Primer Congreso Virtual de Ciencias Morfológicas.

Primera Jornada Científica de la Cátedra Santiago Ramón y Cajal

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SILDENAFIL, EFECTO SOBRE EL DESARROLLO DE LA PLACENTA
EN UN MODELO MURINO DE PRE-ECLAMPSIA. RESULTADOS
PRELIMINARES.

Autores:
Carlos Eugenio Motta1, Carolina Natalia Zanuzzi2, María Carolina Grosso3,
Natalia Yanina Picco4, Romina Valeria Bellingeri5, Fabrisio Eduardo
Alustiza6, Adriana Beatriz Vivas7, María Cristina Romanini8, Claudio
Gustavo Barbeito9.

1 Ayudante de primera, Departamento de Patología Animal, Universidad Nacional de Río

Cuarto, Río Cuarto, Argentina.
2 Doctora Jefe de Trabajos Prácticos Histología y Embriología Facultad Ciencias Veterinarias
Universidad Nacional de La Plata, Buenos Aires Argentina, Investigadora Asistente CONICET,
Argentina
3 Doctora, Ayudante de primera, Histología, Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto,
Argentina.
4 Becario Postgrado tipo II CONICET, Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto,
Argentina.
5 Becario Postgrado tipo II CONICET, Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto,
Argentina.
6 Ayudante de primera, Embriología, Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto,
Argentina.
7 Doctora, Profesor asociado, Histología, Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto,
Argentina.
8 Doctora, Profesor adjunto, Embriología, Universidad Nacional de Río Cuarto, Río Cuarto,
Argentina.
9 Doctor Profesor Titular de Histología y Embriología y Profesor Adjunto de Patología
General. Facultad Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata, Buenos Aires
Argentina, Investigadora Independiente CONICET, Argentina

E-mail: cmotta@ayv.unrc.edu.ar

RESUMEN
El crecimiento de los vasos sanguíneos en la placenta depende, entre otros
factores, del óxido nítrico (NO). El metil L-nitroarginina éster (L-NAME) es un
inhibidor de la Óxido Nítrico Sintetasa y se utiliza como modelo de pre-eclampsia
murino. El Sildenafil es un inhibidor específico de la 5-fosfodiesterasa que aumenta
los efectos vasodilatadores del NO sobre el musculo liso vascular. El objetivo fue
determinar los efectos del Sildenafil sobre el desarrollo placentario en un modelo
murino de pre-eclampsia inducida por L-NAME. Se utilizaron 20 ratones hembras
preñadas. Se dividieron en 4 grupos: 1) Control, 2) L-NAME, 3) Sildenafil y 4) L-
NAME+Sildenafil. A partir del día 7 de preñez se administró L-NAME (50 mg/Kg,
SC) y a partir del día 8 Sildenafil (10 mg/Kg, PO). Los tratamientos se realizaron
hasta el día 16 y los animales fueron sacrificados el día 17. Se midieron y pesaron
las placentas. Se realizaron cortes histológicos para medir el porcentaje de
marcación del endotelio fetal placentario con lectina BS-I. Se observó una
disminución estadísticamente significativa del peso de la placenta en los grupo L-
NAME y L-NAME+Sildenafil y una disminución estadísticamente significativa del
porcentaje de marcación en el grupo L-NAME. El tratamiento con L-NAME disminuyó
el peso de la placenta y el porcentaje de marcación del endotelio fetal. Se observó
un aumento de este último cuando se trató conjuntamente con Sildenafil. En
conclusión L-NAME altera el desarrollo de la placenta y el Sildenafil podría
contrarrestar los cambios producidos en las placentas de ratones con pre-eclampsia
inducida por L-NAME.

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PALABRAS CLAVE: Pre-eclampsia; Sildenafil; lectina BS-I; L-NAME; modelo murino.

INTRODUCCIÓN
En humanos y roedores, la decidualización ocurre en la preñez temprana, cuando
células estromales del endometrio proliferan transitoriamente y luego se diferencian
en grandes células poliploides deciduales. La implantación de los conceptos en los
roedores estimula la decidualización en un tiempo y espacio específico. Esto
comienza en la región anti-mesometrial, adyacente al concepto, para formar la
zona decidual primaria. Luego se extiende a través de la mayor parte del área
antimesometrial restante, formando la zona de decidual secundaria. Finalmente, la
decidualización continua en el área mesometrial del endometrio y allí se forma la
placenta definitiva (Bany y Cross, 2006). La placenta de la rata es similar a la de
humanos, ambas son de forma discoide y hemocoriales. El laberinto representa la
interfase entre la circulación materna y fetal en la placenta. Durante la preñez, las
arterias en espiral del útero de la rata experimentan cambios, que son similares a
los cambios fisiológicos en las arterias espirales de humanos, aunque el tiempo de
invasión del intersticio trofoblástico es significativamente diferente (Nash y
Ericsson, 2007).
Las lectinas son proteínas o glicoproteínas que poseen afinidad de unión específica
a residuos sacáridos o glicoconjudados (glicoproteínas o glicolípidos) y son usadas
extensamente como agentes histoquímicos para investigar la distribución de
residuos de azúcar en diversos órganos y tejidos (Sgambati et al., 2007). En los
roedores, se utiliza la lectina BS-1 que se une a las células endoteliales, para que
facilitar la diferenciación de los capilares fetales, que poseen una capa de células
endoteliales, de los espacios vasculares maternos que no poseen células
endoteliales (Lewis et al., 2001).
El óxido nítrico (NO) es uno de los factores claves para la regulación de los cambios
adaptativos que ocurren en los vasos sanguíneos uterinos y placentarios durante la
preñez (Zhu et al., 2005) y puede participar en la invasión vascular del trofoblasto
(Ogando et al., 2003). La formación del NO es catalizada por la enzima oxido nítrico
sintetasa (NOS). El aumento de la producción de NO en úteros de rata durante la
preñez es el resultado del incremento de expresión de la oxido nítrico sintetasa
inducible (iNOS) (Suzuki et al., 2009). La expresión del factor de crecimiento
endotelio vascular (VEGF) activa las enzimas NOS y se libera el NO el cual potencia
la acción del factor angiogénico y de esta manera se favorece la viabilidad
embrionaria (Rivas et al., 2006; Zhu et al., 2005; Vonnahme y Ford, 2003). El
metil L-nitroarginina éster (L-NAME), es un inhibidor de la NOS que reduce la
formación de NO y da lugar a cambios patológicos similares a los observados en
mujeres con pre-eclampsia, tales como la vasoconstricción renal grave, proteinuria,
trombocitopenia (Cauli et al., 2010).
En los animales, se demostró que la liberación de NO puede conducir a la relajación
del músculo liso a través de la vía mediada por monofosfato guanosina cíclico
(cGMP). La duración de la acción del cGMP está controlada mediante una enzima
citosólica, la 5-fosfodiesterasa (5-PDE) (Reyna Villasmil et al., 2008). Se han
identificado inhibidores específicos de distintos subtipos de 5-PDE, los cuales
pueden aumentar los efectos de los nucleótidos cíclicos sobre el tejido blanco (Sher
y Fisch, 2002). El Sildenafil es un inhibidor específico de la 5-PDE, que aumenta los
efectos vasodilatadores del NO sobre el músculo liso vascular ya que previene la
degradación del cGMP. (Sher y Fisch, 2002; Yildirim et al., 2010). Los mecanismos
involucran efectos beneficiosos sobre vías de transducción que estimulan la
angiogénesis, junto con un aumento en el número y la actividad de las células
progenitoras endoteliales (Dussault et al., 2009). En mujeres con endometrio
delgado sometidas a fertilización in vitro (FIV), el Sildenafil ha aumentado el
desarrollo endometrial en un 70%. de las pacientes tratada, aumentando las tasas
de implantación y de embarazo (Sher and Fisch, 2002). El uso de tabletas de

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Sildenafil intravaginales tuvo un efecto antiabortivo en pacientes con abortos

espontáneos repetidos sin causa aparente (El-Far et al., 2009). En ratas, el uso de
Sildenafil no indujo cambios fetales con gestaciones normales (Sasser y Baylis,
2010). La disfuncionalidad de la vía de señalización del NO, produce una
inadecuada perfusión uterina, como se observa en embarazos con pre-eclampsia o
con restricción del crecimiento intrauterino complicada. La investigación en seres
humanos y animales está centrada en las terapias que manipulan la vía de NO,
incluyendo los donadores de NO y Sildenafil (Hale et al., 2010).
Por lo antes mencionado se propuso que en un modelo murino de pre-eclampsia el
uso de Sildenafil favorece los efectos vasodilatadores y estimuladores de la
angiogénesis mediados por NO.

MATERIAL Y MÉTODOS
Animales
Se utilizaron 20 hembras vírgenes de ratón de la cepa Balb/c de 80 a 120 días de
edad, las cuales fueron apareadas con machos adultos. El día de aparición del
tapón mucoso vaginal (post-coital) fue considerado como el día 0 de preñez. Los
animales fueron mantenidos a temperatura e iluminación controladas, con alimento
y agua ad libitum. Los procedimientos y manejo realizados en este trabajo fueron
aprobados por el comité de ética de la Universidad Nacional de Río Cuarto.

Conformación de grupos
Los animales fueron divididos en 4 grupos experimentales:
1) Control (n=5): recibió 0,04 ml de solución fisiológica vía subcutanea (SC) a
partir del día 7 de preñez y 0,04 ml de agua destilada en forma oral (PO) a partir
del día 8.
2) L-NAME (n=5): recibió L-NAME (50 mg/kg) en 0,04 ml de solución fisiológica SC
a partir del día 7 de preñez y 0,04 ml de agua destilada PO a partir del día 8.
3) Sildenafil (n=5): recibió 0,04 ml de solución fisiológica SC a partir del día 7 de
preñez y Sildenafil (10 mg/kg) en 0,04 ml de agua destilada PO a partir del día 8.
4) L_NAME + Sildenafil (n=5): recibió L-NAME (50 mg/kg) en 0,04 ml de solución
fisiológica SC a partir del día 7 de preñez y Sildenafil (10 mg/kg) en 0,04 ml de
agua destilada PO a partir del día 8.
Los procedimientos se repitieron hasta el día 16 de preñez inclusive.
Los animales fueron sacrificados el día 17 de preñez mediante la técnica de
dislocación cervical.

Análisis morfométrico
Para la obtención de las muestras se realizó una laparotomía por la línea media, se
extrajo el útero completo y se contó el número total de fetos.
Posteriormente, el útero fue dividido en sus dos cuernos, las placentas (sin
membranas embrionarias) del cuerno uterino izquierdo se colectaron, midieron y
pesaron para el análisis morfométrico.

Lectinhistoquímica
El cuerno uterino derecho fue inmediatamente fijado en formol tamponado al 10%
con una relación 10:1 de fijador-tejido. Para el análisis histoquímico se procesaron
solamente las vesículas embrionarias centrales del cuero uterino derecho de cada
animal. Mediante la técnica histológica convencional se obtuvieron cortes delgados
para realizar la marcación de las células del endotelio del laberinto placentario con
Lectinhistoquímica, se utilizó la lectina BS-I.
Para evaluar el porcentaje de marcación se fotografiaron los cortes histológicos
(cámara Cannon G5, programa ZoomBrowser Ex 5.0) y se capturaron 5 imágenes
por corte con un aumento de 400x. El cálculo del porcentaje marcado se realizó con
una macros creada con el programa de procesamiento y análisis de imágenes,
ImageJ 1.46j.

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Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA de una vía y se probarón los
supestos de homogeneidad de varianza y de normalidad, mediante el programa
Infostat Versión 2009.

RESULTADOS
Análisis morfométrico
El número y la superficie placentaria de las vesículas embrionarias del cuerno
izquierdo fueron comparadas en los cuatro grupos experimentales. No se
observaron diferencias estadísticamente significativas en el número promedio de
placentas ni en la superficie placentaria para los grupos evaluados. El peso
placentario fue significativamente menor en los animales tratados con L-NAME y
con L-NAME+ Sildenafil en comparación con los no tratados (p=0,0016) (Tabla 1).
Lectinhistoquímica
La figura 1 muestra el tejido placentario marcado con Lectinhistoquímica. La figura
2 corresponde al tejido placentario luego de realizar el análisis con la macros
desarrollada con el programa ImageJ.
El porcentaje de marcación con Lectinhistoquímica fue significativamente menor en
el grupo L-NAME con respecto a los otros grupos (p=0,0025) (Figura 3). En el
grupo L-NAME+Sildenafil no se observo diferencia estadísticamente significativa con
los grupos Control y Sildenafil.

DISCUSIÓN
La disfuncionalidad de la vía de señalización del NO, produce una inadecuada
perfusión uterina. Cauli et al. (2010) demostraron que el tratamiento con L-NAME,
redujo la formación de NO y dio lugar a cambios patológicos similares a los
observados en mujeres con pre-eclampsia. En nuestro trabajo se observó que el
tratamiento con L-NAME disminuyó significativamente el peso placentario promedio
de los grupos tratados con L-NAME y con L-NAME + Sildenafil. La superficie
placentaria fue menor en estos grupos aunque estas diferencias no fueron
estadísticamente significativas.
La pre-eclampsia es un síndrome que se define como un desorden multisistémico.
Es un trastorno que se produce en dos etapas, la primera se caracteriza por una
falla en la remodelación completa de los canales de gran diámetro de las arterias
espirales, con una reducción del flujo sanguíneo placentario. La segunda etapa es
aquella donde la reducción de la perfusión sanguínea induce un estado de hipoxia.
Roberts y Lain (2002) describieron que en ésta etapa disminuye la secreción de
factores angiogénicos, como el VEGF y el factor de crecimiento placentario. En
nuestro estudio se encontró una disminución significativa en el porcentaje de
células endoteliales en el grupo tratado L-NAME con respecto a los otros grupos, lo
que demuestra que la aplicación del L-NAME induce una disminución del área
vascular fetal. Este efecto podría estar mediado por una disminución del NO en el
trofoblasto fetal debido al efecto inhibitorio del L-NAME sobre la NOS. Es bien
conocido que el NO es una molécula de gran importancia en la regulación de los
cambios adaptativos que ocurren en los vasos sanguíneos uterinos y placentarios
durante la preñez (Zhu et al., 2005).
Sasser y Baylis (2010) demostraron que en ratas con gestaciones normales, el uso
de Sildenafil no induce cambios fetales. Nuestros resultados concuerdan con estos
autores ya que no se observaron cambios placentarios en ratones con gestaciones
normales tratados con Sildenafil. Sin embargo, el efecto del L-NAME sobre el
trofoblasto placentario fue contrarrestado por el uso de Sildenafil, esto fue
demostrado por el aumento de las células del endotelio del laberinto placentario
observada en el grupo L-NAME+Sildenafil.

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CONCLUSIONES
La disminución en el porcentaje de células del endotelio del laberinto placentario
junto a la disminución del área y del peso de la placenta, probablemente sean
debido a una reducción del flujo sanguíneo, producto de un estado de hipoxia
placentaria. Estos cambios fueron contrarrestados por el uso del Sildenafil.

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ANEXOS

Tabla 1: Valoración del número, superficie y peso placentario.

Número de Superficie Peso de
Grupos n
placentas placentaria (mm2) placentas (mg)
Control 5 7,0 ± 1,87 6,81 ± 0,45 122 ± 10,95
Sildenafil 5 7,4 ± 0,89 6,82 ± 0,57 116 ± 5,48
L-NAME 5 8,0 ± 1,58 6,24 ± 0,51 100 ± 7,07*
L-NAME+Sildenafil 5 8,8 ± 1,92 6,11 ± 0,57 92 ± 16,43*
Los valores se expresan como el promedio ± SEM. * indica diferencias
estadísticamente significativas con respecto a los otros grupos (p=0,0016). No existen
diferencias entre los grupos marcados estadísticamente significativas.

Figura 1: Laberinto placentario de ratón de 17 días de preñez, marcación de células

endoteliales. Técnica: Lectihistoquímica (BS-I), 400x, contratinción con eosina.

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Figura 2: Laberinto placentario de ratón de 17 días de preñez, marcación de células

endoteliales luego del procesamiento y análisis con el programa ImageJ 1.46j. Se
observa el área de marcación delimitada con negro. Técnica: Lectihistoquímica (BS-
I), 400x, contratinción con eosina.

Figura 3: Porcentaje promedio de marcación de células endoteliales en placenta de

ratón de 17 días de preñez. Técnica: Lectinhistoquímica (BS-I). Letras diferentes
indican diferencias significativas (p=0,0025).