovilización enzimática, Efectos de transferencia de masa, Estabilidad operativa, Inmovilización
métodos.
1 Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
2 ¿Por qué inmovilizar las enzimas? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
3 Métodos de inmovilización . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
Grupos funcionales enzimáticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

3.1 3.1.1 Grupos funcionales nativos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
3.1.1.1 Cadenas laterales de aminoácidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
3.1.1.2 Carbohidratos ligados a enzimas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
3.1.2 Grupos funcionales sintéticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
3.2 Materiales portadores y grupos funcionales. . . . . . . . . . . . . . 105
3.2.1 Portadores Inorgánicos. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
3.2.2 Portadores orgánicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
3.2.2.1 Portadores orgánicos de origen natural. . . . . . . . . . . . . . . . 107
3.2.2.2 Portadores orgánicos sintéticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
4 Efectos de transferencia de masa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

4.1 Difusión porosa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
4.2 Reacción (dinámica) y generada por soporte (estática)
"Gradientes de protones". . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
4.3 Dependencia de la temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
Temas de la química actual, vol. 200

© Springer Verlag Berlín Heidelberg 1999
96 W. Tischer ∙ F. Wedekind
4.4 Evaluación de estabilidad. . . . . . ... ... ... . . . . . . . . . . 118

4.5 Otras contribuciones. . . ... ... ... ... . . . . . . . . . . 119
5 Rendimiento de Enzimas Inmovilizadas . . ... ... ... . . . . 119

5.1 Formulación y actividad enzimática. . ... ... ... ... . . . . 119
5.2 Estabilidad. . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... ... ... . . . . 121
6 Conclusiones . . . . ... ... . ... ... ... ... ... . . . . 123
7 Referencias . . ... ... ... . ... ... ... ... ... . . . . 123
1
Introducción
El uso artificial de enzimas de unión a materiales sólidos se remonta a la

década de 1950, cuando las enzimas inmovilizadas, es decir, enzimas con movilidad restringida,
se prepararon por primera vez intencionalmente [1,2]. La inmovilización se logró
mediante inclusión en matrices poliméricas o unión a materiales de soporte. Considerable
También se puso esfuerzo en la reticulación de enzimas, ya sea mediante reticulación de
proteína sola o con la adición de materiales inertes [3].
En el transcurso de las últimas décadas numerosos métodos de inmovilización sobre una base
Se han desarrollado una variedad de materiales diferentes. Encuadernación con prefabricados
Los materiales de soporte parecen haber sido el método preferido hasta ahora. Recientemente,
También se ha informado que la reticulación de cristales de enzimas es una opción interesante.
alternativa [4].
Las enzimas inmovilizadas son actualmente objeto de considerable interés. Este
se debe a los beneficios esperados sobre las enzimas solubles o tecnologías alternativas.
El número de aplicaciones de enzimas inmovilizadas aumenta constantemente [5].
Sin embargo, en ocasiones las investigaciones experimentales han producido resultados inesperados.
resultados como una reducción significativa o incluso un aumento de la actividad en comparación
con enzimas solubles. Así, los cristales reticulados de subtilisina mostraron 27 veces
menos actividad en la hidrólisis acuosa de un éster de aminoácido en comparación con iguales
cantidades de enzima soluble [6]. Por otro lado, en la aplicación de lipoproteína
lipasa en la síntesis de ésteres mediada por disolventes hubo un aumento de 40 veces.
aumento de la actividad utilizando preparaciones de enzimas inmovilizadas o modificadas de otro
modo en comparación con el polvo de enzimas [7].
Por eso es obligatorio tener algunos conocimientos básicos de los elementos esenciales.
contribuciones de las fuerzas químicas de unión y de las fuerzas fisicoquímicas.
interacciones durante una reacción enzimática que generalmente es una cuestión de
catálisis heterogénea.
2
¿Por qué inmovilizar las enzimas?
Existen varias razones para la preparación y uso de enzimas inmovilizadas.

Además de un manejo más cómodo de las preparaciones enzimáticas, los dos
Enzimas inmovilizadas: métodos y aplicaciones. 97
Transportador
Enzima
Propiedades bioquímicas Características químicas
Tipo de reacción y cinética Propiedades mecánicas
Método de inmovilización Efectos de transferencia de masa Estabilidad operativa

producir[%] eficiencia [] h ciclos [#]
Actuación
productividad [unidades/kg de producto]
Consumo de enzimas [kg producto/unidad]
Fig. 1. Características de las enzimas inmovilizadas.
Los principales beneficios específicos son (1) fácil separación de la enzima del producto,
y (2) reutilización de la enzima.
La fácil separación de la enzima del producto simplifica las aplicaciones de las enzimas y respalda una
tecnología de reacción confiable y eficiente. En el otro
Por otro lado, la reutilización de enzimas proporciona ventajas de costos que a menudo son un factor esencial.
prerrequisito para establecer un proceso catalizado por enzimas en primer lugar.
Las propiedades de las preparaciones de enzimas inmovilizadas se rigen por la
propiedades tanto de la enzima como del material portador. La interacción específica
entre estos últimos proporciona una enzima inmovilizada con distintas propiedades químicas, bioquímicas,
mecánicas y cinéticas (Fig. 1).
De los numerosos parámetros [810] que deben tenerse en cuenta, el
Los más importantes se describen en la Tabla 1.
En lo que respecta a los costos de fabricación, el rendimiento de enzima inmovilizada
La actividad está determinada principalmente por el método de inmovilización y la cantidad de
enzima soluble utilizada. Bajo condiciones de proceso, la actividad resultante puede ser
reducido aún más por los efectos de transferencia de masa. Más precisamente, el rendimiento de la enzima.
La actividad después de la inmovilización depende no sólo de las pérdidas causadas por la unión.
procedimiento, pero puede reducirse aún más como resultado de la menor disponibilidad de
moléculas de enzima dentro de los poros o de moléculas de sustrato que se difunden lentamente.
Estas limitaciones, resumidas como efectos de transferencia de masa, conducen a una menor eficiencia.
Por otra parte, una mayor estabilidad en las condiciones de trabajo puede compensar
tales inconvenientes, lo que resulta en un beneficio general. En conjunto, estas interacciones
son una medida de la productividad o del consumo de enzimas, por ejemplo, expresada como
unidades de enzima por kg de producto. Si reemplazamos “unidades enzimáticas” por “costos enzimáticos”, tendremos
obtener los costos esenciales relacionados con el producto, por ejemplo, en dólares estadounidenses por kg de producto.
Para estimar las ventajas de costos de las enzimas inmovilizadas, es necesario considerar los pasos de
fabricación individuales y su contribución a
Tabla 1. Parámetros característicos seleccionados de enzimas inmovilizadas
Enzima Propiedades bioquímicas ,

masa molecular, grupos protésicos, grupos funcionales en la superficie de la
proteína, pureza (función inactivadora/protectora de impurezas)
Parámetros cinéticos enzimáticos ,
actividad específica, pH, perfiles de temperatura, parámetros cinéticos de
actividad e inhibición, estabilidad de la enzima frente al pH, temperatura,
disolventes, contaminantes, impurezas.
Transportador Características químicas,
base y composición química, grupos funcionales, comportamiento de
hinchamiento, volumen accesible de matriz y poro. tamaño, estabilidad química
del portador.
Propiedades mecánicas :
diámetro de partícula húmeda, comportamiento de compresión de una sola
partícula, resistencia al flujo (para aplicación en lecho fijo), velocidad de
sedimentación (para lecho fluidizado), abrasión (para tanques agitados).
Inmovilizado Método de inmovilización
enzima proteína unida, rendimiento de enzima activa, parámetros cinéticos
intrínsecos (propiedades libres de efectos de transferencia de masa)
Efectos de transferencia
de masa que consisten en partición (diferentes concentraciones de solutos
dentro y fuera de las partículas del catalizador), difusión externa e interna
(porosa); esto proporciona la efectividad en relación con la enzima libre
determinada en condiciones de reacción apropiadas, estabilidad,
estabilidad
operativa (expresada como disminución de la actividad en condiciones de
trabajo), estabilidad en
almacenamiento,
productividad de "rendimiento" (cantidad de producto formado por unidad o
masa de
enzima), consumo de enzima (p. ej. unidades kg–1 producto, hasta la vida media)
los costos generales. En primer lugar, comprenden los costes de la biomasa de origen
vegetal y animal, o de fermentaciones microbianas. En este último caso, los costes están
determinados principalmente por la escala de fermentación y la tasa de expresión de las
enzimas. En segundo lugar, la degradación es necesaria para alcanzar la pureza requerida,
pero va acompañada de una pérdida de actividad. Puede ser necesario el uso de escalas
de fermentación más grandes para compensar la pérdida de actividad y también algún
aumento en el costo (Fig. 2). En tercer lugar, los costes del procedimiento de inmovilización
aumentan aún más los gastos de fabricación. Por lo tanto, aparte de la ventaja potencial
de una eliminación más fácil de la enzima del producto formado, las enzimas inmovilizadas
hasta ahora no proporcionan ningún beneficio económico. Sin embargo, se lograrán
ahorros de costos mediante la reutilización múltiple de una enzima inmovilizada. Por otro
lado, un uso prolongado también significa una reducción de la operación unitaria y, por
tanto, un aumento de los costes de fabricación de la propia enzima, que también deben
tenerse en cuenta. En conclusión, sólo el uso múltiple conducirá a una reducción drástica
de costes. En la práctica, esto puede controlarse considerando la cantidad de enzima
requerida por kg de producto formado.
[$/kg]
Fig. 2. Costo y productividad
3
Métodos de inmovilización
Durante las últimas dos décadas se han publicado muchas reseñas y libros sobre la
inmovilización de enzimas [5, 1120]. La intención de esta parte de la revisión es explicar
los principios básicos y mostrar los desarrollos recientes de la inmovilización de enzimas
con fines de biotransformación preparativa. Se dará especial énfasis a la unión de enzimas
a soportes artificiales o naturales prefabricados (ver Sección 3.2).
La inmovilización de macromoléculas se puede definir generalmente como un

procedimiento que conduce a una movilidad restringida. En la Fig. 3 se muestra una
clasificación de los métodos de inmovilización según diferentes principios químicos y físicos.
Las enzimas son proteínas que han sido optimizadas por la evolución para reacciones
metabólicas más o menos específicas en las células vivas. Las condiciones de reacción allí
suelen ser muy distintas a las de los biorreactores industriales. Mediante la inmovilización
se pueden inducir nuevas características para hacer que las enzimas sean tolerantes
incluso a entornos de reacción hostiles. Se han revisado algunos intentos de modificar
intencionalmente el comportamiento catalítico [15]. El procedimiento de inmovilización debe
realizarse de manera que permita a la enzima mantener su conformación activa y la
flexibilidad catalítica necesaria. Además, los residuos catalíticamente esenciales de la
enzima deben permanecer intactos y conservados.
Aunque el desarrollo de un procedimiento de inmovilización adecuado a menudo sigue
pautas empíricas, el conocimiento de las características estructurales de la enzima es útil
para lograr un biocatalizador de alto rendimiento.
Básicamente, existen cuatro formas de inmovilizar enzimas en superficies:
1. Antes de la unión se realiza una reacción adecuada para activar la enzima para el
proceso de inmovilización. Este enfoque a menudo sufre una pérdida significativa de
actividad, porque la proteína es modificada por compuestos químicos altamente
reactivos que a menudo no son estrictamente específicos de un grupo y pueden alterarse catalític
Fig. 3. Clasificación de métodos de inmovilización.
residuos estructuralmente esenciales. También entrecruzamiento intra e intermolecular.

tiene que ser considerado.
2. Se modifica y activa el soporte. La enzima nativa se une en un paso posterior en condiciones bien
definidas utilizando la reactividad natural de la
molécula. Esta es la técnica más destacada para unir enzimas de forma covalente.
a las superficies de soporte.
3. Se utiliza un agente de acoplamiento bi o multifuncional para mediar entre el portador

y grupos funcionales enzimáticos. Esto también puede conducir a reticulación de enzimas intra e
intermoleculares.
4. La enzima se modifica mediante técnicas de ADN recombinante para generar una proteína con grupos
"(bio)específicos", de modo que pueda adsorberse en portadores especiales.
utilizando unión de (bio)afinidad.
3.1
Grupos funcionales enzimáticos
3.1.1
Grupos funcionales nativos
Las enzimas están compuestas de cadenas de aminoácidos unidas mediante enlaces peptídicos y pueden
considerarse como macromoléculas polifuncionales y (multi)cargadas con una
estructura tridimensional definida, más o menos rígida. Una molécula enzimática típica con un peso
molecular de 30.000 Da se asemeja a una esfera esférica compacta.
partícula de aprox. 4 nm de diámetro. Muchas enzimas, especialmente aquellas que son
regulados por varios efectores, constan de más de una cadena de aminoácidos (sub
unidad), que están asociados covalentemente (a través de enlaces disulfuro) o no covalentemente. En

Además, las cadenas de aminoácidos de las enzimas pueden modificarse postraduccionalmente.
in vivo por la maquinaria celular. Sólo los residuos de carbohidratos unidos a
Aquí se considerarán la serina/treonina o la asparagina, porque pueden ser un
objetivo de reacciones de inmovilización.
3.1.1.1
Cadenas laterales de aminoácidos
La reactividad química de estas moléculas complejas depende de la reactividad de

las cadenas laterales de los aminoácidos en su microambiente especial. Estudios sobre
La modificación química ha revelado que sólo unas pocas cadenas laterales de aminoácidos son
realmente reactivo [21]. De los 20 aminoácidos proteinógenos, las cadenas laterales alquílicas de
los residuos hidrófobos son químicamente inertes para todos los fines. el alifático
Los grupos hidroxilo de la serina y la treonina pueden considerarse derivados del agua.
y, por tanto, tienen una baja reactividad en competencia con una alta concentración de
moléculas de agua (55 M). Por tanto, sólo nueve cadenas laterales son químicamente activas (ver
Tabla 2). Estos son el grupo guanidinilo de la arginina, el grupo carboxilo y b
gramo
grupos de ácido glutámico y aspártico, respectivamente, el grupo sulfhidrilo de

mi lisina, el
cisteína, el grupo imidazolilo de la histidina, el grupo amino de la
resto tioéter de la metionina, el grupo indolilo del triptófano y el
grupo hidroxilo fenólico de tirosina.
La mayoría de las reacciones de modificación enzimática y, por tanto, de las reacciones de
acoplamiento, son reacciones nucleófilas, en particular reacciones de sustitución nucleófila
bimoleculares que siguen un mecanismo de tipo SN2. Por lo tanto, la sustancia química
La reactividad es básicamente una función de la nucleofilicidad de la cadena lateral del aminoácido.
Siguiendo el orden nucleofílico general de Edwards y Pearson [22], el
El grupo sulfhidrilo de la cisteína es el nucleófilo más potente de la proteína, especialmente en su
forma tiolato.
El nitrógeno en el grupo amino es un nucleófilo considerablemente más débil pero
debido a su abundancia y omnipresencia en enzimas es el más importante
objetivo. Esto es particularmente cierto ya que la mayoría de los productos de reacción del ataque
nucleofílico de tiol son más o menos inestables.
La reactividad de los residuos funcionales está fuertemente influenciada por el pH. Generalmente
las velocidades de reacción son mayores a un pH más alcalino. Bajar el pH por debajo del
El pKa de los grupos amino accesibles disminuirá la velocidad de reacción a medida que se protonen.
Los grupos amino pueden considerarse no reactivos. Como el pKa es función de la temperatura, la
fuerza iónica y el microambiente, los valores dados en la Tabla 2 son
aproximaciones. La proporción de especies protonadas y desprotonadas a un determinado pH.
puede estimarse mediante la ecuación de HendersonHasselbalch:
pH=pKa+ log([A]/[AH]) (1)
La accesibilidad de los grupos funcionales para una reacción de inmovilización está influenciada aún
más por los efectos microambientales. Obstáculo estérico por parte del vecino.
Los grupos, la interacción con grupos vecinos y moléculas de disolvente, o las alteraciones de los
valores de pKa de grupos disociables pueden provocar un desplazamiento de la reactividad.
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3.1.1.2
Carbohidratos ligados a enzimas
Los carbohidratos están unidos a muchas enzimas secretadas de organismos superiores. Dos
Existen formas básicas de utilizar carbohidratos con fines de inmovilización.
En primer lugar, se pueden utilizar lesiones inmovilizadas. Las lectinas son proteínas que muestran
alta selectividad de unión para estructuras de carbohidratos definidas y residuos de azúcar
[23, 24]. La interacción con la enzima glicosilada no es covalente y
La fuerza de unión depende de las constantes de asociación específicas. Este enfoque
es costoso porque permite la producción de otra proteína inmovilizada.
En segundo lugar, se puede realizar una modificación química selectiva porque los residuos de
carbohidratos tienen una reactividad claramente baja. Esto se puede hacer periodate
oxidación que escinde los enlaces CC que contienen grupos hidroxilo adyacentes y los convierte en
aldehídos [25,26]. El dialdehído generado puede reaccionar con un
Variedad de nucleófilos, generalmente grupos amino primarios en la superficie del portador.
materiales. Las bases de Schiff resultantes se pueden estabilizar aún más mediante reducción de
borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio o piridinaborano [27].
3.1.2
Grupos funcionales sintéticos
Se pueden introducir grupos reactivos adicionales en las moléculas de enzimas mediante

modificación química. De particular interés es la conversión de carboxílicos.
ácidos a aminas porque convierte el residuo original en un residuo más potente.
nucleófilo y cambia la carga superficial. Esto se puede hacer mediante la química de carbodiimidas
solubles [28]. Activación del ácido carboxílico de enzimas mediante la condensación de reactivos y
posterior reacción con nucleófilos en la superficie de
el material portador conduce a menudo a una pérdida significativa de actividad enzimática. El
La cantidad de reactivo de condensación, generalmente carbodiimidas solubles en agua [por ejemplo,
1etil3(3dimetilaminopropil)carbodiimida, EDC], debe equilibrarse cuidadosamente para
aquellos grupos carboxilo que no son necesarios para la integridad catalítica del
enzima. Sin embargo, condiciones leves para la inmovilización de enzimas en aminoácidos especiales
Recientemente se ha descubierto la agarosa funcionalizada [29].
La carga superficial de la molécula también se puede alterar, por ejemplo, transformando tioles o
aminas en ácidos carboxílicos. Por lo tanto, interacciones más fuertes
con matrices de intercambio aniónico. Los tioles pueden modificarse mediante haloacetatos [30]. Los
a grupos amino generalmente se modifican usando ácido dicarboxílico.
anhídridos (por ejemplo, anhídrido succínico). Reacción con tirosina, histidina, cisteína,
Las cadenas laterales de serina y treonina producen productos inestables, especialmente en
pH alcalino [31], por lo que la reacción es bastante específica para los grupos amino primarios. en un
De manera similar, la amiloglucosidasa ha sido modificada por un compuesto etileno/maleico.
copolímero de anhídrido dando como resultado un conjugado polianiónico que estaba unido a
portadores policatiónicos. La enzima fijada en el portador se usó repetidamente en almidón.
hidrólisis. Sin embargo, la estabilidad operativa no fue muy alta, permitiendo 10 ciclos
para la mejor preparación (30% de concentración de sustrato, 50°C, 0,5 g L–1 activo
enzima) [32].
La tecnología del ADN recombinante ofrece nuevas formas de diseñar enzimas inmovilizadas
mediante la construcción de proteínas de fusión con etiquetas de unión específicas. Sin embargo, debe mantenerse en
Tenga en cuenta que la expresión y estructura de una enzima alterada también pueden verse influenciadas.
de forma negativa. Además, las interacciones enzimáticas modificadas con la matriz no son covalentes. Aquí sólo se
deben mencionar algunos ejemplos de etiquetas vinculantes o de afinidad, como
como dominios de unión de IgG [33], etiquetas de histidina [34], etiquetas de arginina [35], unión de celulosa
dominios [36], estreptavidina [37], dominio de unión de estreptavidina. Estas etiquetas tienen
se fusionaron con enzimas que luego se unieron a soportes especiales.
Manipulaciones relativas al entrecruzamiento de enzimas para producir macromoleculares.
Los agregados también deben mencionarse aquí. Se ha desarrollado una gran variedad de agentes
reticulantes homo o heterofuncionales [38], algunos de los cuales son
específico del grupo. En biotecnología, la mayoría de las veces son bisepóxidos, bis o trisfuncionales.
Se utilizan aziridinas o dialdehídos (p. ej. glutardialdehído). Reticulación directa
de enzimas produce biocatalizadores con características pobres en cuanto a rigidez mecánica,
compresibilidad y comportamiento hidrodinámico. Las mejoras son
logrado mediante coreticulación con otros materiales inertes como poliminas [18] o mediante
combinación con otros métodos (reticulación sobre soportes sólidos o en geles preformados, ver
más abajo, [39]). Reticulación de cristales de enzimas o amorfos.
Los precipitados enzimáticos ya se han mencionado [109].
Una estrategia diferente para preparar enzimas para la inmovilización es introducir
grupos vinilo alquilando o acilando enzimas con monómeros vinílicos activados
[40]. Las enzimas modificadas luego se polimerizan con mono y bifuncionales.
derivados de acrilamida para producir partículas elásticas de forma irregular después de la trituración
de los bloques poliméricos formados. Estos procesos de copolimerización han producido
Biocatalizadores industriales estables para aplicaciones farmacéuticas que son especialmente
adecuados para aplicaciones de tanques agitados [41].
Recientemente, se ha publicado una forma eficaz de encapsular lipasas en materiales
hidrofóbicos solgel [42]. Al introducir metiltrimetoxisilano/polidimetilsilano en mezclas de agua/lipasa/
alcohol polivinílico, se produce la formación de gel.
catalizado por fluoruro de sodio. Los geles se secaron y se lavaron con disolventes orgánicos. Para
la lipasa de Pseudomonas la actividad de esterificación en disolventes orgánicos fue
dependiendo del contenido de metiltrimetoxisilano con rendimientos de actividad de hasta el 93%.
La modificación de las propiedades de la superficie mediante la introducción de residuos
hidrófobos adicionales a través de anhídridos de ácidos carboxílicos mixtos de ácidos grasos y
derivados oxa [43] o moléculas anfipáticas como el polietilenglicol [44] se ha utilizado generalmente
para efectuar la estabilidad o las velocidades de reacción. de enzimas en medios orgánicos no
polares. En algunos casos, la enzima se volvió insoluble en sistemas acuosos [43]
o soluble y activo en disolventes orgánicos [45, 46].
3.2
Materiales portadores y grupos funcionales.
Las características del transportista tienen una fuerte influencia en el rendimiento de

una enzima inmovilizada. Las siguientes propiedades deben estar bien seleccionadas y
equilibrado para una biotransformación específica:
∑ Grupos funcionales: El tipo de activación, presencia, distribución y densidad.

de grupos funcionales determina el rendimiento de actividad de una inmovilización
reacción, y estabilidad y estabilidad operativa de la enzima fijada en el portador.

Como se muestra arriba, la mayoría de los procedimientos de inmovilización se realizan
mediante un ataque nucleofílico de grupos amino sobre grupos funcionales portadores
activados. Esta es en muchos casos la forma adecuada de acoplar una enzima a una
superficie portadora, ya que evita que la enzima entre en contacto con compuestos orgánicos
altamente reactivos y de bajo peso molecular. El tipo de activación determina las condiciones
de acoplamiento, que por supuesto deberían ser lo más suaves posible en la mayoría de los
casos. Las excepciones son, por ejemplo, la inmovilización de enzimas a partir de mezclas
crudas o semipurificadas, cuando las condiciones de acoplamiento inactivan o reducen
reacciones secundarias enzimáticas indeseables. La estabilidad y la estabilidad operativa
pueden explicarse por la desestabilización termodinámica del estado desnaturalizado como
resultado de una disminución del espacio conformacional disponible para la forma
desnaturalizada a través de la unión multipunto. Además, la inmovilización a veces aumenta
la estabilidad operativa mediante la prevención de la agregación y/o la proteólisis.
∑ Permeabilidad y área de superficie: en la mayoría de los casos es deseable una gran

superficie (>100 m2 g –1) y una alta porosidad, de modo que la enzima y el sustrato puedan
penetrar fácilmente. Un tamaño de poro >30 nm parece hacer que la superficie interna sea
accesible para la inmovilización de la
mayoría de las enzimas. ∑ Hidrofilicidad/hidrofobicidad de la matriz portadora, que influye en el
tipo y la fuerza de la interacción proteínamatriz no covalente. Además, puede influir en la
adsorción, distribución y disponibilidad del sustrato y producto.
∑ Insolubilidad: Esto es esencial, no sólo para prevenir la pérdida de enzima, sino también para
prevenir la contaminación del producto por la matriz y la enzima disueltas. ∑ Estabilidad/
rigidez mecánica: Estas propiedades dependen del tipo de reactor. Si se utiliza en un reactor de
tanque agitado, el soporte debe ser estable contra fuerzas transversales para minimizar la
abrasión. La producción de finos (partículas de menos de 100 a 50 mm) puede provocar la
obstrucción de las placas de tamiz y los filtros.
∑ Forma y tamaño del soporte: El tamaño de las partículas influirá en los tiempos de filtración
de los reactores de tanque agitado en modo discontinuo repetido. Además, este factor es
importante para el rendimiento en reactores de columna en cuanto a contrapresión y
caudales, que por supuesto están correlacionados. Para ello se prefiere un tamaño de
partículas esféricas en el intervalo de 150 a 300 mm. ∑ Resistencia al
ataque microbiano: Durante el uso a largo plazo, el soporte debe ser estable frente a la
degradación microbiana. ∑ Regenerabilidad:
Esta propiedad es de interés en caso de materiales de soporte costosos.
riales.
Se encuentra disponible una clasificación detallada de los materiales de soporte [47].

Básicamente, los materiales portadores se pueden dividir en de origen inorgánico y orgánico.
3.2.1
Portadores inorgánicos
Los soportes inorgánicos (p. ej. vidrio, gel de sílice, alúmina, bentonita, hidroxiapatita, níquel/
óxido de níquel, titania, circonia) suelen mostrar buenas propiedades mecánicas.
estabilidad térmica y resistencia contra ataques microbianos y solventes orgánicos.

Por el contrario, los materiales no porosos como el metal y los óxidos metálicos sólo tienen pequeñas
superficies de unión. Los minerales suelen mostrar una amplia distribución del tamaño de los poros.
Los geles de sílice están disponibles con los nombres comerciales Promaxon (Promat),
Spherosil (RhonePoulenc) o Aerosil (Degussa). Los compuestos de sílice se pueden
preparar con tamaños de poro y superficies de unión definidos (vidrio de poro controlado,
CPG), pero adolecen de costes de producción elevados y muestran una estabilidad
limitada en condiciones alcalinas. Además, los portadores de sílice son químicamente
inertes y necesitan activación y modificación. Por lo general, se tratan con
aminoalquiltrietoxisilanos para introducir grupos amino, que posteriormente pueden
activarse para reacciones de acoplamiento enzimático mediante una variedad de métodos
diferentes, como se describe en [48]. El procedimiento más común es la reacción con
dialdehídos para transformar grupos amino en residuos de aldehído insaturados reactivos que se d
De esta manera, la penicilina G amidasa se acopló primero al dextrano (ver más abajo)
y la enzima modificada mostró una termoestabilidad significativamente mayor, y luego
esta preparación se inmovilizó en geles de sílice activados por amino [49].
Los organopolisiloxanos constituyen materiales sintéticos inorgánicos macroporosos
que llevan grupos funcionales orgánicos y están disponibles comercialmente (Deloxan‚,
Degussa AG). Combinan la resistencia química de la matriz y una alta capacidad de carga.
Los portadores aminofuncionales son más interesantes porque permiten el acoplamiento
covalente mediante la química del glutardialdehído. Se ha cuestionado la reacción directa
de los grupos aldehído con los grupos amino primarios del vehículo y de la enzima. Las
bases de Schiff simples no son tan estables y la reactividad de las proteínas con
glutaraldehído recién destilado es notablemente baja [50]. Por lo tanto, se sugirió que la
reacción implica la adición de grupos amino a dobles enlaces etilénicos de oligómeros
a ,b
insaturados presentes en una solución acuosa comercial de glutardialdehído. Además, la
estabilidad operativa y de almacenamiento de las enzimas inmovilizadas no aumentó con
el tratamiento con borohidruro (observación propia no publicada). Se han desarrollado
biocatalizadores industriales a partir de organopolisiloxano aminofuncionalizado. La
glutaril7ACAacilasa inmovilizada se utiliza para dividir el ácido glutaril7
aminocefalosporánico en ácido 7aminocefalosporánico, un intermediario clave para los
antibióticos semisintéticos de cefalosporina [51]. Se descubrió que los tiempos de
inmovilización dependían de parámetros como la concentración de proteínas, el pH y la
fuerza iónica. Por ejemplo, el aumento de la fuerza iónica condujo a tiempos de reacción
notablemente reducidos (resultados propios de laboratorio).
3.2.2
Portadores orgánicos
3.2.2.1
Portadores orgánicos naturales
Los polímeros orgánicos naturales, como las proteínas estructurales (ceratina, colágeno),
las proteínas globulares (albúmina) o los carbohidratos, son materias primas económicas
para la producción de materiales de soporte y están disponibles en grandes cantidades.
De este grupo, los carbohidratos son de especial interés, porque no sufren de
aspectos de seguridad biológica como matrices proteicas aisladas de fuentes animales y

porque son altamente hidrófilos, lo que proporciona un microambiente deseable
para muchas enzimas. Alginato [52], carragenina [53], quitina o quitosano (preparados
de quitina por desacetilación) son particularmente útiles para encapsular microorganismos mediante
gelificación ionotrópica, respectivamente ácida [52,54]. Las enzimas han sido
vinculados a carbohidratos simplemente por adsorción seguida de reticulación [39].
El quitosano es importante debido a sus grupos amino primarios que son
susceptibles a reacciones de acoplamiento. Además, el quitosano esférico poroso
Hay partículas disponibles comercialmente (Chitopearl, Fuji Spinning) que permiten la unión
covalente o no covalente de enzimas [55]. Esta matriz de soporte puede ser
Se preparan fácilmente [56] y se han resumido los métodos de activación [57].
El tratamiento con polietilenimina o con hexametilendiamina y glutardialdehído puede mejorar las
características mecánicas [53,58] del biocatalizador, que de lo contrario es deficiente. Sin embargo,
esto suele ir acompañado de cierta pérdida de actividad o aumento de las limitaciones de difusión.
El dextrano y la agarosa deben reticularse, por ejemplo, con epiclorhidrina para mejorar sus
características mecánicas y su compresibilidad. covalente
inmovilización en formas de cuentas disponibles comercialmente (Sephadex, Sepharose)
se resume en [59]. El método de activación más extendido es el cianógeno.
método del bromuro [60], produciendo funciones isourea e imidocarbonato que
reaccionan con grupos amino de enzimas para formar carbamatos Nsustituidos. El bromuro de
cianógeno fue sustituido más recientemente por tetrafluoroborato de 1ciano4dimetilaminopiridinio
(CDAP) [61]. Sin embargo, hay que tener en cuenta que
este enlace es inestable a pH <5 y >10. Una forma diferente de activar los carbohidratos para el
acoplamiento covalente es la escisión del peryodato que genera aldehído.
funciones. Reacción de los restos aldehído con grupos amina de enzimas para
Las bases de Schiff son rápidas. Se logra un enlace estable mediante la reducción con borohidruros.
(ver Sección 3.1.1.2). En una modificación de este método, primero se transformó Sepharose en
glioxilSepharose mediante eterificación con 2,3 epoxipropanol, luego
oxidado aún más por periodato para producir un gel de agarosaaldehído, que permite una rápida
reacciones de acoplamiento con grupos amino [62].
Matrices preactivadas disponibles comercialmente [éster de Nhidroxisuccinimida o
La hidrazida, AffiGel (BioRad) o una variedad de diferentes derivados de Sefarosa activados
(Amersham Pharmacia Biotech) I se han desarrollado principalmente para cromatografía de afinidad
y generalmente son demasiado caros para su uso como matriz de biocatalizador.
La celulosa también es un soporte aceptable y puede activarse de manera similar. La capacidad
de unión de las enzimas es generalmente menor en comparación con la agarosa.
pero es económico y está disponible comercialmente en formas fibrosas y granulares.
Algunas desventajas son el bajo tamaño de las partículas, lo que perjudica su uso en aplicaciones
rápidas de alta presión, y su susceptibilidad a las celulasas microbianas. Se han revisado algunos
aspectos de inmovilización y de ingeniería [63].
3.2.2.2
Portadores orgánicos sintéticos
Los polímeros orgánicos sintéticos muestran la mayor variabilidad en cuanto a características

físicas y químicas. En principio, se pueden adaptar a las necesidades.
requisitos de casi cualquier proceso enzimático. Además, son inertes al ataque microbiano. Están
disponibles comercialmente como resinas puramente adsorbentes, como resinas iónicas.
intercambiadores con una variedad de diferentes grupos básicos y ácidos, o como soportes
preactivados que llevan, por ejemplo, grupos epóxido (Eupergit®, Roehm Pharma) o azlactona
(Emphaze™, 3M). Los principales polímeros sintéticos son poliestireno, poliacrilato, polivinilos,
poliamida, polipropileno y copolímeros.
a base de anhídrido maleico y estructuras de etileno o estireno, polialdehído y polipéptidos.
El poliestireno fue el primer polímero sintético utilizado para la inmovilización de enzimas.

La unión se produjo principalmente por fuerzas de adsorción. Generalmente, la unión de la enzima es
favorecido en condiciones bajas en sal. Sin embargo, la hidrofobicidad de la matriz a menudo
conduce a la desnaturalización parcial de la enzima durante el proceso de unión y, por lo tanto,
a bajos rendimientos de la actividad. Al combinar adsorción y reticulación, la penicilina G
La amidasa se acopló covalentemente a un éster poliacrílico bastante hidrófilo (XAD7),
que había sido recubierto previamente con glutardialdehído a pH alcalino [64]. Lo mismo
La enzima se adsorbió en polimetacrilato macroporoso, que se optimizó.
con respecto a la composición monómerocomonómero, y reticulado mediante tratamiento con
glutardialdehído [65]. Sin embargo, el biocatalizador obtenido en este último
El estudio tenía una estabilidad operativa limitada y no podía satisfacer las demandas de
un proceso industrial.
En un enfoque diferente, la penicilina G amidasa se acopló al nailon 6, que
fue parcialmente hidrolizado y activado por conversión del amino liberado
grupos con Nhidroxisuccinimida y diciclohexilcarbodiimida [66]. Los rendimientos de inmovilización
fueron bastante altos y los datos preliminares mostraron una buena estabilidad operativa en un
reactor de columna.
Unión iónica en matrices de intercambio iónico de monómeros mixtos [por ejemplo, débilmente
resina básica de estirenodivinilbenceno (Duolite A 568)] a menudo conduce a mayores
Rendimientos de inmovilización en comparación con la adsorción en un adsorbedor hidrófobo.
resinas. De hecho, la inmovilización puede mejorarse mediante las reacciones de reticulación
mencionadas anteriormente. Esto es de particular importancia si el biocatalizador se utiliza en
sistemas acuosos con un alto contenido de sal o en el caso de procesos que liberan compuestos
cargados, aumentando así la fuerza iónica (p. ej. hidrólisis).
de ésteres o amidas). Sin embargo, la mayoría de las inmovilizaciones no covalentes en (orgánico)
Los soportes son de interés para aplicaciones no acuosas. Lipasas y, en menor medida
En gran medida, las proteasas son las enzimas utilizadas principalmente en disolventes orgánicos.
Sus tecnologías de inmovilización y aplicación han sido revisadas recientemente [16, 67, 68].
La matriz hidrófoba de polipropileno (Accurel EP 100, Akzo Nobel) es una de
los soportes más utilizados para lipasas [69,70]. La inmovilización es muy fácil y
directo. La proteína enzimática se une a partir de soluciones acuosas en las que
el apoyo ha sido suspendido. La lipasa fijada en el soporte se filtra, se lava
y secado. Sin embargo, hay muchos parámetros que influyen en el rendimiento de los disolventes
orgánicos, por ejemplo, el contenido de agua de la enzima fijada en el portador o los aditivos
añadidos antes del secado del biocatalizador [71,72].
La producción de bioésteres, triacilglicéridos estructurados, compuestos ópticamente activos o
ésteres orgánicos sensibles depende de la especificidad de la lipasa y
el rendimiento especial del biocatalizador [73]. En [74, 75] se puede encontrar una comparación de
lipasas inmovilizadas sobre diferentes soportes.
La activación de polímeros sintéticos se puede lograr mediante diversos métodos.

Básicamente, los grupos reactivos se pueden introducir durante la polimerización mediante selección.
de monómeros adecuados o pueden generarse mediante modificación del polímero.
columna vertebral.
Portadores orgánicos activados con epoxi: la enzima "lista para usar" más utilizada
soporte: se puede preparar mediante copolimerización de metacrilato de glicidilo con
metacrilato de etilendimetacrilato [76] o metacrilamida con N,N¢metilenbisacrilamida y éter alilglicidílico
(Eupergit) [77]. Un método diferente de síntesis
utiliza acetato de vinilo y diviniletileno urea para construir la columna vertebral del polímero.
que luego se modifica en superficie con grupos oxirano después de la hidrólisis del
grupos acetato (VAEpoxy BIOSYNTH® y la densidad , Riedelde Haen). Tamaño de partícula, porosidad,
de los grupos epoxi se puede ajustar mediante monómero apropiado
Mezclas y condiciones de polimerización. Generalmente, los polimetacrilatos son
caracterizado por una alta resistencia mecánica y estabilidad química.
Se pueden utilizar directamente para el acoplamiento de enzimas principalmente a través de proteínas amino.
grupos en solución acuosa tamponada, o los grupos epoxi pueden modificarse mediante un
variedad de reactivos diferentes, por ejemplo, introduciendo espaciadores con hidrófilos
o grupos hidrófobos. Mediante este método se consigue una distancia adecuada entre la enzima y el portador.
La columna vertebral se puede ajustar para permitir una flexibilidad enzimática óptima. Además,
el microambiente de una enzima unida puede verse influenciado selectivamente. Exceso
de grupos epóxido se pueden bloquear después del acoplamiento enzimático con compuestos de bajo peso molecular.
compuestos amino en peso (p. ej., glicina, etanolamina) como otra forma de
Modificar el biocatalizador. Una vez más, se ha trabajado mucho en esta dirección con
penicilina G amidasa [7880]. Esta enzima es de especial interés ya que la producción mundial de ácido 6
aminopenicilánico (6APA) se realiza mediante el proceso de un solo paso.
hidrólisis de la penicilina G (penicilina G amidasa) o penicilina V (penicilina V
amidasa). Nuestros propios experimentos han demostrado que la estabilidad operativa está influenciada por
la densidad de los grupos oxirano y la cadena principal del portador.
La inactivación en condiciones de producción más estrictas (37°C) reveló una
biocatalizador significativamente más estable cuando la inmovilización se realizó en un
portador de oxirano de alta densidad, aunque cierta influencia de los diferentes portadores
No se pudo descartar completamente la columna vertebral (ver Fig. 4). Una posible explicación es una
estabilización conformacional mejorada mediante un mayor grado de unión multipunto.
En comparación con el acoplamiento mediado por glutardialdehído, las reacciones con oxirano
Los grupos son más lentos. Sin embargo, también en este caso los tiempos de acoplamiento pueden tener un efecto considerable.
influencia sobre la estabilidad. Esto se ilustra en la Fig. 5, que muestra la estabilidad en almacenamiento de
la penicilina G amidasa inmovilizada sobre un soporte de polimetacrilato en relación con el tiempo de
acoplamiento.
Se obtuvieron resultados similares para la inmovilización de glutaril7ACAacilasa (experimentos de
laboratorio propios). La Figura 6 demuestra la disminución de la actividad en el sobrenadante de la mezcla
de reacción de acoplamiento y el concomitante.
aumento de la actividad vinculada a los transportistas. La actividad máxima se midió después de sólo
6 h, dejando aproximadamente el 20% de la actividad inicial en solución. Durante las siguientes 14 h el
La enzima soluble restante fue inmovilizada. Sin embargo, un aumento de la actividad
no se pudo medir en condiciones estándar debido a la limitación de difusión
y cambios internos de pH en las partículas del biocatalizador. Según estos datos,
120
100
80
60
cina[i
.laoic]t%
40
20
0
0 20 40 60 80 100
ciclo nro.
Fig. 4. Estabilidad operativa de la penicilina G amidasa inmovilizada sobre un soporte epoxi. Ciclos por lotes
se ejecutaron en un reactor de laboratorio de 1,5 l con penicilina G al 10%, 6 kU L–1, 36 °C. El pH se mantuvo
a 8,0 mediante la adición de NH3 2 N. El tiempo de división inicial fue de 65 min. La actividad inicial (relativa
consumo base por minuto al comienzo de cada conversión de lote) se representa frente al número de ciclo.
Se inmovilizó PGA sobre polimetacrilato con una densidad de epoxi.
>2000 mmol g–1 (cuadrados) o de 600 mmol g–1 (triángulos)
Fig. 5. Estabilidad de almacenamiento de la penicilina G amidasa inmovilizada sobre polimetacrilato

activado con epoxi en relación con el tiempo de inmovilización. Se permitió que la reacción de inmovilización
procedió durante 17, 41 y 65 h, respectivamente, y se terminó mediante la adición de etanolamina,
Los catalizadores se lavaron y la actividad (fosfato potásico 5 mM, pH 8, 28°C, penicilina G al 10%, pHstat
8,0) se determinó inmediatamente (t=0), y después del almacenamiento en un recipiente sellado a 25°C
durante 21 y 120d
Fig. 6. Cinética de inmovilización de glutaril7ACAacilasa sobre polimetacrilato activado con epoxi. La

Gl7ACAacilasa se incubó con el portador activado con epoxi. En definitiva
veces se tomaron alícuotas de la suspensión de reacción. Enzima fijada sobre sobrenadante y portador.
fueron separados por centrifugación. La enzima fijada en el portador se lavó con agua para eliminar
enzima unida no covalentemente. Las actividades de la enzima inmovilizada y el sobrenadante.
(tampón de fosfato de potasio 5 mM, pH 8, 37 °C, ácido glutaril7aminocefalosporánico al 2 %, pHstat
8,0). Simultáneamente, se hirvió una alícuota de enzima fijada en el portador en
tampón dodecilsulfato de sodio (SDS)/glicina y el sobrenadante se sometió a electroforesis con SDS
poliacrilamida (ver inserto: de izquierda a derecha: carril 1 Enzima fijada con portador, 2 h;
carril 2 Enzima fijada por portador, 4 h; carril 3 Enzima fijada por portador, 6 h; carril 4 Enzima fijada por
portador, 21 h; carril 5 Enzima fijada por portador, 69 h; carril 6 Enzima dializada; carril 7 sobrenadante,
2 horas; carril 8 Sobrenadante, 21 h; carril 9 Sobrenadante, 69 h; carril 10 Calibración de peso molecular
marcadores)
La inmovilización se completa en 20 h, pero el biocatalizador resultante sólo tiene

mala estabilidad. Análisis de la enzima fijada en el portador mediante dodecilsulfato de sodio.
La electroforesis de poliacrilamida (SDSPAGE) apoya la hipótesis de más
unión multipunto después de adsorción simple y enlace monovalente (ver Fig. 6). Gl7
ACA de Acinetobacter sp. Es una proteína dimérica que consiste en
a 16 kDa y una subunidad deb54 kDa, que no están unidas
una subunidad de aproximadamente
covalentemente. Después de un tiempo de fijación de 2 h, la actividad alcanza aproximadamente el
80% de su valor máximo, pero prácticamente toda la proteína puede eliminarse mediante tratamiento.
con SDS (compare el carril 1 con el carril 7). Durante las próximas horas las bandas de proteínas
de la subunidad
a y la subunidad
b disminuyen lentamente, a pesar de que se carga
proteína adicional en el transportador.
4
Efectos de transferencia de masa
La inmovilización de enzimas significa una restricción deliberada de la movilidad de las enzimas.

enzima, que también puede afectar la movilidad de los solutos. Los diversos fenómenos,
conocidos como efectos de transferencia de masa, pueden conducir a una velocidad de reacción reducida, en otros
es decir, a una eficiencia reducida en comparación con la enzima soluble.
Una velocidad de reacción reducida puede resultar de restricciones de difusión externas en
la superficie de los materiales de soporte. En tanques agitados la difusión externa juega un papel menor.
función siempre que el líquido de reacción se agite lo suficiente. Además, los efectos de partición
puede conducir a diferentes solubilidades dentro y fuera de los soportes. La partición tiene que
Se debe tener en cuenta cuando las fuerzas iónicas o de adsorción de solutos de baja
concentración interactúan con los materiales portadores [8183]. Los efectos más cruciales se observan
en partículas porosas debido a la difusión interna o porosa como se describe a continuación.
4.1
Difusión porosa
En la literatura se da considerable importancia a la descripción teórica y

Aspectos prácticos de los efectos de transferencia de masa sobre enzimas inmovilizadas.
Todas las reacciones de enzimas inmovilizadas deben obedecer las leyes fisicoquímicas de
transferencia de masa y su interacción con la catálisis enzimática. La pregunta es, por tanto,
¿cuáles son las razones de las restricciones causadas por la transferencia masiva y cómo pueden
¿Deben evitarse si es necesario?
La descripción matemática de las limitaciones difusionales de la cinética enzimática.
en la acción combinada con transferencia masiva está bien establecida desde hace años.
La presentación de estas interacciones es muy compleja, en particular cuando los términos
para la inhibición del producto, se incorporan la generación de protones o la desactivación de
enzimas, además de una cinética de MichaelisMenten comparativamente simple.
Para la cinética enzimática basada en MichaelisMenten, el grado de transferencia de masa
El control generalmente se expresa mediante el coeficiente de eficiencia o factor de efectividad,
colina
h expresado como:
n¢ (tasa de conversión del sustrato de la enzima inmovilizada)

h =999999999331 (2)
(tasa de conversión de sustrato de enzima libre)
norte
h
Los valores calculados numéricamente están disponibles cuando solo la difusión del sustrato en
Se considera la cinética de tipo MichaelisMenten. Se pueden presentar en forma gráfica,
expresándose en función F R de sustrato
h del módulo de Thiele y de una concentración
adimensional o ocasionalmente en su forma recíproca como
Constante de Michaelis adimensional según
b Lee y Tsao [84] (revisado en
[82,83]; consulte la Tabla 3 para obtener una explicación de los símbolos), por lo tanto:
h =f( F R, b) (3)
97633311
Vm
F (4)
R=R¥d 97627
Definitivamente ¥KM
S
b =5
(5)
km
Tabla 3. Factores de efectividad h para penicilina G amidasesa inmovilizada
S (mM) FR h
PGA en Eupergit®C 268 68 1.0

10 68 0,995
0.013 68 0.023
PGA en Eupergit®250L 268 69 1.0

10 69 0,995
0.013 69 0.023
Se inmovilizó una penicilina G amidasa sobre soportes prefabricados o se insolubilizó como cristales
entrecruzados. El valor relacionado con Eupergit para R (radio medio de partícula del portador hinchado) fue
80 milímetros [87]. Vm (asumiendo actividad intrínseca máxima por volumen de catalizador accesible, basado en
en moléculas de enzimas activas; 1 unidad = 1 mmol min–1 a 28°C) fue de 90 y 170 U cm–3 para
Eupergit C y 250 L, respectivamente [87]. Deff (coeficiente de difusión efectiva) se tomó de
literatura [87] o calculado como se muestra en el texto. KM (constante intrínseca de Michaelis) se tomó
uniformemente como 13 mM [87] y S = 268 mM corresponde a la concentración de sustrato en
h
superficie del catalizador de una solución al 10% de sal de penicilina G. Se calculó según Atkinson
et al. para partículas esféricas [85]. Para simplificar, los índices relacionados con la superficie y los poros tienen
sido omitido.
Por otro lado, también se pueden utilizar cálculos aproximados

h de [85]. En esto
De esta manera, no se requieren soluciones engorrosas de las ecuaciones diferenciales si se
simplemente desea obtener una idea general de las restricciones de difusión relacionadas con el
sustrato. Kasche [86] ofrece una visión profunda de los factores de eficacia, donde
Se demuestra una buena correlación entre los datos calculados y experimentales.
Para demostrar las limitaciones de la difusión porosa, los datos disponibles para la penicilina
Se recogieron G amidasa en diversos materiales portadores para calcular y comparar
coeficientes de eficiencia mediante inserción en las ecuaciones. (3–5) (Tabla 3).
Los datos relacionados con el tamaño de las partículas y la capacidad de unión son de gran importancia.
La capacidad de unión de los transportadores enzimáticos a las proteínas es del 0,1 al 10 % del
peso del transportador. Los soportes prefabricados tienen un diámetro de 100 a 1000 mm.
Los portadores esféricos como las partículas de Eupergit C tienen un diámetro promedio de
160 milímetros [87].
Los coeficientes de difusión efectivos en los soportes dependen de los diámetros de sus poros
(por ejemplo, 25 y 250 nm en Eupergit® C y Eupergit® 250 L, respectivamente).
Se encontró que el coeficiente de difusión de la penicilina G en solución libre (D0) era
4,0¥10–6 cm2 s–1. El coeficiente de difusión efectiva (Deff) en Eupergit® fue 30 y 67% de este
valor cuando se basó en diámetros de poro promedio de 25 y
250 nm, respectivamente [87].
Suponiendo que los valores anteriores son representativos de las enzimas fijadas en el portador,
Los factores de eficacia de la penicilina G amidasa de E. coli se presentan en
Tabla 3.
En conclusión, las estimaciones de h indican que no hay limitaciones de difusión siempre
que la concentración de sustrato sea alta. Este es el caso bajo el
condiciones de partida de la hidrólisis técnica de penicilina siempre que se tenga en cuenta
únicamente el sustrato. A concentraciones de sustrato más bajas, la difusión de los poros conduce
a una baja eficiencia.
Se producen bajas concentraciones de sustrato en reacciones hidrolíticas cuando el sustrato

la conversión está a punto de completarse. Sin embargo, en estas condiciones, otros factores, como
diversos tipos de inhibición del producto [87], gobernarán la reacción.
tasa. Presumiblemente, esto aumentará aún más las limitaciones de transferencia de masa [88].
Un efecto adicional, que puede eclipsar todos los demás factores en cualquier concentración de
sustrato, es la formación de gradientes de protones generados por la reacción (ver más abajo).
En la práctica, es deseable poder detectar de forma fiable la difusión porosa relacionada con el
sustrato por medios sencillos. Un método popular es analizar la actividad enzimática en diferentes
concentraciones de sustrato. A bajas concentraciones de sustrato, es probable que predominen las
restricciones a la difusión. Se pueden detectar gráficamente.
evaluación. En lugar de líneas rectas se obtienen líneas algo curvas en el
caso de gráficos v/S versus v según EadieHofstee [89]. Sin embargo, la extensión de la
La curvatura no es necesariamente tan grande como se requeriría para detectar la difusión.
control más allá de toda duda. Por tanto, no se pueden excluir los efectos de difusión si no se observa
la no linealidad.
Para evitar limitaciones de difusión es aconsejable ensayar la actividad enzimática.
en condiciones más drásticas. Entre otras cosas, esto significa aumentar
velocidad del agitador para excluir la difusión externa, triturando las partículas para reducir
difusión porosa, aumentando la concentración del sustrato a aproximadamente ≥100 veces de
Valor KM para evitar la falta de sustrato en el centro de las partículas o agregar tampón para evitar
cambios de pH. Si la velocidad de reacción aumenta por cualquiera de estos medios, es
Es probable que el control de difusión sea operativo y, hasta cierto punto, pueda reducirse o reducirse.
incluso eliminado.
Los medios apropiados que pueden utilizarse para aumentar la eficiencia son los siguientes:
∑ Disminución del tamaño de partícula de los portadores. En aplicaciones técnicas el menor

El límite es un diámetro para partículas esféricas de ≥100 mm, lo que permite una cómoda
retención en una placa tamiz incluso en grandes reactores enzimáticos. Para los más pequeños
cristales de enzimas de tamaño reducido se deben aplicar otras técnicas de retención.
∑ Se recomienda reducir la carga de enzimas para enzimas con alto contenido específico.
actividad que se logra fácilmente mediante métodos de fijación comunes. Enzima
La actividad en cristales se diluyó mediante cocristalización con enzima inactivada.
[6]. Por otro lado, en el caso de enzimas con baja actividad específica, estrecha
El empaquetamiento en cristales puede ser un método de fijación útil cuando un exceso de
material portador inerte impediría condiciones de reacción razonables.
∑ La unión preferencial en la capa exterior de los materiales de soporte permitirá una mayor
eficiencias [90]. Se puede esperar una mayor eficiencia de aproximadamente un factor de dos
cuando solo la capa exterior en el 10% del radio está ocupada por la enzima [91].
4.2
Gradientes de protones de reacción (dinámicos) y generados por soporte (estático)
Los cristales reticulados de subtilisina exhibieron 27 veces menos actividad que los solubles.
subtilisina en la hidrólisis del éster etílico de benzoilLfenilalanina. Desnaturalización
de la enzima y restricciones de la difusión interna dependiente del sustrato
fueron descartados. Un cambio en la dependencia del pH de la actividad máxima a mayor
Se observaron valores de pH que se explicaron por electrostática intermolecular.
interacciones que aumentan las pK de los residuos catalíticos de los centros activos [6].
De hecho, los cambios de pH observados en la actividad también pueden deberse a:
1. Gradientes estáticos de protones o sustratos causados por la partición de grupos cargados

cerca de superficies con cargas estacionarias [92,93].
2. Gradientes dinámicos de protones debidos a reacciones hidrolíticas con liberación de protones,
como se ha observado con frecuencia para las enzimas inmovilizadas [10,94–97].
En el primer caso, el cambio de pH observado en la actividad se puede reducir utilizando alta

Fuerzas iónicas que minimizan los gradientes causados por las cargas estacionarias.
del soporte de la enzima inmovilizada. Estos gradientes estáticos son de poca
Relevancia técnica en reacciones donde sustratos cargados con alto contenido iónico.
Se utilizan las fortalezas.
Además de los gradientes estáticos de protones, el gradiente dinámico formado por reacciones
También se debe tener en cuenta el interior de las partículas. A diferencia del sustrato y el producto
limitaciones relacionadas con la transferencia de masa, incluso pequeñas cantidades de protones pueden eclipsar
cualquier otro efecto [94].
La razón de esto último es que en reacciones de formación de protones sin búfer, como
como
R1COOR2+ H2O Æ R1COO–+ H++ R2OH (6)
La hidrólisis de sólo el 1% de un sustrato de 10 a 3 M significa la formación de protones de 10 a 5 M.

(correspondiente a pH 5), que puede ser significativamente diferente del exterior
Valor de pH y pH óptimo de la reacción enzimática deseada.
Esta consideración es importante para reacciones hidrolíticas con hidrolasas como
como lipasas, esterasas y amidasas. Estos incluyen penicilina amidasas (sinónimo de penicilina
acilasas) y cefalosporina acilasas que se utilizan para
escisión hidrolítica de penicilinas y cefalosporinas en miles de toneladas por
~
año [98]. Estas hidrólisis deben realizarse a un valor de pH de 8, que es
cerca del pH óptimo de la enzima. Los valores de pH más bajos conducen a una reacción más baja.
velocidades y reversibilidad de la reacción y, por lo tanto, a una pérdida significativa de producto.
formación. No se recomiendan valores de pH más altos debido a la inestabilidad del
compañeros de reacción. Además, no se acepta la adición de buffers debido a la
costosa eliminación de los componentes del buffer.
Para una mejor comprensión, varios autores han creado modelos de descripción matemática.
Han ampliado la cinética tipo MichaelisMenten mediante
agregando términos generadores de protones [99] y han considerado la inhibición del producto
y valores de pH por encima del pH óptimo de la enzima soluble [100]. Además,
incluyeron transporte facilitado debido a las capacidades amortiguadoras de los sustratos y
productos [95] o de tampones añadidos [96, 99, 101]. En vista de las complejidades de
cálculos exactos sólo se puede dar aquí un esquema básico.
Las reacciones enzimáticas se caracterizan en muchos casos por un pH/
perfil de actividad:
Vm¢
Vm = 957 (7)
yo k2
1
+5K +1 5 I
Fig. 7. Eficiencia de las reacciones enzimáticas generadoras de protones. Curva a reacción enzimática soluble
con un perfil de actividad/pH en forma de campana K1=10–4 M, K2=10–8F M,<0,1 (– – –). Curva b Severa
control de difusión de una enzima inmovilizada cuandoF= 12, S=145 mM, KM=14,5 mM (– – –).
Curva c Control moderado de la difusión interna de una enzima inmovilizada en presencia de un
ácido débil (condiciones de la curva b más ácido débil 10 mM) (……) (representación gráfica
simplificada derivada de [101])
donde I es la concentración real de protones, K1, K2 son las constantes relacionadas con el perfil de pH, dando
un perfil como el que se muestra en la Fig. 7, curva a.
Los protones acumulados generados dentro de los poros de un catalizador provocan la formación de un
gradiente de protones. La extensión de tal gradiente es predominantemente una
cuestión de la tasa de formación de protones, que depende del inmovilizado
La actividad de la enzima y la transferencia de masa impulsan el transporte de protones hacia el exterior de las
partículas del catalizador. En estado estacionario se produce un equilibrio de masa.
Ruckenstein [96] ha calculado la enzima de difusión restringida resultante
actividades a altas concentraciones de sustrato. Él nos enseña en términos simples que
Los cambios de pH y las reducciones resultantes en la actividad ocurren incluso con concentraciones de sustrato
lo suficientemente altas como para excluir cualquier restricción de difusión relacionada con el sustrato.
es decir, en factores de efectividad cercanos a 1.
En sus cálculos, Ruckenstein introdujo un módulo de Thiele modificado y relacionado con
protones. Reemplazó el KM relacionado con el sustrato por el K1 relacionado con el pH [Ec.(7)] y
utilizó el coeficiente de difusión efectivo de protones en lugar de sustratos. Resultó
señala que incluso con valores comparativamente bajos de este módulo de Thiele modificado, las velocidades
de reacción disminuyen y, en lugar de un perfil en forma de campana, se forma una curva que se convierte en
Se obtiene un pH más plano hacia valores alcalinos (Fig. 7, curva b).
En presencia de ácidos débiles, se asumió un transporte facilitado de protones. En
Como consecuencia, se puede lograr un transporte de protones significativamente mayor, de modo que
el perfil de actividad/pH se desplaza a valores de pH más alcalinos (Fig. 7, curva c).
Se obtuvo prueba experimental de cambios de pH relacionados con la difusión en materiales porosos.
portadores de penicilina amidasa inmovilizada. Mediciones directas de fluorescencia.
de fluorocromos coinmovilizados con intensidad de fluorescencia dependiente del pH
reveló gradientes de pH durante la hidrólisis [87, p. 125]. Estos gradientes disminuyen
con una capacidad de amortiguación creciente y son insignificantes para las concentraciones de amortiguación de
> 0,05 M.
Para analizar la actividad dependiente del pH de los cristales de subtilisina como se menciona
Como se mencionó anteriormente, se utilizaron capacidades de amortiguación bajas [6,102]. Así, la formación de una dinámica
El gradiente de pH durante la hidrólisis puede explicar el cambio de pH observado en la actividad.
También la quimotripsinaafijada en el portador revela exactamente el mismo fenómeno [86,
97], que se analiza con más detalle en otra parte [103].
Para optimizar la productividad y reducir la pérdida de catalizador o producto es
Es aconsejable minimizar los efectos de los gradientes de pH dinámicos generados por la reacción.
Siempre que sea practicable y útil, esto se puede lograr de varias maneras:
∑ Al reducir la densidad de la enzima y/o el tamaño de las partículas como se indica para el sustrato.
control difusional mediado.
∑ Utilizando tampones con capacidad suficiente (> 0,05 M) que minimicen los gradientes dinámicos
de pH. Ocasionalmente, los propios sustratos o productos proporcionan tales propiedades que
sólo es necesario determinar el valor de pH externo óptimo.
adaptado. No debe ser inferior al valor pK del ácido débil y no
inferior al pH óptimo de la enzima [95, 96].
∑ Al operar a un pH externo superior al pH óptimo de la enzima.
∑ Por coinmovilización de una enzima consumidora de protones. Esto fue exitoso
hecho con ureasa, donde el amoníaco formado in situ neutralizó el generado
protones de una manera extraordinariamente efectiva [99].
Es probable que las reacciones que consumen protones, como la reacción de la ureasa, lo muestren todo.
el pH relacionado con la difusión cambia en la dirección opuesta. Obviamente, pueden ser
tratados de manera análoga.
4.3
Dependencia de la temperatura
En una reacción enzimática libre de difusión, la velocidad de reacción aumenta hasta un cierto
valor crítico exponencialmente y se describe mediante la ecuación de Arrhenius [82]. En
reacciones controladas por difusión la velocidad de reacción es una cuestión de eficiencia
factor [ver
h Ecs. (3–5)]. Con más detalle, la velocidad de reacción máxima se expresa
dentro de la raíz de la ecuación. (4). En conclusión, la dependencia de la temperatura es función de
la raíz cuadrada de la actividad enzimática. En la práctica, las enzimas inmovilizadas
dependen mucho menos de la temperatura cuando su velocidad de reacción está controlada por
difusión.
4.4
Evaluación de estabilidad
Es útil diferenciar entre estabilidad de almacenamiento y estabilidad operativa.

La estabilidad durante el almacenamiento la proporciona una formulación adecuada. Principalmente,
varios aditivos protegen la enzima de la desnaturalización bajo las condiciones de almacenamiento
recomendadas. Por estos medios se soporta el envío y distribución. La estabilidad operativa es una
cuestión de condiciones de trabajo y de efectos perjudiciales de
las condiciones de reacción seleccionadas, como pH, temperatura, disolventes, impurezas,
y otros factores que contribuyen a la desnaturalización de proteínas o modificación de
grupos funcionales y así mejorar la inactivación. La estabilidad operativa
determina el rendimiento de la enzima y determina los beneficios de costos como se analizó

anteriormente. Para reacciones libres de difusión, la inactivación dependiente del tiempo puede ocurrir a
lo largo de varias velocidades de inactivación, como la caída exponencial de la actividad.
según una reacción de primer orden. En este caso, la tasa de inactivación puede ser
descrito de manera similar a la dada para la dependencia de la temperatura mediante la ecuación de
Arrhenius (ver arriba).
En reacciones estrictamente controladas por difusión, es decir, con bajas eficiencias, en pocas
palabras, sólo una pequeña fracción de la cantidad total de enzima inmovilizada actúa. Si durante la
operación se destruye la enzima que trabaja activamente, algunos
otra fracción previamente “en reposo” puede sustituirla hasta cierto punto. Este es uno
razón por la cual las enzimas inmovilizadas pueden parecer erróneamente más estables
que las enzimas libres. Para evitar tal mala interpretación se requiere el ensayo de la
actividad enzimática en ausencia de limitaciones de difusión. Para aplicaciones industriales es más útil
considerar el rendimiento de la enzima como se indica en la Fig. 1.
en lugar de simplemente evaluar su vida media.
4.5
Otras contribuciones
Desafortunadamente, la mayoría de las enzimas no obedecen a la cinética simple de MichaelisMenten.

La inhibición de sustratos y productos, la presencia de más de un sustrato y producto, o reacciones
enzimáticas acopladas en sistemas multienzimáticos requieren mucho más
ecuaciones de tasas complicadas. Sustratos gaseosos o sólidos o enzimas unidas en
Las células inmovilizadas necesitan que se tengan en cuenta barreras de transporte adicionales. En
lugar de partículas esféricas porosas, se utilizan otras geometrías de partículas de catalizador.
Se puede aplicar en tanques agitados, reactores de flujo pistón y otros que necesitan algo de
Tratamiento modificado de restricciones de difusión y tecnología de reacción.
5
Rendimiento de enzimas inmovilizadas
5.1
Formulación y actividad enzimática
Para reacciones en disolventes orgánicos inmiscibles con agua, el método más sencillo de
La inmovilización consiste en utilizar polvos de enzimas secos y suspenderlos en el
disolvente [104]. Pueden eliminarse mediante filtración o centrifugación y reutilizarse.
después. Sin embargo, incluso este método sencillo puede causar problemas.
Un polvo de lipoproteína lipasa (LPL) esterificó un sustrato orgánico en tolueno
a una velocidad de reacción bastante pobre (Tabla 4), lo que se explica en cierta medida por
adhesión del polvo de enzima pegajoso a la superficie del recipiente de reacción [7].
Cuando el polietilenglicol (PEG) se unió covalentemente a LPL y este modificó
La enzima se disolvió en tolueno, aproximadamente 3,5 U mg–1 de proteína enzimática.
fueron ensayados. Después de la simple adición de PEG a la mezcla de reacción junto con
En polvo de LPL, se observó la misma velocidad de reacción pobre del polvo de enzima solo. Por otro
lado, cuando el polvo de LPL se liofilizó junto con PEG
la preparación resultante tuvo una actividad de 1,8 U mg–1. En este caso, la enzima
Tabla 4. Actividades de acetilación de lipasas dispersas.
Enzima Formulación Actividada
Acetilación de (±)sulcatol en tolueno

LPL polvo <0,06
polvo + PEG <0,06
liofilizado junto con PEG con PEG 1.8
unido covalentemente fijado al 3.5
soporte 2.3
Acetilación de alcohol secfeniletílico.

PSL b 1.5 (15)
enzima
fijada con soporte en polvob 0,08 (8)
CALB b 1.7 (17)
enzima
fijada con soporte en polvob 0,4 (40)
a Unidades/mg de preparación seca; cifras entre paréntesis por proteína enzimática.

b
En nhexano, agua saturada, a 2°C en unidades mg–1 ; ya sea con preparaciones liofilizadas
(polvos) que contienen aproximadamente un 10% de proteína o con preparaciones liofilizadas fijadas en un soporte
(aproximadamente 1% de proteína en peso) [120].
El polvo estaba muy disperso en el medio orgánico y podía separarse fácilmente mediante centrifugación.
La adsorción de LPL sobre un material portador (Celite®) produjo una velocidad de reacción de 2,3 U mg–1
[7].
Estos hallazgos experimentales indican la importancia de una formulación adecuada,
incluso si estos resultados no son necesariamente una mera cuestión de distribución, ya que
la actividad del agua, la conformación de las enzimas y la estabilidad también afectan la actividad ensayada
[6, 105108]. Condiciones de almacenamiento inadecuadas y formulaciones de polvos no
desarrollados especialmente para aplicaciones en disolventes probablemente sean responsables de
actividades bajas, por ejemplo, cuando la humedad del aire o el agua generada por reacción hacen
Liofilizados higroscópicos pegajosos. En conclusión, la formulación adecuada de liofilizados o de
preparaciones fijadas con soporte dará como resultado actividades apreciables.
En contraste con las bajas tasas de reacción reportadas en otros lugares [109], el polvo crudo
de lipasa de Pseudomonas cepacia (PSL) acila el alcohol feniletílico secundario a velocidades de reacción
razonables [120] (Tabla 4). Basado en proteína enzimática activa,
las velocidades de reacción más altas se observaron para las enzimas fijadas en portadores. Esto es también
cierto para la lipasa de Candida antarctica (CALB). Cristales de PSL catalizados con
actividad comparable cuando habían sido pretratados con surfactantes [109].
Con respecto a la distribución, existen varios medios para mejorar la reacción.
tasas para enzimas inmovilizadas:
∑ En el caso de polvos enzimáticos, formulación y condiciones de almacenamiento adecuadas.

garantizará actividades razonables. Esto se logra mediante la adición de varios
compuestos antes del proceso de secado para mejorar la distribución. Tales compuestos también
pueden ser muy útiles como estabilizadores y agentes protectores. Los fabricantes de enzimas suelen
ofrecer preparaciones adecuadas para enzimas específicas.
∑ Solubilización de la enzima en un disolvente orgánico mediante acoplamiento covalente de

compuestos lipófilos. La inmovilización debe entonces lograrse mediante la inclusión.
en dispositivos de membrana o por separación en reacciones de dos o múltiples fases

[110112].
∑ Inmovilización de la enzima. Incluso una simple adsorción sobre soportes porosos
puede aumentar significativamente la disponibilidad de centros catalíticos únicos, y también
asegura una fácil separación del producto. Cristales de enzimas reticulados
parecen requerir tensioactivos para compensar su baja actividad en disolventes orgánicos
inmiscibles en agua [109].
La inmovilización implica la introducción de materiales portadores inertes. Con el

excepción de cristales de enzimas o enzimas dentro de reactores de membrana enzimática,
el material portador inerte suele estar presente en exceso con respecto a la proteína enzimática
activa. El portador de cristales es la propia proteína enzimática, cuya actividad específica
Determina estrictamente la actividad del cristal relacionada con el peso. Esto es diferente en
el caso de materiales de soporte específicos. La gama de enzimas activas puede ser bastante
amplio porque la carga de enzimas se puede ajustar de acuerdo con la capacidad de unión del
material portador. Por lo tanto, es posible establecer un equilibrio
relación entre el volumen de reacción y el portador ajustando la cantidad de
enzima unida al soporte.
Esto se investigó para la hidrólisis de cefalosporinas con fijado en soporte.
glutaril7ACA acilasa, por ejemplo [113]. La aplicación adolece de un problema bastante
baja actividad enzimática específica de aproximadamente 4 U mg–1 [ensayada con ácido glutaril7
ACAb (7(4carboxibutanamido)aminocefalosporánico a 37°C, pH 8].
Aproximadamente 60 g de enzima seca fijada en un portador (5 kU L–1) hidrolizaron más de
95% del sustrato 75 mM en 50 minutos a 20°C. La enzima ocupa aproximadamente
6% del volumen del reactor de un tanque agitado. Cantidades significativamente mayores de
El portador retendría más producto dentro de los poros y requeriría
pasos de lavado adicionales y por lo tanto conducen a la dilución. Por otro lado, mayor
La carga de enzima en el portador reduciría aún más su volumen en el reactor.
y probablemente conduciría a pérdidas de actividad enzimática durante el frecuentemente
pasos de reciclaje repetidos.
Para enzimas poco activas, una alta densidad de catalizador, como en los cristales reticulados.
es una ventaja. Las limitaciones debidas a la baja actividad son menos una cuestión de tecnología
que de los objetivos de costos porque las enzimas suelen ser caras cuando sus características específicas
la actividad es baja. Esto no es necesariamente cierto en el caso de algunas proteasas y lipasas
producidas a gran escala como ingredientes de detergentes. Por tanto, los objetivos de costes pueden
lograrse más fácilmente no mediante una estabilización extrema sino mediante enzimas de bajo precio.
Desafortunadamente, algunas enzimas crudas disponibles comercialmente son una mezcla de
diferentes especies de enzimas [114], lo cual es la razón de algunos de los inconvenientes
descrito aquí. Para obtener resultados reproducibles independientemente de las variaciones de lote,
es aconsejable utilizar únicamente enzimas que al menos tengan especificaciones que garanticen una
calidad adecuada.
5.2
Estabilidad
Una mayor estabilidad operativa de las enzimas inmovilizadas es esencial para

lograr los beneficios en costos ya mencionados. La estabilidad de la enzima se puede controlar.
analizando la disminución de la actividad con el tiempo hasta que se alcanza la vida media de
actividad. Este es un medio útil de control cuando la inactivación térmica tiene lugar según una
cinética de primer orden.
Las complicaciones ocurren cuando están presentes mezclas más o menos estables de diferentes
especies de enzimas, ya sea como resultado de una unión más o menos estrecha o de diferentes
estabilidades intrínsecas.
El papel de los efectos de transferencia de masa, ya sea que ocurran accidentalmente o
intencionadamente, es ambivalente, lo que lleva a Trevan a plantearse la pregunta: “¿Limitación de
la difusión: amiga o enemiga?” [115]. Una menor actividad como resultado de una baja eficiencia
indica que sólo una pequeña porción de la enzima está activa durante la operación. La otra porción
no utilizada puede, en términos simples, reemplazar la enzima a medida que se desactiva paso a
paso. En otras palabras, las reacciones controladas por transferencia de masa parecen ser mucho
menos sensibles a la disminución de la actividad enzimática, creando así falsamente una impresión de estabil
En condiciones de reacción duras, puede ser ventajoso operar en estas condiciones para mantener
constante la velocidad de reacción hasta que desaparezca la limitación de difusión [82, 115, 116].
Con respecto a tales efectos, es aconsejable no sólo determinar la estabilidad operativa

siguiendo el curso temporal de la actividad, sino también seguir su productividad, o viceversa, su
consumo, en relación con el producto formado.
La penicilina G amidasa fijada por portador en la hidrólisis de varias toneladas de penicilina G es
un ejemplo útil para ilustrar el consumo de enzimas. La enzima se aplica en tanques agitados con
placas de tamiz en el fondo para retener las partículas de enzima cuando se drena la solución del
producto. El valor del pH se mantiene constante mediante la alimentación controlada de solución de
amoníaco. La solución de sustrato nueva se rellena unas mil veces o más. El consumo de enzima
en dicho proceso es inferior a 10 mg kg–1 (0,2 kU kg–1) de 6APA aislado cuando la actividad
enzimática se determina con soluciones de penicilina G a 28° C y pH 8,0. En condiciones idénticas,
el consumo de enzima soluble para cada llenado del tanque estaría más allá de todo costo razonable.
Se aplicaron cristales reticulados de lipasa de Candida rugosa (CRL) en la resolución del éster
cloroetílico de ketoprofeno racémico. En la operación por lotes, la vida media del catalizador se
alcanzó después de aproximadamente 18 ciclos o, en términos de consumo de enzima, se
consumieron aproximadamente 5,6 g de proteína enzimática para preparar 1 kg de (S)ketoprofeno .
CRL adolece de una baja actividad específica hacia este sustrato poco soluble en agua, lo que
puede explicar el alto aporte de enzimas [117].
Cuando se aplicaron cristales reticulados de termolisina en la síntesis de péptidos en acetato de
etilo, se mantuvieron estables durante varios cientos de horas con un consumo de enzima
sorprendentemente bajo, mientras que una preparación de enzima soluble se volvió inactiva en un
corto período de tiempo. Nuevamente vale la pena considerar la calidad de la preparación de enzima
soluble. Cuando la termolisina soluble se almacenó en soluciones mixtas acuosasorgánicas, perdió
alrededor del 50% de su actividad dentro del primer día de incubación solo para luego permanecer
bastante estable durante los siguientes 15 días. días. Es posible que la inactivación inicial fuera
causada por una fracción inestable de termolisina y que los cristales de termolisina ya no contuvieran
esta fracción inestable [118].
Se logró una productividad comparable a la de los cristales con termolisina adsorbida en resina
Amberlite® XAD7 que se empleó en reactores de flujo pistón continuo con alcohol tercamílico como
disolvente [119].
Con respecto a la pureza, la calidad y la formulación, y por lo tanto a las

consideraciones de costos, puede ser útil definir “productividad” como el volumen de
fermentación requerido para preparar la actividad enzimática inmovilizada necesaria para
sintetizar una cierta cantidad de producto. .
Esto es útil cuando el rendimiento general de un proceso catalizado por enzima
inmovilizada tiene que ser competitivo con otras tecnologías, como la preparación del
producto deseado mediante fermentación o mediante biotransformaciones de células completas.
6
Conclusiones
Las enzimas han logrado aceptación como catalizadores en la síntesis de compuestos

químicos, particularmente en la industria de química fina para la fabricación de compuestos
enantiopuros. La inmovilización de enzimas es una herramienta útil para cumplir objetivos
de costes y lograr ventajas tecnológicas. La inmovilización permite el uso repetitivo de
enzimas y, por tanto, importantes ahorros de costes. Desde el punto de vista tecnológico,
las enzimas inmovilizadas se pueden separar fácilmente del líquido de reacción y hacen
innecesarios los laboriosos pasos de separación. Beneficios adicionales surgen de la
estabilización frente a condiciones de reacción duras que son perjudiciales para las
preparaciones de enzimas solubles. Debido a la amplia variación en las propiedades de
las especies de enzimas individuales y debido a los diferentes requisitos de la tecnología
de reacción para los compuestos objetivo, es aconsejable explotar plenamente la riqueza
de métodos y técnicas de inmovilización. Cuál de los métodos disponibles es el mejor al
final lo decidirán tanto los requisitos técnicos específicos como el marco empresarial
general.
7
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Chirazyme L2, Cat no 1835807)

1999 - Immobilized Enzymes - Methods and Applications

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Enzimas inmovilizadas: métodos y aplicaciones.

2 ¿Por qué inmovilizar las enzimas? . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

Grupos funcionales enzimáticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

4 Efectos de transferencia de masa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

Temas de la química actual, vol. 200

4.4 Evaluación de estabilidad. . . . . . ... ... ... . . . . . . . . . . 118

5 Rendimiento de Enzimas Inmovilizadas . . ... ... ... . . . . 119

6 Conclusiones . . . . ... ... . ... ... ... ... ... . . . . 123

El uso artificial de enzimas de unión a materiales sólidos se remonta a la

Existen varias razones para la preparación y uso de enzimas inmovilizadas.

Enzimas inmovilizadas: métodos y aplicaciones. 97

Propiedades bioquímicas Características químicas

Tipo de reacción y cinética Propiedades mecánicas

Método de inmovilización Efectos de transferencia de masa Estabilidad operativa

Fig. 1. Características de las enzimas inmovilizadas.

Tabla 1. Parámetros característicos seleccionados de enzimas inmovilizadas

Enzima Propiedades bioquímicas ,

Enzimas inmovilizadas: métodos y aplicaciones. 99

Fig. 2. Costo y productividad

La inmovilización de macromoléculas se puede definir generalmente como un

100 W. Tischer ∙ F. Wedekind

Fig. 3. Clasificación de métodos de inmovilización.

residuos estructuralmente esenciales. También entrecruzamiento intra e intermolecular.

3. Se utiliza un agente de acoplamiento bi o multifuncional para mediar entre el portador

Enzimas inmovilizadas: métodos y aplicaciones. 101

unidad), que están asociados covalentemente (a través de enlaces disulfuro) o no covalentemente. En

La reactividad química de estas moléculas complejas depende de la reactividad de

grupos de ácido glutámico y aspártico, respectivamente, el grupo sulfhidrilo de

pH=pKa+ log([A­]/[AH]) (1)

104 W. Tischer ∙ F. Wedekind

Se pueden introducir grupos reactivos adicionales en las moléculas de enzimas mediante

Enzimas inmovilizadas: métodos y aplicaciones. 105

Las características del transportista tienen una fuerte influencia en el rendimiento de

∑ Grupos funcionales: El tipo de activación, presencia, distribución y densidad.

106 W. Tischer ∙ F. Wedekind

reacción, y estabilidad y estabilidad operativa de la enzima fijada en el portador.

∑ Permeabilidad y área de superficie: en la mayoría de los casos es deseable una gran

Se encuentra disponible una clasificación detallada de los materiales de soporte [47].

Enzimas inmovilizadas: métodos y aplicaciones. 107

estabilidad térmica y resistencia contra ataques microbianos y solventes orgánicos.

Portadores orgánicos naturales

108 W. Tischer ∙ F. Wedekind

aspectos de seguridad biológica como matrices proteicas aisladas de fuentes animales y

Los polímeros orgánicos sintéticos muestran la mayor variabilidad en cuanto a características

Enzimas inmovilizadas: métodos y aplicaciones. 109

El poliestireno fue el primer polímero sintético utilizado para la inmovilización de enzimas.

110 W. Tischer ∙ F. Wedekind

La activación de polímeros sintéticos se puede lograr mediante diversos métodos.

Enzimas inmovilizadas: métodos y aplicaciones. 111

Fig. 5. Estabilidad de almacenamiento de la penicilina G amidasa inmovilizada sobre polimetacrilato

112 W. Tischer ∙ F. Wedekind

Fig. 6. Cinética de inmovilización de glutaril­7­ACA­acilasa sobre polimetacrilato activado con epoxi. La

La inmovilización se completa en 20 h, pero el biocatalizador resultante sólo tiene

La inmovilización de enzimas significa una restricción deliberada de la movilidad de las enzimas.

Enzimas inmovilizadas: métodos y aplicaciones. 113

En la literatura se da considerable importancia a la descripción teórica y

n¢ (tasa de conversión del sustrato de la enzima inmovilizada)

114 W. Tischer ∙ F. Wedekind

Tabla 3. Factores de efectividad h para penicilina G amidasesa inmovilizada

PGA en Eupergit®C 268 68 1.0

PGA en Eupergit®250L 268 69 1.0

Por otro lado, también se pueden utilizar cálculos aproximados

pH=pKa+ log([A]/[AH]) (1)

Fig. 6. Cinética de inmovilización de glutaril7ACAacilasa sobre polimetacrilato activado con epoxi. La

Desafortunadamente, la mayoría de las enzimas no obedecen a la cinética simple de MichaelisMenten.

Acetilación de (±)sulcatol en tolueno

Acetilación de alcohol secfeniletílico.