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Investigación alimentaria internacional 86 (2016) 140–146

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Investigación alimentaria internacional

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El conocimiento actual sobre la aplicación de enzimas antibiopelículas en el

industria de alimentos

Ana Meireles a, Anabel Borges a, Efstathios Giaouris b , Manuel Simõesa ,

a
LEPABE, Departamento de Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería, Universidad de Oporto, Rua Dr. Roberto Frias, s/n, 4200­465 Oporto, Portugal
b
Departamento de Ciencia de los Alimentos y Nutrición, Facultad de Medio Ambiente, Universidad del Egeo, Mitropoliti Ioakeim 2, Myrina 81400, Isla de Lemnos, Grecia

información del artículo abstracto

Historia del artículo:

Los biofilms se encuentran en casi todas las superficies mojadas, siendo muchas veces indeseable su desarrollo debido a los
Recibido el 20 de enero de 2016
graves problemas que pueden ocasionar en diferentes ámbitos, incluido el sector alimentario. Son reconocidos como el estilo de
Recibido en forma revisada el 23 de mayo de 2016
vida microbiano preferido debido a las numerosas ventajas para las células incrustadas. Las células de biopelícula son altamente resistentes.
Aceptado el 6 de junio de 2016
Disponible en línea el 07 de junio de 2016
a condiciones de estrés, particularmente a los antimicrobianos, ya que su estructura compleja y compacta dificulta la
penetración de los antimicrobianos y el acceso a las células ubicadas en lo profundo. La mayor resistencia a la actual
Palabras clave: Las estrategias de control empleadas enfatizan la necesidad urgente de nuevas alternativas y/o complementarias de erradicación.
Aproximaciones alternativas enfoques. En esta dirección, el uso de enzimas es un enfoque anti­biofilm alternativo interesante debido a
enzimas su capacidad para degradar componentes cruciales de la matriz de la biopelícula, provocar la lisis celular y promover la alteración de la biopelícula
Matriz polimérica extracelular e interrumpir los eventos de señalización de célula a célula que rigen la formación y el mantenimiento de biopelículas. Esta revisión
Modo de acción
proporciona una descripción general de las enzimas utilizadas para el control de biopelículas, sus objetivos y ejemplos de aplicaciones efectivas.
Eliminación
© 2016 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
Resistencia

Contenido

1. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
2. Enzimas antibiopelículas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
2.1. Modo de actuación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
2.2. Enzimas anti­detección de quórum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
2.3. Enzimas oxidativas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
2.4. Enzimas que degradan polisacáridos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
2.5. Enzimas proteolíticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
2.6. Combinación de enzimas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
2.7. Combinación de enzimas con tratamientos físicos/químicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
3. Conclusiones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
Agradecimientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
Referencias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145

1. Introducción

Las biopelículas son comunidades microbianas adheridas a superficies bióticas o

Abreviaturas: AHL, acil homoserina lactonas; AI­2, Autoinductor­2; AIP,
Péptidos autoinductores; IA, Autoinductores; UFC, unidades formadoras de colonias; ADNasa,
Desoxirribonucleasa; ADNe, ADN extracelular; EPS, Sustancias poliméricas extracelulares;
QS, detección de quórum; SS, acero inoxidable; Estados Unidos, Ultrasonidos.
Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico: mvs@fe.up.pt (M. Simões).
abióticas e incrustadas en una matriz polimérica hidratada de producción propia (Cos,
Toté, Horemans y Maes, 2010; Costerton, Lewandowski,
Caldwell, Korber y Lappin­Scott, 1995; Simões, 2011; Stoodley, Sauer,
Davies y Costerton, 2002). Este estado sésil representa un excepcional
estrategia de supervivencia para los microorganismos, ya que los protege contra diversos
estrés ambiental (p. ej., inanición, deshidratación) y antimicrobianos.
agentes (por ejemplo, antibióticos y biocidas) (Costerton et al., 1995; Mah &

http://dx.doi.org/10.1016/j.foodres.2016.06.006
0963­9969/© 2016 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
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A. Meireles et al. / Investigación de Alimentos Internacional 86 (2016) 140–146
O'Toole, 2001). Aunque la formación de biopelículas puede desempeñar un importante papel
ventajoso en muchos procesos (por ejemplo, biodegradación de contaminantes ambientales,
promoción del crecimiento de las plantas, mantenimiento de la cadena microbiana),
equilibrio dentro del cuerpo humano), también puede causar problemas importantes
en entornos clínicos y en varias industrias (Bridier et al., 2015; Donlan,
2002; Giaouris et al., 2014; Percival, Malic, Cruz y Williams, 2011). En
De hecho, las biopelículas son responsables de infecciones humanas persistentes,
diseminación de patógenos, contaminación de productos, obstrucción y corrosión.
de tuberías metálicas, disminución de la eficiencia de transferencia de calor, aumento de fluido
resistencia a la fricción y otros daños al equipo, que representan un
importante preocupación económica y de salud pública (Beech, 2004; Cloete,
Jacobs y Brozel, 1998; Gilbert, McBain y Rickard, 2003; Shi y Zhu,
2009). La resistencia a las biopelículas y el consiguiente fracaso de los métodos
convencionales para erradicar los microorganismos encerrados en biopelículas pueden ser
explicado por: (i) la barrera de difusión fisicoquímica generada por
la presencia de una matriz polimérica extracelular; (ii) un estado metabólico microbiano
alterado (tasa de crecimiento reducida/estado latente) en parte debido a
limitación de nutrientes/oxígeno; (iii) la expresión de resistencia específica
genes; y (iv) la diferenciación de células en variantes fenotípicas.
menos susceptible a los tratamientos (por ejemplo, presencia de células persistentes)
(Anderson y O'Toole, 2008; Gilbert et al., 2003; Stewart, 2002).
En la industria alimentaria, los productos químicos agresivos, como el hidróxido de sodio.
o hipoclorito de sodio, junto con técnicas de limpieza in situ.
A menudo se utiliza para mitigar los efectos indeseables de la biopelícula. Sin embargo, estos
enfoques no siempre son efectivos para el control de biopelículas, particularmente con
respecto a la inactivación de las capas celulares internas de estos agregados
y su eliminación de las superficies. Al mismo tiempo, los productos químicos
utilizado para el control de biopelículas puede corroer materiales y maquinaria, poner en peligro
usuarios e impactan negativamente el medio ambiente (Gilbert et al., 2003).
Entre los enfoques de prevención y control de biopelículas recientemente desarrollados
son los que se centran en los procesos celulares intrínsecos implicados en el establecimiento
y maduración de la biopelícula, como la motilidad, la agregación de célula a célula, la
producción de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) y
comunicación intercelular (quorum sensing, QS) (Cegelski et al.,
2009; Huang y Stewart, 1999; Landini, Antoniani, Burgess y Nijland,
2010). Por lo tanto, una estrategia relevante para eliminar biopelículas de los sistemas
industriales es emplear enzimas. De hecho, estos han sido utilizados para el
tratamiento de biopelículas formadas en áreas alimentarias (Anand, Singh, Avadhanula,
& Marka, 2014; Lequette, Boels, Clarisse y Faille, 2010).
2. Enzimas anti­biopelículas
Las enzimas son catalizadores naturales capaces de acelerar reacciones químicas sin
consumirse (Shanmugam & Sathishkumar, 2009).
Sin duda, el metabolismo celular depende de estas proteínas y
Incluso modificaciones moleculares menores pueden tener consecuencias metabólicas
vitales, afectando la complejidad de la red de reacciones químicas.
(Cabral, Gama y Aires­Barros, 2003). Varios factores pueden interferir
con la actividad y especificidad de las enzimas, como la temperatura, el pH,
sustrato, presencia y/o ausencia de activadores, cofactores o inhibidores
(Cabral et al., 2003; Copeland, 2000). Las posibles aplicaciones de estos
Las moléculas biológicas son infinitas, incluido su uso en las industrias de
alimentos y bebidas, detergentes, medicamentos, textiles, pulpa, papel y animales
alimento (Bajpai, 1999; Kirk, Borchert y Fuglsang, 2002). Las enzimas pueden ser
clasificadas en seis clases principales: i) oxidorreductasas (por ejemplo, alcohol
deshidrogenasa, glucosa oxidasa, hemo oxigenasa, catalasa, dihidrofolato reductasa,
fenilalanina hidroxilasa, etc.) que catalizan reacciones redox.
y transferir átomos de oxígeno o hidrógeno; ii) transferasas (por ejemplo, lípido quinasa,
transaldolasa, fosfomutasa, acil­, metil­, glucosil­, fosforil­, transferasa, etc.) que permiten la
transferencia de un átomo o un grupo de
átomos de una molécula a otra; iii) hidrolasas (por ejemplo, serina proteasa, pectinesterasa,
glicosilasa, pirofosfatasa, aminopeptidasa,
oligorribonucleasa, etc) que catalizan reacciones hidrolíticas; iv) liasas
(por ejemplo, piruvato descarboxilasa, hidratasa, aldolasa, sintasa, etc.) que catalizan
reacciones eliminando un átomo o un grupo de átomos; v) isomerasas
(por ejemplo, isomerasa, epimerasa y racemasa) que catalizan reacciones de
141
reordenamiento en una molécula; y vi) ligasas o sintetasas (por ejemplo, sintetasa y
carboxilasa) que pueden unir dos moléculas entre sí con una
enlace covalente (Aehle, 2004; Cabral et al., 2003; Shen & Chou, 2007).
El uso de enzimas como agentes antibiopelículas ha aumentado en los últimos años.
años (Taraszkiewicz, Fila, Grinholc y Nakonieczna, 2013; Thallinger,
Prasetyo, Nyanhongo y Guebitz, 2013) con su aplicación han tenido éxito en la eliminación
de biopelículas de superficies industriales. Varias aplicaciones
se han descrito (Tabla 1) en un esfuerzo por reducir los problemas asociados a la presencia
de biopelículas y sustituir los biocidas químicos nocivos e ineficaces, proporcionando así una
alternativa más ecológica.
(Cortés, Consuegra, Sinisterra, & Méndez­Vilas, 2011; Srey, Jahid, & Ha,
2013). La aplicación de enzimas para la limpieza del contacto con alimentos.
superficies está aprobado por las agencias reguladoras (Schmidt, 1997) y
no hay evidencia relacionada con la interferencia de los tratamientos enzimáticos con la
calidad de los alimentos. De hecho, siempre que las superficies estén correctamente
enjuagados no hay posibilidad de contaminación de los alimentos ni riesgo de que una
enzima sea considerada un aditivo ilegal adicional (Troller, 1993).
2.1. Modo de acción
El objetivo de las enzimas que alteran las biopelículas suele ser la matriz de EPS.
que rodean las células (Lequette et al., 2010; Xavier, Picoreanu, Rani,
van Loosdrecht y Stewart, 2005). Sin embargo, su modo de acción puede
varían mucho. Las enzimas pueden: i) atacar directamente los componentes del biofilm
y degradarlos; ii) inducir la lisis celular; iii) interferir con el sistema QS; iv) o incluso catalizar
la formación de antimicrobianos (Augustin,
Ali­Vehmas y Atroshi, 2004; Cordeiro y Werner, 2011; Donlan, 2002;
Simões, Simões y Vieira, 2010; Thallinger et al., 2013). La acción de las enzimas está
intrínsecamente relacionada con la disminución de la integridad física de la biopelícula,
degradando las moléculas de la matriz en monómeros que pueden ser transportados.
a través de la célula y posteriormente metabolizado (Molobela, Cloete y Beukes,
2010). Como las enzimas pueden actuar sobre la biopelícula EPS, lo ideal es identificar los
componentes estructurales de esta matriz antes de cualquier acción enzimática.
aplicación (Molobela et al., 2010). Hidratos de carbono, polisacáridos,
proteínas (que frecuentemente exhiben propiedades similares a las del amiloide), glicoproteínas,
Generalmente se identifican lípidos, fosfolípidos, glicolípidos y ácidos nucleicos.
como componentes de la matriz EPS (Branda, Vik, Friedman, & Kolter, 2005;
Flemming y Wingender, 2010; Hobley, Harkins, MacPhee y
Stanley­Wall, 2015). La composición y arquitectura de la matriz depende de una serie de
factores extrínsecos, incluidas las fluctuaciones en la concentración de nutrientes.
y niveles gaseosos y cizallamiento de fluidos (Simões et al., 2010). Es más, un
Se puede encontrar una gama de actividades enzimáticas y reguladoras complejas.
dentro de la matriz (Allison, 2003; Sutherland, 1999).
Mediante el uso de enzimas, los biocidas en uso pueden ser reemplazados o sus
La concentración se puede reducir significativamente ya que la acción enzimática
en la matriz de EPS favorece el acceso de los químicos a las células
(Cortés et al., 2011; Lequette et al., 2010; Srey et al., 2013). Dado que
Las biopelículas pueden tener una composición heterogénea, diversos tipos de enzimas.
Se requieren para combatirlos y, por lo general, se debe utilizar una mezcla de enzimas.
aplicarse o combinarse con tratamientos complementarios (Augustin et
otros, 2004; Kumar y Anand, 1998; Thallinger et al., 2013). Hay
cuatro tipos de enzimas de particular interés para la eliminación de biopelículas: enzimas anti
QS, enzimas oxidativas (Thallinger et al., 2013), enzimas que degradan los polisacáridos y
enzimas proteolíticas (Johansen, Falholt,
& Gram, 1997; Thallinger et al., 2013). Estos cuatro tipos de enzimas pertenecen a tres de
las clases principales mencionadas anteriormente: hidrolasas, oxidor ductasas y liasas (Fig.
1).
2.2. Enzimas anti­detección de quórum
La estrecha proximidad de las células en las biopelículas y las condiciones
espacioquímicas permiten la coexistencia bacteriana y la matriz de retención proporciona
condiciones óptimas para el fenómeno QS (Giaouris et al., 2015; Li &
Tian, 2012). QS es una forma de comunicación intercelular utilizada por muchos
especies de bacterias en respuesta a un aumento en la densidad celular. Este complejo
sistema regulador de genes se basa en la producción, liberación y
 al.
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Al
M
e(11
In
A.
8 –t
tabla 1
Aplicaciones de enzimas antibiopelículas, su clasificación y objetivos.

Acción clase de enzima enzima aplicada Productor de biopelícula objetivo Material de superficie Efecto Referencia

Enzimas anti­QS hidrolasa lactonasa P. aeruginosa Bacterias de poliestireno al revés 69–77 % de eliminación de biopelículas Kiran et al. (2011)
hidrolasa acilasa Membrana de ósmosis inversa 9,0 % de eliminación de biopelículas Kim y cols. (2013)
membrana de ósmosis (material no especificado)
hidrolasa Lactonasa (expresada por un P. aeruginosa y E. coli Cloruro de polivinilo Inhibición de la formación de biopelículas. Pei y Lamas­Samanamud
bacteriófago T7 diseñado) (2014)
Enzimas oxidativas hidrolasa ADNasa E. faecalis Poliestireno Eliminación de biopelículas Tomás y col. (2008)
hidrolasa ADNasa L. monocytogenes Poliestireno Eliminación del 50% de biopelículas Nguyen y Burrows
(2014)
Enzimas que degradan polisacáridos hidrolasa Dispersina B S. epidermidis S. Vaso 40% de eliminación de biopelículas Brindle et al. (2011)
hidrolasa α­amilasa aureus, S. epidermidis Poliestireno 79% eliminación de biopelículas de S. aureus; No Craigen et al. (2011)
eliminación de biopelículas para S. epidermidis

Enzimas proteolíticas hidrolasa Pandion, resinasa, spezima y P. aeruginosa Poliestireno Eliminación de biopelículas de 4 log UFC/ml Augustin et al. (2004)
paradigma utilizado individualmente
hidrolasa enzima bacteriófago E. coli O157:H7 Acero inoxidable Eliminación de 2,8 log UFC Sharma y cols. (2005)
por cupón de acero inoxidable
hidrolasa enzima bacteriófago E. coli clavijas de plastico Eliminación del 99,997% Lu y Collins (2007)
hidrolasa pronasa P. fluorescens Vidrio de borosilicato Eliminación de biopelículas del Orgaz et al. (2007)
hidrolasa Savinasa® Pseudoalteromonas sp. Poliestireno 30% Eliminación completa de biopelículas Leroy et al. (2008)
hidrolasa Savinasa® P. fluorescens Lana de vidrio Eliminación del 80% de Molobela et al. (2010)
hidrolasa Endolisina (LysH5) S. aureus Poliestireno biopelículas Eliminación de biopelículas Gutiérrez et al. (2014)
Anti QS + enzimas proteolíticas hidrolasa Acilasa I + proteinasa K Bacterias al revés Membrana de ósmosis inversa de 1 a 3 log Eliminación de biopelículas del 34% Kim y cols. (2013)
membrana de ósmosis (material no especificado)
Enzimas oxidativas + degradadoras de polisacáridos. Oxidorreductasa + hidrolasa Glucosa oxidasa + lactoperoxidasa S. aureus, S. epidermidis, Acero inoxidable 1–2 log UFC/biopelícula de disco Johansen et al. (1997)
P. aeruginosa, P. fluorescens eliminación de estafilococos;
Eliminación de biopelículas de disco/CFU de 3 log

de Pseudomonas spp.
Enzimas proteolíticas + degradadoras de polisacáridos hidrolasa Celulasa + pronasa P. fluorescens Vidrio de borosilicato 94% de eliminación de biopelículas Orgaz et al. (2007)
Enzima proteolítica + estrés cortante hidrolasa Savinase® + esfuerzo cortante P. aeruginosa E. Polietileno 90% de eliminación de biopelículas Pechaud et al. (2012)
Enzimas proteolíticas + ultrasonidos hidrolasa Amiloglucosidasa + α­amilasa coli B. Acero inoxidable 96% de eliminación de biopelículas Oulahal­Lagsir et al. (2003)
Enzimas que degradan polisacáridos + sustancia química hidrolasa US + tampón con mycoides Acero inoxidable 2,98 log UFC/cm2 de eliminación de biopelículas Lequette et al. (2010)
tratamiento un tensioactivo aniónico
Enzimas degradantes de polisacáridos + antibiótico liasa Alginato liasa + gentamicina P. aeruginosa fibras de celulosa Eliminación completa de biopelículas Alkawash et al. (2006)
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A. Meireles et al. / Investigación de Alimentos Internacional 86 (2016) 140–146 143

Fig. 1. Clasificación de enzimas relevantes para el control de biopelículas y formulaciones de detergentes

(adaptado de Thallinger et al., 2013).

Detección de pequeñas moléculas de señalización llamadas autoinductores (AI).

(LaSarre y Federle, 2013). Como el uso de enzimas anti­QS solo se discutirá
brevemente, se remite al lector a varias revisiones integrales excelentes sobre
esta área (Grandclément, Tannières, Moréra, Dessaux, & Faure, 2016; Kalia,
2013; Lade, Paul, & Kweon, 2014; LaSarre y Federle, 2013).

Ya se han identificado varias clases químicas de moléculas de señalización

derivadas de microbios, y las más comúnmente estudiadas pertenecen a una de
las siguientes tres categorías: acil homoserina lactonas (AHL), péptidos
autoinductores (AIP) y autoinductor­2 (AI­2) ( Miller y Bassler, 2001). Los sistemas
QS se componen de tres componentes: la IA, el gen que codifica la proteína AI
sintasa y el gen que codifica la proteína reguladora de la respuesta. Por tanto,
cualesquiera que sean los esfuerzos empleados para alterar el fenómeno QS,
todas las estrategias se basan en la inhibición de uno de estos mecanismos
(Kalia, 2013). Dada la participación típica de QS en el desarrollo y mantenimiento
de biopelículas, se podrían utilizar enzimas anti­QS (Lazar, 2011). Ejemplos de
tales enzimas son N­acil homoserina lactonasas y acilasas. Las lactonasas son
enzimas anti­QS que hidrolizan el enlace en el anillo de homoserina, evitando la
unión de las homoserina lactonas (AHL) a los reguladores transcripcionales
(Thallinger et al., 2013). Kiran, Sharma, Harjai y Capalash (2011) utilizaron una
lactonasa en sus estudios y lograron una reducción de biopelículas del 69 % al
77 %.
ción de Pseudomonas aeruginosa, así como una disminución en la producción
de factores de virulencia. Kim y cols. (2013) utilizaron acilasa I porque es capaz
de escindir moléculas de QS. Esta enzima (a 100 μg/mL) solo fue capaz de
eliminar el 9,0% de las células presentes en una membrana de ósmosis inversa
(Kim et al., 2013). En otro estudio, Pei y Lamas­Samanamud (2014) construyeron
un bacteriófago T7 diseñado que expresa una lactonasa con actividad de amplio
rango para la inhibición de QS. La adición del fago modificado a biopelículas de
especies mixtas que contienen P. aeruginosa y Escherichia coli dio como
resultado la inhibición de la formación de biopelículas en placas de microtitulación
de cloruro de polivinilo.

2.3. Enzimas oxidativas

Los tratamientos enzimáticos también pueden apuntar al ADN extracelular

(eDNA) que se encuentra en la matriz del biofilm (Hall­Stoodley et al., 2008;
Moscoso, García y López, 2006; Okshevsky & Meyer, 2015; Thomas, Thurlow,
Boyle y Hancock, 2008). De hecho, su degradación enzimática puede prevenir,
dispersar o sensibilizar las biopelículas a los antimicrobianos (Okshevsky, Regina
y Meyer, 2015). Tomás y col. (2008) demostraron que los tratamientos con Fig. 2. Visualización microscópica de la biopelícula de E. coli (5 días) en SS (a), después de la aplicación de
desoxirribonucleasa (DNasa) redujeron la acumulación de biopelículas de Biorem A1 0,25% + Biorem 10 0,05% (Realco, Bélgica) durante 1 h a 25 °C (b), y combinación del tratamiento
Enterococcus faecalis. La ADNasa también se utilizó para controlar las biopelículas enzimático con 50 ppm de hipoclorito de sodio durante 20 min a 25 °C (c). Ampliación × 1000 y barra de
escala de 10 μm. Las células se tiñeron con 0,1 μg/ml de naranja de acridina (Sigma, Portugal). Después de
de Streptococcus pneumoniae (Hall­Stoodley et al., 2008; Moscoso et al., 2006).
20 minutos de incubación en la oscuridad, los portaobjetos se montaron con aceite de inmersión no
Hall Stoodley et al. (2008) observaron una disminución en el espesor de la fluorescente sobre portaobjetos de vidrio para microscopio.
biopelícula superior al 85%. Nguyen y Burrows (2014) estudiaron el apego Los portaobjetos se examinaron utilizando un microscopio de epifluorescencia (LEICA DMLB2).
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144 A. Meireles et al. / Investigación de Alimentos Internacional 86 (2016) 140–146
de Listeria monocytogenes a superficies de poliestireno y verificó que la
La adición de ADNasa al comienzo de la formación de la biopelícula permitió reducir la unión
de L. monocytogenes en un 50%.
2.4. Enzimas que degradan polisacáridos
Johansen et al. (1997) probaron por primera vez la actividad de oxidor ductasas individuales
Las enzimas antibiopelículas que degradan polisacáridos están compuestas por
amilasa, alginato liasa, celulasa y lisozima (Lequette et al., 2010;
Thallinger et al., 2013). Loiselle y Anderson (2003) informaron que
la enzima celulasa inhibe la formación de biopelículas de P. aeruginosa. El efecto
de la celulasa en la descomposición del EPS se vio respaldada por la disminución de la
peso molecular aparente de estas sustancias y por el aumento de
reduciendo la producción de azúcares (Loiselle & Anderson, 2003). De hecho, la especificidad
enzimática depende del microorganismo como se demostró
por Craigen, Dashiff y Kadouri (2011). En su estudio, la α­amilasa fue
sólo es capaz de reducir la biopelícula de Staphylococcus aureus en un 79%, mientras que
no fue eficaz para eliminar las biopelículas de Staphylococcus epidermidis
(Craigen et al., 2011). Brindle, Miller y Stewart (2011) utilizaron
dispersinB ya que hidroliza la poli­N­acetilglucosamina excretada por S.
epidermidis, un polisacárido responsable de la estructura del biofilm. Este
Se aplicó enzima a 40 ppm sobre biopelículas de S. epidermidis sobre superficies de vidrio, lo
que permitió una eliminación del 40 % de la biopelícula (Brindle et al., 2011).
2.5. Enzimas proteolíticas
Una clase de enzimas proteolíticas son las proteasas. Estas enzimas fueron
Se ha demostrado que hidroliza proteínas en tuberías (Augustin et al., 2004).
Molobela et al. (2010) probaron varias enzimas y describieron Savinase®
como una de las preparaciones enzimáticas más eficaces para eliminar biopelículas de
Pseudo monas fluorescens de la lana de vidrio. Los autores también concluyeron
que es necesario tener en cuenta la composición estructural de la biopelícula
ya que encontraron que las amilasas eran menos efectivas que las proteasas en
degradar biopelículas de P. fluorescens (Molobela et al., 2010). Asimismo,
Huang et al. (2014) obtuvieron los mismos resultados, es decir, las proteasas fueron más
eficientes en la eliminación de biopelículas. De hecho, Leroy, Delbarre, Ghillebaert,
Compere y Combes (2008) utilizaron Savinase® para evitar
Pseudoalteromonassp. Adhesión y formación de biopelículas, provocando la eliminación
completa de la biopelícula. Agustín et al. (2004) utilizaron diferentes enzimas
(Pandion, Resinase, Spezyme y Paradigm, aplicados individualmente), durante 30 min, y
lograron una reducción de 4 log de la población de P. aeruginosa. Orgaz, Neufeld y SanJose
(2007) aplicaron pronasa a P.
biopelículas de fluorescens se formaron en superficies de vidrio de borosilicato y se
capaz de eliminar el 30% del biofilm.
Los bacteriófagos (o fagos) son virus que infectan bacterias y, en última instancia,
causan la lisis celular (Donlan, 2009; Fischetti, 2005). Por esta razón
también se pueden utilizar como estrategia anti­biopelículas (Sillankorva &
Azeredo, 2014; Simões et al., 2010). La lisis celular es causada por lisinas.
que son producidos por los fagos (Fischetti, 2005). Además, el
Los fagos también pueden producir polisacáridos despolimerasas que son capaces de
para alterar la matriz de EPS (Donlan, 2009; Hughes, Sutherland, Clark, &
Jones, 1998). Sharma, Ryu y Beuchat (2005) utilizaron bacteriófagos
y biopelículas reducidas de E. coli O157:H7 en 2,8 log de formación de colonias
unidades (UFC) por cupón de acero inoxidable (SS). Gutiérrez, Ruas­Madiedo,
Martínez, Rodríguez y García (2014) lograron reducir S. aureus
(aislada de un entorno alimentario) biopelícula en 1 a 3 unidades logarítmicas por pocillo
de placas de microtitulación de poliestireno usando endolisina ­ LysH5 que indujo
lisis celular (Borysowski, Weber­Dabrowska y Gorski, 2006).
Varios autores (Fischetti, 2005; Lu & Collins, 2007; Tait, Skillman, &
Sutherland, 2002) ya utilizó la biología sintética para aumentar la acción de los fagos de las
bacterias, modificándolos para producir enzimas que alteran las biopelículas. Estos
bacteriófagos pueden simultáneamente y más eficazmente
causan tanto lisis celular como alteración de la matriz (Lu & Collins, 2007). Por ejemplo, Lu y
Collins (2007) produjeron un bacteriófago que fue capaz de
producir una enzima degradante de biopelículas capaz de reducir las biopelículas de E. coli
en un 99,997%, una capacidad que era aproximadamente dos órdenes de magnitud mejor
que la del fago no enzimático.
2.6. Combinación de enzimas
El uso de combinaciones enzimáticas ya ha sido demostrado.
como una estrategia anti­biopelícula eficaz (Johansen et al., 1997; Orgaz et al.,
2007; Yamasaki, Ogura, Hashimoto, Mikami y Murata, 2005).
y enzimas hidrolizadoras de polisacáridos y encontraron un efecto bactericida y una capacidad
de eliminación de biopelículas, respectivamente. Sin embargo,
cuando se combinaron ambas enzimas, se observó simultáneamente la eliminación de
biopelículas y la inactivación celular (Johansen et al., 1997). Kim y cols.
(2013) mezclaron acilasa I (100 μg/mL) con proteinasa K (5 μg/mL) y
fueron capaces de eliminar el 33,7% de las células presentes en una ósmosis inversa
membrana. Orgaz et al. (2007) aplicaron celulasa seguida de pronasa
a biopelículas de P. fluorescens formadas en superficies de vidrio de borosilicato y
Pudieron eliminar el 94% de la biopelícula.
2.7. Combinación de enzimas con tratamientos químicos/físicos.
La combinación de enzimas con otras técnicas antimicrobianas/
También se han estudiado compuestos como ultrasonidos y biocidas.
y demostró ser más eficiente que los tratamientos individuales aplicados
solo. Oulahal, Martial­Gros, Bonneau y Blum (2007) combinaron enzimas (proteasa, tripsina,
amiloglucosidasa, papaína y lisozima)
con ultrasonidos (40 kHz durante 10 s) y un agente quelante (ácido etilendiaminotetraacético
­ EDTA) para eliminar biopelículas de las superficies de SS.
La combinación permitió una eliminación del 75% y el 100% de las biopelículas de E. coli y
S. au reus, respectivamente (Oulahal et al., 2007). Alkawash, Soothill y
Schiller (2006) logró la eliminación completa de las biopelículas de P. aeruginosa en
fibras de celulosa, al aplicarse alginato liasa y gentamicina durante 96 h.
Pechaud et al. (2012) observaron que la combinación de Savinase®
con esfuerzo cortante (2,5 Pa) promovió la eliminación de la biopelícula de P. aeruginosa mediante
90%. Mientras que solo se observó una eliminación del 20 % cuando se utilizó hipoclorito de
sodio (50 ppm) individualmente. Oulahal­Lagsir, Martial­Gros,
Bonneau y Blum (2003) utilizaron enzimas proteolíticas y ultrasonidos.
(40 kHz durante 10 s) para eliminar las biopelículas de E. coli de las superficies de SS. En eso
En el estudio, la combinación de amiloglucosidasa (50 U.mL­1 ) ejerció una acción sinérgica
al provocar la eliminación del 96% de la biopelícula (Oulahal­Lagsir et al.,
2003). Lequette et al. (2010) combinaron un tampón con un tensioactivo aniónico mezclado
con α­amilasa y biopelícula reducida de Bacillus mycoides en SS
por 2,98 log UFC/cm2 .
La figura 2 muestra la acción de eliminación de biopelículas de una mezcla de enzimas.
(Biorem 10) con tensioactivos (Biorem A1) como propone Realco (Bélgica) (Fig. 2b). Se logró
la eliminación completa de la biopelícula cuando este
El cóctel se combinó con hipoclorito de sodio (Fig. 2c).
3 Conclusiones
Las recientes mejoras en la comprensión de los mecanismos subyacentes a la formación
y resistencia de biopelículas han permitido el desarrollo de
Estrategias anti­biopelículas nuevas y más efectivas. Enfoques exitosos
debe promover tanto la muerte/inactivación microbiana como la eliminación del
biomasa adherida. Las enzimas disruptoras de biopelículas tienen la capacidad de degradar
diferentes componentes de la matriz de la biopelícula, mientras que algunas de ellas
También son capaces de interrumpir la comunicación bacteriana, afectando no sólo
desarrollo de biopelículas sino también promoviendo su erradicación. El empleo de enzimas
es ventajoso ya que no imponen una presión selectiva sobre las bacterias y tienen un estado
verde. Sin embargo, teniendo en cuenta
que la composición de la matriz del biofilm es compleja y las enzimas
tienen un carácter específico, a menudo se requiere el uso de una mezcla de enzimas. El
conocimiento actual propone claramente la aplicación de
enzimas diseñadas (usando biología sintética) y también la combinación
aplicación de enzimas con otros tratamientos antimicrobianos (químicos
y/o físicos) como enfoques valiosos para la mitigación efectiva de biopelículas.
Estos enfoques ciertamente reducirán los inconvenientes relacionados con la alta
El costo de las enzimas y los requisitos para condiciones ambientales específicas,
aumentando el interés en su uso como agentes anti­biofilm.
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A. Meireles et al. / Investigación de Alimentos Internacional 86 (2016) 140–146 145

Ambientes de procesamiento: causas, implicaciones, papel de las interacciones bacterianas y control

Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado financieramente por: Proyecto POCI­01­0145­
FEDER­006939 ­ Laboratorio de Ingeniería de Procesos, Medio Ambiente,
Biotecnología y Energía – LEPABE financiado por fondos FEDER a través
de COMPETE2020 ­ Programa Operacional Competitividade e
Internacionalização (POCI) – y por fondos nacionales a través de FCT ­
Fundação para a Ciência ea Tecnologia; Proyecto de investigación
europeo SusClean (número de contrato FP7­KBBE­2011­5, número de
proyecto: 287514); Beca de doctorado otorgada a Ana Meireles (SFRH/
BD/52624/2014) y beca de posdoctorado otorgada a Anabela Borges
(SFRH/BPD/98684/2013). Los autores también reconocen la Acción
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