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Técnicas en biología celular y molecular

3º Grado en Biología

Facultad de Biología
Universidad de Vigo

Reservados todos los derechos.

No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 INFORME TBCM BIOQUÍMICA

ÍNDICE:
Práctica 1: espectrofotometría de masas de proteínas...................................................2
Práctica 2: separación de formas moleculares del enzima β-D-galactosidasa.................6
Práctica 3: Purificación del enzima glutatión S-transferasa.............................................8
Práctica 4: Electroforesis de proteínas SDS-PAGE............................................................9
Práctica 5: Valoración de proteínas por el método de Bradford....................................10

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Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad.
 Práctica 1: espectrofotometría de masas de proteínas.
Ejercicio nº 1. Identificación de proteínas por su masa molecular.
Cuestiones. Empleando los datos de los espectros de masas #1, #2 y #3
a) Calcular la masa molecular de cada proteína y el estado de carga correspondiente a

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cada ion.
b) Identificar cada proteína con ayuda de la base de datos de la tabla 1.
c) Calcular los errores absoluto y relativo en que se incurre en la identificación
- Espectro de masas #1:
Tabla 1: datos para realizar los cálculos de M del espectro #1.

m/z m1-1 m2-m1 n m2-1 M Z

1374,05 137,21 9,0069 1373,05 12367 9+
1236,84 1235,84 112,37 9,9980 1235,84 12356 10+
1124,47 1123,47 93,59 11,0042 1123,47 12363 11+
1030,88 1029,88 79,2 12,0035 1029,88 12362 12+
951,68 950,68 67,87 13,0074 950,68 12366 13+
883,81 882,81 59,02 13,9578 882,81 12322 14+
824,79 823,79

a) M= 12356 Da. Estado de carga en orden decreciente: 14+, 13+, 12+, 11+, 10+, 9+.
b) La proteína es: citocromo c (caballo).
c) Error absoluto (EA)=12360-12356= 4 Da
Error relativo (ER)= (12360-12356) / 12360*100= 0,033 %.
- Espectro de masas #2:
Tabla 2:: datos para realizar los cálculos de M del espectro #2.

m/z m1-1 m2-m1 n m2-1 M Z

1224,34 152,71 7,0109 1223,34 8577 7+
1071,63 1070,63 118,82 8,0105 1070,63 8576 8+
952,81 951,81 94,08 9,1170 951,81 8678 9+
858,73 857,73 77,74 10,0333 857,73 8606 10+
780,99 779,99 64,45 11,1022 779,99 8660 11+
716,54 715,54 54,86 12,0430 715,54 8617 12+
661,68 660,68

a) M= 8619 Da. Estado de carga en orden decreciente: 12+, 11+, 10+, 9+, 8+, 7+.
b) La proteína es: Elastina (oveja).

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Técnicas en biología celular...
Banco de apuntes de la
 c) Error absoluto (EA)=8662-8619= 43 Da
Error relativo (ER)= (8662-8619) / 8662*100= 0,5 %.
- Espectro de masas #3:
Tabla 3: datos para realizar los cálculos de M del espectro #3.

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m/z m1-1 m2-m1 n m2-1 M Z
2435,3 299,1 7,14 2434,3 17378 7+
2136,2 2135,2 237,5 7,99 2135,2 17061 8+
1898,7 1897,7 187,4 9,13 1897,7 17319 9+
1711,3 1710,3 153,6 10,13 1710,3 17333 10+
1557,7 1556,7 127,8 11,18 1556,7 17405 11+
1429,9 1428,9 106,5 12,42 1428,9 17743 12+
1323,4 1322,4 92,9 13,23 1322,4 17502 13+
1230,5 1229,5 80,4 14,29 1229,5 17572 14+
1150,1 1149,1 72,9 14,76 1149,1 16964 15+
1077,2 1076,2 64,8 15,61 1076,2 16797 16+
1012,4 1011,4

a) M= 17307 Da. Estado de carga en orden decreciente: 16+, 15+, 14+, 13+, 12+, 11+,
10+, 9+, 8+, 7+.
b) La proteína es: Apomioglobina (caballo).
c) Error absoluto (EA)=16951-17307= 356 Da
Error relativo (ER)= (16951-17307) / 16591*100= 2,10 %.
Ejercicio nº 2. Identificación de proteínas por su huella peptídica.
2. Examinar los espectros de masas de péptidos trípticos #4, #5 y #6 y, en cada caso,
anotar
a) nombre la proteína identificada y organismo al que pertenece.
b) probabilidad de coincidencia al azar de la identificación.
c) masa molecular.
d) proporción de péptidos trípticos coincidentes.
e) cobertura de la secuencia de la proteína.
- Espectro de masas #4:
a) Mioglobina de caballo.
b) 0,00000011
c) 17072 Da.

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 d) 9/12.
e) Cobertura del 59 %.
- Espectro de masas #5:
a) Citocromo c de caballo.

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b) 0,00012
c) 11825 Da.
d) 7/12
e) Cobertura del 40 %.
- Espectro de masas #6:
a) Lisozima C de gallo.
b) 0,0022.
c) 16228 Da.
d) 6/10
e) Cobertura del 36 %.
Ejercicio nº 3. Secuenciación de péptidos mediante espectrometría de masas en
tándem.
Cuestiones
3. Empleando los espectros de fragmentación #7, #8 y #9, y la tabla de masas residuales
de los aminoácidos proteicos
a) deducir la secuencia de aminoácidos de los péptidos en código de una letra.
b) identificar la proteína a la que pertenece el péptido mediante las herramientas en
línea “peptide search” de UniProt (http://uniprot.org) o “Protein BLAST”
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).
c) Describir brevemente la función de la proteína identificada.
- Espectro de masas #7:
a) FVNQHLCGSH
b) Cadena b de la insulina.
c) La insulina es una hormona polipeptídica que permite la entrada de la glucosa en las
células, interviniendo de este modo en el control de la glucemia y el metabolismo de
nutrientes.
- Espectro de masas #8:

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 a) HSQGTFTSDY
b) Glucagón.
c) El glucagón es una hormona producida por el páncreas que ayuda a controlar el nivel
de glucosa en sangre en el cuerpo. Su secreción aumenta la gluconeogénesis.
- Espectro de masas #9:
a) HPSRPGGVPG
b) Elastina
c) La elastina es una proteína que forma parte del tejido conjuntivo, aporta dureza y
resistencia, además proporciona elasticidad a las arterias, ligamentos y a la piel.
Constituida por aminoácidos como la valina, lisina, prolina, etc.

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 Práctica 2: separación de formas moleculares del enzima
β-D-galactosidasa.
Cuestiones:
1. Calcular la actividad enzimática (en µmol ml-1 min-1) en cada fracción sabiendo

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que el producto liberado por hidrólisis enzimática el p-nitrofenol tiene un
coeficiente de extinción molar ε400 de 18.300 M-1 cm-1.
Tabla 4: resultados de la actividad enzimática de la β-D-galactosidasa

Tubo AE (µmol ml-1 AE (µmol ml-1 min-1)

min-1) x 10-4(valores gráfico)
1 1,82E-05 0,2
2 0,00098 9,8
3 0,00079 7,9
4 0,00114 11,4
5 0,00107 10,7
6 0,00047 4,7
7 0,00034 3,4
8 0 0
9 9,11E-05 0,9
10 0,00118 11,8
11 0,00099 9,9
12 0,00087 8,7
13 0,00137 13,7
14 0,00197 19,7
15 0,00159 15,9
16 0,00192 19,2

2. Representar los resultados en una gráfica poniendo en abscisas las fracciones (en
primer lugar, las fracciones obtenidas con tampón y a continuación las obtenidas
con KCl) y, en ordenadas, el valor de actividad enzimática obtenido para cada
fracción.

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Figura 1: resultados de la valoración de la actividad enzimática de las formas de la β-D-galactosidasa.

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 Práctica 3: Purificación del enzima glutatión S-
transferasa.
Cuestiones:
1. Representar en una gráfica los valores de absorbancia a 340 nanómetros de las

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muestras E, S y G frente al tiempo y obtener las rectas de ajuste lineal y sus ecuaciones.

Figura 2: valoración de GST.

2. Calcular la actividad enzimática de GST en las fracciones E, S y G en µmol ml-1 min-1,

sabiendo que el conjugado que se forma tiene un coeficiente de extinción molar ε340 =
9,6 mM-1 cm-1.
AE (E)= 25,19 µmol ml-1 min-1
AE (S)= 0,511 µmol ml-1 min-1
AE (G)= 3,84 µmol ml-1 min-1

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 Práctica 4: Electroforesis de proteínas por SDS-PAGE.
Cuestiones:

1. Representar los valores de Rf de la banda formada por cada proteína marcadora,

en abscisas, frente al logaritmo decimal de la masa molecular (Mr)
correspondiente.

Figura 3: recta patrón SDS-PAGE.

2. Obtener la recta de ajuste y utilizar su ecuación para estimar el tamaño de la

proteína problema GST.

Recta de ajuste: y = -1,0093x + 5,0347.

Y= (-1,0093 x 0,592) + 5,0347= 4,437 =>Dado que se trata de un logaritmo en base 10:

Tamaño: 104,437= 27345 Da

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 Práctica 5: Valoración de proteínas por el método de
Bradford.
Cuestiones:
1. Representar en una gráfica los valores de absorbancia a 595 nm de los patrones

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(y) frente a sus respectivas concentraciones de proteína μg/ml (x) y obtener la
ecuación de ajuste lineal.

Figura 4: recta patrón SAB.

2. Empleando la ecuación de la recta patrón anterior y los valores de absorbancia

de las muestras calcular la concentración de proteínas en las muestras E, S y G;
ajustar su concentración final teniendo en cuenta el factor de dilución.

Muestra [proteina] [proteina]

μg/ml μg/ml *FD
E 604,5 6045
S 599,5 2997,5
G 267 534

10

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