Instituto Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez

Doctorado en ciencias de los alimentos y biotecnologí´a

CUADERNO DE PROTOCOLOS:

“ESTUDIO BIOQUÍMICO DE SERÍN PROTEASAS RECOMBINANTES

DE BACTERIAS POLIEXTREMÓFILAS DEL VOLCÁN EL CHICHÓN”

MCIBQ.ARTURO PEÑA BLASSI

DIRECTORA DE TESIS
DRA. PEGGY ELIZABETH ÁLVAREZ GUTIÉRREZ

TUXTLA GUTIÉRREZ, OCTUBRE 2022

 Instituto Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO MICROBIANO

Fundamento: Espátula
El medio de cultivo YT es un medio optimizado Vortex
para el crecimiento de bacterias y la producción Vaso de precipitado
de enzimas proteolíticas. Debido a su alto de 1L
contenido de péptidos (peptona de caseína) el Autoclave
medio YT es un medio alta mente selectivo para Cajas Petri
la producción de enzimas proteasas (Miller,
1972). Procedimiento:
Objetivo: Preparación de medios de cultivo. 1. Medio de cultivo: Disolver en 1 L de agua
destilada: 10 g de peptona de caseína, 1 de
Símbolos y abreviaturas: extracto de levadura, 3 g de Fosfato
g Gramos dipotásico, 1 g de sulfato de magnesio
L Litro heptahidratado, sulfato de manganeso
dihidratado, 0.3 g de cloruro de calcio, 2 g de
Reactivos: glucosa, 1 g de cloruro de sodio y 20 g de
Peptona de caseína 10 g/L agar bacteriológico.
Extracto de levadura 1 g/L 2. Ajustar el pH correspondiente (4.0, 6.0 y 8.0)
Fosfato dipotásico 3 g/L según sea el caso con HCL 1N y NaOH al
Sulfato de magnesio 1 g/L 0.1
heptahidratado N. Esterilizar durante 15 minutos a 121°, 15
Sulfato de manganeso 0.1 g/L lb.
dihidratado 3. Vaciar el medio de cultivo en cajas Petri
Cloruro de calcio 0.3 g/L estériles y esperar a que solidifiquen.
Glucosa 2 g/L 4. Etiquetar las cajas Petri para identificar la
Cloruro de sodio 1 g/L variación del pH.
Agar bacteriológico 20 g/L Resultados:
Se obtendrán medios de cultivo selectivo para
Equipos e instrumentos: fomentar el crecimiento microbiano, así como la
producción de enzimas proteolíticas.

Balanza analítica Referencias:

Auto clave Miller, J.H., 1972. Experiments in Molecular
Piseta Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY, pp. 431-435.
 Instituto Tecnológico de Tuxtla Gutiérrez

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO A BASE DE CASEÍNA

Fundamento: Autoclave
Las proteinasas son un grupo de enzimas Cajas Petri
complejas con capacidad de hidrolizar proteínas
altamente específicas. Presenta una alta Procedimiento:
especificidad para las moléculas biológicas y 1.- Medio de cultivo: Disolver agua destilada:
tiene un amplio valor de aplicación en los 10 g de caseína, 1 g de glucosa, 1 g de extracto
campos de los alimentos, la medicina y los de levadura, 1 g de Fosfato dipotasico,0.5 g de
Fosfato dipotasico, 0.1 g de sulfato de
detergentes. El método de la placa de caseína
magnesio, y agar 20 g.
resuelve principalmente el problema de la 2.- Ajustar el pH correspondiente (4.0, 6.0 y
interferencia del extracto de muestra de color 8.0) según sea el caso con HCL 1N y NaOH al
oscuro en los métodos comunes para detectar la 0.1 N. Esterilizar durante 15 minutos a 121°C,
actividad de la proteasa (Zhang, 2021). 15 lb.
3.- Vaciar el medio de cultivo en cajas Petri
Objetivo: Preparación de medios de cultivo
estériles y esperar a que solidifiquen.
para escrutinio de microorganismos con
4.- Etiquetar las cajas Petri para identificar la
actividad proteolítica extracelular.
variación del pH.
Símbolos y abreviaturas: Resultados:
g Gramos Se espera la producción de un halo de actividad
L Litro enzimática en las cajas donde exista crecimiento
microbiano positivas a la actividad proteolítica
Reactivos: (Figura 1)
Peptona de caseína 10 g/L
Fosfato dipotásico 3 g/L
Sulfato de magnesio 0.1 g/L
dihidratado
Cloruro de calcio 0.3 g/L
Glucosa 1 g/L
Agar bacteriológico 20 g/L

Equipos e instrumentos: Figura 1: Medios de cultivo inoculado con

bacterias con actividad proteolítica.
Referencias:
Balanza analítica
Auto clave Zhang, X. Shuai, Y., Tao, H. Li, C. He, L.
Piseta (2021). Novel Method for the Quantitative
Espátula Analysis of Protease Activity: The Casein Plate
Vortex Method and Its Applications. ACS Omega, 6,
Vaso de precipitado 3675- 3680.
de 1L