ESPAÑOL PF 07302048 Structural and Biophysical Characterization

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PF-07302048: Caracterización estructural y biofísica de la glicoproteína de pico (P2 S) del SARS-CoV-2 como
antígeno de vacuna
VR-VTR-10741, versión. 2.0
Título: Caracterización estructural y biofísica de la glicoproteína de pico (P2 S) del SARS-CoV-2

como antígeno de vacuna
Número de estudio:N / A
Número(s) del compuesto principal:PF-07302048

090177e195e446ea\Aprobado\Aprobado el: 27 de diciembre de 2020 02:23 (GMT)
Identificadores de compuestos alternativos:N / A
Ciencias del descubrimiento de Pfizer
Carretera del punto oriental

Groton, Connecticut, EE.UU.
CONFIDENCIAL DE PFIZER
Página 1
FDA-CBER-2021-5683-0709157
antígeno de vacuna

INVESTIGADOR PRINCIPAL:(segundo) (6)
CIENTÍFICO(S) CONTRIBUYENTE(S):
(b) (6)
PREPARADO POR:
(b) (6)
APROBADO POR:
(b) (6)
Página 2
FDA-CBER-2021-5683-0709158
antígeno de vacuna

SINOPSIS
El análisis estructural y de unión del SARS-CoV-2 P2 S expresado a partir del ADN que codifica la misma
secuencia de aminoácidos que el ARN BNT162b2 indica que el antígeno P2 S codificado presenta
auténticamente el sitio de unión ACE2 y otros epítopos a los que se dirige la neutralización del SARS-
CoV-2. anticuerpos.
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antígeno de vacuna
TABLA DE CONTENIDO
SINOPSIS................................................. ................................................. ................................3
LISTA DE TABLAS............................................... ................................................. ...................4
LISTA DE FIGURAS ............................................... ................................................. .................4
1. OBJETIVOS ................................................ ................................................. ........................5
2. INTRODUCCIÓN ............................................... ................................................. ................5
3. MATERIALES Y MÉTODOS................................................ ................................................6
3.1. Análisis de citometría de flujo de la unión a P2 S expresado en la superficie celular ................6
3.2. Expresión y purificación de P2 S ................................................. ................................6

3.3. Cinética de unión de P2 S a ACE2 humana inmovilizada y a un anticuerpo monoclonal
neutralizante mediante interferometría de biocapa................................ ...................6
3.4. Crio-EM de P2 S................................................ ................................................. .........7

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................. ................................................9
5. CONCLUSIÓN............................................... ................................................. ...................12
6. DESVIACIONES ................................................ ................................................. ...................12
7. REFERENCIAS ............................................... ................................................. ...................12
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Recopilación de datos CryoEM, reconstrucción 3D y estadísticas de
refinamiento................................. ................................................. ..........8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Unión a P2 S recombinante expresado en la superficie celular...................9
Figura 2. Sensorgramas de interferometría de biocapa para la unión de P2 S a
ACE2-PD y B38 mAb.................... ................................................. .10
Figura 3. Estructura de CryoEM P2 S con una resolución de 3,29 Å ........................... 11
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antígeno de vacuna

Número de estudio: N/A
Área funcional: Ciencias Medicinales
Instalación de prueba: Pfizer Discovery Sciences, Eastern Point Road,

Groton, CT
Fecha de inicio del estudio/pruebas: 07abril2020
Fecha de finalización del estudio/exámenes:19ago2020
1. OBJETIVOS
El propósito de este estudio fue expresar y caracterizar el antígeno vacunal codificado por
BNT162b2.
2. INTRODUCCIÓN
La vacuna contra la enfermedad del coronavirus 2019 (COVID-19) (número de código BioNTech BNT162, número
de código Pfizer PF-07302048) es una vacuna en investigación destinada a prevenir el COVID-19, que es causado
por el síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2 (SARS-CoV-2). ). El coronavirus S es un objetivo
importante de los anticuerpos neutralizantes del virus y es un antígeno clave para el desarrollo de vacunas. S es
una glicoproteína transmembrana responsable del reconocimiento del receptor, la unión a la célula y la fusión
de la envoltura viral con la membrana de la célula huésped, lo que da como resultado la liberación del genoma.
Mientras que el S2 proximal a la membrana es responsable de la fusión de la membrana, el S1 distal a la
membrana, con su dominio de unión al receptor (RBD), reconoce el receptor del huésped, la enzima convertidora
de angiotensina 2 (ACE2) (Zhou y otros, 2020). El RBD forma “cabezas” distales de membrana en el trímero S que
están conectadas al cuerpo mediante una bisagra. En la S nativa, el RBD alterna entre una posición abierta
(arriba) y cerrada (abajo). Aunque se han descrito potentes epítopos neutralizantes cuando el RBD está en la
conformación cerrada "cabeza abajo", la conformación accesible al receptor "cabeza arriba" expone una
amplitud potencialmente mayor de objetivos de anticuerpos neutralizantes (Brouwer y otros, 2020;Liu y otros,
2020; Robbiani y otros, 2020).
La glicoproteína codificada por la vacuna candidata BNT162b2 incluye dos sustituciones de aminoácidos
de la prolina (P2 S) que bloquean la proteína transmembrana en una conformación de prefusión
antigénicamente óptima.Pallesen et al, 2017;Wrapp y otros, 2020). El antígeno P2 S se expresó a partir de
ADN y se caracterizó por su estructura y unión a anticuerpos neutralizantes humanos ACE2 y SARS-CoV-2.
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antígeno de vacuna
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Análisis de citometría de flujo de la unión a P2 S expresado en la superficie celular
Se expresó una construcción pcDNA3.1 Zeo (+) modificada que codifica el antígeno P2 S bajo el control
de un promotor CAG en células Expi293F según el protocolo del kit de transfección Expifectamine 293
suministrado.
Las células se recogieron 48 horas después de la transfección, se lavaron con tampón TBS y se usaron a 4-5 x 104
para cada condición. Las células se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) en TBS +
BSA al 4% + 7-AAD 0,01 mg/ml para detectar células no viables y con (i) anti-6xHis marcado con FITC
1:100 más 10 nM. Dominio de peptidasa ACE2 humana etiquetado con His (ACE2-PD); (ii) Fab IgG
anti-Conejo marcado con Alexa-488 100 nM más RBD Spike anti-SARS-CoV-2 de 33 nM (αRBD, Sino
Biological 40592-T62), Spike S1 anti-SARS-Cov-2 (αS1, Sino Biological 40150-R007), o anti-SARS Spike
S2 (αS2, Novus NB100-56578); o (iii) Fab ant-IgG humano marcado con Alexa-488 100 nM más
anticuerpo terapéutico CR3022 33 nM (αCR3022) (Yuan y otros, 2020), anticuerpo neutralizante B38
(αB38) o anticuerpo neutralizante H4 (αH4) (Wu y otros, 2020). Las células se lavaron con TBS y
luego se analizaron en una placa de 96 pocillos con fondo en V utilizando un sistema de citometría
de flujo Guava EasyCyte HT. Para cada condición, se midieron tres réplicas con 3000 eventos
recopilados por réplica.
3.2. Expresión y purificación de P2 S

Para expresar el SARS-CoV-2 P2 S codificado por BNT162b2 para la caracterización biofísica, se utilizó un
gen que codifica el pico de longitud completa del SARS-CoV-2 (GenBank: MN908947) con dos prolinas
sustituidas en los residuos 986 y 987 (K986P y V987P) seguido de un Se clonó el sitio de proteasa HRV3C
C-terminal y una etiqueta TwinStrep en un vector pcDNA3.1(+) modificado con el promotor CAG. El P2 S
etiquetado con TwinStrep se expresó en células Expi293F.
La purificación de la proteína recombinante se basó en un procedimiento descrito anteriormente, con

modificaciones menores (Cai y otros, 2020). Tras la lisis celular, se solubilizó P2 S en detergente NP-40 al 1%.
Luego, la proteína marcada con TwinStrep se capturó con resina StrepTactin Sepharose HP en NP-40 al 0,5%. P2
S se purificó aún más mediante cromatografía de exclusión por tamaño y eluyó como tres picos distintos en
NP-40 al 0,02 % como se informó anteriormente (Cai y otros, 2020). En la caracterización estructural se utilizó un
pico que consiste en P2 S intacto que migra a alrededor de 150 kDa, así como subunidades S1 y S2 disociadas
(que co-migran justo por encima de 75 kDa). La disociación espontánea de las subunidades S1 y S2 se produce
durante el curso de la purificación de proteínas, comenzando en el punto de extracción de proteínas mediada
por detergente, de modo que las preparaciones de P2 S también contienen S1 y S2 disociados.
3.3. Cinética de unión de P2 S a ACE2 humana inmovilizada y un anticuerpo monoclonal

neutralizante mediante interferometría de biocapa
Unión de P2 S solubilizado y purificado de NP-40 a ACE2-PD y al anticuerpo monoclonal neutralizante

humano B38 (Wu y otros, 2020) se midió mediante interferometría de biocapa a 25 °C en un Octet RED384
(FortéBio). La unión de P2 S se midió en Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM y NP-40 al 0,02%. La
ACE2-PD humana marcada con Avi se inmovilizó en sensores recubiertos con estreptavidina; El anticuerpo
B38 se inmovilizó en sensores recubiertos con proteína G. Para
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En una serie de concentraciones de P2 S, después del equilibrio inicial inicial de 120 segundos, los sensores se
sumergieron en una solución de 10 µg/ml de ACE2-PD o B38 mAb etiquetado con Avi durante 300 segundos
para lograr niveles de captura de 1 nM usando la función de umbral. Luego, después de otros 120 segundos de
referencia, se recogieron datos de unión durante 300 segundos de asociación y 600 segundos de disociación.
Los datos de interferometría de biocapa se recopilaron con el software Octet Data Acquisition versión
10.0.0.87 y se procesaron utilizando el software FortéBio Data Analysis versión 10.0. Los datos se restaron
como referencia y se ajustaron a un modelo de unión 1:1 con R2valor superior a 0,95 para determinar la
cinética y la afinidad de unión utilizando el software de análisis de datos Octet v10.0 (FortéBio).
3.4. Crio-EM de P2 S
Para P2 S etiquetado con TwinStrep, se aplicaron 4 μL de proteína purificada a 0,5 mg/mL a rejillas de malla
Quantifoil R1.2/1.3 de oro de 300 recién recubiertas con óxido de grafeno. La muestra se secó usando un
Vitrobot Mark IV durante 4 segundos con una fuerza de -2 antes de sumergirla en etano líquido enfriado con
nitrógeno líquido. Se recogieron 27.701 micrografías de dos rejillas preparadas de forma idéntica. Los datos se
recopilaron de cada cuadrícula en un rango de desenfoque de -1,2 a
- 3,4 μm con una dosis total de electrones de 50,32 y 50,12 e-/A2, respectivamente, fraccionados en 40
fotogramas durante una exposición de 6 segundos para 1,26 y 1,25 e-/A2/marco. La corrección de movimiento
sobre la marcha, la estimación de CTF y la recolección y extracción de partículas con un tamaño de caja de 450
píxeles se realizaron en Warp (Tegunov y Cramer, 2019), durante el cual se agruparon datos de superresolución
para dar un tamaño de píxel de 0,87 Å. Se extrajeron un total de 1.119.906 partículas. Todo el procesamiento
posterior se realizó en RELION 3.1-beta (Zivanov y otros, 2018). La heterogeneidad de las partículas se filtró con
clasificación 2D y 3D, dando como resultado un conjunto de 73.393 partículas, que se refinaron a 3,6 Å con
simetría C3. La clasificación 3D de este conjunto de datos sin alineación de partículas separó una clase con un
solo RBD hacia arriba, lo que representa 15.098 partículas. Las 58.295 partículas restantes, en las tres
conformaciones 'hacia abajo' de RBD, se refinaron para dar un modelo final de 3,29 Å. El modelo atómico de
PDB ID 6XR8
(Cai y otros, 2020) se instaló un cuerpo rígido en la densidad del mapa, luego se ajustó de manera flexible a la
densidad utilizando el refinamiento del espacio real en Phenix (Adams y otros, 2010) alternando con la construcción
manual en Coot (Emsley y otros, 2010). Las estadísticas de recopilación de datos, reconstrucción 3D y refinamiento del
modelo se enumeran entabla 1.
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antígeno de vacuna
Tabla 1. Recopilación de datos CryoEM, reconstrucción 3D y estadísticas de refinamiento
Recopilación de datos
Equipo de microscopía electrónica Titán Krios (Thermo Fisher Scientific)

Voltaje (keV) 300
Detector Cumbre K2
Filtro de energía Gatan GIF, rendija de 20 ev
aumento nominal 165.000x
Tamaño de píxel (Å) 0,435 (superresolución)
Cuadrícula 1 Cuadrícula 2
Dosis de electrones (e-/A2) 50,32 50.12

Tasa de dosis (e-/A2/seg) 8.4 8.33
Rango de desenfoque (-m) - 1,2 a -3,4 - 1,2 a -3,4
Número de micrografías recolectadas 10.422 17.279
Número de micrografías seleccionadas 27.701
Reconstrucción 3D
Software Deformación, Relion
Número de partículas 58.295

utilizadas Simetría impuesta C3
Resolución global (Å)
Corrección de capa de Fourier = 3.29
0,143 Factor B aplicado (Å2) - 50
Refinamiento
Software fénix, focha
Residuos de proteínas 2,919
Coeficiente de correlación del mapa 0,82
Desviación cuadrática media
Longitud de enlace (Å) 0.011
Ángulos de enlace (-) 0.962
Estadísticas de la trama de Ramachandran (%):
Preferido 90,4
Permitido 9.59
Parte aislada 0
Rotámeros pobres (%) 11.06
Puntuación de MolProbity 2,96
Puntuación EMRinger 2.23
Puntuación de choque (todos los átomos) 13.23
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antígeno de vacuna
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Para confirmar la expresión superficial de P2 S sin etiquetar, así como la capacidad de P2 S para unirse a
ACE2 humana, se realizaron experimentos de citometría de flujo en células no permeabilizadas (Figura 1).
Los anticuerpos contra RBD, S1 y S2 se preincubaron con Fab anti-IgG Alexa-488 para teñirlos y se usó un
tinte de ácido nucleico para separar las células vivas y muertas. Para confirmar la unión de ACE2 humana,
se marcaron células que expresan P2 S con el dominio extracelular de ACE2 humano preincubadas con un
anticuerpo marcado con FITC contra una etiqueta de afinidad en ACE2. Finalmente, los anticuerpos
neutralizantes humanos B38 y H4 anti-RBD aislados de un paciente convaleciente de COVID-19 (Wu y
otros, 2020) y el anticuerpo terapéutico anti-RBD CR3022 (Yuan y otros, 2020) se confirmó de manera
similar que se unen al P2 S expresado en la superficie.
Figura 1. Unión al P2 S recombinante expresado en la superficie celular

El antígeno P2 S se expresó en células Expi293F y la expresión en la superficie se confirmó mediante tinción con anticuerpos contra las
regiones RBD, S1 y S2 de la proteína S de longitud completa. Se confirmó además que el dominio peptidasa ACE2 humano, así como el
anticuerpo terapéutico CR3022 y dos anticuerpos neutralizantes aislados de un paciente convaleciente de COVID-19, B38 y H4, se unen
a la superficie que expresa P2 S. Se utilizó el colorante de ácido nucleico 7-AAD para identificar viables. celdas (cuadrantes inferiores en
diagramas de flujo). La unión a P2 S expresada en superficie sobre el fondo en células vivas se cuantifica en las réplicas en el gráfico de
barras.
Para la caracterización estructural y biofísica, P2 S se expresó en células Expi293F a partir de ADN que codifica
la misma secuencia de aminoácidos que el ARN BNT162b2, con la adición de una etiqueta TwinStrep C-terminal
para la purificación por afinidad. Después de la purificación, como se describe en Métodos, P2 S eluyó como
tres picos distintos en NP-40 al 0,02% como se informó anteriormente.
(Cai y otros, 2020). La proteína del primer pico de una columna de exclusión por tamaño, que contenía P2
S intacto y S1 y S2 disociados, se analizó mediante interferometría de biocapa (Figura 2). el trimerico
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P2 S unido al ACE2-PD humano y un anticuerpo neutralizante humano anti-RBD B38 con

alta afinidad (K aparenteD= 1 nM).
Figura 2. Sensorgramas de interferometría de biocapa para la unión de P2 S a ACE2-PD y

B38 mAb
P2 S con una etiqueta TwinStrep C-terminal expresada en células Expi293F, se solubilizó con detergente y se purificó mediante
cromatografía de afinidad y exclusión por tamaño. La proteína del primer pico de una columna de exclusión por tamaño, que contenía
P2 S intacto y S1 y S2 disociados, se analizó mediante interferometría de biocapa en un Octet RED384 (FortéBio) a 25 °C en un tampón
de funcionamiento que consta de Tris 25 mM, pH 7,5, 150 mM. NaCl, EDTA 1 mM y NP-40 al 0,02 %. Sensorgramas que muestran la
cinética de unión de P2 S etiquetado con TwinStrep a inmovilizadosA, ACE2-PD humana y B, Anticuerpo monoclonal B38. La
concentración más alta probada para P2 S fue 71 nM con 2 diluciones más de 3 veces. Las curvas de unión se ajustaron globalmente a
un modelo de unión Langmuir 1:1 con R2valores superiores a 0,95. Datos de enlace reales (negro) y el mejor ajuste de los datos a un
modelo de enlace 1:1 (verde). Los parámetros cinéticos aparentes se proporcionan en los gráficos.
El P2 S purificado etiquetado con TwinStrep se caracterizó estructuralmente mediante crioEM. La

clasificación 2D de partículas a partir de datos crioEM reveló una población de partículas que se parece
mucho a la conformación de prefusión de la proteína de pico del SARS-CoV-2 (figura 3A). El procesamiento
y refinamiento de este conjunto de datos produjo un mapa 3D de alta calidad con una resolución nominal
de 3,29 Å (figura 3B), en el que se instaló y reconstruyó un modelo atómico previamente publicado (PDB
ID: 6VSB). El modelo reconstruido (figura 3C) muestra una buena concordancia con las estructuras
reportadas de prefusión de tipo salvaje de longitud completa (Cai y otros, 2020) y su ectodominio con
mutaciones P2 (Wrapp y otros, 2020). Clasificación tridimensional del conjunto de datos (figura 3D) mostró
una clase de partículas que estaban en una conformación RBD 'arriba' (accesible para la unión al
receptor), dos RBD 'abajo' (cerrada) y representaban el 20,4% de las moléculas triméricas. El resto estaban
en la conformación "hacia abajo" de RBD. El RBD en la conformación 'arriba' estaba peor resuelto que
otras partes de la estructura, lo que sugiere flexibilidad conformacional y un equilibrio dinámico entre los
estados 'arriba' y 'abajo' de RBD como también lo sugieren otros (Cai y otros, 2020;Henderson y otros,
2020).
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antígeno de vacuna
Figura 3. Estructura de CryoEM P2 S con una resolución de 3,29 Å

A. Promedios de clase 2D representativos de partículas P2 S etiquetadas con TwinStrep extraídas de micrografías crioEM. Borde
de la caja: 39,2 nm.B.Curva de correlación de capa de Fourier del refinamiento estándar de oro RELION del trímero P2 S.C. Mapa
crioEM de 3,29 Å de P2 S etiquetado con TwinStrep, con modelo atómico ajustado, que muestra vistas superior (perpendicular
al eje triple) y lateral (paralela al eje triple). El modelo CryoEM se basa en PDB 6VSB y se instaló en la estructura mediante
reconstrucción manual en Coot y refinamiento en espacio real en Phenix.
Se recolectaron aproximadamente 28 000 micrografías utilizando un microscopio electrónico Titan Krios que operaba a un voltaje de
aceleración de 300 kV, y el procesamiento de imágenes y reconstrucciones 3D se realizaron utilizando Warp y RELION.D. Diagrama de
flujo para el procesamiento de datos crio-EM del complejo, que muestra promedios de clase 3D. Los mapas de P2 S producidos por
clasificación 3D indican cierta heterogeneidad en el posicionamiento de los dominios RBD. Los porcentajes de la población de partículas
representadas en cada clase se indican debajo de los modelos.
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antígeno de vacuna
5. CONCLUSIÓN
Demostramos que la secuencia de ARN BNT162b2 codifica un P2 S recombinante que puede presentar
auténticamente el sitio de unión ACE2 y otros epítopos a los que se dirigen los anticuerpos neutralizantes
del SARS-CoV-2.
La unión de la superficie celular expresó P2 S al receptor ACE2 humano y se confirmó un panel de mAb
neutralizantes humanos en células mediante citometría de flujo. Se confirmó que la proteína expresada a partir
de ADN con la secuencia de aminoácidos P2 S codificada por BNT162b2 estaba en la conformación de prefusión
mediante crio-EM. Este análisis mostró que el RBD antigénicamente importante puede asumir la conformación
'arriba', con el sitio de unión al receptor, rico en epítopos neutralizantes, accesible en una proporción de las
moléculas (Zost y otros, 2020). Los estados alternativos observados reflejan un equilibrio dinámico entre las
posiciones 'arriba' y 'abajo' de RBD.
(Cai et al, 2020; Henderson et al, 2020). La unión de P2 S expresada y purificada a ACE2 y a un
anticuerpo monoclonal neutralizante demuestra aún más su integridad conformacional y antigénica.
6. DESVIACIONES
N/A
7. REFERENCIAS
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antígeno de vacuna
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Título: Caracterización estructural y biofísica de la glicoproteína de pico (P2 S) del SARS-CoV-2

Número(s) del compuesto principal:PF-07302048

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Ciencias del descubrimiento de Pfizer

Carretera del punto oriental

Título: Caracterización estructural y biofísica de la glicoproteína de pico (P2 S) del SARS-CoV-2

INVESTIGADOR PRINCIPAL:(segundo) (6)

Título: Caracterización estructural y biofísica de la glicoproteína de pico (P2 S) del SARS-CoV-2

3.2. Expresión y purificación de P2 S ................................................. ................................6

3.4. Crio-EM de P2 S................................................ ................................................. .........7

7. REFERENCIAS ............................................... ................................................. ...................12

Título: Caracterización estructural y biofísica de la glicoproteína de pico (P2 S) del SARS-CoV-2

Número de estudio: N/A

Área funcional: Ciencias Medicinales

Instalación de prueba: Pfizer Discovery Sciences, Eastern Point Road,

Fecha de inicio del estudio/pruebas: 07abril2020

Fecha de finalización del estudio/exámenes:19ago2020

3.2. Expresión y purificación de P2 S

La purificación de la proteína recombinante se basó en un procedimiento descrito anteriormente, con

3.3. Cinética de unión de P2 S a ACE2 humana inmovilizada y un anticuerpo monoclonal

Unión de P2 S solubilizado y purificado de NP-40 a ACE2-PD y al anticuerpo monoclonal neutralizante

Tabla 1. Recopilación de datos CryoEM, reconstrucción 3D y estadísticas de refinamiento

Equipo de microscopía electrónica Titán Krios (Thermo Fisher Scientific)

Dosis de electrones (e-/A2) 50,32 50.12

Número de partículas 58.295

Figura 1. Unión al P2 S recombinante expresado en la superficie celular

P2 S unido al ACE2-PD humano y un anticuerpo neutralizante humano anti-RBD B38 con

Figura 2. Sensorgramas de interferometría de biocapa para la unión de P2 S a ACE2-PD y

El P2 S purificado etiquetado con TwinStrep se caracterizó estructuralmente mediante crioEM. La

Figura 3. Estructura de CryoEM P2 S con una resolución de 3,29 Å

Emsley P, Lohkamp B, Scott WG y col. Características y desarrollo de Coot. Acta Crystallogr D

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