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MANUAL TÉCNICO

ADN genómico Wizard®

Kit de purificación

Instrucciones de uso de los productos

A1120, A1123, A1125 y A1620

Revisado el 23/10
TM050
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Kit de purificación de ADN genómico Wizard®

Toda la literatura técnica está disponible en: [Link]/protocols/ Visite el sitio
web para verificar que está utilizando la versión más actualizada de este Manual técnico.
Envíe un correo electrónico a Servicios Técnicos de Promega si tiene preguntas sobre el uso de este sistema: techserv@[Link]

1. Descripción............................................... ................................................. ..........................................1

2. Componentes del producto y condiciones de almacenamiento ................................. ................................................. .2

3. Protocolos para el aislamiento de ADN genómico ................................................. ................................................. ............4

3.A. Aislamiento de ADN genómico de sangre entera (volumen de muestra de 300 µl o 3 ml) ................................. ..........4
3.B. Aislamiento de ADN genómico de sangre total (volumen de muestra de 10 ml).................... ...................6
3.C. Aislamiento de ADN genómico a partir de sangre total (placa de 96 pocillos) ......................... ................................8
3.D. Aislamiento de ADN genómico a partir de células de cultivo de tejidos y tejidos animales................................. ............ 10
3.E. Aislar ADN genómico de tejido vegetal ................................. ................................................ 12
3.F. Aislar ADN genómico de levadura................................................. ................................................. ... 13
3.G. Aislamiento de ADN genómico de bacterias Gram positivas y Gram negativas................................. ....... 14

4. Solución de problemas ................................................ ................................................. .................................. 15

5. Referencias ................................................. ................................................. ......................................... dieciséis

6. Apéndice................................................. ................................................. ................................................ 17

6.A. Composición de buffers y soluciones ................................................. ................................................ 17
6.B. Productos relacionados................................................ ................................................. ........................ 17

7. Resumen de cambios ................................................ ................................................. ................................ 17

1. Descripción

El kit de purificación de ADN genómico Wizard® está diseñado para el aislamiento de ADN de glóbulos blancos (Secciones 3.A, B y C), células
de cultivo de tejidos y tejido animal (Sección 3.D), tejido vegetal (Sección 3.E), levadura (Sección 3.F) y bacterias Gram positivas y Gram
negativas (Sección 3.G). La Tabla 1 enumera el rendimiento típico de ADN purificado de cada una de estas fuentes.

El kit de purificación de ADN genómico Wizard® se basa en un proceso de cuatro pasos (1). El primer paso del procedimiento de purificación
lisa las células y los núcleos. Para el aislamiento de ADN de glóbulos blancos, este paso implica la lisis de los glóbulos rojos en la solución de
lisis celular, seguida de la lisis de los glóbulos blancos y sus núcleos en la solución de lisis de núcleos. En este momento se puede incluir un
paso de digestión con RNasa; es opcional para algunas aplicaciones. Luego, las proteínas celulares se eliminan mediante una etapa de
precipitación con sal, que precipita las proteínas pero deja el ADN genómico de alto peso molecular en solución.
Finalmente, el ADN genómico se concentra y se desaliniza mediante precipitación con isopropanol.

El ADN purificado con este sistema es adecuado para una variedad de aplicaciones, incluyendo amplificación, digestión con endonucleasas
de restricción e hibridaciones de membrana (p. ej., transferencias Southern y dot/slot).

Promega Corporation ∙ 2800 Woods Hollow Road ∙ Madison, WI 53711­5399 EE. UU. ∙ Número gratuito en EE. UU. 800­356­9526 ∙ 608­274­4330 ∙ Fax 608­277­2516 1
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2. Componentes del producto y condiciones de almacenamiento

Aislamiento a pequeña escala (minipreparaciones)

PRODUCTO TAMAÑO GATO.#

Kit de purificación de ADN genómico Wizard® 100 aislamientos A1120

Cada sistema contiene reactivos suficientes para 100 aislamientos de ADN genómico a partir de 300 µl de muestras de sangre completa.
Incluye:

•
Solución de lisis celular de 100 ml.
•
Solución de lisis de núcleos de 50 ml.
•
Solución de precipitación de proteínas de 25 ml
•
Solución de rehidratación de ADN de 50 ml.
•
250 µl de solución de ARNasa A

PRODUCTO TAMAÑO GATO.#

Kit de purificación de ADN genómico Wizard® 500 aislamientos A1125

Cada sistema contiene reactivos suficientes para 500 aislamientos de ADN genómico a partir de 300 µl de muestras de sangre completa.
Incluye:

•
Solución de lisis celular de 500 ml.
•
Solución de lisis de núcleos de 250 ml.
•
Solución de precipitación de proteínas de 125 ml
•
100 ml de solución de rehidratación de ADN
• 1,25 ml de solución de ARNasa A

Aislamiento a gran escala (maxiprep)

PRODUCTO TAMAÑO GATO.#

Kit de purificación de ADN genómico Wizard® 100 aislamientos A1620

Cada sistema contiene reactivos suficientes para 100 aislamientos de ADN genómico a partir de 10 ml de muestras de sangre total.
Incluye:

•
Solución de lisis celular de 3 litros
•
Solución de lisis de núcleos de 1 litro
•
Solución de precipitación de proteínas de 350 ml
•
Solución de rehidratación de ADN de 150 ml.

Nota: Cat.# A1620 no incluye la solución de ARNasa A.

Condiciones de almacenamiento: Guarde el kit de purificación de ADN genómico Wizard® a temperatura ambiente (+15 °C a +30 °C). Consulte la etiqueta del producto

para conocer la fecha de vencimiento.

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Tabla 1. Rendimientos de ADN de diversos materiales de partida.

Especies y Material Cantidad de material de partida Rendimiento típico de ADN Tratamiento con ARNasa

Sangre entera humana (el

rendimiento depende de la 300 µl 5–15 µg Opcional

cantidad de glóbulos blancos 1,0 ml 25–50 µg Opcional
presentes) Placa 10,0 ml 250–500 µg Opcional
de 96 pocillos 50 µl/pocillo 0,2–0,7 µg Opcional
(procesar tan solo 20 µl/
pocillo; consulte la Tabla 2).

Sangre entera de ratón

EDTA (4%) tratado 300 µl 6 µg Opcional

Placa de 96 pocillos tratada 300 µl 6–7 µg Opcional
con heparina (4%) 50 µl/pocillo 0,2–0,7 µg Opcional

Líneas celulares

K562 (humano) 3 × 106 células 15–30 µg Requerido

COS (mono verde africano) 1,5 × 106 células 10 µg Requerido
NIH3T3 (ratón) 2,25 × 106 células 9,5–12,5 µg 6 Requerido
PC12 (feocromocitoma de rata) 8,25 × 106 células 1– µg Requerido
CHO (hámster) 2 × 106 células 6–7 µg Requerido

Tejido animal
Hígado de ratón 11 mg 15–20 µg Requerido
Cola de ratón 0,5­1,0 cm de cola 10–30 µg Opcional

insectos
células sf9 5 × 106 celdas 16 µg Requerido

Tejido vegetal
Hoja De Tomate 40 mg 7–12 µg Requerido

Bacterias Gram­negativo
Cultivo nocturno de Escherichia 1ml 20 µg Requerido
coli JM109, ~2 × 109 5ml 75–100 µg Requerido
células/ml
20 µg Requerido
Cultivo nocturno de 1ml
75–100 µg Requerido
Enterobacter cloacae , 5ml
~6 × 109 células/ml

Cultivo nocturno de bacterias

Gram positivas Staphylococcus 1ml 6–13 µg Requerido

epidermis , ~3,5 × 108
células/ml

Levadura

Cultivo nocturno de Saccharomyces 1ml 4,5–6,5 µg Requerido

cerevisiae , ~1,9 × 108
células/ml

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3. Protocolos para el aislamiento de ADN genómico

Probamos la purificación de ADN genómico a partir de sangre entera fresca recogida en tubos de anticoagulante con EDTA, heparina y citrato y no detectamos

efectos adversos en manipulaciones posteriores del ADN, incluida la PCR (2). Las muestras de sangre con anticoagulantes se pueden almacenar a una

temperatura de 2 a 8 °C durante un máximo de dos meses, pero la producción de ADN se reducirá a medida que aumenta el tiempo de almacenamiento.

El protocolo de la Sección 3.A ha sido diseñado y probado para muestras de sangre de hasta 3 ml de volumen. El protocolo de la Sección 3.B ha sido

diseñado y probado para muestras de sangre de hasta 10 ml de volumen. El rendimiento de ADN genómico variará dependiendo de la cantidad de glóbulos blancos

presentes. Se puede usar sangre congelada en los siguientes protocolos, pero el rendimiento puede ser menor que el obtenido con sangre fresca y es posible que se

requiera solución de lisis celular adicional.

Precaución: Al manipular muestras de sangre (Secciones 3.A, B y C), siga los procedimientos recomendados en su institución para materiales biopeligrosos o
consulte la referencia 3.

3.A. Aislamiento de ADN genómico de sangre total (volumen de muestra de 300 µl o 3 ml)

Materiales a ser suministrados por el usuario

•
Tubos de microcentrífuga estériles de 1,5 ml (para muestras de sangre de 300 µl)
•
Tubos de centrífuga estériles de 15 ml (para muestras de sangre de 3 ml)
•
baño de agua, 37°C
•
isopropanol, temperatura ambiente
•
Etanol al 70%, temperatura ambiente.
•
baño de agua, 65°C (opcional; para una rápida rehidratación del ADN)

1. Para un volumen de muestra de 300 µl: agregue 900 µl de solución de lisis celular a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.

Para un volumen de muestra de 3 ml: agregue 9,0 ml de solución de lisis celular a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml.

! Importante: La sangre debe recolectarse en tubos con anticoagulante EDTA, heparina o citrato para evitar la coagulación.

2. Agite suavemente el tubo de sangre hasta que esté bien mezclado; luego transfiera la sangre al tubo que contiene la solución de lisis celular.
Invierta el tubo de 5 a 6 veces para mezclar.

3. Incubar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente (invertir 2 a 3 veces una vez durante la incubación) para lisar los glóbulos rojos. Centrifugar a

13 000–16 000 × g durante 20 segundos a temperatura ambiente para obtener 300 µl de muestra. Centrifugar a 2000 × g durante 10 minutos a temperatura

ambiente para obtener 3 ml de muestra.

4. Retire y deseche la mayor cantidad de sobrenadante posible sin alterar el sedimento blanco visible. Aproximadamente

Quedarán entre 10 y 20 µl de líquido residual en el tubo de 1,5 ml (muestra de 300 µl). Quedarán aproximadamente entre 50 y 100 µl de líquido residual en el

tubo de 15 ml (muestra de 3 ml).

Si la muestra de sangre se congeló, repita los pasos 1 a 4 hasta que el sedimento esté blanco. Puede haber cierta pérdida de ADN de las muestras congeladas.

Nota: Es posible que se vean algunos glóbulos rojos o restos de células junto con los glóbulos blancos. Si el sedimento parece contener solo glóbulos rojos,

agregue una alícuota adicional de solución de lisis celular después de retirar el sobrenadante sobre el sedimento celular y luego repita los pasos 3 y 4.

4 Promega Corporation ∙ 2800 Woods Hollow Road ∙ Madison, WI 53711­5399 EE. UU. ∙ Número gratuito en EE. UU. 800­356­9526 ∙ 608­274­4330 ∙ Fax 608­277­2516
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5. Agite el tubo vigorosamente hasta que los glóbulos blancos se resuspendan (10 a 15 segundos).

! Resuspender completamente los glóbulos blancos para obtener una lisis celular eficiente.

6. Agregue la solución de lisis de núcleos (300 µl para un volumen de muestra de 300 µl; 3,0 ml para un volumen de muestra de 3 ml) al tubo que contiene

las células resuspendidas. Pipetee la solución 5 a 6 veces para lisar los glóbulos blancos. La solución debería volverse muy viscosa. Si se ven grumos de

células después de mezclar, incube la solución a 37 °C hasta que se rompan los grumos. Si los grumos aún son visibles después de 1 hora, agregue más

solución de lisis de núcleos (100 µl para un volumen de muestra de 300 µl; 1,0 ml para un volumen de muestra de 3 ml) y repita la incubación.

7. Opcional: agregue solución de ARNasa (1,5 µl para un volumen de muestra de 300 µl; 15 µl para un volumen de muestra de 3 ml) al lisado nuclear y

mezcle la muestra invirtiendo el tubo de 2 a 5 veces. Incubar la mezcla a 37°C durante 15 minutos y luego enfriar a temperatura ambiente.

8. Agregue la solución de precipitación de proteínas (100 µl para un volumen de muestra de 300 µl; 1,0 ml para un volumen de muestra de 3 ml) al reactor nuclear.

lisado y agitar vigorosamente durante 10 a 20 segundos. Es posible que se vean pequeños grupos de proteínas después de agitar.

Nota: Si se agregó solución de lisis de núcleos adicional en el paso 6, agregue un total de 130 µl de solución de precipitación de proteínas para un volumen

de muestra de 300 µl y 1,3 ml de solución de precipitación de proteínas para un volumen de muestra de 3 ml.

9. Centrifugar a 13 000–16 000 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente para obtener un volumen de muestra de 300 µl. Centrifugar a 2000 ×

g durante 10 minutos a temperatura ambiente para obtener un volumen de muestra de 3 ml.

Debería verse una bolita de proteína de color marrón oscuro. Si no se observa ningún pellet, consulte la Sección 4.

10. Para un volumen de muestra de 300 µl, transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml que contenga 300 µl de

isopropanol a temperatura ambiente. Para un volumen de muestra de 3 ml, transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 3 ml de

isopropanol a temperatura ambiente.

Nota: Es posible que quede algo de sobrenadante en el tubo original que contiene el sedimento de proteínas. Deje este líquido residual en el tubo para

evitar contaminar la solución de ADN con la proteína precipitada.

11. Mezcle suavemente la solución por inversión hasta que las hebras blancas de ADN en forma de hilos formen una masa visible.

12. Centrifugar a 13 000–16 000 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente para obtener 300 µl de muestra. Centrifugar a 2000 × g durante 1 minuto a

temperatura ambiente para obtener 3 ml de muestra. El ADN será visible como una pequeña bolita blanca.

13. Decante el sobrenadante y agregue un volumen de muestra de etanol al 70% a temperatura ambiente al ADN. Invierta suavemente el tubo varias veces para lavar

el sedimento de ADN y los lados del tubo de microcentrífuga. Centrifugar como en el paso 12.

14. Aspire con cuidado el etanol utilizando una pipeta Pasteur extraída o una punta de pipeta de secuenciación. El sedimento de ADN es

muy flojo en este punto y se debe tener cuidado para evitar aspirar el sedimento hacia la pipeta. Invierta el tubo sobre papel absorbente limpio y seque el pellet

al aire durante 10 a 15 minutos.

15. Agregue la solución de rehidratación de ADN (100 µl para un volumen de muestra de 300 µl; 250 µl para un volumen de muestra de 3 ml) al tubo y rehidrate

el ADN incubando a 65 °C durante 1 hora. Mezcle periódicamente la solución golpeando suavemente el tubo.

Alternativamente, rehidrate el ADN incubando la solución durante la noche a temperatura ambiente o a 4°C.

16. Almacene el ADN a 2–8°C.

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3.B. Aislamiento de ADN genómico de sangre total (volumen de muestra de 10 ml)

Hay disponible un kit a gran escala para procesar hasta 1 litro de sangre completa (n.º de catálogo A1620). Este kit no incluye la solución RNase
ya que el paso de digestión de RNase es opcional. La solución de ARNasa A (4 mg/ml) está disponible como un artículo separado (n.° de cat. A7973). Si
es necesario, se requiere un total de 5 ml de solución de RNasa A para procesar 1 litro de sangre.

Materiales a ser suministrados por el usuario

•
tubos de centrífuga estériles de 50 ml
•
baño de agua, 37°C
•
isopropanol, temperatura ambiente
•
Etanol al 70%, temperatura ambiente.
•
baño de agua, 65°C (opcional; para una rápida rehidratación del ADN)

1. Para muestras de sangre total de 10 ml: agregue 30 ml de solución de lisis celular a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml.

! Importante: La sangre debe recolectarse en tubos con anticoagulante EDTA, heparina o citrato para evitar la coagulación.

2. Agite suavemente el tubo de sangre hasta que esté bien mezclado; luego transfiera 10 ml de sangre al tubo que contiene la solución de lisis
celular. Invierta el tubo de 5 a 6 veces para mezclar.

3. Incubar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente (invertir 2 a 3 veces una vez durante la incubación) para lisar los glóbulos rojos.
Centrifugar a 2000 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.

4. Retire y deseche la mayor cantidad de sobrenadante posible sin alterar el sedimento blanco visible. Aproximadamente
Quedarán 1,4ml de líquido residual.

Si la muestra de sangre se ha congelado, agregue 30 ml adicionales de solución de lisis celular, invierta 5 a 6 veces para mezclar y repita los pasos
3 a 4 hasta que el sedimento esté casi blanco. Puede haber cierta pérdida de ADN en muestras congeladas.

Nota: Es posible que se vean algunos glóbulos rojos o restos de células junto con los glóbulos blancos. Si el sedimento parece contener solo
glóbulos rojos, agregue una alícuota adicional de solución de lisis celular después de retirar el sobrenadante sobre el sedimento celular y luego repita
los pasos 3 y 4.

5. Agite el tubo vigorosamente hasta que los glóbulos blancos se resuspendan (10 a 15 segundos).

! Resuspender completamente los glóbulos blancos para obtener una lisis celular eficiente.

6 Promega Corporation ∙ 2800 Woods Hollow Road ∙ Madison, WI 53711­5399 EE. UU. ∙ Número gratuito en EE. UU. 800­356­9526 ∙ 608­274­4330 ∙ Fax 608­277­2516
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6. Agregue 10 ml de solución de lisis de núcleos al tubo que contiene las células resuspendidas. Pipetee la solución 5 a 6 veces para lisar los glóbulos blancos.
La solución debería volverse muy viscosa. Si se ven grumos de células después de mezclar, incube la solución a 37 °C hasta que se rompan los
grumos. Si los grumos aún son visibles después de 1 hora, agregue 3 ml de solución de lisis de núcleos adicionales y repita la incubación.

7. Opcional: agregue RNasa A, hasta una concentración final de 20 µg/ml, al lisado nuclear y mezcle la muestra invirtiendo el tubo de 2 a 5 veces.
Incubar la mezcla a 37°C durante 15 minutos y luego enfriar a temperatura ambiente.

8. Agregue 3,3 ml de solución de precipitación de proteínas al lisado nuclear y agite vigorosamente durante 10 a 20 segundos. Es posible que se vean
pequeños grupos de proteínas después de agitar.

Nota: Si se agregó solución de lisis de núcleos adicional en el paso 6, agregue 4 ml de solución de precipitación de proteínas (en lugar

de 3,3 ml).

9. Centrifugar a 2000 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Debería verse una bolita de proteína de color marrón oscuro. Si no se observa ningún pellet, consulte la Sección 4.

10. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 50 ml que contenga 10 ml de isopropanol a temperatura ambiente.

Nota: Es posible que quede algo de sobrenadante en el tubo original que contiene el sedimento de proteínas. Deje el líquido residual en el tubo
para evitar contaminar la solución de ADN con la proteína precipitada.

11. Mezcle suavemente la solución por inversión hasta que las hebras blancas de ADN en forma de hilos formen una masa visible.

12. Centrifugar a 2000 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente. El ADN será visible como una pequeña bolita blanca.

13. Decantar el sobrenadante y añadir 10 ml de etanol al 70% a temperatura ambiente al ADN. Invierta suavemente el tubo varias veces para lavar el
sedimento de ADN y los lados del tubo de centrífuga. Centrifugar como en el paso 12.

14. Aspirar con cuidado el etanol. El sedimento de ADN está muy suelto en este punto y se debe tener cuidado para evitar aspirarlo.
el pellet en la pipeta. Seque el pellet al aire durante 10 a 15 minutos.

15. Agregue 800 µl de solución de rehidratación de ADN al tubo y rehidrate el ADN incubándolo a 65 °C durante 1 hora.
Mezcle periódicamente la solución golpeando suavemente el tubo. Alternativamente, rehidrate el ADN incubando la solución durante la
noche a temperatura ambiente o a 4°C.

16. Almacene el ADN a 2–8°C.

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3.C. Aislamiento de ADN genómico a partir de sangre total (placa de 96 pocillos)

Este protocolo se puede ampliar a 20 µl, 30 µl o 40 µl de sangre. La Tabla 2 describe los distintos volúmenes de solución utilizados en cada paso. Las

preparaciones de cincuenta microlitros generalmente producen ADN genómico en el rango de 0,2 a 0,7 µg, dependiendo del número de leucocitos en la

muestra de sangre.

Tabla 2. Volúmenes de reactivos necesarios para diversas cantidades iniciales de sangre.

Proteína ADN

Solución de lisis celular Lisis de núcleos Precipitación Rehidratación

Muestra (Lisis de glóbulos rojos) Solución Solución isopropanol Solución

20 µl 60 µl 20 µl 6,7 µl 20 µl 10 µl

30 µl 90 µl 30 µl 10 µl 30 µl 15 µl

40 µl 120 µl 40 µl 13,3 µl 40 µl 20 µl

50 µl 150 µl 50 µl 16,5 µl 50 µl 25 µl

Materiales a ser suministrados por el usuario

•
Placa(s) de 96 pocillos con fondo en V capaces de contener 300 µl de volumen/pocillo (Costar® Cat.# 3896)
•
isopropanol, temperatura ambiente
•
Etanol al 70%, temperatura ambiente.
•
Selladores de placas de 96 pocillos (Costar® Cat.# 3095) (opcional; para uso con sangre humana)

1. Agregue 150 µl de solución de lisis celular a cada pocillo.

! Importante: La sangre debe recolectarse en tubos con anticoagulante EDTA, heparina o citrato.

2. Agregue 50 µl de sangre fresca a cada pocillo y pipetee 2 o 3 veces para mezclar.

3. Deje la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos, pipeteando la solución dos veces durante la incubación para ayudar a
lisar los glóbulos rojos.

4. Centrifugar a 800 × g durante 5 minutos en una centrífuga de mesa para concentrar las células.

5. Retire con cuidado y deseche la mayor cantidad posible de sobrenadante con la punta de una micropipeta, dejando un pequeño sedimento de

glóbulos blancos y algunos glóbulos rojos. Se recomienda el uso de una punta de pipeta extendida, como una punta de carga de gel. Inclinar la placa

de 96 pocillos entre 50 y 80° (dependiendo de la cantidad de líquido presente por pocillo) permite una eliminación más completa del líquido del pocillo.

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6. Agregue 50 µl de solución de lisis de núcleos a cada pocillo y pipetee 5 a 6 veces para resuspender el sedimento y lisar los glóbulos blancos. La solución debería

volverse más viscosa. Como ayuda en la visualización del sedimento de ADN, en este paso se pueden agregar 2 µl por pocillo de un portador (p. ej.,

Polyacryl Carrier [Molecular Research Center, Inc., Cat.# PC152]). Los rendimientos de ADN son generalmente equivalentes con o sin uso de portador.

7. Agregue 16,5 µl de solución de precipitación de proteínas por pocillo y pipetee 5 a 6 veces para mezclar.

8. Centrifugar a 1400 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Debería verse una bolita de proteína marrón. Si no se ve ningún pellet, consulte la
Sección 4.

9. Precipitación/rehidratación del ADN en placa de 96 pocillos

a. Transfiera con cuidado los sobrenadantes a pocillos limpios que contengan 50 µl por pocillo de isopropanol a temperatura

ambiente y mezcle con pipeta.

Nota: Es posible que quede parte del sobrenadante en el pocillo original que contiene el sedimento de proteínas. Deje este líquido residual en el pozo

para evitar contaminar la solución de ADN con la proteína precipitada. Como en el Paso 5, inclinar la placa facilitará la eliminación del líquido del

pocillo. El uso de una punta de pipeta extendida en este paso no permite mezclar fácilmente la muestra con isopropanol.

b. Centrifugar a 1400 × g durante 10 minutos. Retire con cuidado el isopropanol con una punta de micropipeta.

C. Añadir 100 µl de etanol al 70 % a temperatura ambiente por pocillo.

d. Centrifugar a 1400 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.

mi. Aspire con cuidado el etanol utilizando una pipeta Pasteur extraída o una punta de pipeta de secuenciación. Se debe tener cuidado para evitar

aspirar el sedimento de ADN. Coloque la bandeja en un ángulo de 30 a 45° y déjela secar al aire durante 10 a 15 minutos.

F. Agregue 25 µl de solución de rehidratación de ADN a cada pocillo. Deje que el ADN se rehidrate durante la noche a temperatura

ambiente o a 4°C.

gramo.
Guarde el ADN a una temperatura de 2 a 8 °C.

Nota: Se pueden recolectar fácilmente pequeños volúmenes de ADN en el fondo de un pocillo en V centrifugando brevemente la placa de 96 pocillos

antes de su uso.

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3.D. Aislamiento de ADN genómico a partir de células de cultivo de tejidos y tejidos animales

Materiales a ser suministrados por el usuario

•
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
•
Tubos de centrífuga de 15 ml (para tejido animal)
•
homogeneizador pequeño (Fisher Tissue Tearor, Cat.# 15­338­55, o equivalente) (para tejido animal)
•
tripsina (solo para células de cultivo de tejidos adherentes)
•
PBS (para células de cultivo de tejidos)
•
nitrógeno líquido (opcional; para células de cultivo de tejidos, Paso 1.d; para trituración de tejido animal, Paso 2.b, en lugar de un homogeneizador
pequeño; y para cola de ratón, Paso 3.b)
•
mortero y maja (opcional; para triturar tejido animal, paso 2.b, en lugar de un homogeneizador pequeño; y para cola de ratón, paso 3.b)

•
Baño de agua a 95 °C (opcional; para células de cultivo de tejidos, paso 1.d)
•
baño de agua, 37°C
•
isopropanol, temperatura ambiente
•
Etanol al 70%, temperatura ambiente.
•
baño de agua, 65°C (opcional; para una rápida rehidratación del ADN)
•
EDTA 0,5 M (pH 8,0) (para cola de ratón)
•
Proteinasa K (20 mg/ml en agua; Cat.# V3021) (para cola de ratón)
•
Baño María a 55°C (para cola de ratón)

1. células de cultivo de tejidos

a. Coseche las células y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para las células adherentes, tripsinice las células antes de cosecharlas.

b. Centrifugar a 13.000­16.000 × g durante 10 segundos para sedimentar las células.

C. Retire el sobrenadante, dejando el sedimento celular más 10–50 µl de líquido residual.

d. Lavar las células añadiendo 200 µl de PBS y agitando vigorosamente para resuspender las células. Centrifugar como en el Paso 1.b,
y retire el PBS.

Nota: Para las células que no se lisan bien solo en la solución de lisis de núcleos (por ejemplo, células PC12), realice un paso adicional de congelación y

descongelación de la siguiente manera antes de continuar con el Paso 1.e: Lave las células como en el Paso 1.d; luego congelar en nitrógeno líquido.

Descongelar las células calentándolas a 95°C. Repita este procedimiento por un total de 4 ciclos.

mi. Agregue 600 µl de solución de lisis de núcleos y pipetee para lisar las células. Pipetear hasta que no queden grupos de células visibles.

F. Continúe con la Sección 3.D, Paso 4.

2. Tejido animal (hígado y cerebro de ratón)

a. Agregue 600 µl de solución de lisis de núcleos a un tubo de centrífuga de 15 ml y enfríe en hielo.

b. Agregue de 10 a 20 mg de tejido fresco o descongelado a la solución de lisis de núcleos fría y homogeneice durante 10 segundos con un homogeneizador

pequeño. Transfiera el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Alternativamente, muela el tejido en nitrógeno líquido usando un mortero

que haya sido preenfriado en nitrógeno líquido. Después de la molienda, deje que el nitrógeno líquido se evapore y transfiera aproximadamente

de 10 a 20 mg del tejido molido a 600 µl de solución de lisis de núcleos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.

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C. Incubar el lisado a 65°C durante 15 a 30 minutos.

d. Continúe con la Sección 3.D, Paso 4.

3. Tejido animal (cola de ratón)

a. Para cada muestra a procesar, agregue 120 µl de una solución de EDTA 0,5 M (pH 8,0) a 500 µl de solución de lisis de núcleos en un tubo de
centrífuga. Enfriar sobre hielo.

Nota: La solución se volverá turbia cuando se enfríe.

b. Agregue entre 0,5 y 1 cm de cola de ratón fresca o descongelada a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.

Nota: El tejido se puede moler hasta obtener un polvo fino en nitrógeno líquido utilizando un mortero previamente enfriado en nitrógeno
líquido. Luego transfiera el polvo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.

C. Agregue 600 µl de solución de lisis de núcleos/EDTA del paso 3.a al tubo.

d. Añadir 17,5 µl de Proteinasa K de 20 mg/ml.

mi. Incubar durante la noche a 55°C con agitación suave. Alternativamente, realice una incubación de 3 horas a 55°C (con agitación); Agite la
muestra una vez por hora si realiza una incubación de 3 horas. Asegúrate de que la cola esté completamente digerida.

4. Opcional para cola de ratón: agregue 3 µl de solución de ARNasa al lisado nuclear y mezcle la muestra invirtiendo el tubo de 2 a 5 veces. Incubar
la mezcla durante 15 a 30 minutos a 37°C. Deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de continuar.

5. A la muestra a temperatura ambiente, agregue 200 µl de solución de precipitación de proteínas y agite vigorosamente a alta velocidad durante 20
segundos. Enfríe la muestra en hielo durante 5 minutos.

6. Centrifugar durante 4 minutos a 13.000–16.000 × g. La proteína precipitada formará un gránulo blanco apretado.

7. Retire con cuidado el sobrenadante que contiene el ADN (dejando atrás el sedimento de proteína) y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga
limpio de 1,5 ml que contenga 600 µl de isopropanol a temperatura ambiente.

Nota: Es posible que quede algo de sobrenadante en el tubo original que contiene el sedimento de proteínas. Deje este líquido residual en el tubo
para evitar contaminar la solución de ADN con la proteína precipitada.

8. Mezcle suavemente la solución por inversión hasta que las hebras blancas de ADN en forma de hilos formen una masa visible.

9. Centrifugar durante 1 minuto a 13.000–16.000 × g a temperatura ambiente. El ADN será visible como una pequeña bolita blanca.
Decantar con cuidado el sobrenadante.

10. Agregue 600 µl de etanol al 70 % a temperatura ambiente e invierta suavemente el tubo varias veces para lavar el ADN. Centrífugo
durante 1 minuto a 13.000–16.000 × g a temperatura ambiente.

11. Aspire con cuidado el etanol utilizando una pipeta Pasteur extraída o una punta de pipeta de secuenciación. El sedimento de ADN está muy suelto en
este punto y se debe tener cuidado para evitar aspirar el sedimento hacia la pipeta.

12. Invierta el tubo sobre papel absorbente limpio y seque el sedimento al aire durante 10 a 15 minutos.

13. Agregue 100 µl de solución de rehidratación de ADN y rehidrate el ADN incubando a 65 °C durante 1 hora. Mezcle periódicamente la solución
golpeando suavemente el tubo. Alternativamente, rehidrate el ADN incubando la solución durante la noche a temperatura ambiente o a 4°C.

14. Almacene el ADN a 2–8°C.

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3.E. Aislamiento de ADN genómico de tejido vegetal

Materiales a ser suministrados por el usuario

•
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
•
nitrógeno líquido
•
tubo de microcentrífuga, mortero o mortero y maja
•
baño de agua, 65°C
•
baño de agua, 37°C
•
isopropanol, temperatura ambiente
•
Etanol al 70%, temperatura ambiente.

1. Procese el tejido de la hoja congelándolo con nitrógeno líquido y moliéndolo hasta obtener un polvo fino utilizando un mortero con tubo de

microcentrífuga o un mortero. Agregue 40 mg de este polvo de hoja a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.

2. Agregue 600 µl de solución de lisis de núcleos y agite durante 1 a 3 segundos para humedecer el tejido.

3. Incubar a 65°C durante 15 minutos.

4. Agregue 3 µl de solución de ARNasa al lisado celular y mezcle la muestra invirtiendo el tubo de 2 a 5 veces. Incubar el

mezcla a 37°C durante 15 minutos. Deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de continuar.

5. Agregue 200 µl de solución de precipitación de proteínas y agite vigorosamente a alta velocidad durante 20 segundos.

6. Centrifugar durante 3 minutos a 13.000–16.000 × g. Las proteínas precipitadas formarán un gránulo apretado.

7. Retire con cuidado el sobrenadante que contiene el ADN (dejando atrás el sedimento de proteína) y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga limpio
de 1,5 ml que contenga 600 µl de isopropanol a temperatura ambiente.

Nota: Es posible que quede algo de sobrenadante en el tubo original que contiene el sedimento de proteínas. Deje este líquido residual en el tubo para

evitar contaminar la solución de ADN con la proteína precipitada.

8. Mezcle suavemente la solución por inversión hasta que las hebras de ADN en forma de hilos formen una masa visible.

9. Centrifugar a 13.000–16.000 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente.

10. Decantar con cuidado el sobrenadante. Agregue 600 µl de etanol al 70 % a temperatura ambiente e invierta suavemente el tubo varias veces para lavar el

ADN. Centrifugar a 13.000–16.000 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente.

11. Aspire con cuidado el etanol utilizando una pipeta Pasteur extraída o una punta de pipeta de secuenciación. El sedimento de ADN está muy suelto en este

punto y se debe tener cuidado para evitar aspirar el sedimento hacia la pipeta.

12. Invierta el tubo sobre papel absorbente limpio y seque el pellet al aire durante 15 minutos.

13. Agregue 100 µl de solución de rehidratación de ADN y rehidrate el ADN incubando a 65 °C durante 1 hora. Mezcle periódicamente la solución golpeando

suavemente el tubo. Alternativamente, rehidrate el ADN incubando la solución durante la noche a temperatura ambiente o a 4°C.

14. Almacene el ADN a 2–8°C.

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3.F. Aislar ADN genómico de levadura

Materiales a ser suministrados por el usuario

•
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
• caldo YPD
•
EDTA 50 mM (pH 8,0)
•
liticasa (Sigma Cat.# L2524), resuspendida con agua libre de nucleasas hasta una concentración final de 75 unidades/μl
•
baño de agua, 37°C
•
isopropanol, temperatura ambiente
•
Etanol al 70%, temperatura ambiente.
•
baño de agua, 65°C (opcional; para una rápida rehidratación del ADN)

1. Agregue 1 ml de un cultivo cultivado durante 20 horas en caldo YPD a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.

2. Centrifugar a 13.000­16.000 × g durante 2 minutos para sedimentar las células. Retire el sobrenadante.

3. Resuspender bien las células en 293 µl de EDTA 50 mM.

4. Agregue 7,5 µl de 75 unidades/µl de liticasa y pipetee suavemente 4 veces para mezclar.

5. Incubar la muestra a 37°C durante 30 a 60 minutos para digerir la pared celular. Dejar enfriar a temperatura ambiente.

6. Centrifugar la muestra a 13.000–16.000 × g durante 2 minutos y luego retirar el sobrenadante.

7. Agregue 300 µl de solución de lisis de núcleos al sedimento celular y pipetee suavemente para mezclar.

8. Agregue 100 µl de solución de precipitación de proteínas y agite vigorosamente a alta velocidad durante 20 segundos.

9. Deje reposar la muestra en hielo durante 5 minutos.

10. Centrifugar a 13 000–16 000 × g durante 3 minutos.

11. Transfiera el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml que contenga 300 µl de espacio.
temperatura isopropanol.

Nota: Es posible que quede algo de sobrenadante en el tubo original que contiene el sedimento de proteínas. Deje este líquido residual en el tubo
para evitar contaminar la solución de ADN con la proteína precipitada.

12. Mezcle suavemente por inversión hasta que las hebras de ADN en forma de hilos formen una masa visible.

13. Centrifugar a 13 000–16 000 × g durante 2 minutos.

14. Decantar con cuidado el sobrenadante y escurrir el tubo sobre papel absorbente limpio. Añadir 300 µl de temperatura ambiente.

Etanol al 70% e invertir suavemente el tubo varias veces para lavar el sedimento de ADN.

15. Centrifugar a 13 000–16 000 × g durante 2 minutos. Aspire con cuidado todo el etanol.

16. Drene el tubo sobre papel absorbente limpio y deje que el pellet se seque al aire durante 10 a 15 minutos.

17. Agregue 50 µl de solución de rehidratación de ADN.

18. Agregue 1,5 µl de solución de RNasa a la muestra de ADN purificada. Agite la muestra durante 1 segundo. Centrifugar brevemente en una
microcentrífuga durante 5 segundos para recoger el líquido e incubar a 37°C durante 15 minutos.

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3.F. Aislamiento de ADN genómico de levadura (continuación)

19. Rehidratar el ADN incubándolo a 65°C durante 1 hora. Mezcle periódicamente la solución golpeando suavemente el tubo.
Alternativamente, rehidrate el ADN incubando la solución durante la noche a temperatura ambiente o a 4°C.

20. Almacene el ADN a 2–8°C.

3.G. Aislamiento de ADN genómico de bacterias Gram positivas y Gram negativas

Materiales a ser suministrados por el usuario

•
Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
•
baño maría, 80°C
•
baño de agua, 37°C
•
isopropanol, temperatura ambiente
•
Etanol al 70%, temperatura ambiente.
•
baño de agua, 65°C (opcional; para una rápida rehidratación del ADN)
•
EDTA 50 mM (pH 8,0) (para bacterias grampositivas)
•
10 mg/ml de lisozima (Sigma Cat.# L4919) (para bacterias grampositivas)
•
10 mg/ml de lisostafina (Sigma Cat.# L7386) (para bacterias grampositivas)

1. Agregue 1 ml de un cultivo nocturno a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.

2. Centrifugar a 13.000­16.000 × g durante 2 minutos para sedimentar las células. Retire el sobrenadante. Para bacterias Gram positivas, continúe con el
Paso 3. Para bacterias Gram Negativas, vaya directamente al Paso 6.

3. Resuspender bien las células en 480 µl de EDTA 50 mM.

4. Agregue la(s) enzima(s) lítica(s) apropiada(s) al sedimento celular resuspendido en un volumen total de 120 µl y pipetee suavemente para mezclar. El
objetivo de este pretratamiento es debilitar la pared celular para que pueda tener lugar una lisis celular eficaz.

Nota: Para determinadas especies de Staphylococcus , se requiere una mezcla de 60 µl de 10 mg/ml de lisozima y 60 µl de 10 mg/ml
de lisostafina para una lisis eficaz. Sin embargo, muchas cepas de bacterias Gram positivas (p. ej., Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Nocardia
otitidiscaviarum, Rhodococcus rhodochrous y Brevibacterium albidium) se lisan eficazmente utilizando lisozima sola.

5. Incubar la muestra a 37°C durante 30 a 60 minutos. Centrifugar durante 2 minutos a 13.000–16.000 × g y retirar el sobrenadante.

6. Agregue 600 µl de solución de lisis de núcleos. Pipetear suavemente hasta que las células se resuspendan.

7. Incubar a 80°C durante 5 minutos para lisar las células; luego enfriar a temperatura ambiente.

8. Agregue 3 µl de solución de RNasa al lisado celular. Invierta el tubo de 2 a 5 veces para mezclar.

9. Incubar a 37°C durante 15 a 60 minutos. Enfriar la muestra a temperatura ambiente.

10. Agregue 200 µl de solución de precipitación de proteínas al lisado celular tratado con RNasa. Agite vigorosamente a alta velocidad durante 20
segundos para mezclar la solución de precipitación de proteínas con el lisado celular.

11. Incubar la muestra en hielo durante 5 minutos.

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12. Centrifugar a 13 000–16 000 × g durante 3 minutos.

13. Transfiera el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml que contenga 600 µl de espacio.

temperatura isopropanol.

Nota: Es posible que quede algo de sobrenadante en el tubo original que contiene el sedimento de proteínas. Deje este líquido residual en el tubo para

evitar contaminar la solución de ADN con la proteína precipitada.

14. Mezcle suavemente por inversión hasta que las hebras de ADN en forma de hilos formen una masa visible.

15. Centrifugar a 13 000–16 000 × g durante 2 minutos.

16. Retirar con cuidado el sobrenadante y escurrir el tubo sobre papel absorbente limpio. Agregue 600 µl de etanol al 70 % a temperatura ambiente e invierta suavemente

el tubo varias veces para lavar el sedimento de ADN.

17. Centrifugar a 13 000–16 000 × g durante 2 minutos. Aspirar con cuidado el etanol.

18. Drene el tubo sobre papel absorbente limpio y deje que el pellet se seque al aire durante 10 a 15 minutos.

19. Agregue 100 µl de solución de rehidratación de ADN al tubo y rehidrate el ADN incubando a 65 °C durante 1 hora.

Mezcle periódicamente la solución golpeando suavemente el tubo. Alternativamente, rehidrate el ADN incubando la solución durante la noche a temperatura

ambiente o a 4°C.

20. Almacene el ADN a 2–8°C.

4. Solución de problemas

Si tiene preguntas que no se abordan aquí, comuníquese con su sucursal o distribuidor local de Promega. Información de contacto disponible en: [Link].

Correo electrónico: techserv@[Link]

Síntomas Comentarios

Coágulos de sangre presentes en muestras de sangre. Es posible que el tubo se haya almacenado incorrectamente; la sangre no se mezcló

completamente o se utilizaron tubos inadecuados para extraer sangre. Deseche la

sangre coagulada y extraiga nuevas muestras utilizando tubos anticoagulantes

tratados con EDTA, heparina o citrato.

Pobre rendimiento de ADN La muestra de sangre puede contener muy pocos glóbulos blancos. Extraer nuevas

muestras de sangre.

El sedimento de glóbulos blancos no se resuspendió completamente en el Paso 5 de

la Sección 3.A o B. El sedimento de glóbulos blancos se debe agitar vigorosamente

para resuspender las células.

La muestra de sangre era demasiado antigua. Los mejores rendimientos se obtienen con sangre

fresca. Las muestras que se han almacenado a una temperatura de 2 a 8 °C durante más

de 5 días pueden dar rendimientos reducidos.

El sedimento de ADN se perdió durante la precipitación con isopropanol. Tenga

mucho cuidado al retirar el isopropanol para evitar perder el pellet.

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4. Solución de problemas (continuación)

Síntomas Comentarios

ADN degradado (<50 kb de tamaño) Recolección o almacenamiento inadecuado de la muestra de sangre. Obtener una
nueva muestra en las condiciones adecuadas.

Pobre rendimiento de ADN utilizando el protocolo de Los cultivos cultivados durante un tiempo prolongado contienen una alta
bacterias Gram positivas proporción de células que se lisan fácilmente tras la exposición al tratamiento con lisostafina.
Iniciar purificaciones con un cultivo saludable.

Sin gránulos de proteínas La muestra no se enfrió a temperatura ambiente antes de agregar la solución de
precipitación de proteínas. Enfriar la muestra a temperatura ambiente (al

menos 5 minutos) o enfriar en hielo durante 5 minutos, agitar durante 20

segundos, centrifugar durante 3 minutos a 13 000–16 000 × g

(10 minutos a 2000 × g para un volumen de muestra de 3 ml) y continuar con el

protocolo.

La solución de precipitación de proteínas no se mezcló completamente con el lisado

nuclear. Mezcle siempre completamente el lisado nuclear y la solución de
precipitación de proteínas.

Pellet de ADN difícil de disolver Es posible que las muestras se hayan secado demasiado. Rehidratar el ADN
incubando durante 1 hora a 65 °C y luego dejar la muestra a temperatura ambiente o
4 °C durante la noche. Precaución: No deje el ADN a 65°C durante la noche.

Las muestras no se mezclaron durante la etapa de rehidratación. Recuerde mezclar

las muestras periódicamente durante el paso de rehidratación.

5. Referencias

1. Miller, SA, Dykes, DD y Polesky, HF (1988) Un procedimiento simple de salazón para extraer ADN de células nucleadas
humanas. Núcleo. Ácidos res. 16, 1215.

2. Beutler, E., Gelbart, T. y Kuhl, W. (1990) Interferencia de la heparina con la reacción en cadena de la polimerasa.
BioTécnicas 9, 166.

3. Departamento de Trabajo de EE. UU., Administración de Salud y Seguridad Ocupacional (1991) Exposición ocupacional a patógenos transmitidos por
la sangre, regla final. Registro Federal 56, 64175.

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6. Apéndice

6.A. Composición de buffers y soluciones.

Solución de rehidratación de ADN (incluida) ARNasa A

Tris­HCl 10 mM (pH 7,4)

Disolver la RNasa A a 4 mg/ml en solución de rehidratación de ADN, hervir
EDTA 1 mM (pH 8,0) durante 10 minutos para eliminar la DNasa contaminante y almacenar en

alícuotas a –20 °C. Esta solución también está disponible en Promega

(n.º de catálogo A7973).

6.B. Productos relacionados

Sistemas de purificación de ADN

Producto Tamaño Gato.#

Solución de lisis celular 1L A7933

Solución de lisis de núcleos 1L A7943

Solución de precipitación de proteínas 350ml A7953

Solución de rehidratación de ADN 50ml A7963

ARNasa A (4 mg/ml) 1ml A7973

Sistema de purificación de ADN genómico ReadyAmp™ 100 reacciones A7710

Sistema de purificación de ADN Wizard® Plus SV Minipreps 50 preparaciones A1330

Sistema de purificación de ADN Wizard® Plus SV Minipreps + adaptadores de vacío 50 preparaciones A1340

Sistema de purificación de ADN Wizard® Plus SV Minipreps 250 preparaciones A1460

Sistema de purificación de ADN Wizard® Plus SV Minipreps + adaptadores de vacío 250 preparaciones A1470

Adaptadores de vacío 20 cada una A1331

Sistemas de amplificación de ADN

Producto Tamaño Gato.#

Sistema central de PCR GoTaq® I 200 reacciones M7660

7. Resumen de cambios

Se realizaron los siguientes cambios en la revisión del 23/10 de este documento:

1. Declaraciones de patentes y exenciones de responsabilidad actualizadas.

2. Se cambió la fuente y la imagen de portada.

3. Realicé ediciones menores de texto.

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(a) MEDIANTE EL USO DE ESTE PRODUCTO, EL INVESTIGADOR ACEPTA ESTAR OBLIGADO POR LOS TÉRMINOS DE ESTA LICENCIA DE ETIQUETA DE USO LIMITADO. Si el investigador no está

dispuesto a aceptar los términos de esta licencia de etiqueta y el producto no se utiliza, Promega aceptará la devolución del producto no utilizado y le proporcionará al investigador un reembolso completo.

El investigador puede utilizar este producto únicamente para fines de investigación; no se permite ninguna transferencia o uso comercial de este producto. Uso comercial significa todos y cada uno de los
usos de este producto por parte de una parte a cambio de una contraprestación, incluido, entre otros, (1) el uso en la fabricación posterior del producto; (2) uso en la prestación de servicios, información o
datos; y (3) reventa del producto o sus derivados, ya sea que dicho producto o derivados se revendan o no para su uso en investigación. Con respecto a cualquier uso fuera de esta licencia de etiqueta,
incluido cualquier uso comercial, de diagnóstico, terapéutico o profiláctico, comuníquese con Promega para obtener información sobre el suministro y la licencia. PROMEGA NO HACE DECLARACIONES
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PRODUCTO. Los términos de esta licencia de etiqueta se regirán por las leyes del estado de Wisconsin, EE. UU.

(b) Patentes Pendientes.

(c) Licenciado según la patente de [Link]. Nos. 9.933.417, 10.018.624 y 10.161.932 del Instituto Médico Howard Hughes.

(d) Patente de [Link]. Nos. 7.867.726, 8.168.405 y 8.257.939, patente japonesa núms. No. 4748685 y otras patentes en trámite.

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