M3_UF2_T1i2

TEMA 1. INTRODUCCIÓN AL CULTIVO CELULAR .

Cultivo → es cultivar células y puedes usar → levaduras (eucariotas), , hongos, bacterias
(procariotas), de insectos

Todos los cultivos responden a las mismas leyes matemática y fisicoquímicas → las cel consumen
oxígeno y una fuente de C, H, O y genera Co2 y H2O

Biomasa → cuando crecemos muchas cel y lo compactamos para obtener un pellet

Son kg de biomasa

La ecuación general de un cultivo es:

Se necesita:
- C → para construir la biomasa y energía
- Fuente de N → para las BN, como sales de nitratos/nitritos.
- O → problema para el crecimiento y, por eso, hay toda una arquitectura en la construcción
del reactor.

➔ obtienes biomasa, producto (prot x por ejemplo) y calor

Velocidad de crecimiento → el valor Mu

Interesa poder medir el M porque es lo que permitirá en un
biorreactor , porque este es una campana de acero inox y dentro no
sabes qué pasa.

Vas tomando muestras e ir midiendo parámetros y con estos

parametros y usando toda la matemática disponible → puedes
saber si el cultivo está en una fase de crecimiento óptima.

Mu máxima → es la vel. de crecimiento óptima (exponencial)

Objetivo del cultivo → que el cultivo esté el máximo tiempo posible en Mu máxima, porque la
velocidad de crecimiento óptima quiere decir que el organismo está a tope.

1
No puede parar de dividirse y en cada división va a estar generando el producto que nos interesa (no
la bacteria).

Hay que medir todos los parámetros que aparecen en la ecuación, a través de un vector del reactor y
de ecuaciones matemáticas.

El primer modelo es:

EL MODELO DE MONOD Y CINÉTICA DE CRECIMIENTO

La misma ecuación que establece la probabilidad de lectura de un aparato electrónico.

Modelo de Monod → relaciona la cantidad de sustrato (fuente de C) con la velocidad de
crecimiento
+ cantidad de sustancia a + velocidad crece

Luego, se dieron cuenta que a la fórmula se le tenía que agregar el efecto de crecimiento por efecto
del que ya creció. La biomasa generada empieza a perjudicar en la velocidad de crecimiento.

La ley dice Monod que: Mu= vel máxima de crecimiento (K) y que depende del sustrato y otra K
asociada al sustrato.

Ley de monod para calcular Mu:

Que viene a ser → μ= lnXf - lnXo / tf - to

En la situación ideal → lo óptimo, lo que queremos lograr que la Mu sea = la Mu máxima porque es
la máxima vel de crecimiento.
Si no, lo que dice es que la velocidad de crecimiento va a depender de la Mu max x la cantidad de S y
la Ks (K asociada a una cte). fórmula de abajo

Para calcular la biomasa final en relación a la inicial →

La X es biomassa.

El modelo plantea que la velocidad de crecimiento depende solamente del sustrato pero luego se
estableció la ecuación de Contois (un modelo más complejo) donde → la vel mu depende del
sustrato pero también de la cantidad de biomasa

MISMA FÓRMULA PARA ESTABLECER EL MU (MONOD Y CONTOIS) PASA QUE CONTOIS CONSIDERA EL
EFECTO QUE PRODUCE EL INCREMENTO DE LA BIOMASA.

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GRÁFICO DE MU EN FUNCIÓN A LA [ ] DEL S
En la medida que ↑ el sustrato ↑ el mu.
Queremos estar siempre en las regiones cercanas del mu máximo.

No crece + → pq si la vel máxima sólo depende de la cantidad máxima, hay un punto en el que no
sigue ↑ la gráfica, si no que se forma un plató.
+ S mayor vel max

Mu máxima → K que depende de cada organismo que estés usando.

Haces lo posible para que la mu se parezca a la mu máxima en momentos que la cantidad de

sustrasto es infinita, y te hace plantear cómo será un cultivo.

Cultivo continuo → se hace para que un biorreactor tenga una cantidad de sustrato infinita.
Un biorreactor lo estás alimentando constantemente con sustrato y, por otro lado, le sacas el exceso
de medio.
Un flujo continuo que alimente la cantidad de sustrato.

FASES DE LOS CULTIVOS

Todos los cultivos los dividimos en 4 etapas con cualquier Erlenmeyer y reactor.
Primero, en el gráfico tenemos el tiempo por un lado y, por el otro, la cantidad de biomasa (la
cantidad de ln).

A tiempos cortos, en el inicio, senyala el inóculo

Inóculo → la primera vez que al erlenmeyer/reactor las bacterias que quieres que crezcan.
Cuando tu lo agregas, ocurren las siguientes fases:

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 1. Fase de latencia → normalmente es una recta sin pendiente en donde no ↑ la cantidad de
biomasa.
Si mides la biomasa en función del tiempo, no ↑ y permanece cte.
Permanece cte porque la bacteria se está adaptando a lo que hay en el biorreactor con el
cultivo.
La bacteria no crece porque está generando la resistencia antibiótica y al medio de cultivo se
le ha cambiado la temperatura.
Es la fase inicial, y tiene que ser del menor tiempo posible.
Para levantar esto antes de inocular en el erlenmeyer, hay que hacerlo en un tubo de ensayo
pequeño para que al momento de inocular las bacterias están aceleradas.

2. Fase exponencial → es donde queremos que esté el cultivo la mayor parte posible.
Es donde empieza a desarrollarse porque tiene todas las mejores condiciones que estás
dando, por ejemplo, sustrato infinito.
La Mu en fase exponencial será máxima o al menos tendiendo a máxima.
Si esto es un cultivo en erlenmeyer y tu no puedes estar alimentando con sustrato todo el
rato → cuando el sustrato se haya acabado no se reproducirá más, entonces pasas a la fase
estacionaria

3. Fase estacionaria → vas midiendo a lo largo del tiempo y la biomasa siempre es igual.
El cultivo se limita por completo en la cantidad de sustrato, ya que no hay más sustrato para
generar biomasa.
Si se quiere producir algo no es una etapa muy buena para ello.

4. Fase de muerte → si al cultivo no se le hace nada más, el número de colonias empezará a ↓

dentro del medio de cultivo.

➔ Para producir la proteína X las etapas que más nos interesan son la exponencial y la
exponencial en menor proporción.

Todo se mide con la fórmula de la biomasa para calcular en todo momento cómo va la muestra.

Mides la cantidad de biomasa en función del tiempo.

La curva que no interesa y la pasas en escala logarítmica para poder tener una línea recta.

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GRÁFICA DE [BIOMASA] EN FUNCIÓN DEL TIEMPO PARA DIFERENTE MU
Los gráficos de las velocidades de crecimiento de 3 organismos distintos que cada uno tiene su Mu
máxima establecida.
- La ROJA tiene mayor pendiente, mayor velocidad de crecimiento.
- La lila es el estado de latencia.

FACTORES QUE AFECTA LA MU

La mu importa mucho pero en cultivos se estudia mucho que afecta a la mu.

1. Ph → afecta mucho a la mu.

Que haya un cambio de ph que genera la prot x, y está de modica considerablemente.

El org rojo tiene una mu máxima a casi 7.9 pero si por algún motivo disminuye el ph a 5 la Mu es
máxima a esa y hay un problema

2. BUFFER → para solucionar el problema de ph

Cambio de ph en el cultivo por lo que suelta la bacteria, que puede acidificar por ejemplo.

Cada organismo tiene una vel de velocidad y una temperatura óptima.

Hay 3 tipos de cultivos:

1. Discontinuo/por lotes/ batch → sirve para una cantidad finita det. de biomasa que
queremos generar en un tiempo determinado y en lotes muy pequeños, como para hacer el
cariotipo en cultivos discontinuos porque se necesita poca cantidad.

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 2. Continuo → necesitamos que el cultivo no se termine nunca, con 2 variables:
- tienes que estar agregando sustrato infinito
- quitando CO2 y biomasa porque el biorreactor tiene un tamaño y el volumen no da.

Tanque cerrado donde se le agrega medio esteril, se inocula y empieza el procedimiento, y por un
tubo administras medio rico alimentando constantemente el biorreactor.
Por el otro, retiras el medio viejo, biomasa…

Si las bacterias fabrican el interferón o antígeno que te interesa → produce cantidades todo el rato.

Se transforma en biomasa y la cantidad de sustrato ↓, entonces agregas medio de cultivo fresco.

(tanque no examen)
3. Semicontinuo → funciona por fases.
Para traspaso: tienes un erlenmeyer con x volumen de medio y cuando llega a Mu máxima,
lo traspasas a otro erlenmeyer con medio rico hasta que obtienes la cantidad de biomasa
necesaria.
Simulas el sistema contínuo pero en diferentes recipientes → logras lo que buscas en el
contínuo.
Es como repetir un cultivo batch indefinidamente.
Es hacer un medio discontinuo muchas veces como el batch.

GRÁFICO QUE RELACIONA OD Y EL Nº DE BACTERIAS POR ML

Cómo se grafica un cultivo semicontinuo.

Se grafica la biomasa en función del tiempo de cultivo.

Tienes el 1r erlenmeyer y cuando empiezas alcanzar la fase de muerte → haces una dilución a otro
erlenmeyer con medio fresco y otra vez las bacterias van creciendo.
Alcanzas otra vez la fase estacionaria, haces otra dilución y vuelven a crecer. Así todo el rato.
Es como si todos los cultivos terminasen unidos.

Lo hacemos muchas veces → para que no se muera, porque si no traspasas, la biomasa

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TEMA 2: REALIZACIÓN DE CULTIVOS CELULARES .

1. TIPOS DE CULTIVOS CELULARES EN CITOGENÉTICA

Cultivo de órganos → Consiste en mantener un órgano entero o parte de él en la interfase entre un

medio de cultivo artificial y una atmósfera controlada.
Se utiliza cuando se va a realizar un transplante i ese órgano se mantiene en un medio para que no se
mueran las células.

Cultivo de explantes → Consiste en adherir un fragmento de tejidos a una superficie (placa o frasco
de cultivo) y nutrirlo con un medio de cultivo.
Cuando se hace un transplante de pelo,

Cultivo de células → Conjunto de procedimientos que hacen posible el mantenimiento de células de

organismos pluricelulares in vitro, preservando al máximo sus características fisiológicas, bioquímicas
y genéticas.
- Cultivo celular primario: la suspensión celular de partida se obtiene disgregando las células
de un tejido por métodos mecánicos o enzimáticos. De esta manera, se obtiene una mezcla
celular compleja formada por distintos tipos celulares presentes en el tejido. El cultivo
celular se puede hacer a partir de esta mezcla seleccionando un tipo celular concreto.

Es el primer cultivo que se hace a partir de un órgano para obtener una determinadas células
a través de procesos mecánicos o enzimáticos.
Tripsina: Separa las células (enzimático).

- Cultivo celular secundario: la suspensión celular de partida se obtiene a partir de un cultivo

primario o de otro secundario mediante un subcultivo o un “pase”. También se puede
obtener a partir de una línea celular mantenida en congelación.

Es el primer pasaje que se hace a un medio rico para obtener mas cantidad de células.

El cultivo primario es el mas crítico porque las células sufren un shock porque pasan de se un órgano
para ser cultivadas in vitro i normalmente se fracasa. cuando pasan a ser un cultivo secundario ya
han hecho una adaptación a ser cultivadas.

2. BIOLOGÍA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO

Curva de crecimiento del cultivo → Representación gráfica de la dinámica de crecimiento de un
cultivo (concentración de células por días de evolución de cultivo).

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Formas de crecimiento:
- Crecimiento en monocapa → Las células crecen adheridas sobre una superficie sólida
(plástico o vidrio).
Estas células solo crecen a lo ancho, nunca hacia arriba, es decir, no hay mas pisos (células
epiteliales, siempre estan quietas), crecen hasta ocupar el espacio disponible.

- Crecimiento en suspensión → las células no necesitan pegarse a una superficie para crecer
por lo que se mantienen dispersas en el seno del medio de cultivo y proliferando.
Estan en agitación y se cultivan células sanguíneas. Se trata de simular un crecimiento similar
en las que se encuentran en condiciones naturales. Se mantienen en agitación.

No todos los tipos celulares tienen la misma facilidad para crecer en cultivo. En general, se
puede afirmar que que un tipo celular será tanto más fácil de cultivar cuanto más
indiferenciado sea, es decir, cuanto mayor sea la capacidad de sus células de dividirse o
diferenciarse en otras células.

De hecho, muchos tipos celulares pierden características de diferenciación cuando se

cultivan, entre ellas la incapacidad de dividirse, producción de enzimas, rutas metabólicas,
etc.

Esta pérdida de propiedades y funcionalidades puede ser debida a la desdiferenciación o

adaptación a las nuevas condiciones microambientales generadas por el medio y a las
condiciones de cultivo, tan diferentes a las condiciones tisulares.

Cuando se hacen muchos pasajes, se van perdiendo por aberraciones genéticas que se van
incorporando y las células pierdan la capacidad de reproducirse y el el cultivo muere. Las
células si no se dividen, el cultivo muere.

Comportamiento vital tras sucesivos pases

Utilización de líneas primarias: Realización de un cariotipo.

En la continua se busca una linia celular, se busca una molécula que te produzca la célula (se busca
cantidad).

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Características de las células transformadas
Son la células que se convierten de un cultivo primario a una inmortal, tiene todas las características
de una célula pero tienen un crecimiento indefinido.

- Crecen indefinidamente en cultivo: son inmortales

- Pierden la dependencia del anclaje para crecer, pueden crecer en suspensión (pueden crecer
en agitación).
- Pierden inhibición por contacto, pueden empezar a comportarse como un tumor, pueden
dejar de crecer en monocapa.
- Pueden invadir tejidos y producir tumores.
- Acumulan anomalías genéticas. Normalmente son aneuploides y con múltiples aberraciones
cromosómicas. Es una cosa positiva, las célula pueden obtiene una característica que pueda
ser conveniente. Por ejemplo, ser knockout en un gen en eucariotas significa apagar un gen
ya sea espontáneo o expresamente, puede ser útil para estudiar un gen en concreto. knock
in seria introducir un gen.

Factores que pueden inducir la aparición de líneas celulares continuas:

- Métodos físicos: irradiación del cultivo con UV.

- Métodos químicos: tratamiento con productos químicos carcinogénicos como bromuro de

etidio, a muy bajas concentraciones produce alteraciones sin llegar a matar las células. Estas
alteraciones pueden provocar algún cambio que interese para el estudio de la célula o de un
gen y otros que no van a ser útiles.

- Métodos biológicos: infección vírica, transfección de ADN, etc.

3. FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL CULTIVO

1. Soporte físico en el que van a crecer las células

Tenemos que tener en cuenta ciertos aspectos del recipiente:

- El material o el sustrato con el que está fabricado: plástico reutilizable, plástico desechable,
matrices tridimensionales , microesferas de sephadex o poliacrilamida, metales.

- Características y tipos de recipientes de cultivo: placas multipocillo, placa transwell, placas

petri, frascos o botellas roux.

- Tratamiento de las superficies: para facilitar la adhesión celular.

Para que las células puedan crecer necesitan un tipo de soporte físico para que puedan crecer ya que
no pueden crecer en cualquier sitio. Es un plástico especializado que tiene propiedades químicas que
permiten la adherencia de la célula en el fondo para formar un lecho celular.

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 En un recipiente se cultiva previamente una monocapa de células
llamadas células diana y en otro recipiente se cultivan otro tipo de
células llamadas células efectoras que tiene unas leves particiones
que permiten la comunicación de las células dianas con las
efectoras.

El objetivo es estudias sis hay algún tipo de comunicación celular

entre las CD y las CE.

CE: Células cerebrales de la pituitaria que generan oxitocinas

CD: Células cérvix de un paciente

Las CE poroduciran la oxitocina que emigrara por los canales y tendrá como como diana las CD que
estarán estimuladas y por microscopia se evaluara si hay algún tipo de cambio.

2. Composición y propiedades fisicoquímicas del medio de cultivo:

- Sales minerales: solución salina equilibrada
- Tampón: las células son muy sensibles a los cambios de pH (bicarbonato, HEPES...)
- Glucosa: fuente de energía para las células. Puede ir acompañado de otros hidratos de
carbono.
- Aminoácidos: como mínimo, todos los aminoácidos esenciales (aquellos que los organismos
no pueden sintetizar por sí mismos)
- Vitaminas: influyen en la tasa de crecimiento y en la supervivencia celular.
- Suplementos orgánicos de bajo peso molecular: ácidos grasos esenciales, otros lípidos,
nucleósidos, piruvatos, etc.
- Indicador de pH: como el rojo fenol. Normalmente el pH óptimo es 7,4

- Hormonas y factores de crecimiento: Actúan sobre los promotores de los genes, lo cual
induce a la célula a crecer, dividirse y desarollarse.
- Antibióticos y antifúngicos.
- Osmolaridad: deben ser isotónicos o ligeramente hipotónicos respecto de las células que se
cultivan.
- Tensión superficial: debe mantenerse baja y no suele ser un problema.

3. La atmósfera gaseosa
Es la mezcla de gases en que se mantienen los cultivos.
- Oxígeno: en general, la concentración de oxígeno atmosférico es suficiente para cubrir las
necesidades de cualquier cultivo celular.

- CO2: los niveles de CO2 pueden influir en el pH del medio. La concentración más habitual es
del 5%. Mantiene el pH estable.

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4. Las condiciones de incubación
- Temperatura: influye en gran medida en la tasa de crecimiento del cultivo. La temperatura
óptima suele ser la misma a la que están sometidas fisiológicamente en los organismos de
procedencia.
Ejemplo: Células de mamíferos: 37º y células de insectos: 28º

- Humedad: Debe ser suficientemente elevada para evitar la evaporación del medio de cultivo,
lo que produciría un aumento de la concentración de los componentes y de la osmolaridad, y
variaciones de pH. Humedad relativa: 95% (hidratar el cultivo).

4. TÉCNICAS DE OBTENCIÓN, MANTENIMIENTO Y PROPAGACIÓN DE CULTIVOS

DISGREGACIÓN CELULAR
separación de las células entre sí y de la matriz extracelular en la que se encuentran.

Se puede disgregar de forma:

- Mecánica: Fragmento de órgano en PP, triturar suavemente y se filtra para retirar los restos
de tejido. Hay filtros muy pequeños que el tamaño de por es especial y solo permite el paso
de células independiente. El resultado del filtro son las células independientes.

- Enzimática: Eliminan la sustancia la que mantiene unidas la células. Se utilizan estas 4

enzimas y se coloca el órgano en una solución y se espera a que estas enzimas solas
disgreguen el órgano. Se pueden combinar con EDTA (quelante1 de Ca2+). Retira los cationes
de Ca2+ que estabilizan las uniones entre las proteínas de matriz y las células. Las más
utilizadas són la Tripsina, Dispasa, Papaína, Elastasa y Pronasa.

La recomendación es una combinación de ambas.

Selección de células: tras la disgregación de un tejido se obtiene una mezcla de células. Se puede
comenzar el cultivo primario (cultivo mixto) o seleccionar el tipo celular de interés (cultivo puro).

Métodos de selección celular:

1. Propiedades específicas:
- Adhesión a sustratos naturales (colágeno, endotelios, etc,)
- Adhesión a sustratos artificiales (lana de vidrio, plástico)

1
Quelante: Compuesto químico que se une con firmeza a los iones metálicos. Los quelantes se usan para
extraer metales tóxicos del cuerpo.

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Si conozco la célula de interés y es capaz de unirse a algún tipo de sustrato por sus características
como podría ser el colágeno, se realiza una columna con una resina en particular y se agregan los
grupos que se quiere que interactúen con el licuado de células. Todo el cultivo interactúa con la
columna y saldra el eluato. Solo quedaran retenidas las células que interactuan con el sustrato de la
resina. Se hacen varios lavados con buffer para eliminar el eluato y quedarme solo con las células de
interés.

2. Métodos inmunológicos: uso de anticuerpos específicos que reconocen las células de interés
anclados a un soporte sólido.
- En placa multipocillo
- Esferas de material inerte + filtrado
- Esferas magnéticas + imán

A la columna hay anticuerpos contra un receptor que expresa la célula de interés. Al pasar el licuado
por la columna, las células que expresan el receptor quedan retenidas en la columna.

Para recuperar las células, se introduce un detergente no iónico y con el ph muy controlado a muy
baja concentración como podría ser Twean que tiene mas afinidad y reemplazan a las células que
permite recuperarlas.

RECUENTO Y VIABILIDAD
Necesitamos saber la densidad del cultivo (número de células por ml) y la proporción de células
vivas.
Colorante vital: Azul de tripran (tripan blue). Sólo entra en las células muertas.

Las célula vivas no se tiñen y quedan blancas, en cambio, las muertas

no tienen esa capacidad y se tiñen de azul.

Conteo de células: Cámara de contaje celular o hemocitómetro.

Ej. Cámara de Neubauer

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La cámara de Neubauer es una cámara de recuento adaptada al microscopio de campo claro o al de
contraste de fase. Consta de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual
se ha marcado una cuadrícula (por lo general, con la ayuda de un diamante). Es un cuadrado de 3x3
mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0,25mm.

La depresión central del cubreobjetos está hundida 0,1 mm respecto a la superficie de forma que,
cuando se cubre con un cubreobjetos, éste dista de la superficie marcada 0,1mm.

Con el microscopio puedo ir desplazando e ir

contando las células y me permite establecer
una relación de células / mL

Cuando se va a sembrar coloca la muestra por un extremo y se deja que por capilaridad la muestra
inserte dentro de la cámara.

Para contar hay que tener un criterio que se aplica en todos los cuadrantes.
- 10x → Para ver que la muestra está distribuida de forma homogénea se hace un vistazo en el
microscopio. Si no es homogéneo no se puede contar.
- 40x → Para realizar el conteo

Para un correcto conteo:

- Solo se cuenta en los cuadros completos
- No se cuentan las células que tocan las lineas
- No se cuentan los cuadrados de fuera

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Si la densidad celular es muy elevada y no se puede hacer bien el recuento, se puede hacer un
dilución previa en PBS 1/10-1/100. Este factor de dilución se deberá tener en cuenta a la hora de
hacer los cálculos.

Tambien existen contadores de células automáticos (cell coulter) que se colocan pequeños tubos de
ensayo y el sensor va tomando muestras y midiendo la cantidad de células donde hay un ánodo y
cátodo que las células al pasar generan un cambio en el potencial de acción y lo reconoce como
células. Estos contadores evitan el error y mucho tiempo.

DESCONGELACIÓN DE CÉLULAS
Para iniciar cultivos secundarios a partir de líneas celulares mantenidas en congelación en nitrógeno
líquido o a -80ºC.

Pasos a seguir en el proceso de descongelación:

1. Incubar el vial que contiene las células congeladas en un baño a 37ºC.
Para evitar la aparición de cristales que aparecen cuando se pasa de sólido a líquido.

2. Limpiar la superficie externa del vial con etanol 70% para prevenir contaminaciones.
Se desinfecta todo el entorno del vial con cuidado de no borrar el nombre.

3. Transferir el contenido del criovial a un tubo falcon de 15mL y añadir 10mL de medio de
cultivo precalentado a 37ºC.
Se hace el pase con pipeta para evitar arrastrar contaminaciones.
Se le agrega el medio para eliminar el sobrenadante que contiene DMSO
4. Centrifugar 4-5 minutos a 700-800 rpm para obtener el pellet.

5. Eliminar el sobrenadante para eliminar el DMSO que es un solvente tóxico.

6. Añadir 4-5mL de medio de cultivo completo nuevo. La suspensión celular está lista para
iniciar el cultivo.

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INICIO DEL CULTIVO
Antes de iniciar la siembra hay que tener en cuenta el numero inicial de siembra, para ello hay que
tener en cuenta el tamaño y tiempo.

Pasos a seguir en el proceso de siembra:

1. Elegir el tipo de recipiente que se va a utilizar para el cultivo.

2. En virtud del recipiente, establecer el número de células que se van a sembrar inicialmente.

3. Hacer recuento de células viables en la suspensión.

4. Transferir un volumen de suspensión que contenga el número de células deseado a un tubo

falcon y lavarlas con medio de cultivo completo precalentado a 37ºC para evitar el shock.

5. Diluir las células con el volumen adecuado de medio de cultivo completo e introducirlas en el
recipiente de cultivo.

6. Colocar el recipiente de cultivo en un incubador a la temperatura adecuada (normalmente

37ºC) con la proporción de CO2 requerida (del 5% habitualmente) y 95% de humedad.

Las células estarán listas para estudiar cuando lleguen a la confluencia, es decir, cuando hayan
ocupado todo el espacio disponible.

MANTENIMIENTO DE CULTIVO
El objetivo es mantener la viabilidad y el crecimiento de las células.
El medio RPMI es un medio de cultivo celular y tiene un color rojo que es un indicador de pH (rojo
fenol), como las células hacen lactato y ácido carbónico entre otras sustancian cambia a color
amarillo o magenta segun la variació de pH (ácido o básico) e indica que hay que renovar el medio.

El mantenimiento se basa en cambiar el el medio. Para hacerlo hay que:

1. Se inclina el medio a 45º y el medio se desplaza hacia un lado.

2. Con una pipeta se retira todo el sobrenadante y se descarta.

3. Rápidamente se agrega cultivo fresco precalentado a 37º y se coloca muy lentamente hasta
completar el volumen.

4. Se agrega antibiótico y antifúngico para evitar una contaminación.

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A los 10 días se observa al microscopio y se observa que las células están en confluencia. En ese
momento se cosechan las células para guardar una alícuota y utilizar mas cantidad para algún
estudio.

Para poder hace la siembra, primero se tienen que despegar las células, primero se utiliza un método
enzimático, generalmente con tripsina (rompe el enlace de la célula con el fondo de la placa) y se
complementa con un método mecánico con un rastrillo. Se raspa el fondo del cultivo para que todas
las células se despeguen del fondo.

CONSERVACIÓN DE CÉLULAS
las líneas continuas o inmortales se pueden mantener en el tiempo mediante pases seriados. El
problema es que consume tiempo y recursos. Otra opción es congelarlas.

Pasos a seguir en el proceso de congelación:

1. Se procede como si se fuese a realizar un pase.

2. Después del recuento de células viables se retira el medio de cultivo por centrifugación y se
añade por un volumen adecuado de suero animal con un 10% de DMSO. Una densidad
celular aceptable en el medio de congelación.

3. Alicuotar la solución en criotubos y congelar de manera progresiva.

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TEMA 3: INFECCIÓN IN VITRO .
Ensayo de protección → Se llama ensayo de protección porque las células no permiten que el
antibiótico permee en la célula y protegen a las bacterias que hayan infectado a la célula.

Material necesario:
- Patógeno ([Link])
- Campana
- Cultivo celular (Hela → eucariota)
- Medio de cultivo (RPMI → eucariota)
- Azul de tripan
- Placa elisa de 12 o 24 (pueden ser más o menos)

CULTIVO DE CÉLULAS
Se cultivan la células en placa y se siembran en los pocillos. Con el microscopio se controla el
crecimiento hasta que lleguen a la confluencia.

Confluencia → Momento en el que las células llenan todo el espacio disponible.

- L → confluencia
- M → células muertas (rojo)

Se pasa una alícuota del cultivo a un falcon de 50μL y se añade 5mL de RPMI y 10% de SFB.
A continuación se centrifuga a muy bajas rpm para no lisar las células.

Para controlar el crecimiento se depositan 1010 células/mL en la placa elisa. Para calcular la cantidad
se utiliza la fórmula: Vo · Co = Vf · Cf

Para facilitar la adhesión, se centrifuga la placa a muy bajas rpm durante 5 min.

CULTIVO DE BACTERIAS
Paralelamente se hace un cultivo en un erlenmeyer de [Link] en medio LB con AMP (antibiótico).
Es importante saber la cantidad de bacterias que hay, para eso se utiliza la espectrofotometría.

X = UFC / mL → DO = UFC / mL

Se hace una dilución 1/10 y la absorbancia es de 0,2 con lo que el FD es = 2

Sabemos que en una DO tenemos 6·109 bacterias/ mL y queremos 109 en cada pocillo

En cada pocillo se pondrán 0,5mL de bacterias y en total 6mL de RPMI + SFB 10%

INFECCIÓN IN VITRO
Antes de infectar las células, se renueva el medio y se hace un lavado 3 veces con 500μL PBS.

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Cuando se tiene la células limpias y sin medio se añade las bacterias con el medio RPMI. Una vez
infectadas las células se centrifuga para acelerar el proceso de infección.

4h 24h 48h Control

. E. coli

. Lut

. E. coli II

A LA PRIMERA HORA
Con el kitasato, se elimina todo el medio y las células muertas y se hace 3 lavados y se añade medio
nuevo. RPMI + antibiótico para eliminar todas las bacterias que no hayan infectado.

A LAS 4 HORAS
Se hace el primer punto. Se quita el medio y se añade PBS + detergente + tripsina
Se rompen todas las células y las bacterias sobreviven se siembran en un medio con antibiótico al
cual las bacterias son resistentes. Se dejan 24h en una estufa a 37º y se hace un recuento y se hace
una relación de las UFC que han crecido.

A LAS 24 Y 48 HORAS
Se repite el procedimiento anterior y se grafica el crecimiento de cada bacteria.

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