TEMA 4: OTRAS TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA

TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA DE LUZ TRANSMITIDA

INTRODUCCIÓN
Existen diversas clases de microscopios, según la conformación, la naturaleza de los sistemas de luz y otros
elementos utilizados para obtener las imágenes.

El microscopio óptico puede ser monocular, binocular, trinocular (para microfotografía).

En los microscopios binoculares la observación se hace con los dos ojos y esto permite una observación más cómoda
y se percibe una mayor nitidez de los detalles en la imagen. Se fabrican en diferentes tamaños incluyendo
microscopios pequeños portátiles o de viaje.

Microscopio vertical
Es el microscopio convencional, perfeccionado a partir de los modelos antiguos, que posee la fuente de luz ubicada
en la base, por debajo de la platina.
Es el microscopio de uso más común.

Microscopio invertido
La estructura del microscopio es invertida en comparación al microscopio
convencional.
La fuente de luz está ubicada por encima de la platina y el principio de funcionamiento y
formación de la imagen es el mismo que el del microscopio tradicional.
Utilizado principalmente para cultivos celulares (células vivas) sin una preparación
previa y para monitorear actividades (crecimiento, comportamiento).

Microscopio estereoscópico
Este tipo de microscopio proporciona una imagen estereoscópica, en tres dimensiones
(3D) del espécimen.
Se fundamenta en la visión binocular convencional, en la que los dos ojos observan el
espécimen con ángulos levemente distintos.
El microscopio estereoscópico debe ser binocular.
Se utiliza para observar especímenes de gran tamaño, sin corte o preparación previa
puesto que emplea luz incidente y no funciona por trans-iluminación. Es ideal para
realizar microdisección.

Microscopio quirúrgico
Es un microscopio que se emplea en microcirugía.
Proporciona un campo muy bien iluminado y un aumento de las estructuras anatómicas, facilitándole al cirujano una
mayor visibilidad de los tejidos sanos y patológicos que serán manipulados más cuidadosamente y con menores
posibilidades de lesión.
Algunos modelos más sofisticados tienen piezas automatizadas robóticas.
Se utiliza principalmente en intervenciones quirúrgicas en las que se necesite una minuciosa disección, como por
ejemplo del cráneo y cerebro o del globo ocular.

TIPOS DE MICROSCOPIO
LUPA
La lupa, también llamada microscopio simple o lente de aumento es una lente convergente que permite ver los
objetos de mayor tamaño que el natural.

MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO

Las muestras son observadas en un campo brillante muy iluminado.
El contraste se sacrifica a expensas de la resolución y viceversa, limitándose p.e el estudio de células y tejidos vivos.
La adición de sustancias químicas para incrementar el contraste puede provocar cambios o modificaciones en la
estructura de la célula e incluso producirle la muerte.
Si se reduce la apertura del diafragma o se disminuye la cantidad de luz se incrementa el contraste, pero también se
reduce seriamente la resolución y la nitidez.
Con el empleo de programas informáticos de digitalización y edición de imágenes, las micrografías de células
incoloras pueden ser tratadas mejorando de manera significativa el contraste, sin embargo, para observar más
detalles en los especímenes vivos necesariamente hay que emplear otros métodos ópticos de contraste más
sofisticados.

Los principios básicos de estas técnicas especiales de microscopía se basan en:

 La modificación de la manera como incide la luz sobre el espécimen: empleo de condensadores y filtros.
- Microscopio de campo oscuro.
- Microscopio de contraste de fase.
- Microscopio de luz polarizada, microscopio petrográfico y metalúrgico.
- Contraste por interferencia diferencial (Differential Interference Contrast) Nomarski.
 La modificación de la fuente emisora de luz: cambiando la luz blanca por luz ultravioleta o rayos láser.
- Microscopio de luz ultravioleta.
- Microscopio de fluorescencia.
- Microscopio confocal.

MICROSCOPIO DE CAMPO OSCURO

“De manera similar a un cielo nocturno en el cual brillan las estrellas o al iluminar con una linterna un cuarto oscuro
y las partículas de polvo flotantes en el aire se tornan visibles porque reflejan o difractan la luz, los especímenes
observados al microscopio de campo oscuro se ven blancos y brillantes sobre un fondo oscuro (negro).”

Se consigue con un condensador especial, que modifica la dirección de la luz. En vez de ir hacia arriba, consigue que
la luz vaya hacia los lados; de este modo, sólo pasará al ocular la luz difractada por la muestra
Es muy útil para muestras que tienen poco contraste.
Aparecen al revés de cómo aparecen respecto al campo claro. La imagen aparece brillante y el fondo oscuro.

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES

Con esta técnica de iluminación se aumenta el contraste de manera notoria entre las partes claras y oscuras de las
células transparentes.
El principio es semejante al de campo oscuro: se ilumina la muestra con un cono hueco de luz pero mucho más
estrecho.
Se emplea un filtro en forma de anillo (en el objetivo) que disminuye la intensidad de la luz y al mismo tiempo
provoca un retraso o desfase en la longitud de onda de la luz.
Permite observar células sin colorear y resulta especialmente útil para células vivas (mitosis y migración celular)

Aprovecha las pequeñas diferencias de los índices de refracción en las distintas partes de una célula y en las distintas
partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor índice de refracción experimenta una
deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron por la muestra.

En las células y tejidos no coloreados, el escaso contraste se mejora y acentúa al

transformar las diferencias de fase (invisibles al ojo humano) en diferencias de
intensidad luminosa las cuales sí son detectables.

CAMPO CLARO vs. CONTRASTE DE FASES vs. CAMPO OSCURO

MICROSCOPIO DE LUZ POLARIZADA

Es un microscopio de campo claro al cual se le adicionan filtros que modifican la luz.
También se le denomina “microscopio petrográfico o metalúrgico” por su uso inicial en el estudio de minerales, sin
embargo su aplicación se ha extendido al campo de la biología, medicina, química y muchas otras disciplinas.
Comparada con las otras técnicas de incremento de contraste, el uso de la luz polarizada es la más efectiva en el
estudio de muestras ricas en materiales birrefringentes, puesto que mejora de manera incomparable la calidad de la
imagen.
Birrefringencia = propiedad óptica de ciertos cuerpos de desdoblar un rayo de luz incidente en dos rayos
linealmente polarizados y perpendiculares entre sí, lo que impide su visualización al microscopio.

La luz proveniente de una fuente estándar de iluminación vibra y se propaga en todas las direcciones, pero al pasar
por un filtro polarizador las ondas y su campo eléctrico oscilan todos en un mismo plano.
Polarizador = dispositivo que solo deja pasar la luz que vibra en un plano determinado denominado eje de
polarización.
Mediante esta técnica se pueden visualizar sustancias cristalinas o fibrosas intracelulares, como el citoesqueleto, y
extracelulares, como la sustancia amiloidea, los cristales de uratos…

MICROSCOPIO DE INTERFERENCIA DIFERENCIAL

Microscopio sofisticado de contraste en trans-iluminación, también denominado microscopio Nomarski, ideal para
visualizar especímenes no coloreados y transparentes.
Permite obtener información sobre la densidad óptica de la muestra y observar detalles que de ordinario son
invisibles.
Los objetos se ven oscuros o claros en un fondo gris, de manera semejante a las imágenes del microscopio de
contraste de fases, pero sin halos de difracción.
Emplea luz polarizada la cual pasa por dos prismas birrefringentes (Nomarski, Wollaston) que la fraccionan en dos
rayos cuyos trayectos e índices de refracción son diferentes, dando como resultado una imagen del espécimen en 3D
o relieves que corresponden a las variaciones de la densidad óptica de la muestra.
Se utiliza sobre todo para el estudio de células vivas no coloreadas y en tratamientos de fertilidad “in vitro”.

TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA DE LUZ REFLEJADA

MICROSCOPIO DE LUZ ULTRAVIOLETA

Es un microscopio en el que se usa la luz ultravioleta, que es una radiación cuya longitud de onda es de
aproximadamente 200 nm y en consecuencia permite un mayor poder de resolución que la luz visible.
La luz ultravioleta es invisible para el ojo humano, no puede ser captada por la retina y además es muy nociva; es por
ello que la imagen no se observa directamente, por el contrario debe visualizarse mediante fluorescencia, fotografía
o un sensor digital.
Todos los elementos ópticos del microscopio, incluyendo las láminas porta y cubre-objetos están hechos de cuarzo o
fluorita; no pueden ser de vidrio puesto que este material no transmite la luz ultravioleta.
Se utiliza en ciencia forense para el análisis del ADN, drogas y estudios de evidencias.

MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
Fluorescencia = propiedad que tienen ciertos elementos químicos (fluoróforos o fluorocromos) de emitir luz visible
cuando sobre ellos incide una radiación intensa; en otras palabras, absorben una luz de una longitud de onda
determinada (por ejemplo luz ultravioleta o luz monocromática azul) y luego emiten otra luz de una mayor longitud
de onda (de un determinado color, verde, rojo, amarillo).
Existen numerosos tipos de fluorocromos y cada uno de ellos tiene su espectro de absorción y de emisión específico
que depende de la composición y estructura de la molécula fluorescente.
También existen fluorocromos intracelulares naturales, tales como nucleótidos de nicotina reducidos (NADH,
NADPH), nucleótidos de flavina oxidados, clorofilas, proteínas fluorescentes (Green Fluorescent Protein GFP) y esto
debe ser tomado en cuanta al realizar esta técnica con marcadores fluorescentes.
La microscopía de fluorescencia es muy útil porque la molécula fluorescente, aún cuando sea muy pequeña, puede
ser observada debido a la luz que emite.
Los fluorocromos actúan como fuentes de luz de un color determinado que pueden ser localizadas en áreas
específicas de la muestra que se estudia.
El marcaje selectivo de moléculas y otros compuestos celulares se realiza mediante la técnica de
inmunofluorescencia.
Son numerosas las aplicaciones de la microscopía de fluorescencia, notablemente en biología y medicina: marcaje de
moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación, estudio de células normales y patológicas;
estudios inmunológicos y genéticos.

MICROSCOPIO CONFOCAL
En la microscopía fotónica clásica el tejido debe cortarse finamente para ser examinado y mientras más delgado sea,
más nítida será la imagen; pero con este método se pierde la información tridimensional durante el corte.
Si una muestra gruesa es observada al microscopio fotónico, la imagen que se enfoca se ve contaminada por la
superposición de los elementos del tejido que están fuera de foco, tanto por encima como por debajo del plano
enfocado; la imagen enfocada se deteriora a causa de las estructuras superpuestas borrosas o no enfocadas.
Con el microscopio confocal estas limitaciones han sido superadas, ya que es un instrumento que permite realizar
cortes ópticos finos a muestras de tejidos más o menos gruesos y realizar reconstrucciones en tres dimensiones a
partir de cortes seriados.

Ventajas
- Uso de la fluorescencia (epi-fluorescencia).
- Enfoca un solo plano del espécimen.
- Elimina la información proveniente de otros planos no enfocados del espécimen.
- Obtención de cortes ópticos seriados a partir de muestras con cierto grosor o cuyo corte fino se dificulta.
- Gracias a programas de computación, se combinan los cortes ópticos seriados y a partir de ellos se reconstruye
en tres dimensiones la estructura observada.

Aplicaciones
Proporciona un método altamente sofisticado y mejorado para obtener imágenes.
En investigaciones en el campo de la biología celular y biomedicina es muy útil para medir procesos dinámicos,
realizar videos para capturar secuencias en muy corto tiempo en células vivas y otras aplicaciones:
- Procesos celulares: Para medir actividades enzimáticas, reacciones de oxidación, pH intracelular, fagocitosis,
apoptosis, comunicaciones intercelulares. Electrofisiología.
- Estudios de ADN y ARN.
- Morfología de organoides citoplasmáticos.
- Cirugía y otros métodos clínicos.
- Otras aplicaciones en el campo de la física, la química y en tecnología alimentaria.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

INTRODUCCIÓN
La microscopia electrónica hace posible la toma de imágenes directas de las estructuras celulares a niveles
supramoleculares, es decir, la ultraestructura celular.
Se puede alcanzar una resolución unas 40.000 veces mayor que un microscopio fotónico.
Pasos para la formación de la imagen en un microscopio electrónico:
1. Un haz de electrones se forma en el cátodo y es acelerado hacia el espécimen gracias a un potencial eléctrico
positivo.
2. El haz de electrones es enfocado mediante el empleo de lentes electromagnéticas.
3. En la muestra irradiada ocurren interacciones que afectan al haz de electrones.
4. Las interacciones y efectos son detectadas y transformadas en una imagen.
5. La imagen se forma en un dispositivo (pantalla fluorescente, monitor de televisión, placa fotográfica….).

TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

 De transmisión
 De barrido

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN

Se observa a través del espécimen (trans- iluminación).
El espécimen se corta en láminas ultrafinas (en el orden de nanómetros) que se colocan en una rejilla de cobre, la
cual es bombardeada con un haz de electrones enfocado.
Una silueta del espécimen se proyecta en una pantalla fluorescente o placa fotográfica situada por debajo del
mismo.
La resolución puede ser de 0,2nm.

Elementos que lo conforman

 Emisor de electrones
El haz de electrones de alta energía puede obtenerse de varias maneras (por emisión termoiónica o de campo) y se
realiza aplicando un fuerte campo eléctrico para extraer los electrones del filamento de metal (tungsteno).

 Condensador
Con la introducción del condensador, conformado por una lente electromagnética, el haz de electrones puede ser
enfocado de manera más precisa en el espécimen.

 Sistema óptico
Un microscopio electrónico de transmisión funciona de manera análoga al microscopio de luz.
En lugar de un haz de fotones, se emplea un haz de electrones aumentado y enfocado ya sea por lentes eléctricas
(electrostáticas) o magnéticas (electromagnéticas).
La mayoría de microscopios electrónicos emplean lentes electromagnéticas.

 Platina
Cumple una función similar a la platina en el microscopio fotónico, garantizando el intercambio de especímenes y el
movimiento preciso del mismo durante la observación.

 Pantalla o visor y la cámara fotográfica

La imagen se proyecta en una pantalla fluorescente en la cual la energía cinética de los electrones se transforma en
luz gracias a la fluorescencia.
La pantalla consiste en una superficie revestida de una capa de cristales de sulfato de zinc.
Cada cristal es una unidad que emana luz cuando sobre ella inciden electrones y en consecuencia la resolución de la
pantalla dependerá de la talla de los cristales.

 Sistema de vacío
Los electrones al chocar con las moléculas de aire se dispersan y luego de repetidas
colisiones son detenidos.
Esta dispersión puede arruinar las posibilidades de obtener imágenes bien definidas.
Por eso, el haz de electrones empleado en microscopia electrónica debe viajar en un
espacio al vacío (bien evacuado y sin moléculas de aire).

Algunas aplicaciones
- Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales, animales y humanos.
- Realización de estudios de histoquímica e inmunohistoquímica para identificar
compuestos específicos.
- Reconocimiento de virus y sus características ultraestructurales.
- Estudios de citoquímica.
- Estudios de estructuras moleculares.
- Determinación de estructura cristalina en minerales, metales y otros materiales.
- Estudio de fases y zonas cristalinas en polímeros.
- Determinación del tamaño de partículas.
- Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos.

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO

Se observa la superficie de un espécimen sólido (epi-iluminación).
Se puede lograr una resolución de 10nm y un aumento hasta de 20.000x.
Se producen imágenes muy interesantes en 3D (tridimensionales) gracias a una mayor profundidad de campo.
Se escanea la superficie del espécimen con un haz de electrones (primarios) y los electrones que rebotan
(secundarios) son recogidos por un detector.
La señal se observa en un monitor de televisión.
Los átomos del espécimen producen rayos X que también son detectados.

Diseño del microscopio

Los cortes finos de tejido no muestran el arreglo tridimensional de los constituyentes celulares, y aunque la tercera
dimensión puede ser reconstruida a partir de cortes seriados, es un método largo y pesado.
Permite la visualización de las muestras en 3D y el haz de electrones no atraviesa la muestra, por el contrario, incide
sobre la superficie de la misma y los electrones secundarios son captados por un detector y la señal es enviada a una
pantalla de televisión.
La profundidad de campo obtenida por este microscopio es considerable; la imagen es constituida de zonas
brillantes y zonas oscuras que dan un aspecto tridimensional. Sin embargo, solamente la superficie puede ser
observada. La técnica se emplea para estudiar células intactas y tejidos.
Componentes básicos
 Sistema de alto vacío.
 El filamento emisor de electrones (cátodo).
 Lentes (electromagnéticas, electrostáticas o superconductoras).
 Generador del escaneo: el haz de electrones es desplazado por la superficie del espécimen de una manera
predeterminada.
 Detector de electrones secundarios.
 Pantalla de televisión.

El haz de electrones o electrones primarios, al incidir en la superficie de la muestra genera

electrones secundarios, los cuales se originan del espécimen y son colectados por un
detector de electrones.
Además de electrones secundarios, también se producen rayos X, infra-rojos, y
ultravioleta.
El espécimen es colocado en una platina portaobjeto y puede ser desplazado o rotado en
varias direcciones, permitiendo un amplio rango de posibilidades de observación.
Otros accesorios pueden añadirse al microscopio, tales como computadoras para análisis
directo, impresoras, videocámaras, circuito cerrado de televisión, entre otros.

Algunas aplicaciones
- Morfología de células y tejidos animales, humanos o vegetales.
- Morfología interna de células y tejidos.
- Morfología superficial de minerales.
- Formas de cristalización de minerales.
- Cambios morfológicos de materiales sometidos a tratamientos químicos.
- Estudio de moléculas.
- Reconocimiento de fósiles.

AUMENTOS EN EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

En el microscopio fotónico, para obtener imágenes a mayores aumentos simplemente se cambia el objetivo.
En el microscopio electrónico esto no es posible y el aumento se obtiene modificando el haz de electrones y el
voltaje de la lente proyectora, ya que el aumento de la lente objetivo es fijo.
Por ejemplo, para observar a mayores aumentos es necesario utilizar una mayor e intensa radiación de electrones y
modificar la distancia focal de la lente proyectora, pero disminuyendo a su vez el diámetro del haz, con un tiempo de
exposición del espécimen sumamente corto.
- Al intensificar el haz de electrones se incrementa también la tª, y se puede quemar la muestra que se observa.
- Al aumentar la potencia del haz se reduce el tamaño del área que se observa y el campo visual representa áreas
muy diminutas en el objeto.

De manera inversa, para observar a menores aumentos, el haz de electrones posee un mayor diámetro y el área de
observación a su vez también es mayor; en consecuencia, a mayor diámetro del haz de electrones, menor aumento y
a menor diámetro del haz, mayor aumento.