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Hum Genet (2008) 123:177–187 DOI
10.1007/s00439­007­0460­x
INVESTIGACIÓN ORIGINAL
El color de ojos azules en humanos puede ser causado por una
mutación fundadora perfectamente asociada en un elemento regulador
ubicado dentro del gen HERC2 que inhibe la expresión de OCA2 .
Hans Eiberg ∙ Jesper Troelsen ∙ Mette Nielsen ∙ Annemette
Mikkelsen ∙ Jonas Mengel­From ∙ Klaus W. Kjaer ∙ Lars
Hansen
Recibido: 31 de octubre de 2007 / Aceptado: 18 de diciembre de 2007 / Publicado en línea: 3 de enero de 2008
© Springer­Verlag 2007
Resumen El color de ojos humanos es un rasgo cuantitativo que presenta
herencia multifactorial. Varios estudios han
demostrado que el locus OCA2 es el principal contribuyente a la
variación del color de los ojos humanos. Mediante análisis de vinculación de una gran
familia danesa, asignamos el lugar del color de ojos azules a un
Región de 166 Kbp dentro del gen HERC2 . Por asociación
análisis, identificamos dos SNP dentro de esta región que
estaban perfectamente asociados con los colores de ojos azules y
marrones: rs12913832 y rs1129038. De estos, rs12913832 es
ubicado 21.152 pb aguas arriba del promotor OCA2 en un
Secuencia altamente conservada en el intrón 86 de HERC2. El
El alelo de color de ojos marrón de rs12913832 está altamente conservado
en varias especies. Como lo muestra una luciferasa
Ensayos en cultivos celulares, el elemento reduce significativamente la
Actividad del promotor OCA2 y movilidad electroforética.
Los ensayos de cambio demuestran que los dos alelos se unen de manera diferente.
Material complementario electrónico La versión en línea de este artículo
(doi:10.1007/s00439­007­0460­x) contiene material complementario, que
está disponible para los usuarios autorizados.
H. Eiberg (&) ∙ J. Troelsen ∙ M. Nielsen ∙ A. Mikkelsen ∙ KW Kjaer ∙
L. Hansen
Departamento de Medicina Celular y Molecular, Sección
IV Edificio. 24.4, Instituto Panum, Universidad
de Copenhague, Blegdamsvej 3b, 2200 Copenhague,
Dinamarca
correo electrónico: he@imbg.ku.dk
J. Mengel­De
Instituto de Genética Forense, Universidad de Copenhague, Fredrik
V's vej 11, 2100 Copenhague, Dinamarca
KW Kjaer ∙ L. Hansen
Centro Wilhelm Johannsen para la Investigación del Genoma Funcional,
Departamento de Medicina Celular y Molecular, Instituto
Panum, Universidad de Copenhague, Blegdamsvej
3, 2200 Copenhague, Dinamarca
subconjuntos de extractos nucleares. Un solo haplotipo, representado por
seis SNP polimórficos que cubren la mitad de los 3 extremos.
del gen HERC2 , se encontró en 155 individuos de ojos azules de
Dinamarca, y en 5 y 2 individuos de ojos azules
de Turquía y Jordania, respectivamente. Por lo tanto, nuestros datos
sugieren una mutación fundadora común en un inhibidor de OCA2 .
elemento regulador como causa del color de ojos azules en
humanos. Además, una puntuación LOD de Z = 4,21 entre
color de cabello y D14S72 se obtuvo en la familia numerosa,
indicando que RABGGTA es un gen candidato para el cabello
color.
Introducción
La variación del color de ojos es el resultado de cantidades variables y
Distribución del pigmento melanina en el iris. En los humanos, el
La diversidad más notable del color de ojos se encuentra entre los
caucásicos. La genética del color de ojos azul/marrón es conocida por el
público como ejemplo escolar de herencia monogénica, sin embargo,
la variación en la concentración del pigmento y la distribución
de pigmento en el iris (Fig. 1) sugieren la genética del color de ojos
ser mucho más complejo como lo respaldan datos recientes (Eiberg
y Mohr 1996; Sturm et al. 2001; Zhu et al. 2004; Post­huma et al. 2006;
DuVy et al. 2007). Pérdida de pigmentación
en la piel, el cabello y los ojos, también conocido como oculocutáneo
albinismo, deriva de mutaciones en los genes OCA1­4
(Sturm et al. 2001). El locus responsable del color marrón o
Los fenotipos de color de ojos azules (MIM 227220) se identificaron por
primera vez mediante vinculación al cromosoma 15q (puntuación LOD multipunto
de Z = 32,2) en la población danesa por Eiberg y Mohr
(1996). El locus candidato se asignó a 15q12­13.
Superado por los marcadores D15S156 y D15S144 con una puntuación
LOD máxima cercana a D15S165 y OCA2 (MIM
611409) fue sugerido como gen candidato. Subse­
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Fig. 1 Fenotipos diferentes del color

de ojos. a Azul (sin marrón
zonas). b Azul con manchas marrones
(con marrón) obtuvo una
puntuación “desconocida” en los
estudios de vinculación y asociación. c Marrón–verde/
avellana (BEY1) con un anillo puri­
pupilar de tablero. d Marrón (BEY2),
pigmentación marrón total . La
persona con color de ojos azules (a)
representa el genotipo
rs12913832 G/G, mientras que las
personas b–d representan el genotipo
rs12913832 A/G.

Posteriormente, varios otros estudios de vinculación y asociación Los dromes se han asociado con el albinismo oculocutáneo.

confirmaron que el locus y OCA2 son los principales contribuyentes a
variación del color de los ojos humanos (Sturm et al. 2001; Zhu et al.
2004; Póstuma et al. 2006; Frudakis et al. 2003) y 74%
de la variación se estimó a un QTL, vinculado a OCA2
(DuVy et al. 2007).
Intentos de identificar las mutaciones BEY/blue en OCA2
han fracasado (Frudakis et al. 2007), y una variación dentro del
Se sugirió que la región de control reguladora proximal de OCA2 era
responsable del 90% de la variación de la pigmentación del color de ojos
(DuVy et al. 2007).
La función de la proteína OCA2 es ambigua (Reb­beck et al. 2002), y
se ha sugerido que es una proteína Na+ /H+.
antiportador (Ancans et al. 2001; Puri et al. 2000) o un transportador de
glutamato (Lamoreux et al. 1995). Tanto las funciones
o pigmentación reducida (Spritz et al. 1997) en varios
casos. Se desconoce la función de HERC2 pero el gen
codifica dominios proteicos funcionales conservados deferentes
involucrado en la espermatogénesis, proteólisis mediada por ubicutina
y transporte intracelular (Yonggang et al. 2000). El
El genoma humano codifica entre 3 y 12 pseudogenes HERC2 .
la mayoría ubicada en el cromosoma 15q, que tienen complicaciones
estudios de esta región.
Aquí presentamos evidencia de vinculación y asociación.
estudios que una región en HERC2 contiene un altamente conservado
elemento regulador, que es la causa del color de ojos azules
Inhumanos. La influencia de otros loci como el color del cabello, como
controlar la variación en el color de ojos marrones, son
examinado.

indican que OCA2 está involucrado en el suministro de sustratos a

una tirosinasa en la biosíntesis de melanina (Ancans et al.
2001). Alternativamente, OCA2 puede estar involucrado en el seguimiento
intracelular de la enzima tirosinasa durante la maduración del melanosoma
(Toyofuku et al. 2002).
Corriente arriba de OCA2 está el gen HERC2 (MIM 605837)
situado. Eliminaciones del exón 86–90 o del exón 53–86 en Herc2
Se ha demostrado que los ratones afectan la pigmentación del color de
los ojos y el pelaje, así como la producción de esperma, lo que conduce a
la esterilidad masculina (Lehman et al. 1998; Russel et al. 1995). Inhumanos,
Se conocen deleciones parciales del locus OCA2­HERC2 en
los síndromes de Prader­Willi y Angelman. Ambos sin­
material y métodos
Material familiar
Una familia danesa de tres generaciones (CFB#694) que representa
Se utilizaron 28 meiosis informativas para el análisis de ligamiento y
el lugar del color de ojos azules fue Wnemapeado. La familia usó
en el análisis de ligamiento, estudios de asociación y haplotipos.
eran de origen danés y recuperados del Copenhague
Banco Familiar, las familias utilizadas en este estudio (familias

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CFB#604­1505) (Eiberg et al. 1989). Sólo familias con
hermanos, que tenían ojos azules y marrones, respectivamente, eran
incluidos en el estudio. Los padres y hermanos estaban clasificados como
de ojos azules (Fig. 1a) o de ojos marrones (Fig. 1c o d).
individuos. Los haplotipos se construyeron a partir de 100 daneses.
Se seleccionaron tríos de familias informativos, y la mayoría de estos
padres también se incluyeron en los estudios de asociación. Estos
100 triosis representaron 45 familias donde al menos un individuo tenía
ojos marrones y 55 familias donde todos los individuos tenían ojos azules.
Familias donde el ojo verde y el marrón
No se utilizaron manchas de color segregadas. Los haplotipos fueron
deducida manualmente del estudio familiar. Se recolectó material de
control adicional para la secuenciación de ADN de dos
familias numerosas danesas del Copenhagen Family Bank.
Cinco individuos de Turquía con ojos azules, cabello negro y
piel clara y dos individuos de Jordania con ojos azules,
pelo negro y piel oscura fueron incluidos en la asociación
análisis. Además, se examinaron dos personas con heterocromía natal.
El fenotipo del color de ojos azules se describió como un completo
falta de pigmentación marrón (Fig. 1a), se describió un fenotipo intermedio
como “ojo azul con puntos soplados” (Fig. 1b),
un fenotipo de color de ojos marrón intermedio se describió como
avellana con un amplio anillo peripupilar y fue nombrado el
El fenotipo BEY1 (Fig. 1c) y un color de ojos completamente pigmentado
de color marrón se definieron como el fenotipo BEY2.
(Figura 1d).
Todos los individuos en el estudio fueron entrevistados mediante
cuestionarios y se les pidió que determinaran su propio color de ojos a partir de Se seleccionaron el fenotipo BEY2, respectivamente, (Fig. 1c, d).
las categorías: marrón, azul, gris y verde, y si
Había manchas marrones o anillos peripupilares marrones.
Los colores del cabello se clasificaron en rojo, negro, marrón y
cabello rubio en el momento en que las personas tenían entre 20 y
y 30 años de edad. En la familia CFB#694, el color de ojos de
todos los individuos fueron documentados con fotografías y todas las
personas clave fueron reexaminadas. Todos los individuos con ojos verdes.
color o color de ojos azul o gris con manchas marrones no localizadas
cercanos al alumno fueron excluidos de los estudios de vinculación y
asociación. El ADN genómico se extrajo de
sangre completa usando procedimientos estándar de fenol/cloroformo
y el estudio se adhirió a los principios de la declaración de
Helsinki.
Estudios de asociación
La búsqueda en la base de datos reveló que la mayoría de los SNP en
HERC2 muestra bajas frecuencias [q < 0,1, UCSC Human
Genome Browser (julio de 2003) y GenBank dbSNP] y
no fueron incluidos en el estudio de asociación debido a la falta de
información potente. Muchos de los »2.000 SNP reportados en
HERC2 puede explicarse por variaciones de un solo par de bases
entre HERC2 y los pseudogenes HERC2 . Después
exclusión de SNP redundantes, pudimos identificar 15
179
SNP polimórficos (Tabla complementaria 1) que fueron
utilizado para análisis de asociación y construcción de haplotipos.
(Tablas 1, 2). Se utilizó la prueba exacta de Fisher para probar
distribuciones significativas de genotipo­fenotipo.
Análisis de ligamiento y construcción de haplotipos.
La región candidata OCA2­HERC2­APBA2 para BEY1
Se mapeó el locus (Eiberg y Mohr 1996) y se construyeron haplotipos
utilizando los siguientes marcadores STS
y SNP: D15S1002, D15S156, D15S1533, rs4074658,
rs1129038, rs10680280, rs3054537, rs10627597 y
D15S1048 (Figura 2). Los SNP se analizaron mediante ADN directo.
secuenciación o digestiones de enzimas de restricción (cebador de PCR
Las secuencias están disponibles en la Tabla 1 complementaria). Se
probaron marcadores adicionales y se encontró que no eran informativos en
las familias analizadas (datos no mostrados). Los cálculos de la puntuación
LOD se realizaron utilizando FASTLINK (SchäVer et al. 1994)
y el color de ojos marrones se consideraba un rasgo dominante
el color de ojos azules. Los familiares del CFG#694 fueron
previamente genotipado con más de 400 marcadores (Eiberg
y Mohr 1996).
secuencia ADN
Cuatro individuos no relacionados que representan el color de ojos azules.
fenotipo (Fig. 1a), el fenotipo variante BEY1 con
varias manchas marrones (Fig. 1b), el BEY1 (Fig. 1c) y el
para la identificación de posiciones de nucleótidos polimórficos en el
Región candidata a BEY mediante análisis de secuencia de ADN. El
Tres personas con diferentes fenotipos de color de ojos marrones.
fueron seleccionados de familias, donde puntuaciones LOD superiores a
Z = 2,5 para los marcadores D15S1533 y rs10680280 en el
Se logró la región candidata a BEY. El promotor OCA2
(Lee et al. 1995) y exón 1, 2, 7 y 10 y exón HERC2
21, 26, 30, 33, 39, 44–47, 51, 52, 54, 55, 59, 72, 76–78, 85,
87–93, incluida la secuencia 3UTR, se secuenciaron bidireccionalmente.
Las regiones secuenciadas representaron exones codificantes,
incluidos SNP no sinónimos, islas CpG y regiones que codifican dominios
de zinc Wnger o áreas filogenéticamente conservadas.
ubicado en intrones de OCA2 y HERC2 según el
Navegador del genoma UCSC (posiciones de cebador y físico)
Las posiciones se dan en la Tabla complementaria 2). Los oligonucleótidos
se diseñaron utilizando el software Primer3 en combinación con
alineamientos de ClustalW para la identificación de
secuencias de cebadores únicas. Incluye amplificación por PCR de exones
mínimo 100 pb del sitio de empalme intrón­exón. las cartillas
utilizado para análisis de secuencia de posiciones polimórficas en
HERC2 se presentan en la Tabla 2 complementaria.
La PCR se llevó a cabo utilizando condiciones estándar de acuerdo
con los protocolos del fabricante, Taq ADN polimerasas.
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Tabla 1 Asociación de 12 SNP en el locus OCA2­HERC2­APBA2

OCA2 rs4778190 (int24) rs1800401 (ex9) rs4778241 (int1)

Automóvil club británico EN TT GG Georgia Automóvil club británico CC California Automóvil club británico

Sin marrón/azul 10 6 3 91 6 0 59 3 0
Con marrón 15 13 2 35 4 0 15 30 0
P = 0,48 P = 0,47 P = 3,13e–12

HERC2 rs1129038 (3UTR) rs12913832 (int86) rs3935591 (int83)

Automóvil club británico AG GG GG AG Automóvil club británico GG AG Automóvil club británico

Sin marrón/azul 150 0 0 150 0 0 150 0 0

Con marrón 0 46 0 0 46 0 15 31 0
P = 6,12e–46 P = 6,12e–46 P = 1,5e–25

HERC2 rs11636232 (ex78) rs7170852 (int56) rs2238289 (int44)

CC TC TT Automóvil club británico EN TT TT TC CC

Sin marrón/azul 12 20 8 147 3 0 150 0 0
Con marrón 15 14 0 19 27 0 18 28 0
P = 0,012 P = 1,1e–17 P = 4,2e–22

HERC2/APBA2 rs2240203 (int20) rs916977 (int12) rs2279483 (APBA2,int10)

Automóvil club británico AG GG GG AG Automóvil club británico Automóvil club británico AG GG

Sin marrón/azul 149 1 0 145 5 0 55 18 2
Con marrón 36 29 0 15 30 0 28 4 0
P = 8,9e–17 P = 3,9e–19 P = 0,31

Las muestras de ADN representan 150 padres daneses de ojos azules y 46 de ojos marrones recuperadas del Copenhagen Family Bank (CFB). Los valores de p fueron
calculado utilizando la prueba exacta de Fisher

Tabla 2 Haplotipos para 13 SNP diferentes en OCA2 y HERC2 encontrados mediante el examen de 100 tríadas familiares

fenotipo Azul Marrón

haplotipo h­1 h­2 h­3 h­4 h­5 h­6 h­7 h­8 h­9 h­10

rs4778241­OCA2b C (A3 ) C C C C (A2 ) AAA (C1 ) A A

rs1129038c A q AA G GGG GG
rs12593929 A A A A A A A A GRAMO GRAMO

rs12913832c G GGG A AAAAA

rs7183877 C C C C C C C un aa
rs3935591 GRAMO GRAMO GRAMO GRAMO GAAAAAA _

rs7170852 A A T AA AA T A t
rs2238289 t t t t t t t C.C.C.
rs3940272 C C C C C C C un aa
rs8028689 t t t t t t t t C C
rs2240203 A A A GRAMO AAAG _ GRAMO

rs11631797 GRAMO GRAMO GRAMO A GGGAAAA _

rs916977 GRAMO A GRAMO A GRAMO G AA AA

Número 345 5 4 1 14 1 3 19 1 7
Numero total 355 45

En las 100 familias sólo se analizaron el padre y la madre. Las familias fueron recuperadas del Copenhagen Family Bank1
a
Los haplotipos #1 a #4 representan individuos con color de ojos azules; Los haplotipos #5 a #10 representan individuos con color de ojos marrones (BEY1 o BEY2)
b
Los valores en cursiva (alelos y números entre paréntesis) representan posibles nuevas mutaciones o recombinantes.
C
Las variaciones en rs1129038 y rs12913832 son comunes en caucásicos y muy raras entre otros grupos étnicos (dbSNP, GenBank, NCBI)

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Fig. 2 Pedigrí de tres generaciones
de la familia 694 segregada por el
color de ojos marrones. Los fenotipos
del iris se definen como azul
(símbolos cuadrado abierto, círculo
abierto), BEY1 es un área amplia de
color marrón alrededor de la pupila
(anillo peripupilar, símbolos cuadrado
abierto, círculo abierto) y color
de ojos marrón completo BEY2
(símbolos cuadrado abierto, círculo
abierto). círculo ). El fenotipo BEY2
era más oscuro en un anillo peripupilar.
fueron adquiridos en Qiagen (Hilden, Alemania), nuevos
England Biolabs (Ipswich, MA, EE. UU.) y Applied Bio­system Industries
(Foster City, CA, EE. UU.). Las reacciones fueron
realizado en volúmenes de 15 l que contienen el buVer, 2,5 M
dNTP, 10 M de cada cebador, rojo cresol al 0,008% (Sigma­
Aldrich Co., St Louis, EE. UU.), 12 % de sacarosa (p/v) y 50–
100 ng de plantillas de ADN. Condiciones de reacción estándar para todos.
los pares de cebadores fueron: 95°C, 5 min; 40 ciclos 95°C durante 30 s,
56,4°C durante 30 s y 72°C durante 1 min; seguido de 5 min en
72°C. Las reacciones de PCR se analizaron mediante electroforesis en gel
de agarosa al 2% teñida con bromuro de etidio, 1£ de TBE,
antes de la secuenciación. La secuenciación se realizó según
al protocolo del fabricante utilizando los cebadores de PCR y
BigDye versión 1.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA,
EE.UU.) sin mayores modificaciones y analizado mediante un
Secuenciador ABI370. Los datos de secuencia se analizaron utilizando
software estándar (Chromas ver. 2.1, Technelysium Pty
Ltd, Australia) y se llevaron a cabo alineamientos de secuencias
utilizando ClustalW. Las digestiones con enzimas de restricción de los
productos de PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%, 1 £cagaacttgacatttaatgctcaaatg;
TBE.
Ensayo de actividad promotora en cultivo celular.
La región promotora OCA2 humana posición +80 a ¡435
Se amplificó por PCR utilizando ADN genómico de un animal de ojos marrones.
individuo homocigoto usando el cebador HindIII y KpnI
par (Tabla complementaria 2). El producto de la PCR se subclonó en pCR2.1­
TOPO y se confirmó mediante secuenciación.
El fragmento del promotor HindIII/KpnI OCA2 se subclonó adicionalmente en
el plásmido indicador de luciferasa pGL4.10 generando el plásmido pGL4
OCA2. La región en el intrón HERC2
86 ubicado en la posición ¡20.708 a ¡21.383 aguas arriba de
181
El sitio de inicio de la transcripción de OCA2 se amplificó por PCR utilizando
el BamHI que contiene un par de cebadores y ADN genómico de
una persona de ojos azules (el alelo G de rs12913832) y de
una persona de ojos marrones (BEY2) (el alelo A de rs12913832)
(Tabla complementaria 2). Los fragmentos de PCR de 675 pb fueron
clonado en pCR2.1­TOPO y secuenciado antes de la subclonación
en pGL4 OCA2 usando el sitio de restricción BamHI aguas arriba
del promotor OCA2 . Los dos plásmidos se denominaron pGL4.
OCA2­HERC2­azul y pGL4 OCA2­HERC2­marrón. El
actividad transcripcional del plásmido pGL4 OCA2, pGL4
OCA2­HERC2­azul y pGL4 OCA2­HERC2­marrón fueron
analizado mediante transfección en células Caco­2 y COS7 (Reme­nyi et al.
2004; Troelsen et al. 2003b), y la luciferasa
las actividades se corrigieron para la eficiencia de transfección y se
normalizaron al nivel de pGL4 OCA2.
La preparación de extractos nucleares y EMSA se realizó como se
describió anteriormente (Troelsen et al. 2003a). El
En el ensayo se utilizan los siguientes oligonucleótidos:
Variante A: tcatttgagcattaaatgtcaagttctgcacgc y agcgtg
Variante G: tcatttgagcattaagtgtcaagttctgcacgc y agcgtg
cagaacttgacacttaatgctcaaatg
Sin especificar: aacgtagctgatcgaatcggttac y agtaaccgattcg
atcagctacgt
Resultados
Los fenotipos de color de ojos marrón (BEY2) y avellana (BEY1) se segregan
en la familia danesa CFB#694 (Fig. 2).
El análisis de vinculación dio como resultado una puntuación LOD de Z = 6,30
( = 0) para el marcador rs10680280 cuando se segrega el
Se consideró el fenotipo BEY2 y se obtuvo una puntuación LOD de
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182 Hum Genet (2008) 123:177–187

Z = 8,10 ( = 0) cuando los fenotipos BEY2 y BEY1
fueron considerados como un fenotipo. Se construyeron haplotipos para
cinco microsatélites y cuatro SNP y se revelaron
dos eventos de recombinación clave en los individuos II­3 y III­4,
respectivamente. Esto redujo la región candidata a
estar entre rs4074658 y rs10602331 (Figs. 2, 3a).
Estudios de asociación
El alelo rs4778241*A para el haplotipo 1 encontrado en tres
personas podría ser una mutación posterior o un evento de recombinación,
ya que este marcador está cerca de rs4074658. No tenemos
examinó más a fondo esta recombinación. El haplotipo h­1 fue
encontrado como el haplotipo común entre las personas de ojos azules
de Dinamarca y el haplotipo se encontró además en
siete individuos no relacionados con el fenotipo de ojos azules
de Turquía o Jordania y en dos personas con heterocromía natal.

La distribución de alelos SNP en la región candidata fue

estudiado en 155 individuos no relacionados de ojos azules y 45 de ojos
marrones (Tabla 1). Se encontró una asociación completa para el
alelos rs1129038*A y rs12913832*G (valor P 6,12 e­46) con fenotipo de
ojo azul y estos dos SNP candidatos
Se encontró que los alelos estaban en posición cis (Tabla 1).
El estudio del haplotipo
Los haplotipos que utilizan 13 SNP en el locus OCA2­HERC2 fueron
asociado con el color de ojos marrón y azul en 200 padres
de 100 tríos. Se encontraron diez haplotipos diferentes donde
los haplotipos h­1 a h­4 representaron el color de ojos azules y
los haplotipos h­5 a h­10 representaron el color de ojos marrones
fenotipos BEY1 y BEY2 (Tabla 2).
Se observó un evento de recombinación entre
rs8028689 y rs2240203 en una familia portadora de haplotipo
h­4. Esta recombinación podría minimizar al candidato BEY
región a un fragmento de 166 Kbp entre los SNP rs4074658
(Fig. 3a) y rs2240203, que cubre la región desde
OCA2 intrón 1 al intrón 20 de HERC2 (Tabla 2; Fig. 3b).
secuencia ADN
Los siguientes exones HERC2 21, 26, 30, 33, 39, 44–47, 51,
52, 54, 55, 59, 72, 76–78, 85, 87–93 incluyendo 3UTR y
el exón 1, 2, 7 y 10 de OCA2 y el promotor OCA2 fueron
secuenciado sin detectar ninguna variación causante del ADN
en las regiones codificantes, las regiones de empalme de intrones y las
Región promotora de OCA2 . Análisis de secuencia de las regiones
correspondientes en el ADN genómico de las dos personas.
con heterocromía mostró que tanto las personas portadoras
el haplotipo azul h­1.
Análisis funcional de rs12913832.
Para dilucidar posibles efectos regulatorios de los dos alelos de
rs12923832, se inició un estudio funcional en cultivos celulares. El
fragmento de 676 pb del intrón 86 de HERC2 que contiene
la variación de ADN fue subclonada junto con un 514 pb
fragmento de elementos promotores OCA2 humanos en el vector
pGL4.10. Los análisis de matrices de expresión genética indicaron que

Fig. 3 El mapa genético y físico

del locus del color del ojo
humano. El mapa del cromosoma
15q13.1 cubre el mapa físico
desde las posiciones 25,3 a 26,8
Mbp e incluye espacios en la
secuencia de ADN, genes y SNP. el gris
las barras muestran las áreas candidatas

encontradas mediante los estudios de

ligamiento (a), el estudio de asociación y
el análisis de tipo haplo (b) y las
eliminaciones reportadas en ratones (c)

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Hum Genet (2008) 123:177–187
Las células Caco2 expresan ARNm de OCA2 en su estado diferenciado (http://
gastro.imbg.ku.dk/chipchip/, término de búsqueda = OCA2), por lo tanto,
transfectamos la línea celular de carcinoma de colon humano Caco2 y
también la línea celular COS7 de Wbroblast de riñón transformada con African
Green Monkey SV40 con las construcciones del promotor OCA2 (Fig. 4a).
Ambas líneas celulares pudieron iniciar la expresión del gen indicador a partir
del promotor OCA2 . El promotor OCA2 era aproximadamente 10 veces más
activo en las células Caco2 en comparación con las células COS7. El
fragmento HERC2 de 676 pb que incluye rs12913832 redujo la expresión del
gen indicador de luciferasa en un 60­70% tanto en células Caco­2 como en
células COS7. En las células Caco2, se observó una diferencia significativa en
la actividad represora entre el alelo A (marrón) y el G (azul) (P <0,05 Fig. 4a).
Estos resultados sugieren un elemento regulador conservado en la secuencia
del intrón 86 que actúa como silenciador transcripcional con poder regulador
genético en células de carcinoma de colon que podría ser el mismo en los
melanocitos.
Se realizó un análisis de ensayo de cambio de movilidad electroforética de
oligonucleótidos bicatenarios que portan el alelo rs12913832*A o *G utilizando
extracto nuclear de células Caco2 diferenciadas para investigar las interacciones
de proteínas con la región rs12913832 (Fig. 4b) . Se formaron tres complejos
específicos de proteína/ADN (Sc1, Sc2, Sc3 en la Fig. 4b) con la sonda del
alelo A (carril 1), ya que estos complejos pueden competir con el exceso de
alelo A no marcado y G­. oligonucleótidos alelos pero no por un oligonucleótido
no específico (carriles 2, 3 y 4). Se obtuvo un resultado similar utilizando el
alelo G como sonda (carriles 5­6); sin embargo, el patrón de unión fue
diferente entre las dos variantes, lo que indica una
Fig. 4 Estudios funcionales de la regulación del promotor OCA2 en cultivos de
células COS7 y Caco2. a Las secuencias del promotor OCA2 y del intrón HERC2
de individuos de ojos azules y marrones se insertaron en un plásmido del gen
indicador de borrado de lucif (pGL4.10) y se transfectaron en células COS7 o
Caco2. Las actividades de luciferasa medidas se corrigieron para determinar la
eficiencia de transfección y se normalizaron con respecto a la expresión de pGL4­
OCA2 en células COS7, N = 4. Los valores de P se calcularon con la prueba T de Student.
183
Unión diferencial de factores nucleares a las dos variantes.
Especialmente el complejo Sc3 es más pronunciado usando la sonda del alelo
G en comparación con la sonda del alelo A.
Asociaciones del color de ojos con el color de cabello.
La investigación del color de cabello rubio versus oscuro en la familia CFG#694
demostró una asociación del cabello rubio con el fenotipo BEY1 y una
asociación del color de cabello oscuro con el fenotipo BEY2 (P = 0,0056, Tabla
3). Al analizar el material total, los SNP rs12593529*G y rs7495174*A se
asociaron con el fenotipo BEY2 (Tabla 3). Un estudio de vinculación en esta
familia que utilizó más de 400 marcadores versus color de cabello oscuro o
rubio dio como resultado una puntuación LOD de Z = 4,21 con = 0,0 para el
marcador D14S72, que está cerca de
un gen posiblemente candidato RABGGTA, para el color del cabello (número
de acceso Gen­Bank NM_182836).
Discusión
El color de ojos azul/marrón está vinculado a una región de 166 Kbp
Los genes que controlan la variación fenotípica del color de ojos desde el color
de ojos marrón total versus el color de ojos azul se asignaron previamente al
cromosoma 15q mediante una exploración completa del genoma de cinco
familias danesas informativas. La exploración de todo el genoma se amplió
mediante un análisis de vinculación multipunto de 40 familias danesas
adicionales y dio como resultado una puntuación LOD de
Z = 32,2 (Eiberg y Mohr 1996) y excluyó todos los demás
b El ensayo de cambio de movilidad electroforética del elemento conservado
demostró la unión de los factores nucleares de las células Caco2 tanto al alelo A
(ojo marrón) como al alelo G (ojo azul). Se añadieron oligonucleótidos no
marcados para demostrar la unión específica a ambas variantes. Los complejos
específicos se indican mediante Sc1­3. Nosotros indicamos un complejo
inespecífico.
123
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184 Hum Genet (2008) 123:177–187

Tabla 3 Asociación entre 5 SNP y los dos fenotipos de ojo marrón BEY1 y BEY2

SNP Genotipo Número de individuos Fenotipo Prueba exacta de Fisher

bey1 bey2

rs1800401 G,G 8 (17) 24 (73) P = 0,19

OCA2 (ex9) GEORGIA 2 (2) 1 (2) (P = 0,28)
P total = 0,06

rs4778137 C,C 4 (5) 8 (28) P = 0,41

OCA2 (int1) CALIFORNIA 6 (14) 17 (47) (P = 0,27)
P total = 0,33

rs7495174 AUTOMÓVIL CLUB BRITÁNICO 0 (0) 6 (16) P = 0,10

OCA2 (int1) A,G 10 (19) 18 (58) (P = 0,018)
P total = 0,0018

rs12593529 HERC2 (int90) GEORGIA 0 (0) 7 (17) P = 0,071

Haplotipo­10 AUTOMÓVIL CLUB BRITÁNICO 10 (19) 18 (58) (P = 0,014)
P total = 0,0011

rs3935591 A,G 6 (14) 14 (40) P = 0,72

HERC2 (int83) G,G 4 (5) 11 (35) (P = 0,07)
P total = 0,06

Color de cabello en la familia CFB#694 Rubio 10 0 P = 0,00056

Marrón 1 6

El número de individuos para los dos fenotipos BEY1 y BEY2 representa personas normales no relacionadas y el número entre paréntesis representa el
Número de niños hasta los primeros 4 años con ojos marrones. Las asociaciones más significativas para BEY1 y BEY2 se encuentran en rs12593529 y el color del cabello en
familia CFB#694
Los valores de p se calcularon utilizando la prueba exacta de Fisher.

loci potenciales para el fenotipo de color de ojos azul/marrón. El
El locus candidato se asignó a 15q12­13 Xanked por el
marcadores D15S156 y D15S144 con un Zmax cercano a
marcador D15S165. Este locus incluía el gen OCA2 ,
que fue propuesto como el gen candidato para el BEY2
fenotipo.
En este estudio, hemos minimizado la región candidata para
pigmentación del iris marrón/azul mediante análisis de ligamiento a 1,1 Mb
intervalo Xanked por los marcadores rs4074658 y rs10602331
y luego a un fragmento de 166 Kbp Xanked por los SNP
rs4074658 y rs2240203 por construcción de haplotipos dentro
los tríos investigados. Este fragmento incluye el OCA2.
intrón 1 y el promotor OCA2 y la región intergénica
más el tercer extremo de HERC2 hasta el intrón 20 (Tabla 1; Fig. 3b).
Un haplotipo compartido entre individuos de ojos azules es casi perfecto
y sugiere que el fenotipo del color de ojos azules es causado por una
mutación fundadora.
Más del 97% de las personas de ojos azules analizadas portaban el
haplotipo h­1 y el 3% restante portaba el haplotipo h­1.
rs12913832 se encuentra dentro de un elemento regulador
que inhibe la expresión de OCA2
Nuestro estudio de asociación sugiere tanto rs1129038*A como
rs12913832*G como mutaciones candidatas preferibles responsables del
fenotipo de color de ojos azules. La fuerte conservación entre especies
propone la región del ADN donde
rs12913832*G está ubicado para tener importantes funciones regulatorias.
Esto está respaldado por el potencial regulatorio de ESPERR.
presentado por el navegador del genoma UCSC (Fig. 5a). Nosotros
mostró que una secuencia de 676 pb, que representa el HERC2
intrón 86 que alberga rs12923832, redujo la expresión de
el gen indicador de luciferasa 60­70% ambos en células Caco­2
y células COS7, cuando estaba bajo el control del promotor OCA2 (Fig.
4a). Estos resultados apoyan una función reguladora.
de OCA2 para este elemento y esta función reguladora se conserva entre
especies (Tabla 4). El rs1129038*A y
Los alelos rs12913832*G demostraron diferentes regulaciones.
Efectos sobre la actividad del promotor OCA2 en células Caco2, y
esto está respaldado por el estudio de EMSA donde diferentes enlaces
AYnidades de los factores nucleares Caco2 con el azul y el marrón.

haplotipos h­2, h­3 y h­4 (Tabla 2). El origen de estos
tres haplotipos podrían explicarse por recombinación
eventos o mutaciones de menor edad que la mutación original. Siete
individuos no emparentados de origen mediterráneo
con ojos azules portaba el haplotipo h­1 en ambos cromosomas, lo que
sugiere que este haplotipo es idéntico para el azul
individuos oculares en otras poblaciones humanas.
Se mostraron los alelos. Esto infiere que los dos alelos tienen
diferentes actividades reguladoras de genes in vivo para los dos alelos;
sin embargo, dadas las grandes diferencias en el OCA2 observado
actividad en dos tipos de células utilizadas en el estudio, esto habría
destinado a experimentos con melanocitos humanos.
La búsqueda del posible elemento regulador en la secuencia
conservada reveló la unión transcripcional

123
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Hum Genet (2008) 123:177–187 185

Fig. 5 Presentación gráfica de la región altamente conservada del intrón 86 de
HERC2 . a La curva superior muestra los potenciales reguladores de ESPERR y
la parte inferior muestra el área de conservación entre especies (adaptado de
UCSC Human Genome Browser). Tres SNP diferentes están representados en la
región, pero solo el alelo rs12913832*G está 100% asociado con el alelo azul (P =
0,792 en el material CEPH de
el navegador del genoma UCSC y HapMap CEU). b Un modelo hipotético para el
complejo silenciador­promotor (T) para la regulación de la actividad del gen OCA2 .
El alelo rs12593929*G en el intrón 90 está asociado con el fenotipo BEY2 (Tabla
4) y puede interferir con la actividad del complejo de unión.

Tabla 4 Conservación de la secuencia del silenciador del color de ojos en el intrón 86 de HERC2 en 9 especies diferentes

Las secuencias de ADN de las 9 especies provienen del navegador del genoma de la UCSC (mayo de 2006). Las secuencias sombreadas en gris representan la región
del sitio de unión y el nucleótido G o A en negrita en el área gris representa la variación encontrada entre el color de ojos azul y marrón. Nkx­2.5 coincide con la secuencia
azul (puntuación 0,99) y CdxX­1 coincide con las secuencias marrón (puntuación 0,92) y azul (puntuación 0,87) analizadas por TFSEARCH

secuencia TAAATGTCAA (coincidencia 0.92, el alelo A (TAAGTGTCAA, coincidencia 0,98, el alelo G está en negrita).
rs12923832 está en negrita) para el factor de transcripción del Dado que Cdx­1 y Nkx­2.5 se expresan en el intestino y el
homeodominio Cdx­1, y el alelo G correspondiente da como corazón, respectivamente, no es probable que participen en el
resultado una unión rápida al factor de transcripción del homeodominio
desarrollo
Nkx­2.5 y la regulación de los melanocitos del iris. Este

123
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186
indica que los melanocitos del iris expresan otros factores de transcripción
de homeodominio implicados en la actividad reguladora de la región
conservada rs12923832. Estas diferencias en la afinidad de unión al factor
nuclear mediante un cambio de G a A en la secuencia de reconocimiento
pueden explicar por qué el complejo silenciador­promotor implicado en la
regulación del gen OCA2 puede cambiar la conformación y, por tanto, la
actividad (Heinemeyer et al. 1998 ; Carter et al. 1998 ). otros 2002).
El alelo SNP rs12593529*G asociado con BEY2
El fenotipo (Tabla 3) se encuentra en el intrón 90 de HERC2 entre el
promotor OCA2 y rs12923832 (Fig. 5b). Este SNP puede tener un efecto
estabilizador o desestabilizador sobre el complejo silenciador­promotor
OCA2 propuesto . Curiosamente, el rs7495174*A en el intrón 1 de OCA2
se asoció con rs12593529*G (Tabla 3) y sugiere un haplotipo común para
aproximadamente el 30 % de los individuos con fenotipo BEY2.
DiVerentes fenotipos de color de ojos marrones
Se encuentra que el SNP rs12913832 está asociado con el
color de ojos marrones y azules, pero esta única variación de ADN no
puede explicar toda la variación del color de ojos marrones, desde marrón
oscuro sobre avellana hasta ojos azules con manchas marrones.
Todos los individuos portadores de los fenotipos BEY1 y BEY2 en la
familia CFG#694 (Fig. 2) compartieron los mismos dos haplotipos h­5 y
h­1. Además, todos los individuos de ojos marrones compartieron una
región de 7,6 Mbp que incluye toda la región codificante de OCA2 desde
D15S113 a D15S144 (chr15: 23,8–31,4 Mbp) pero excluye cualquier
secuencia reguladora ubicada en el exón 1 de OCA2 y la región promotora
aguas arriba para el Variaciones de color de ojos marrones y cabello
castaño en esta familia. Un estudio reciente de DuVy et al. (2007)
mostraron una asociación del 90 % con los tres alelos SNP (TGT) en el
intrón 1 de OCA2 para el color de ojos azules humanos. Esta región puede
tener una función reguladora en la variación del color de ojos marrones,
pero es más probable que el haplotipo TGT para estos SNP esté asociado
con el haplotipo h­1 identificado para el gen HERC2 encontrado en este
estudio.
Sin embargo, nuestros datos para la familia CFB#694 no estaban de
acuerdo con las variaciones marrones controladas por los alelos en el
intrón 1 de OCA2 , ya que las personas que tienen diferentes fenotipos de
ojos marrones portan haplotipos OCA2­HERC2 idénticos.
Los estudios de los fenotipos BEY1 y BEY2 mostraron asociación entre
el cabello rubio y BEY1 y asociación
entre el color de cabello oscuro y BEY2 (P = 0,0056, Tabla 3).
RABGGTA en el cromosoma 14 es el gen candidato más cercano a
D14S72 (una puntuación LOD z = 4,21 para = 0,0) y este gen puede
moderar el fenotipo de ojo marrón en la familia CFG#694, como se muestra
en la Tabla 3. Se sabe que resulta en una mutación en el gen RABGGTA
en el albinismo en ratones (Novak et al. 1995).
123
Hum Genet (2008) 123:177–187
Se ha descrito la asociación o vinculación entre BEY2 y /HCL3 (color
de cabello castaño) (Eiberg y Mohr 1996; DuVy et al. 2007), pero los
resultados apuntan hacia otros loci no vinculados a OCA2­HERC2 (DuVy
et al. 2007). Los candidatos para estos loci son MATP y MC1R , donde
se asocian
Se ha encontrado una relación con el color del cabello humano (Remenyi et al.
2004). Curiosamente, también los fenotipos BEY2 muestran asociación
con rs7495174*A (P = 0,0018) y rs12593529*G (P = 0,0010) en los loci
OCA2­HERC2 (Tabla 3), lo que sugiere fuertemente que la variación del
ADN en esta región está asociada con el fenotipo BEY2 (Eiberg y Mohr
1996).
El origen de la mutación fundadora.
Las mutaciones responsables del color de ojos azules probablemente se
originan en la zona más cercana o en la parte noroeste de la región del
Mar Negro, donde tuvo lugar la gran migración agrícola hacia la parte norte
de Europa en el Neolítico, hace unos 6 a 10.000 años (Cavalli­ Sforza y
otros 1994).
La alta frecuencia de individuos de ojos azules en las zonas
escandinavas y bálticas indica una selección positiva para este fenotipo
(Cavalli­Sforza et al. 1994; Myant et al.
1997). Se han sugerido varias teorías para explicar la selección evolutiva
de los rasgos de pigmentación que incluyen la exposición a los rayos UV
que causa cáncer de piel, la deficiencia de vitamina D y también se ha
mencionado la selección sexual. La selección natural, como se sugiere
aquí, hace difícil calcular la edad de la mutación.
Conclusión
En conclusión, hemos identificado un elemento regulador conservado
dentro del intrón 86 del gen HERC2 que está perfectamente asociado con
el color de ojos marrón/azul en individuos estudiados de Dinamarca,
Turquía y Jordania. Este elemento tuvo un efecto inhibidor sobre la
actividad del promotor OCA2 en cultivos celulares, y se demostró que los
alelos azul y marrón se unen a subconjuntos no idénticos de extractos
nucleares. En total, todos estos datos respaldan firmemente un modelo en
el que el color de ojos azules en los seres humanos es causado por la
homocigosidad del alelo rs12913832*G.
Recursos web
Los números de acceso y las URL de los datos presentados en este documento
son los siguientes:
AceView NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Acembly/
index.html (para información funcional de OCA2 y HERC2)
Machine Translated by Google
Hum Genet (2008) 123:177–187
ClustalW, http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ (para alineación de
secuencias)
Prueba exacta de Fisher, http://home.clara.net/sisa/Wsher.htm
(prueba de distribuciones significativas de genotipo­fenotipo)
GenBank dbSNP, http://genome.ucsc.edu/cgi­bin/hgGateway
(para el contig genómico del cromosoma 15 de Homo sapiens
[número de evaluación NT_010280]) OCA2 (NM_000275), HERC2
(NM_004667)
SNP de HapMap, http://genome.cse.ucsc.edu/cgi­bin/
hgPistas (para SNP en los genes OCA2 y HERC2 )
Herencia mendeliana en el hombre en línea (OMIM), http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/Omin/ (para OCA2 y HERC2).
Primer3 , http://frodo.wi.mit.edu/cgi­bin/primer3/primer3_www.cgi
(para construcción de imprimación)
TFSEARCH, http://www.cbrc.jp/research/db/TFS EARCH.html
(para determinar los sitios de unión de un factor de transcripción a
una secuencia de ADN específica)
La base de datos de objetivos del factor de transcripción intestinal
http://gastro.imbg.ku.dk/chipchip/, término de búsqueda = OCA2
UCSC Human Genome Browser (julio de 2003 y mayo de 2006)
http://genome.cse.ucsc.edu/cgi­bin/hgGateway?org= human (para
detecciones de SNP, regiones conservadas, exones­intrones en
OCA2, gen HERC2 y cromosoma 15).
Agradecimientos Nos gustaría agradecer a Karin U. Hansen por su asistencia
técnica. El proyecto contó con el apoyo financiero de la Fundación Danesa de
Investigación (JN 22­02­0208). El Centro Wilhelm Johannsen es establecido
por el Centro Nacional de Investigación Danés.
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