Guía de Aplicación - Guía de Diseño de Ensayos de QPCR en Tiempo Real para Experimentos de Expresión Génica (PCR-10127-AG, Primera Edición)

22/2/2021 Guía de aplicación: guía de diseño de ensayos de qPCR en tiempo real para experimentos de expresión génica (PCR-10127-AG, primer…
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Guía de diseño de ensayos de qPCR en tiempo real

Orientación para experimentos de expresión génica
Primera edición
www.idtdna.com
https://translate.googleusercontent.com/translate_f#5 1/26
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qPCR Guia de APLICACION

Primera edición
Gestión de editores y colaboradores
Nicola Brookman-Amissah, PhD 1 ; Hans Packer, PhD 1 ; Ellen Prediger, PhD 1 ; Jaime Sabel 1
Colaboradores
Stephen Gunstream 1 ; Jan Hellemans, PhD 2 ; Aurita Menezes, PhD 1 ; Sharon Rouw 1 , Brendan Owens 1 ;
Scott Rose 1 , PhD 1 ; Rick Sander 1 ; Jo Vandesompele, PhD 2
1 Tecnologías de ADN integradas; 2 Biogazelle NV, Bélgica; Universidad de Gante, Bélgica
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Tabla de contenido
1. Introducción 5
2. Selección y diseño del ensayo de nucleasa 5 ' 6
una. Consideraciones generales de diseño 6
I. Imprimaciones 8
ii. Sondas 9
iii. Amplicones 9
iv. Temperatura de fusión (Tm) 9
C. Tintes de reportero 11
D. QPCR multiplex 13
mi. Ensayo prediseñado frente a ensayo personalizado 15
3. Replica y controla dieciséis
una. Replica dieciséis
B. Controles negativos 17
C. Controles positivos 17
4. Mezclas maestras 19
5. Ensayos de qPCR PrimeTime y productos asociados 21
una. Ensayos qPCR prediseñados PrimeTime 21
B. Ensayos de qPCR personalizados PrimeTime 21
C. Sondas de doble extinción ZEN y TAO 22
D. Mezcla maestra de expresión genética PrimeTime 23
mi. Otros reactivos útiles de IDT 23
I. Oligonucleótidos de ADN ultramer 23
ii. Fragmentos genéticos gBlocks 23
iii. Conjuntos de genes 24

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iv. Ensayos de genes de referencia para normalización 24
v. Reactivos de detección y control de nucleasas 24
vi. Búfer IDTE 24
vii. H 2 O libre de ARNasa 24
6. Herramientas de software para el diseño de ensayos y la evaluación de cebadores 25
una. Herramienta de selección de ensayo qPCR prediseñada 25
B. Herramienta PrimerQuest 25
C. Herramienta de selección de tintes PrimeTime Multiplex 25
D. Herramienta NCBI BLAST 25
mi. Herramientas y calculadoras adicionales 26
7. Resumen 27
8. Referencias 28

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1. Introducción
Esta guía le aconsejará sobre el diseño de ensayos de PCR cuantitativa (qPCR) eficaces para
estudios de expresión. Incluye la experiencia de nuestros científicos con recomendaciones y consejos para el ensayo.
diseño, así como listas de reactivos útiles y programas de software en línea gratuitos que se pueden utilizar para ayudar
diseño de cebador y ensayo.
A diferencia del criterio de valoración, la PCR con transcripción inversa (RT-PCR), que se utiliza para determinar la presencia o
ausencia de un producto génico en particular, PCR en tiempo real, qPCR o RT-PCR (denominado qPCR
a lo largo de esta guía) puede proporcionar una medida del número de copias iniciales y detectar pequeñas
diferencias en los niveles de expresión entre muestras. qPCR involucra reactivos fluorescentes, que
Permitir a los investigadores observar la acumulación de productos de PCR durante toda la amplificación y
eliminar la necesidad de ejecutar un gel, reduciendo la duración del proceso y la posibilidad de
contaminación. La amplificación y cuantificación ocurren simultáneamente utilizando

termocicladores equipados con detectores de fluorescencia.
Si bien la PCR de punto final es sólida y casi siempre produce "un resultado", garantizar que qPCR sea
cuantitativo, preciso y reproducible requiere un diseño, una configuración y una optimización cuidadosos del ensayo.
Diseño deficiente del ensayo de qPCR: condiciones de reacción imperfectas (p. Ej., Elección de mezcla maestra, cebador o sonda
Tm), la presencia de inhibidores o polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) subyacentes: puede provocar
amplificación subóptima y resolución de problemas extensa.
Incluso el uso de ensayos previamente identificados (por ejemplo, de la literatura) que no fueron validados bajo
sus condiciones de reacción específicas (por ejemplo, método de extracción de ARN, reactivos de ensayo, termociclador),
requieren la repetición de experimentos, lo que implica una pérdida de tiempo y recursos valiosos, incluidas muestras valiosas [1].
Para lograr resultados confiables e interpretables de qPCR, los siguientes factores importantes deben ser
considerado:
• El diseño del cebador y la sonda son cruciales para el éxito del experimento.
• El instrumento de PCR en tiempo real dictará ciertos parámetros del experimento; importante, algunos
Los instrumentos no son compatibles con algunos tintes fluorescentes.
• Si está ejecutando un experimento múltiple, deberá incorporar consideraciones adicionales:

particularmente en el diseño del ensayo y elección de tintes.
• Como paso final antes de configurar la reacción, determine los controles que ejecutará. Incluir
controles positivos y negativos, y asegúrese de calcular esas reacciones adicionales en su total
número de reacciones.
• Utilice siempre reactivos libres de ARNasa y DNasa, verifique sus fechas de vencimiento y verifique su
concentraciones.
Empecemos.

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2. Selección y diseño del ensayo de nucleasa 5 '
una. Consideraciones generales de diseño

Conozca su gen: un ensayo bien diseñado comienza con la comprensión del gen de interés,
incluido el conocimiento de las variantes de la transcripción y su organización de exones. Utilice bases de datos como
Ensembl (Instituto Europeo de Bioinformática del Laboratorio Europeo de Biología Molecular) o GenBank ®
(Centro Nacional de Información Biotecnológica de EE. UU., NCBI) bases de datos para identificar uniones de exones,
variantes de empalme y ubicaciones de los SNP. Para genes que tienen múltiples variantes de transcripción, alinee relacionados
transcripciones para comprender la superposición de exón utilizando un programa, como Clustal (Fundación de Ciencias
Ireland y University College Dublin), o herramientas en línea, como Genome Data Viewer (NCBI).
Para diseños específicos de transcripciones, apunte a cebadores y sondas dentro de exones exclusivos de las transcripciones de
interés y utilice la herramienta BLAST ® ( Herramienta básica de búsqueda de alineación local; NCBI) para garantizar que el cebador y la sonda
Las secuencias no ocurren en transcripciones relacionadas ni reaccionan de forma cruzada con otros genes dentro de la especie (ver
Asegúrese de la sección de especificidad a continuación). Para diseños comunes de empalme, apunte cebadores y sondas dentro
exones encontrados en todas las variantes de transcripción.
Gestionar el posicionamiento de SNP: con el mayor enfoque en la secuenciación de alto rendimiento, el número
de SNP identificados en el genoma humano está aumentando rápidamente. En el genoma humano, los SNP son
presentes en al menos el 1% de la población y ocurren en promedio una vez cada pocos cientos de bases [2].
Dada la alta frecuencia de aparición de SNP, no es realista intentar evitar los SNP por completo cuando
diseñar ensayos de PCR / qPCR. Sin embargo, realizar PCR utilizando cebadores y secuencias de sonda que
Los sitios SNP superpuestos pueden tener un impacto dramático en una reacción o pueden tener poco o ningún impacto. Específicamente,
la posición de los SNP subyacentes a un cebador o sonda puede influir en la Tm del cebador y la sonda, la eficiencia
de la extensión de la polimerasa, e incluso la especificidad del objetivo. Para obtener los datos más precisos,
Es importante saber cómo los diseños de sus ensayos se superponen a los SNP y gestionar este posicionamiento (consulte
el artículo del boletín IDT DECODED , Consideración de los SNP al diseñar ensayos de PCR y qPCR).
Garantizar la especificidad: asegúrese de que tanto los cebadores como la sonda sean específicos del objetivo y no
complementario a otras secuencias. Utilice BLAST para analizar las secuencias para asegurar su especificidad.
La herramienta BLAST encuentra regiones de similitud local entre secuencias. Ingrese un número de acceso
o la secuencia en formato FASTA y compararla con el genoma de una especie específica o con todas
Bases de datos BLAST. BLAST permite búsquedas en bases de datos de nucleótidos o proteínas y proporciona
la significación estadística de las coincidencias (para más información, consulte el boletín IDT DECODED
artículo, Consejos para utilizar BLAST para localizar cebadores de PCR ; ver también la Sección 6d).
Ensayos de qPCR prediseñados por IDT
Los ensayos qPCR prediseñados PrimeTime se generan mediante un algoritmo de diseño que tiene en cuenta
estos parámetros generales de diseño. Los cebadores y las secuencias de la sonda han sido analizados por
la herramienta BLAST y evaluó los SNP subyacentes. Consulte la Sección 5a para obtener más información.

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Trabajar con muestras limitadas o objetivos de baja abundancia: para protocolos RT-qPCR de dos pasos, el
La cantidad de entrada de cDNA utilizada para qPCR puede regularse para aumentar la cantidad de diana disponible
para la detección. Esto es útil cuando se trabaja con objetivos de baja abundancia cuando la muestra no está limitada.
Cuando la muestra es limitada, preamplificación de ARN (por amplificación lineal, isotérmica) o primera hebra
El cDNA, antes de qPCR, puede aumentar la cantidad de diana detectable para transcripciones de baja abundancia
de pequeñas cantidades de muestra. Este paso adicional a menudo se agrega al realizar análisis de una sola celda
o trabajar con muestras clínicas, biopsias con aguja fina, muestras de microdisección capturadas con láser o
Células generadas por FACS.
Publicaciones MIQE
La información en este manual está diseñado para seguir las normas descritas en el
Directrices MIQE: información mínima para la publicación de PCR cuantitativa en tiempo real
experimentos [3]. El propósito de las pautas de MIQE descritas en esta publicación es
proporcionar un conjunto mínimo de requisitos para realizar experimentos de qPCR que permitan a otros
investigadores para replicar los hallazgos. En IDT recomendamos que los investigadores que utilizan RT-qPCR
Revise esas pautas junto con esta guía para ayudar al rendimiento, la reproducibilidad,
y publicación de datos experimentales.
Dos publicaciones actualizadas, MIQE resumen: Implementación práctica del estándar mínimo
directrices para experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real basados en fluorescencia [4] y
Revelación de la secuencia del cebador: una aclaración de las directrices MIQE [5], proporciona información adicional
información sobre la entrega de muestras, condiciones experimentales, normalización a genes de referencia,
y análisis de datos.

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B. Cebadores y sondas
Es importante prestar una cuidadosa consideración a las ubicaciones y características de los cebadores, sondas,
y amplicones antes de comenzar cualquier experimento de PCR en tiempo real. Particularmente crucial para imprimaciones y
sondas se asegura de tener una temperatura de fusión adecuada (Tm), que determina la
condiciones bajo las cuales los cebadores y la sonda se unirán a su secuencia objetivo. Longitud del oligo
y el contenido de GC afectarán a la Tm. Nuestras recomendaciones para cebadores, sonda y amplicón
Las especificaciones se proporcionan en el siguiente texto y se resumen en la Tabla 1. Además, proporcionamos
un conjunto de herramientas en línea gratuitas ( programas SciTools) que ayudan en la selección y diseño de cebadores y sondas.
Consulte la Sección 6 para obtener más información.
Imprimaciones Investigacion Amplicón
Abarcar Ideal Abarcar Ideal Abarcar Ideal
Largo 18-30 nt 22 nt 20-28 nt * 24 nt 70-150 pb 100 pb
Temperatura de fusión 60–64 ° C 62 ° C 66–70 ° C 68 ° C N/A N/A
Contenido de GC 35–65% 50% 35–65% 50% N/A N/A
* Para sondas que no contienen aglutinante de surcos menores (MGB) propiedades mejoradas de Tm
Tabla 1. Especificaciones recomendadas para cebadores, sondas y amplicones. Estas especificaciones se basan en una reacción final.
composición de KCl 50 mM, 3 mM MgCl , y dNTPs 0,8 mM.
2
I. Imprimaciones
Tm: Normalmente, se utiliza una temperatura de recocido (Ta) de 60 ° C durante la PCR. La fusión óptima
La temperatura (Tm) de los cebadores está entre 60 y 64 ° C, con una temperatura ideal de 62 ° C, que
se basa en las condiciones medias y los factores asociados con el PCR. La temperatura de fusión
de los 2 cebadores no debe diferir en más de 4 ° C para que ambos cebadores se unan simultáneamente
objetivos y amplificar eficientemente el producto.
Longitud: Apunte a longitudes de imprimación de 18 a 30 bases con un equilibrio entre la temperatura de fusión,
consideraciones de pureza, especificidad y estructura secundaria.
Contenido de GC: asegúrese de que los cebadores sean específicos del objetivo y que no contengan regiones
de 4 o más G consecutivos [6]. El contenido de GC debe estar dentro del rango de 35-65%, con un
contenido ideal del 50%, que permite la complejidad manteniendo una secuencia única. Evitar
secuencias que pueden crear estructuras secundarias, autodímeros y heterodímeros; usar programas
tales como el Herramienta IDT OligoAnalyzer (Sección 6e) para encontrar sitios potenciales que probablemente se formen
estas estructuras.

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ii. Sondas
Tm: La temperatura de fusión de la sonda debe ser de 6 a 8 ° C más alta que la de los cebadores y debe
caen dentro del rango de 66-70 ° C para un protocolo estándar de dos pasos. Si la temperatura de fusión es demasiado
bajo, la sonda no se unirá al objetivo. En este caso, los cebadores pueden amplificar un producto, pero como el
La sonda no está unida a un objetivo, no se degradará proporcionalmente y, por lo tanto, no podrá
proporcionan la fluorescencia necesaria para detectar el producto.
Longitud: la longitud de una sonda apagada debe ser de 20 a 30 bases para lograr una Tm ideal
sin aumentar la distancia entre el tinte y el extintor, de modo que el extintor no
absorber más la fluorescencia del tinte (es decir, sondas con un extintor de terminal único que
más de 30 bases pueden funcionar mal debido a la distancia entre el extintor y el tinte).
Sondas de doble extinción, como las que incluyen moléculas IDT ZEN o TAO como secundarias,
extintor interno, permiten el uso de sondas más largas, mientras que proporciona un fuerte enfriamiento y aumento
señal. Consulte la Sección 5c para obtener más información sobre las sondas de doble enfriamiento.
Contenido de GC: apunte a un contenido de GC de 35 a 65% y evite una G en el extremo de 5 'para evitar el enfriamiento
del fluoróforo 5 '. Al igual que con los cebadores, evite secuencias que puedan crear estructuras secundarias.
o dímeros.
Ubicación: idealmente, la sonda debe estar muy cerca del cebador directo o inverso, pero no
superposición, aunque esto no es absolutamente necesario. Las sondas pueden diseñarse para unirse a cualquier hebra
del objetivo.
iii. Amplicones
Longitud: diseño de amplicones de 70 a 150 pb, lo que permitirá que los cebadores y la sonda compitan por
hibridación y proporcionar una secuencia que sea lo suficientemente larga para que todos los componentes se unan. Esta longitud
se amplifica más fácilmente utilizando condiciones de ciclo estándar. Amplicones más largos de hasta 500 bases pueden
generarse, pero las condiciones del ciclo deberán modificarse para tener en cuenta el aumento de extensión
hora. Los amplicones o los diseños de ensayo deben abarcar una unión exón-exón para reducir la posibilidad de
contaminación genómica.
Tm: Calcule todas las temperaturas de fusión en condiciones de PCR en tiempo real. Parámetros estándar para
qPCR son K + 50 mM , Mg 2+ 3 mM y dNTP 0,8 mM; sin embargo, pueden variar mucho de esto,
particularmente con respecto a la concentración de Mg 2+ . Consulte la siguiente sección para obtener más información sobre
calcular la temperatura de fusión.
iv. Temperatura de fusión (Tm)

Durante el paso de hibridación de la PCR, los cebadores y las sondas se hibridan con los objetivos, formando dúplex cortos.
La estabilidad de estos dúplex se describe mediante la temperatura de fusión: la temperatura a la que

un dúplex de oligonucleótidos es 50% monocatenario y 50% bicatenario (Figura 1).

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La temperatura de fusión es un parámetro de diseño clave. Las predicciones inexactas de Tm aumentan la probabilidad
de diseño de ensayo fallido. Ofrecemos varias herramientas de software gratuitas (programas SciTools; consulte la Sección 6) en
el sitio web que puede predecir los valores de Tm a partir de secuencias de oligonucleótidos y composición de reacciones.
A menudo se cree erróneamente que Tm es únicamente una propiedad de la secuencia de oligonucleótidos y
independiente de las condiciones experimentales. La temperatura de fusión depende del oligonucleótido
secuencia, concentración de oligonucleótidos y cationes presentes en el tampón, específicamente monovalente
([Na + ]) y concentraciones de sal divalente ([Mg 2+ ]) (Figura 2). Por esta razón, la temperatura de fusión
para condiciones experimentales específicas deben calcularse utilizando los programas IDT SciTools (consulte la Sección 6
para obtener información sobre qué programas de SciTools se adaptan mejor a sus necesidades).
Figura 1. Perfiles de fusión para imprimaciones de varias longitudes.
100
15 pares de bases
Las reacciones se realizaron utilizando un tampón de PCR que contenía
20 pares de bases
30 pares de bases Mg 1 mM , KCl 50 mM, Tris 10 mM. Contenido de GC para todos

2+
80 los cebadores fue ~ 50%.
60
40
Dúplex (%)
20
30 40 50 TM 60 70 80 90
Temperatura (ºC)
Herramienta gratuita en línea que predice los valores de Tm
La herramienta OligoAnalyzer ha sido el resultado de una investigación continua en termodinámica y
innovación en IDT. Tiene en cuenta los efectos del oligonucleótido, catión, dNTP y sal.
concentraciones, secuencia de oligonucleótidos e interacciones con el vecino más cercano. Consideración
de todos estos factores permite una predicción precisa del oligonucleótido Tm específico para su
condiciones de reacción.
Los algoritmos predictivos se han mejorado significativamente recientemente; el método del vecino más cercano
predice Tm con un mayor grado de precisión que los métodos utilizados anteriormente [7]. Fórmulas más antiguas,
que no tienen en cuenta las interacciones entre pares de bases vecinos, proporcionan predicciones de Tm
que son demasiado inexactos para el diseño de PCR en tiempo real. Los científicos de IDT han publicado estudios experimentales
sobre los efectos de Na + , K + y Mg 2+ sobre la estabilidad de los dúplex de oligonucleótidos y han propuesto
un modelo con mayor precisión [8]. La corrección lineal de Tm se ha utilizado previamente para tener en cuenta
efectos estabilizadores de la sal, pero los datos de fusión de un gran conjunto de oligonucleótidos demostraron que no
los efectos lineales son sustanciales y deben tenerse en cuenta [8].

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Figura 2. La concentración de sal afecta a la Tm. La estabilidad de un 25 bp
dúplex (CTG GTC TGG ATC TGA GAA CTT CAG G) varía con
Concentraciones de K y Mg . Unión competitiva de iones a
+ 2+
Se observa ADN.
76
74
72
(ºC)
70
TM
68
66
100 mM
64
1M
10 mM
100 mM
[K + ] 10 mM [Mg 2+ ]
1 mM
1 mM
Los tampones de PCR también contienen trifosfatos de desoxinucleósido (dNTP), que se unen a iones de magnesio (Mg 2+ )
con mucha mayor afinidad que el ADN. Dado que los dNTP disminuyen la actividad del Mg 2+ libre , la Tm también puede ser
disminuyó [8] (Figura 2). El mejor algoritmo predictivo también considera este efecto. IDT SciTools
Las herramientas de diseño (ver Sección 6) emplean el último método del vecino más cercano, parámetros termodinámicos
[9-11], y el modelo mejorado de efectos de la sal [8] para lograr predicciones de fusión de última generación
temperaturas con un error medio de aproximadamente 1,5 ° C.
C. Tintes de reportero
La elección del tinte fluorescente dependerá del instrumento que esté utilizando y la compatibilidad de
el tinte con el instrumento. La Tabla 2 enumera los tintes que recomendamos que sean compatibles con los
instrumentos de PCR en tiempo real. Sin embargo, esta lista es limitada y puede estar sujeta a cambios. Consulte su
pautas del fabricante del instrumento para verificar tintes compatibles y condiciones de ciclo correctas. FAM
es el más popular de estos tintes y, a menudo, es más sensible que algunos de los otros tintes disponibles.

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Tinte y longitud de onda máxima de emisión
518 nanómetro
536 nanómetro
548 nm 551 nm 556 nanómetro
557 nm 563 nanómetro
605 nanómetro
615 nanómetro
640 nm 665 nm 667 nm 670 nm 710 nm
METRO
Instrumento FA TET JOSÉ
Akima
Y Y
ellow
MALEFICIO
MAX TYE563 Cy3
AMRA
T ROX LC 610
rojo
exas
T rojo TEXAS
615 LC 640 TYE665 Cy5 Quásar
670 LC 705
Agilent
AriaMx • o o o • o o • o • X X X o o • X X
Biosistemas aplicados
7000 • o • o o1 o X X • # X X X X X X X X
7300 (prisma) • X • o o1 o X X • # X X X X X X X X
7500 (prisma) • X • o o1 o o • • # o • o o o • o X
7500 HT (rápido) • X • o o1 o o • • # o • o o o • o X
7700 • • • o • o X X • # X X X X X X X X
7900 (prisma) • • • o o1 o X X • # X X X X X X X X
7900HT • • • o o1 o X X • # X X X X X X X X
Paso uno • o • o o1 o X X X # X X X X X X X X
StepOnePlus • o • o o1 o X X • # X X X X X X X X
Viia 7 • • • o • o o o • # X o o X o o X o
QuantStudio 3 • • • o • o o • • • X • o X X X X X
QuantStudio 5 • • • o • o o • • • X • X X o • X X
QuantStudio 6 Flex • o • o o1 o o • • # o • o o o o o X
QuantStudio 7 • o • o o1 o o • • # o • o o o o o X
QuantStudio 12K flexible • • • o • o o o • # o o o o o o o X
BioRad
CFX384 • o o o • o X X o • o • • o o • • X
CFX96 • o o o • o X X o • o • • o o • • X
Chromo4 • •1 o o • o X X X X X X X X X X X X
Conectar • • o1 o •1 X X X X X X X X X X X X X
iCycler • o o o • o o o o o o • o o o • X X
MiniOpticon • o o o • o X X X X X X X X X X X X
MiniOpticon 2 • o o o • o X X X X X X X X X X X X
MyIQ2 • o o o • o X X X X X X X X X X X X
MyIQ5 • o o o • o o o • o o • o o o • X X
QX100 • X o o •1 X X X X X X X X X X X X X
QX200 • X o o •1 X X X X X X X X X X X X X
Cefeida
Smartcycler • • o o o o o • X o o • o o o • o X
Smartcycler II • • o o o o o • X o o • o o o • o X
Illumina
Eco • o o1 o •1 X X X X • X o o X o • • X
Qiagen
Rotor-gen Q • • • o • • X X X • • • o X o • o •
Rotor-gene 6000 • • • o • • X X X • • • • X • • • X
Roche
LC 2.0 •2 X •2 o •2 •2 X X X •2 •2 •2 •2 •2 •2 •2 •2 •2
LC480 • o •1 o •1 o o o o o • o o • o • X o
LC1536 • o o o • o o o o o o o o o o o X X
LC Nano • o o o • o o o o o • • o o o • X X
LC96 • X o1 o • X X X X X • • • X X • X X
• Colorantes reporteros proporcionados o recomendados por el proveedor

o Tintes aptos para instrumentos, pero pueden requerir calibración
X Instrumento incapaz de soportar
# El instrumento usa el canal para un tinte de referencia
1 El instrumento funciona con VIC, por lo que JOE o Yakima Yellow pueden servir como alternativa si se calibran / prueban.
2 Roche recomienda ejecutar la compensación de color para cualquier juego de tinte utilizado.
Tabla 2. Compatibilidad del instrumento con tintes indicadores.

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D. QPCR multiplex
En la qPCR multiplex, se amplifican múltiples dianas en un solo tubo de reacción. Cada objetivo se amplifica
mediante un conjunto diferente de cebadores y una sonda marcada de forma única que distinguirá cada amplicón de PCR.
La multiplexación ofrece algunas ventajas sobre la PCR de reacción única, incluida la necesidad de una
menor cantidad de material de partida, mayor rendimiento, menores costos de reactivos y menos muestra
manejo. Sin embargo, el diseño experimental para multiplexación es más complicado porque el
la amplificación de cada objetivo puede afectar a otros en la misma reacción. Por lo tanto, una cuidadosa consideración
de diseño y optimización de las reacciones es fundamental. Para incorporar todos los parámetros necesarios,
Recomiendo encarecidamente utilizar una herramienta de diseño para cebadores y sondas. Se pueden encontrar herramientas adecuadas en
Sección 6.
1. Asegúrese de que los conjuntos de cebadores y sondas no sean complementarios entre sí. Utilice BLAST para
analizar las secuencias y asegurarse de que no sean complementarias. Para obtener ayuda con el uso de BLAST
herramienta, consulte el artículo del boletín IDT DECODED ,Consejos para utilizar BLAST para localizar cebadores de PCR .
2. Cada objetivo debe identificarse con un tinte indicador separado. Seleccione tintes con poca o ninguna superposición
en sus espectros de emisión (ver Tabla 3; también, la Sección 6 proporciona información sobre un
herramienta de selección de tinte multiplex). Algunos instrumentos son compatibles solo con ciertos tintes (ver
Sección 2c, arriba), por lo tanto, consulte la documentación de su instrumento para asegurarse de que los tintes estén
compatible. Como regla general, es una buena idea seleccionar FAM para cualquier transcripción de copia baja
porque tiene una señal fuerte. Los fluoróforos de señal más baja se pueden usar para más
abundantes transcripciones.
3. Minimice la intercomunicación de señales mediante el uso de sondas de alta extinción, como IDT ZEN y TAO Double-
Sondas apagadas (consulte la Sección 5c).
4. Optimice las reacciones individuales y asegúrese de que cada una tenga una eficiencia> 90%.
5. Valide las reacciones multiplex ejecutando una reacción multiplexada junto con su correspondiente
reacciones singleplex para asegurar un rendimiento similar (Figura 3). Compare las curvas estándar y
Verifique que los valores de Cq sean similares tanto en el extremo superior como en el inferior. Un buen multiplex debe
tienen curvas similares y límites de detección similares.
6. Optimice las reacciones multiplex. Limite los cebadores para objetivos expresados en un nivel alto a un
Relación cebador / sonda 1: 1. Aumente la proporción de cebador a sonda para los objetivos expresados en
niveles. Puede ser necesario aumentar la cantidad de enzima y dNTP añadidos a la reacción:
recomendamos duplicar la cantidad de estos reactivos. Hay algunos disponibles comercialmente
mezclas maestras que están especialmente formuladas para multiplexación.

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Fluoróforo * Longitud de onda de emisión (nm) Bebida refrescante
6-FAM 520
TET 539
MALEFICIO 555 ZEN – Iowa Black FQ †

JOSÉ 555
Amarillo Yakima 549
VIC ‡ 554
Cy3 564
ATTO 550 § 575

NED ‡ 575
TAMRA 583
ABY ‡ 580
ATTO 565 § 591

PET ‡ 595 Iowa Negro RQ II
ROX 608
Texas Red-X 617
JUN ‡ 617
ATTO 633 § 657

LIZ ‡ 655
ATTO 647 § 669
Cy5 668 TAO – Iowa Black RQ ¶
* Excepto donde se indique, los fluoróforos en esta tabla están libres de tarifas de licencia y están disponibles en IDT como Freedom Dyes.
† Las sondas con fluoróforos 6-FAM, TET, HEX o JOE también están disponibles como sondas tradicionales de enfriamiento simple con agujero negro
Quencher -1 (Biosearch Technologies, Inc .; se requieren licencias adicionales de terceros para uso diagnóstico).
®
‡ Solo por referencia. No disponible a través de IDT.
§ Las sondas con tintes ATTO son disponible de IDT.
II Black-Hole Quencher-2 también se puede utilizar como extintor. Sin embargo, se requieren licencias adicionales de terceros para el uso de diagnóstico.
¶ Cy5 también está disponible como una sonda tradicional de enfriamiento único con Iowa Black RQ (sin licencia) o Black Hole Quencher-2
(se requieren licencias de terceros adicionales para uso de diagnóstico).
Tabla 3. Longitud de onda de emisión de fluoróforos y extintores apropiados.
FAM singleplex
Figura 3. Validar reacciones multiplex comparando con
Múltiplex FAM reacciones singleplex. Cada reacción se realizó usando
HEX singleplex
Múltiplex HEX
50 ng de ADNc con colorante FAM o HEX. Los valores de Cq fueron 22,8 para FAM
singleplex, 22.5 para FAM multiplex y 25 para HEX singleplex y
multicine. Los ensayos IDT PrimeTime qPCR se utilizaron para generar este
1.000 datos. Consulte la Sección 5 para obtener más información.
Rn
∆
1.000 E-1
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Ciclo

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mi. Ensayo prediseñado frente a ensayo personalizado

Ensayos prediseñados, ya sea de un colega, la literatura o una fuente comercial, si bien
diseñado, puede ahorrar mucho tiempo de investigación. ¿Por qué tomarse la molestia de diseñar un ensayo cuando
¿Ha tenido éxito un ensayo diseñado previamente dirigido contra el mismo objetivo? Bueno, hay
algunas advertencias a tener en cuenta. La secuencia y la estructura de la transcripción, así como la anotación SNP.
información, puede haber sido actualizada desde que se diseñó el ensayo. Por tanto, es importante
para comprobar si las secuencias que está a punto de utilizar son representativas de las más actualizadas
información de secuencia. Además, es posible que el ensayo no haya sido validado experimentalmente y
ciertamente no se optimizó en las mismas condiciones de investigación, incluido el tipo de muestra, el método
de preparación de muestras, reactivos de ensayo y termociclador, que ahora planea utilizar. Por lo tanto,
es importante optimizar y validar dichos ensayos utilizando su propia configuración experimental.
Varias empresas ofrecen ensayos qPCR inventariados que no solo han sido prediseñados, sino que también
prefabricados y almacenados, a la espera de que se realice su pedido. Los ensayos incluidos en el inventario fueron
no necesariamente diseñado con la última información disponible sobre la secuencia objetivo. Información genética
se actualiza y revisa continuamente y se agregan, retiran y vuelven a anotar transcripciones.
Para obtener los datos de qPCR más precisos, los investigadores deben tomar esta información de secuencia actualizada en
cuenta.
Ensayos qPCR prediseñados PrimeTime de IDT
Los ensayos de qPCR prediseñados IDT PrimeTime son únicos en el sentido de que solo se sintetizan una vez al año.
se realiza el pedido. De esta manera, los diseños se pueden comparar con la información de secuencia más reciente.
Los ensayos personalizados son especialmente apropiados para transcripciones anotadas y recientemente descubiertas, detección
de ADN microbiano y colocación personalizada de cebadores y sondas.

15
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3. Replica y controla
Para un análisis preciso de los resultados de qPCR, cada experimento debe configurarse con múltiples repeticiones
y controles (Figura 4). Esta sección proporciona una explicación de cada tipo de control y nuestra
recomendaciones para configurarlos y el número de réplicas necesarias.
una. Replica
Los experimentos de qPCR utilizan los siguientes dos tipos diferentes de réplicas:
• Se utilizan réplicas técnicas (reacciones repetidas RT o qPCR) para compensar el ruido técnico
y aumentar la precisión de los resultados de qPCR. Estas medidas repetidas no deben usarse
para la prueba estadística de hipótesis biológicas.
• Se requieren réplicas biológicas (cultivos celulares repetidos o diferentes individuos o muestras) para
sacar conclusiones biológicamente relevantes de sus experimentos.
El número de réplicas depende de las necesidades específicas del experimento. Para cada experimental
y muestra de control a comparar, se necesitan al menos 3 réplicas biológicas y 3 técnicas para
minimizar los errores en la expresión génica medida debido al pipeteo. Y al menos 3 réplicas biológicas
son necesarios si desea sacar conclusiones estadísticas. Consulte la Figura 4 para ver un ejemplo.
Sin embargo, si está interesado en pequeñas diferencias de expresión o necesita una mayor confianza
(por ejemplo, para diagnóstico), es útil incluir réplicas adicionales. La mayoría de los estudios requieren más
número de muestras. Por otro lado, cuando lo realizan usuarios experimentados, las pantallas grandes
pueden ser suficientes estudios que incluyan muchas muestras y menos réplicas.
Figura 4. Configuración del ensayo de qPCR. Esquema de las réplicas y controles

necesario para un experimento que comprende 2 muestras diferentes examinadas
en varios momentos después del tratamiento. Incluya de 3 a 5 biológicos
replica para cada punto de tiempo estudiado. Para cada réplica biológica
Normal Mutante
estudiado, realizar 2 reacciones de transcripción inversa (+ RT) y 1 con
sin RT (control –RT). Para cada muestra de ADNc generada, configure
24 horas 48 horas 72 horas 24 horas 48 horas 72 horas
3 réplicas técnicas para análisis qPCR. Incluya un "sin plantilla
control ”(NTC) para cada gen analizado para identificar cualquier señal debido a
contaminación.
• Múltiples réplicas biológicas
• 2 preparaciones de RT para cada muestra +

1 sin control RT
• 3 réplicas técnicas para cada muestra +

NTC para cada ensayo de qPCR probado
• qPCR para el gen de interés; múltiples genes de referencia probados para expresión estable
en condiciones experimentales

dieciséis
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B. Controles negativos
Recomendamos los siguientes 3 controles negativos:
• El “control sin plantilla” (NTC) es un requisito absoluto para todos los experimentos de qPCR. Un NTC
omite el ADN de la PCR. Esta reacción sirve como control general de ácidos nucleicos no deseados.
contaminación o formación de dímeros de cebadores que pueden dificultar la interpretación de los resultados,
particularmente cuando se usa SYBR ® Green I colorante (Life Technologies, Inc). Realice este control para cada
ensayo.
• Un control sin transcriptasa inversa (–RT) omite la transcriptasa inversa en la transcripción inversa
paso de un RT-qPCR. El propósito de este control es evaluar la cantidad de ADN genómico
contaminación presente en una preparación de ARN. Realice este control para cualquier ensayo que pueda amplificar
ADN genómico.
• Un control sin amplificación omite la ADN polimerasa de la PCR. Esta reacción sirve como
control de la fluorescencia de fondo del ensayo de PCR y estabilidad de la sonda.
C. Controles positivos
• Un control positivo exógeno es ADN o ARN externo que lleva una diana de interés.
Estas reacciones de control le alertarán sobre cualquier componente de la muestra que pueda inhibir la
transcripción y / o PCR [12]. IDT sintetiza fragmentos de genes gBlocks, genes personalizados, y
Oligonucleótidos de ADN ultramer , que pueden servir como controles positivos exógenos con conocidos
número de copia inicial.
• Un control positivo endógeno es una diana nativa que está presente en la muestra experimental de
interés y puede servir como un normalizador o referencia entre muestras.
Estas reacciones de control corregirán las diferencias de cantidad y calidad entre las muestras. Nosotros
le recomiendo que pruebe al menos 2, pero preferiblemente 3, genes normalizadores (de referencia o de mantenimiento)
para garantizar controles internos precisos. El gen normalizador más apropiado para usar dependerá de
la fuente de ARN y las condiciones experimentales de la muestra que probará. Es una buena práctica
cribar múltiples genes en las condiciones experimentales empleadas para determinar qué expresión
los niveles fluctúan menos. Los programas, como qBase + (Biogazelle), se pueden utilizar para evaluar
rendimiento de varios normalizadores. Los normalizadores más utilizados se enumeran en la Tabla 4.
[13]. Alternativamente, revise la literatura para los genes probados en muestras con condiciones similares a
tuya. Si elige un gen normalizador de la literatura, asegúrese de realizar una reacción para verificar
que los niveles de expresión génica no fluctúen entre las muestras antes de usarlo como control.

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ID del gen Descripción
18S ARN ribosómico 18S
ACTB actina, beta
ALDOA aldolasa A, fructosa-bisfosfato
ARHGDIA Inhibidor de disociación Rho GDP (GDI) alfa
B2M beta-2-microglobulina
GAPDH gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
GUSB glucuronidasa, beta
HMBS hidroximetilbilano sintasa
HPRT1 hipoxantina fosforribosiltransferasa 1
HSPCB choque térmico 90 kDa proteína 1, beta
IPO8 importin 8
LDHA lactato deshidrogenasa A
NO NO que no contiene dominio POU, unión de octámero
PGK1 fosfoglicerato quinasa 1
POLR2A polimerasa (ARN) II (dirigido por ADN) polipéptido A
PPIA peptidilprolil isomerasa A (ciclofilina A)
RPL11 proteína ribosomal L11
RPLP0 proteína ribosomal, grande, P0
RPS18 proteína ribosomal S18
RPS27A proteína ribosomal S27a
SFRS9 factor de empalme, arginina / rico en serina 9
TBP Proteína de unión a caja TATA
TFRC receptor de transferrina
UBC ubiquitina C
Proteína de activación 3-monooxigenasa / triptófano 5-monooxigenasa,

YWHAZ
polipéptido zeta
Tabla 4. Genes comúnmente usados para normalización. Varios de estos ensayos de genes de referencia se ofrecen como qPCR prediseñado de PrimeTime
Ensayos. VerEnsayos de genes de referencia para obtener más información.

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4. Mezclas maestras
Mezclas maestras preparadas mediante la adición manual de componentes (tampón de reacción, dNTP, MgCl 2 y
Taq polimerasa) permiten la máxima flexibilidad, porque los componentes se pueden ajustar de acuerdo con
necesidades experimentales. Sin embargo, la mayoría de los investigadores utilizan mezclas maestras comerciales optimizadas para funcionar
con la mayoría de los ensayos estándar. Es importante tener en cuenta que los pequeños cambios en la formulación de la mezcla maestra
puede afectar significativamente los ensayos, y algunas formulaciones están diseñadas para su uso con ciclos específicos
condiciones (es decir, condiciones de ciclo estándar o rápido). La figura 5 proporciona un ejemplo de cómo master
La elección de la mezcla puede afectar la eficacia y la sensibilidad del ensayo.
A continuación, se ofrece una breve descripción del papel de los diferentes componentes en una mezcla maestra.
• Tampón: necesario para mantener condiciones óptimas de pH y sal.
• MgCl 2: necesario para estabilizar las interacciones del cebador y la sonda con el ADN y como cofactor de Taq
polimerasa. Ocasionalmente, puede ser necesario agregar más MgCl 2 a la mezcla maestra para lograr
resultados óptimos de amplificación.
• dNTP: los componentes básicos de la síntesis de ADN. Algunas mezclas maestras incluyen dUTP y UNG
enzima para eliminar el arrastre de producto de una PCR anterior. Sin embargo, no se incorpora dUTP
tan eficientemente como dTTP y podría afectar la amplificación.
• Enzima UNG (uracilo N-glicosilasa): se utiliza en algunas mezclas maestras para eliminar el arrastre de PCR
contaminación al degradar cualquier producto de PCR con bases de uracilo incorporadas. Si una mezcla maestra
incluye dUTP, es necesario adaptar las condiciones de ciclismo para incluir un paso UNG para degradar cualquier
producto de PCR anterior.
• Polimerasa: las mezclas maestras normalmente contienen ADN polimerasas modificadas para eliminar las no específicas
cebado que puede ocurrir antes del paso de desnaturalización inicial. Las polimerasas de arranque en caliente han sido
modificado, mediante el uso de un anticuerpo, modificación química o aptámeros, para ser inactivo a baja
temperaturas. Estas enzimas modificadas requieren activación mediante calentamiento a 95 ° C durante 2 a 10 minutos.
durante el paso de desnaturalización inicial.
• Tinte ROX: algunos termocicladores requieren el uso de un tinte de referencia interno, como el tinte ROX, para
normalización entre pozos y para tener en cuenta los errores de pipeteo. Por lo tanto, ciertas mezclas maestras son
disponible con diferentes formulaciones de ROX. Consulte el manual de usuario de su instrumento para obtener instrucciones.

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Mezcla maestra de expresión genética PrimeTime Mezcla maestra alternativa
Gráfico de amplificación Gráfico de amplificación

PrimeTime Gene Expression MM – Alt MM
gBlocks Gen
1.000 1.000 ADNc (ng) Cq Fragmentos Cq

(copias)
Rn Rn
∆ ∆
ADNc 50 –2.022 10 7 –2,463
1.000 E-1 1.000 E-1
10 –2,169 10 6 –2,675
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Ciclo Ciclo
2 –2,679 10 5 –3,098
Gráfico de amplificación Gráfico de amplificación
0.4 –2,386 10 4 –3,096
1.000 1.000
0,08 –2.400 10 3 –3,169

Rn Rn
∆ ∆
10 2 –3,784
1.000 E-1 1.000 E-1
Fragmentos genéticos gBlocks

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
10 1 –3,862
Ciclo Ciclo
ID del ensayo PrimeTime HPRT: s.PT.58V.45621572 Mismo umbral y mismo eje y
Figura 5. La composición de la mezcla maestra afecta la eficacia y la sensibilidad del ensayo. Las PCR contenían ensayos PrimeTime HPRT qPCR (cebadores y
sondas) y PrimeTime Gene Expression Master Mix + colorante de referencia u otra mezcla maestra comercial y colorante de referencia separado.
Se utilizaron como plantilla ADNc (paneles superiores) o fragmentos génicos gBlocks (paneles inferiores). Las PCR se realizaron por triplicado en un 7900HT Real-Time
Sistema de PCR (Thermo Fisher Scientific). Manteniendo constantes los ensayos, las plantillas y las condiciones de reacción, variando solo la mezcla maestra, las reacciones
usando PrimeTime Gene Expression Master Mix fueron consistentemente más eficientes y sensibles.

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5. Ensayos de qPCR PrimeTime y productos asociados
É
Hemos desarrollado una selección de productos qPCR para evaluar la expresión génica. Éstos incluyen
Ensayos prediseñados basados en sondas y cebadores que cubren los objetivos del transcriptoma en humanos, ratones y
rata. Se pueden crear ensayos personalizados para cualquier secuencia de cualquier especie utilizando la herramienta PrimerQuest.
Puede obtener los reactivos IDT qPCR como soluciones listas para usar con PrimeTime, basadas en sonda o cebador.
ensayos y mezcla maestra, o cree una opción completamente personalizada de nuestro catálogo de sondas.
una. Ensayos qPCR prediseñados PrimeTime

Los ensayos de qPCR prediseñados PrimeTime están disponibles para la mayoría de los casos de humanos, ratones y ratas.
transcripciones en la base de datos NCBI, donde los diseños de cebadores y sondas cumplen con nuestros estrictos criterios de selección.
Estos ensayos se diseñan utilizando un algoritmo patentado. Además del oligo Tm optimizado (base
composición, longitud del oligo, etc.), los cálculos bioinformáticos tienen en cuenta factores, como los SNP
(basado en las versiones actuales de NCBI RefSeq), búsquedas de reacción cruzada para evitar la amplificación fuera del objetivo,
reconocimiento de variantes de empalme y predicciones de estructura secundaria. El pedido basado en web de IDT
(Sección 6a) permite a los usuarios filtrar, clasificar y seleccionar ensayos basados en características como exón
ubicación, objetivos variantes de empalme, número de RefSeq o símbolo del gen.
Es importante señalar que, a diferencia de muchos otros ensayos inventariados disponibles comercialmente, PrimeTime
Los ensayos de qPCR prediseñados no se fabrican ni almacenan, sino que solo están prediseñados. De este modo,
Se pueden tener en cuenta las actualizaciones de las bases de datos de secuencias y SNP.
Se garantiza que los ensayos prediseñados funcionan con eficiencias de PCR del 90–110% y R 2 > 0,99. Si usted
Si encuentra un ensayo que no cumple con estos criterios, será reemplazado por otro sin cargo adicional. Nosotros
También proporciona secuencias de imprimación con cada pedido para ayudar con las mejores prácticas en informes de investigación y
reproducibilidad, específicamente, transparencia de secuencia [5].
Los ensayos consisten en un cebador directo, un cebador inverso y una sonda de qPCR, todos entregados en un solo tubo.
Además, para los tamaños estándar y XL, combinación de extintor de tinte y cebador a sonda personalizado
La proporción se puede especificar para satisfacer demandas experimentales únicas. Cada ensayo se realiza a pedido con
envío estimado en 2 a 4 días desde la recepción del pedido. Cada oligonucleótido se somete al 100% de control de calidad mediante
espectrometría de masas y todos los resultados de control de calidad se le proporcionan sin cargo en el sitio web de IDT.
Más información sobre IDT Ensayos de qPCR prediseñados PrimeTime .
B. Ensayos de qPCR personalizados PrimeTime

Los ensayos de nucleasa 5 'personalizados también se pueden diseñar para cualquier secuencia en cualquier especie utilizando el
Herramienta PrimerQuest (consulte la Sección 6). La herramienta incluye parámetros de diseño predefinidos optimizados para PCR
y qPCR, o personalizar parámetros para otras aplicaciones.

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Los ensayos PrimeTime Custom qPCR consisten en un cebador directo, un cebador inverso y una sonda qPCR
todo entregado en un solo tubo. Además, para los tamaños estándar y XL, combinación de tinte-extintor
y se puede especificar una proporción personalizada de cebador a sonda para satisfacer demandas experimentales únicas. Cada
El ensayo se realiza a pedido con envío estimado en 2 a 4 días desde la recepción del pedido. Cada oligonucleótido
se somete al 100% de control de calidad por espectrometría de masas, y todos los resultados de control de calidad se le proporcionan sin cargo en
el sitio web de IDT.
Aprender más acerca de Ensayos de qPCR personalizados PrimeTime .
C. Sondas de doble extinción ZEN y TAO

Las sondas de doble extinción ZEN / Iowa Black FQ y TAO / Iowa Black FQ proporcionan un rendimiento superior
en comparación con las sondas tradicionales de enfriamiento único. Mientras que las sondas tradicionales tienen aproximadamente
20-30 bases entre el fluoróforo y el extintor, el extintor interno ZEN o TAO
disminuye esa longitud a solo 9 bases. Esta distancia acortada, particularmente cuando se combina con la
extintor de extremo de 3 'tradicional, conduce a un enfriamiento mucho más completo con un fondo mucho más bajo
y permite el uso de sondas mucho más largas para diseñar en regiones objetivo ricas en AT. Además de
fondo significativamente reducido, las sondas de doble extinción también proporcionan una reducción constante
Valores de Cq y precisión mejorada en comparación con las sondas tradicionales. Uso de doble temple
Las sondas pueden ofrecer mayor sensibilidad y precisión para sus experimentos de qPCR.
Para obtener más información, descargue el Folleto de sondas qPCR personalizadas de PrimeTime .
Otras modificaciones de la sonda
Sondas LNA
LNA (ácido nucleico bloqueado) es un monómero de ácido nucleico modificado. Cuando se incorpora a un
sonda, LNA imparte una mayor estabilidad estructural a la secuencia objetivo que conduce a un aumento
temperatura de hibridación. Consulte PrimeTime LNA qPCR Probes para obtener más información.
Sondas MGB
Las sondas MGB Eclipse ® (Elitech Group) y los cebadores complementarios GMP son proporcionados por nuestro GMP
y el grupo de producción con certificación ISO 13485 y son ideales para ensayos qPCR en diagnóstico y
aplicaciones clínicas. Nuestra gama de opciones de fluoróforos (FAM, HEX, TET y Yakima Yellow)
le permite asegurar la compatibilidad con su instrumento y diseñar ensayos multiplex más fácilmente.
Tintes Freedom
Freedom Dyes son tintes fluorescentes sin licencia para uso en aplicaciones comerciales o de diagnóstico.
aplicaciones. Están disponibles para longitudes de onda de tinte de uso común y se pueden combinar con
Apagadores ZEN, TAO y Iowa Black para crear sondas qPCR con un fondo más bajo y
señal más alta.

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D. Mezcla maestra de expresión genética PrimeTime

PrimeTime Gene Expression Master Mix está optimizado para admitir ensayos de qPCR basados en sondas para
análisis de expresión génica. Esta mezcla maestra está garantizada para proporcionar eficiencias de ensayo> 90% cuando
utilizado con los ensayos PrimeTime qPCR en RT-qPCR de dos pasos. También es compatible con otras imprimaciones.
y sondas.
Cada pedido incluye una solución de mezcla maestra 2X (ADN polimerasa de inicio en caliente mediada por anticuerpos;
dNTPs; MgCl 2 ; potenciadores; y estabilizadores) y una solución madre de colorante de referencia separada.
PrimeTime Gene Expression Master Mix se envía a temperatura ambiente. Eliminación de envío
en hielo seco le ahorra dinero a su investigación, minimiza las demoras en el envío y beneficia al medio ambiente.
Para ver nuestras pruebas exhaustivas que muestran que el envío ambiental no afecta la función del
mezcla maestra, consulte nuestro libro blanco.
Aprender más acerca de Mezcla maestra de expresión genética PrimeTime.
mi. Otros reactivos útiles de IDT
I. Oligonucleótidos de ADN ultramer

Los sistemas y las químicas de síntesis de IDT permiten la síntesis de alta fidelidad de
oligonucleótidos de cadena (hasta 200 bases). Los oligonucleótidos Ultramer son adecuados para
aplicaciones exigentes como clonación, shRNA, mutagénesis y construcción de genes. Ultramer
Los oligonucleótidos sirven como controles excelentes y pueden usarse como patrones de concentración conocida.
Aprender más acerca de Oligonucleótidos de ADN ultramer.
ii. Fragmentos genéticos gBlocks

Hasta 3000 pb de longitud, estos fragmentos de ADN de doble hebra se construyen utilizando Ultramer
Se verifican los oligonucleótidos y la secuencia. Los fragmentos de gBlocks sirven como excelentes controles y
se pueden utilizar como patrones de concentración conocida. Consulte el informe técnico de IDT,gBlocks Gen
Fragmentos como estándares qPCR , para más detalles. Adquiriendo fragmentos de destino completos como gBlocks Gene
Fragmentos, los investigadores pueden ahorrar una gran cantidad de tiempo y esfuerzo.
Aprender más acerca de gBloquea fragmentos de genes .

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Página 24
iii. Conjuntos de genes

Hemos compilado listas de genes sugeridos para apuntar a algunas vías comúnmente estudiadas en humanos,
ratón y rata. Estos incluyen limpieza, apoptosis, citocinas, factor de crecimiento y tumor.
genes de metástasis. Listas de genes para vías de señalización humanas adicionales (Notch, TLR, WNT, etc.),
También están disponibles las vías bioquímicas y los genes que se han asociado con ciertos cánceres.
como una lista ampliada de conjuntos de genes. Ver estas listasaquí.
iv. Ensayos de genes de referencia para normalización

Ofrecemos una selección de ensayos prediseñados para genes de normalización (mantenimiento) comunes para
humano, ratón y rata. Revise los detalles de estos en elSección de ensayos de genes de referencia .
v. Reactivos de detección y control de nucleasas

También ofrecemos varios reactivos para la detección rápida y eliminación de RNasas y DNasas. los
Los ensayos de detección, el kit RNaseAlert ® (Life Technologies, Inc) y el kit DNaseAlert, son eficaces para
pruebas de reactivos de laboratorio, equipos y otros suministros de laboratorio. Los resultados se pueden leer visualmente para fines cualitativos.
evaluación de la contaminación o cuantificado mediante fluorometría. Una solución de descontaminación de nucleasas
que inactiva irreversiblemente las nucleasas y que se puede aplicar a la mayoría de las superficies de laboratorio también
disponible.
Más información sobre IDT reactivos de detección y control de nucleasas .
vi. Búfer IDTE

Proporcionamos 1X TE Buffer (Tris 10 mM, EDTA 0.1 mM; disponible a pH 7.5 u 8.0) para
resuspensión y almacenamiento de oligonucleótidos de ADN. Los oligonucleótidos de ADN pueden resultar dañados por
incubación prolongada o almacenamiento incluso en soluciones ligeramente ácidas; ADN disuelto en agua destilada
a menudo tiene un pH final <5.0 y está en riesgo de depurificación. Se garantiza que IDTE no contiene nucleasas. Cada
El lote se prueba con nuestros kits RNaseAlert y DNaseAlert para documentar la ausencia de actividad nucleasa.
Aprender más acerca de Tampón IDTE y otros reactivos disponibles en IDT.
vii. H libre de ARNasa

2
O
El agua libre de nucleasas es conveniente para diluciones rápidas de existencias de almacenamiento, o especialmente a corto plazo.
almacenamiento. Para obtener más información sobre varios medios de almacenamiento y sus efectos sobre la estabilidad del oligo, haga clic enaquí .

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Página 25
6. Herramientas de software para el diseño de ensayos y la evaluación de cebadores
una. Herramienta de selección de ensayo qPCR prediseñada

La herramienta de selección IDT Predesigned qPCR Assay es una herramienta de diseño dedicada para la biblioteca de
Ensayos de qPCR prediseñados PrimeTime. Si su objetivo es una secuencia humana, de ratón o de rata, este
El programa ofrece el más alto nivel de análisis bioinformático, incluida la búsqueda BLAST para evitar cruces
reacción y amplificación fuera del objetivo, y reconocimiento de variantes de empalme.
B. Herramienta PrimerQuest
La herramienta de diseño PrimerQuest es altamente personalizable y útil para el diseño de ensayos de qPCR con
requisitos no estándar. Por ejemplo, puede utilizar esta herramienta de diseño para dirigir el ensayo hacia
regiones específicas de su objetivo, o puede especificar secuencias de cebadores o sondas. Utilice PrimeQuest
Herramienta para ajustar las condiciones de reacción, agregar una sonda a un conjunto de cebadores previamente diseñados, definir
posiciones de los cebadores e incluyen o excluyen secuencias de los diseños de ensayo. Entonces, si tu diseño
requiere una personalización más exigente, este programa altamente flexible puede ser de gran utilidad. IDT
El soporte técnico está disponible para ofrecer asistencia con este programa para ayudarlo a cumplir con sus
desafíos de diseño. Póngase en contacto con ellos en applicationsupport@idtdna.com .
C. Herramienta de selección de tintes PrimeTime Multiplex

La herramienta de selección de tintes PrimeTime Multiplex le ayuda a seleccionar combinaciones de tintes que sean compatibles
con su instrumento qPCR. La multiplexación de 2 a 5 objetivos qPCR en una sola reacción puede ahorrar tiempo y
dinero.
D. Herramienta NCBI BLAST

Herramienta básica de búsqueda de alineación local de NCBI (Herramienta BLAST) es una herramienta increíblemente poderosa que se puede
utilizado para consultar de manera eficiente la base de datos masiva de GenBank para encontrar regiones de similitud local entre
secuencias. Calcula la significación estadística de las coincidencias y se puede utilizar para seleccionar cebadores y
secuencias de sonda para ensayos de qPCR. Para obtener más información, consulte el artículo del boletín IDT DECODED ,
Consejos para utilizar BLAST para localizar cebadores de PCR.

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Página 26
mi. Herramientas y calculadoras adicionales

Además de las herramientas de diseño de ensayos descritas en las Secciones 6a-c, los programas de SciTools incluyen
calculadoras y una reconocida herramienta de análisis de oligonucleótidos que puede ser útil para configurar RT-qPCR
experimentos, especialmente cuando se trabaja con ensayos personalizados.
I. OligoAnalyzer Tool es el programa IDT SciTools más utilizado. Esta herramienta analiza el
propiedades de las secuencias de oligonucleótidos. Simplemente ingresando su secuencia, puede averiguar
su longitud, contenido de GC, rango de temperatura de fusión, peso molecular, coeficiente de extinción,
y densidad óptica. El programa también proporciona información sobre estructuras secundarias, como
como formación de horquilla y dímero de cebador, así como desajustes, efectos de modificaciones o tampón
condiciones en esas propiedades, y una variedad de otra información útil que puede afectar
RT-qPCR u otro rendimiento de la aplicación.
ii. losDilution Calculator es una calculadora fácil de usar diseñada para calcular el volumen de
stock de oligonucleótidos concentrado requerido para lograr un volumen de dilución deseado y
concentración.
iii. losLa calculadora de resuspensión determina el volumen de tampón o agua que se debe agregar a un
oligonucleótido liofilizado para alcanzar la concentración final deseada.

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7. Resumen
Ahora debería estar familiarizado con las variables críticas en el diseño, la configuración y la optimización del ensayo de qPCR.
La atención a estos garantizará que sus experimentos de qPCR proporcionen datos cuantitativos, precisos y
datos interpretables. Informar sus condiciones optimizadas para estas variables se ha convertido en una necesidad
para la publicación de datos experimentales y permitirá a otros investigadores replicar sus hallazgos, una
pilar de las directrices MIQE [3-5].
Hemos dedicado importantes recursos de investigación para mejorar el rendimiento del ensayo qPCR y
reproducibilidad tanto para nuestros clientes como para nuestros propios investigadores. Al hacerlo, hemos documentado
lo que hemos aprendido en artículos y videos educativos . Visitanos enwww.idtdna.com para más
información.

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8. Referencias
1. Bustin S, Huggett J. (2017) Revisión del diseño del cebador qPCR. Biomol Detect Quant, 14: 19-28.
2. El Consorcio Internacional HapMap. (2007)Un mapa de haplotipos humanos de segunda generación de más de 3,1
millones de SNP. Nature, 449: 851-861.
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Experimentos cuantitativos de PCR en tiempo real . Clin Chem, 55 (4): 611–622.
4. Bustin SA, Beaulieu JF, et al. (2010)Resumen MIQE: Implementación práctica del estándar mínimo
directrices para experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real basados en fluorescencia. BMC Mol Biol, 11:74.
5. Bustin SA, Benes V y col. (2011) Revelación de la secuencia del cebador: una aclaración de las pautas de MIQE. Clin
Chem, 57 (6): 919–921.
6. Poon K, Macgregor RB Jr. (1998) Comportamiento inusual exhibido por ADN multicatenario rico en guanina
complejos . Biopolímeros, 45 (6): 427-434.
7. Owczarzy R, Vallone PM, et al. (1997)Predicción de la estabilidad de fusión dependiente de la secuencia de dúplex corto
Oligómeros de ADN. Biopolímeros, 44 (3): 217-239.
8. Owczarzy R, Moreira BG, et al. (2008)Predicción de la estabilidad de los dúplex de ADN en soluciones que contienen
magnesio y cationes monovalentes . Biochem, 47 (19): 5336-5353.
9. SantaLucia J Jr, Hicks D. (2004) La termodinámica de los motivos estructurales del ADN. Annu Rev Biophys Biomol
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10. McTigue, PM, Peterson RJ, Kahn JD. (2004)Parámetros termodinámicos dependientes de la secuencia para bloqueado
Formación de dúplex de ácido nucleico (LNA) -DNA . Bioquímica, 43 (18): 5388-5405.
11. Xia T, SantaLucia Jr J, et al. (1998)Parámetros termodinámicos para un modelo de vecino más cercano expandido
para la formación de dúplex de ARN con pares de bases de Watson-Crick. Bioquímica, 37 (42): 14719-14735.
12. Nolan T, Hands RE, et al. (2006). SPUD: un ensayo de PCR cuantitativa para la detección de inhibidores en nucleicos
preparaciones ácidas. Anal Biochem, 351 (2): 308-310.
13. Eisenberg E, Levanon EY. (2003)Los genes domésticos humanos son compactos . Trends Genet, 19: 362–365.

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Página 29

Primera edición
Apoyo técnico:
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oligos personalizados • qPCR • secuenciación de próxima generación • ARNi • genes y fragmentos de genes • edición del genoma CRISPR

Guía de Aplicación - Guía de Diseño de Ensayos de QPCR en Tiempo Real para Experimentos de Expresión Génica (PCR-10127-AG, Primera Edición)

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Guía de Aplicación - Guía de Diseño de Ensayos de QPCR en Tiempo Real para Experimentos de Expresión Génica (PCR-10127-AG, Primera Edición)

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22/2/2021 Guía de aplicación: guía de diseño de ensayos de qPCR en tiempo real para experimentos de expresión génica (PCR-10127-AG, primer…

Guía de diseño de ensayos de qPCR en tiempo real

Guía de diseño de ensayos de qPCR en tiempo real

Gestión de editores y colaboradores

1 Tecnologías de ADN integradas; 2 Biogazelle NV, Bélgica; Universidad de Gante, Bélgica

2. Selección y diseño del ensayo de nucleasa 5 ' 6

una. Consideraciones generales de diseño 6

iv. Temperatura de fusión (Tm) 9

mi. Ensayo prediseñado frente a ensayo personalizado 15

3. Replica y controla dieciséis

una. Replica dieciséis

5. Ensayos de qPCR PrimeTime y productos asociados 21

una. Ensayos qPCR prediseñados PrimeTime 21

B. Ensayos de qPCR personalizados PrimeTime 21

C. Sondas de doble extinción ZEN y TAO 22

D. Mezcla maestra de expresión genética PrimeTime 23

mi. Otros reactivos útiles de IDT 23

I. Oligonucleótidos de ADN ultramer 23

ii. Fragmentos genéticos gBlocks 23

iii. Conjuntos de genes 24

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iv. Ensayos de genes de referencia para normalización 24

v. Reactivos de detección y control de nucleasas 24

vi. Búfer IDTE 24

vii. H 2 O libre de ARNasa 24

una. Herramienta de selección de ensayo qPCR prediseñada 25

C. Herramienta de selección de tintes PrimeTime Multiplex 25

D. Herramienta NCBI BLAST 25

mi. Herramientas y calculadoras adicionales 26

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contaminación. La amplificación y cuantificación ocurren simultáneamente utilizando

• Si está ejecutando un experimento múltiple, deberá incorporar consideraciones adicionales:

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2. Selección y diseño del ensayo de nucleasa 5 '

una. Consideraciones generales de diseño

Ensayos de qPCR prediseñados por IDT

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Imprimaciones Investigacion Amplicón

Abarcar Ideal Abarcar Ideal Abarcar Ideal

Largo 18-30 nt 22 nt 20-28 nt * 24 nt 70-150 pb 100 pb

Temperatura de fusión 60–64 ° C 62 ° C 66–70 ° C 68 ° C N/A N/A

Contenido de GC 35–65% 50% 35–65% 50% N/A N/A

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iv. Temperatura de fusión (Tm)

La estabilidad de estos dúplex se describe mediante la temperatura de fusión: la temperatura a la que

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30 pares de bases Mg 1 mM , KCl 50 mM, Tris 10 mM. Contenido de GC para todos

80 los cebadores fue ~ 50%.

Herramienta gratuita en línea que predice los valores de Tm

La herramienta OligoAnalyzer ha sido el resultado de una investigación continua en termodinámica y

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Tinte y longitud de onda máxima de emisión

• Colorantes reporteros proporcionados o recomendados por el proveedor

Tabla 2. Compatibilidad del instrumento con tintes indicadores.

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Fluoróforo * Longitud de onda de emisión (nm) Bebida refrescante

MALEFICIO 555 ZEN – Iowa Black FQ †

ATTO 550 § 575

ATTO 565 § 591