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Tinción de Gram

AUTORES

Laura Sofia Infante Parra

Edna Sofia Urrego Quevedo

Alison Valeria Guzmán Porras

Luisa Valentina Lopez Rodríguez

Luna Linzay Meneses Cruz

Grupo C

PROFESOR

Mauren Andrea Ortiz Barbosa

Bacteriología

Facultad de ciencias de la salud, Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca

Bogotá D.C
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Contenido
1.Objetivos ...................................................................................................................................... 4

1.1 General .................................................................................................................................. 4

1.2 Específicos ............................................................................................................................ 4

2. Marco teórico .............................................................................................................................. 5

2.1 Yogurt ................................................................................................................................... 5

2.1.1 Bacterias ácido lácticas (BAL) ...................................................................................... 5

2.1.2 Probióticos ..................................................................................................................... 6

2.2 GRAM positivas y GRAM negativas .................................................................................. 6

2.2.1 Peptidoglicano.................................................................................................................... 7

2.2.2 Membrana Celular ......................................................................................................... 7

2.2.3 Toxicidad Gram negativa ............................................................................................... 8

2.2.4 Porinas............................................................................................................................ 8

2.3 Patógeno................................................................................................................................ 9

2.4 Solución Salina amortiguada por Fosfatos (PBS) ................................................................. 9

2.5 Colorantes ............................................................................................................................. 9

2.5.1 Cristal Violeta ................................................................................................................ 9

2.5.2 Yodo/Lugol .................................................................................................................. 10

2.5.3 Alcohol ......................................................................................................................... 10

2.5.4 Safranina / fucsina........................................................................................................ 10

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3. Materiales .................................................................................................................................. 11

4. Metodología .............................................................................................................................. 12

5. Resultados ................................................................................................................................. 17

5.1 Imágenes ............................................................................................................................. 17

5.1.1 Uso del Microscopio .................................................................................................... 17

5.1.2 Tinción de Gram .......................................................................................................... 19

5.2 Protocolo (dónde se describa el paso a paso) para la tinción de Gram basándose en el

laboratorio virtual...................................................................................................................... 21

5.3 ¿Cuál es la diferencia entre Bacterias Gram positivas y Gram Negativas que permite la

tinción de Gram las clasifique en grupos diferentes? ............................................................... 22

5.4 ¿Qué otro(s) colorante(s) puede sustituir el Gram’s iodine? .............................................. 22

5.5 ¿Qué otro colorante puede sustituir la Safranina? .............................................................. 23

5.6 ¿Por qué es importante utilizar el Alcohol al 95%? ............................................................ 23

5.7 ¿Es necesario seguir algún orden específico para la tinción de Gram? ¿Por qué? ............. 23

6. Análisis de Resultados .............................................................................................................. 24

7. Conclusiones ............................................................................................................................. 27

Referencias .................................................................................................................................... 28
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1.Objetivos

1.1 General

Observar la tinción de Gram positivos y Gram negativos por medio de un simulador para lograr

la identificación de las tinciones.

1.2 Específicos

• Seguir el proceso de tinción por medio de la guía virtual para conocer los utensilios y

procedimientos necesarios para lograr una buena tinción.

• Realizar el paso a paso de tinción en dos muestras de un cultivo de yogurt por medio de

un laboratorio virtual para lograr la visualización de bacterias Gram negativas y gram

positivos, comprobando cuál de las muestras está contaminada.

• Revelar la tinción de Gram por medio de los tintes indicados en el proceso del simulador

con su respectivo intervalo de reposo y enjuague para identificar la muestra contaminada.

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2. Marco teórico

2.1 Yogurt

Es un producto a base de leche coagulado que se obtiene a través de una fermentación

láctica, debido a la acción de dos tipos de bacterias, el lactobacillus bulgaricus y el streptococcus

thermophilus, ofrece efectos beneficiosos sobre el aparato intestinal, acción desintoxicante, su

nivel de lactosa es reducido de un 20%-30% con respecto a la leche, por la acidificación de las

bacterias encargadas de la coagulación de la leche, las proteínas de esta son admitidas mas

fácilmente por las enzimas digestivas, para una mejor digestión. (Llangarí, 1985)

Las bacterias a pesar de poseer una actividad lipolítica restringida, pero en la realización

de productos fermentados, la grasa es hidrolizada liberando ácidos grasos, con aroma y sabor

agradable, manteniendo todos sus minerales y vitaminas en el proceso, sin embargo el ácido

láctico ayuda a la absorción del calcio, fósforo y hierro así como, las vitaminas del complejo B.

(Llangarí, 1985)

2.1.1 Bacterias ácido lácticas (BAL)

Microrganismos con diversas aplicaciones, son más conocidas en el proceso de fermentación de

lácteos, carnes, vegetales a quesos encurtidos, embutidos, así como de vinos y cervezas, también

en la biopreservación de alimentos de manera más importante se encuentran los probióticos ya

sean cultivos puros o cultivos mixtos de microrganismos que al ser consumiendo en cantidades

adecuadas mejoran la salud, estando ampliamente en la naturaleza, aisladas de diversos

alimentos, multiplicándose a través de azúcares, aminoácidos, vitaminas (Ramirez, Rosas Ullosa,

Velazquez Gonzalez, Ulloa, & Arce Romero, 2011)

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2.1.2 Probióticos

Son aquellos cultivos de microorganismos vivos que tienen como finalidad con una ingesta

adecuada mejorar en el huésped las propiedades de la microflora nativa, la flora intestinal es de

vital importancia en el ser humano ya que tiene una relación directa en cuanto se refiere a la

presencia de enfermedades, ya que además de tener una notable presencia en la salud intestinal

es de estimulo en el sistema inmunológico, controlando las infecciones por patógenos entéricos,

intolerancia a la lactosa, colesterol sérico, enfermedades cardiacas, son tantos los beneficios que

se pueden encontrar que, se pueden encontrar en capsulas, en polvo como la bacteria en forma

liofilizada. (Ramirez, Rosas Ullosa, Velazquez Gonzalez, Ulloa, & Arce Romero, 2011)

2.2 GRAM positivas y GRAM negativas

GRAM POSITIVAS GRAM NEGATIVAS

Contienen una capa muy amplia de Contiene una capa muy delgada de

peptidoglucano al realizar la tinción de Gram peptidoglucano, por esto su coloración rosa en

obtendrán un color azul oscuro o morado. la tinción de Gram

Algunas de estas bacterias pertenecientes al Su patogenicidad se debe a la presencia de

género Streptococcus pueden ser patógenos y lipopolisacáridos también llamadas

otros beneficiosos para el ser humano como endotoxinas, desencadenando una respuesta

las bacterias lácticas, algunas consideradas inmune a sus antígenos, generando un shock

como los probióticos. endotóxico o la muerte

(Garcia & Dongil, 2022) (Patzi & González Villalobos, 2014)

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2.2.1 Peptidoglicano

También llamado sáculo de mureína se encuentra en el periplasma de bacterias, entre las

membranas externa e interna, en las bacterias Gram negativas el sáculo es de alrededor del 10%

de la pared celular, en las bacterias Gram positivas donde el peptidoglicano esta en un 90% en la

pared celular, es un hetero polímero de largas cadenas glucídicas entrecruzadas por cadenas

peptídicas cortas formando así una malla, integra y elástica que termina rodeando la celula para

dar un soporte en cuanto a la presión osmótica interna, cambios ambientales asi como ayudar en

el crecimiento y la división celular. (Perez, 2015)

2.2.2 Membrana Celular

Es la encargada de definir la extensión de la célula, funciona como un filtro, que controla

la entrada de nutrientes, salida de desechos, se trata de agrupaciones de moléculas lipídicas y

proteicas unidas por interacciones no covalentes, la bicapa lipídica actúa como una barrera

semipermeable al fulo de mayoría de moléculas hidrosolubles que ayudan en las diferencias de

concentración de iones al interior y exterior de la célula, actúa como un sensor de señales,

permitiendo la respuesta ante estímulos del entorno, además posee moléculas específicas

adecuadas en el interior o exterior de la célula, así como enzimas que catalizan reacciones

asociadas a la membrana. Los principales fosfolípidos son los fosfolípidos, el colesterol y

glucolípidos los cuales son anfipáticos, con un extremo hidrofílico y otro hidrofóbico (Arrazola,

1994).
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2.2.3 Toxicidad Gram negativa

Al ser compuestas por solo una capa de peptidoglicano, no retienen el violeta cristal sino

se tiñen con la contra tinción usualmente de safranina, es mal delgada respecto a las Gram

positivas, sin embargo, sigue siendo fuerte, resistente y elástica para protegerlas contra

condiciones ambientales, la moléculas de lipopolisacárido es toxica, clasificado como una

endotoxina provocando una fuerte respuesta inmune frente a una infección (Español, 2022)

Los lipopolisacáridos (LPS) constituyen la mayoría de la membrana, siendo el principal

actor en la patogénesis de las infecciones bacterianas, así como el huésped y el daño a su sistema

de defensa, compuesto por una porción muy conservada de lípido A y una parte hidrofílica de

azúcares, el lípido A es el encargado de las propiedad pato fisiológicas de endotoxinas

encargadas de la potente activación de macrófagos y la producción de citoquinas, el polisacárido

O siendo la parte mas externa le da su característica serológica. (Campos, 2022)

2.2.4 Porinas

Son proteínas con estructura barril formado por laminas, siento una proteína integral de

membrana, funcionan como un poro por el cual se realiza el paso de moléculas, no son tan

grandes para procesos de difusión pasiva, como azúcares iones y aminoácidos. su estructura es

única debido a una alternación de residuos polares y no polares, plas puntas polares apuntan

hacia afuera, y los residuos al interior para interactuar con el canal, este se encuentra

parcialmente bloqueado por un ojal que posee una carga negativa pasada de cuatro residuos de

ácido glutámico y siete residuos de ácido aspártico, cargas compensadas por dos átomos de

calcio, las láminas entre cada barril son las encargadas de definir el tamaño de soluto a pasar.

(CO, 2023)
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2.3 Patógeno

Es un agente patógeno a aquella identidad biológica capaz de producir una enfermedad

infecciosa, produciendo enfermedades, malestar al afectar la fisiología no solo de ser humanos,

plantas y animales siendo aquellos el huésped de bacterias, hongos, protozoos y virus (Unilabs,

s.f.)

El cuerpo ante los diferentes patógenos en el ambiente actúa mediante el sistema inmune, como

primeros agentes están las barreras superficiales; la piel, la mucosa, las lagrimas que repelan,

envuelven los agentes externos para después expulsarlos, ya cuando aquellos patógenos ingresan

al organismo, hay células encargadas como los glóbulos blancos de defender al ser humano de

manera específica, capturando a los organismos nocivos (Virus y bacterias, s.f.)

2.4 Solución Salina amortiguada por Fosfatos (PBS)

Constituye una solución amortiguadora de pH, empleado en procedimientos bioquímicos,

su osmolaridad y concentración de iones es muy semejante a la del líquido extracelular de los

mamíferos, preparada a partir de cloruro de sodio, fosfato de sodio, solución isotónica, un

vehículo neutro para las células al no modificar el funcionamiento de una célula normal, para el

lavado de células después de un proceso de centrifugación. (Humana, 2008)

2.5 Colorantes

2.5.1 Cristal Violeta

Es un indicador ácido-base, desnaturalizado de alcohol, como una tinción de carácter

biológico, como indicador de sales de compre, tinción de microorganismos y líneas celulares.

(Scientific, 2023)
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2.5.2 Yodo/Lugol

Solución acuosa que contine yodo y yoduro de potasio, es un oxidante para dar a la

sustancia oxidada un carácter más acido, para que el microrganismo tenga una tinción más

profunda por los colorantes básicos

2.5.3 Alcohol

Sirve para realizar una decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo de yodo

con cristal violeta, los gram positivos no se decoloran mientras que los gram negativos sí lo

hacen.

2.5.4 Safranina / fucsina

Con este colorante de color rojo se hace una coloración de contraste mostrando las Gram

negativas, dejando la distinción de color entre rosado y morado,

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3. Materiales

• Computador

• Internet
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4. Metodología
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5. Resultados

5.1 Imágenes

5.1.1 Uso del Microscopio

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5.1.2 Tinción de Gram

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5.2 Protocolo (dónde se describa el paso a paso) para la tinción de Gram basándose en el

laboratorio virtual.
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5.3 ¿Cuál es la diferencia entre Bacterias Gram positivas y Gram Negativas que permite la

tinción de Gram las clasifique en grupos diferentes?

La diferencia entre bacterias Gram positivas y Gram negativas es el grosor de la capa de

peptidoglicano y la presencia de una membrana exterior, en las bacterias Gram + se encuentra una

capa gruesa de peptidoglicano, mientras que las Gram – poseen una capa fina de peptidoglicano.

Además, en las últimas mencionadas, se encuentra una membrana exterior la cual como

característica esencial tiene un lipopolisacárido, este posee proteínas llamadas porinas las cuales

permiten el paso de compuestos hidrofílicos (azúcares, aminoácidos, entre otros) y su principal

característica es la presencia de un Lípido A que genera toxicidad para los seres vivos (Steward,

2019).

La Tinción de Gram permite la clasificación de estas bacterias a través del peptidoglicano,

en las Gram + observaremos que la capa gruesa de peptidoglicano tendrá una retención del cristal

violeta y por el contrario, las Gram – al tener una capa menor de peptidoglicano, no retienen el

tinte violeta y se destiñen por efecto del alcohol, por ello se usa la contra tinción con safranina que

logra teñirlas de rojo o rosado (Steward, 2019).

5.4 ¿Qué otro(s) colorante(s) puede sustituir el Gram’s iodine?

El Lugol o solución de Lugol es una solución de Yodo (I2) Al 1% y Yoduro de Potasio (KI)

al 2% o en relación 1:2, en agua destilada. Estas soluciones en agua son inestables, el yodo se

puede perder por evaporación y esto puede alterar el resultado de la tinción de Gram, por lo que

debe usarse como disolución con polivinilpirrolidona (PVP) para que sea más estable y se obtenga

el mismo resultado que usando el Yodo de Gram (LabMedica, 2011).

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5.5 ¿Qué otro colorante puede sustituir la Safranina?

La solución de Fucsina Básica Fenicada según Ziehl-Neelsen (Esta tinción se usa para

diferenciar microorganismos resistentes al ácido-alcohol) es un colorante de contraste que puede

reemplazar a la Safranina para teñir las paredes de las bacterias Gram – y al ser enjuagadas en agua

no perder el color rojizo-rosado que permite su diferenciación con las Gram +.

(PanReacAppliChem, 2012).

5.6 ¿Por qué es importante utilizar el Alcohol al 95%?

El alcohol deshidrata la capa de peptidoglicano, logrando que este se encoja y se tense,

por lo que la combinación de cristal violeta/yodo se pierde al no tener peptidoglicano al cual

atenerse. Gracias al alcohol es posible que la Safranina logre teñir a las células Gram – y no

interfiere con la coloración púrpura inicial de las Gram + (Steward, 2019).

5.7 ¿Es necesario seguir algún orden específico para la tinción de Gram? ¿Por qué?

Si, es necesario seguir el orden: Cristal Violeta, Yodo de Gram, Alcohol al 95% y

Safranina/Fucsina. Lo anterior debido a que el Cristal Violeta ingresa a la pared celular de ambas

bacterias y tiñe su peptidoglicano, con ayuda del Yodo se forman cristales del primer colorante

que no pueden salir de la pared celular, se vuelve insoluble al agua y esto permite que la coloración

permanezca.

El alcohol al 95% permite que la membrana externa de las bacterias Gram – se degrade y

se formen huecos en su peptidoglicano, lo que resulta en la pérdida de los cristales de violeta/yodo

y, por tanto, del color púrpura. Finalmente, la safranina no es soluble al agua y tiñe a estas bacterias

restantes de color rojo claro. Seguir estos pasos en desorden provocará que haya fallas en la

formación de cristales, en la tinción resultante o que no se logre diferenciar ninguna de las dos

bacterias (Steward, 2019).

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6. Análisis de Resultados

En la tinción de Gram se utilizan distintos reactivos para poder apreciar al microscopio

los microorganismos deseados y poder distinguirlos. En el caso del cristal violeta por las

diferencias estructurales que presentan las bacterias gram positivas y las bacterias gram negativas

en el grosor de su pared celular al exponerlas al cristal violeta se van a teñir ambas, se une el

reactivo a la pared bacteriana por su afinidad a los peptidoglicanos y se estabiliza con el Lugol

que forma un complejo de cristal violeta-yodo que satura e impide la salida de los

peptidoglicanos de la pared celular por lo cual el color va a quedar fijado en las bacterias. La

mezcla alcohol-acetona deshidrata, cierra los poros y disuelve la membrana externa de las

bacterias Gram negativas (que es soluble a disolventes orgánicos) extrayéndose el cristal violeta.

La safranina, como tinte de contra tinción va a teñir solamente a las gram negativas que son las

que están decoloradas, que son las bacterias que no pudieron retener el cristal violeta-yodo, por

lo tanto, las gram positivas estarán teñidas de cristal violeta y las gram negativas de safranina

(color fucsia). (Inteligente, 2020)

El proceso de tinción de gram, para comenzar a realizar el proceso de tinción de gram es

necesario tener a nuestro alcance los siguientes materiales

- , yogurt sospechoso por examinar

- asa de inoculación
- láminas
- laminillas
- mechero de bunsen
- dilusor
- 1 pipeta pasteur
- tubos de ensayo
- cristal violeta
- yodo
- alcohol al 95%
- safranina
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Como primer paso vamos a realizar una dilución del yogurt a examinar con el diluyente

seleccionado, ya teniendo esto listo, vamos a esterilizar el asa de inoculación con ayuda del

mechero de bunsen y vamos a tomar una muestra del yogurt diluido, y colocarlo en una lámina

asegurándose de que sea una cantidad de muestra adecuada.

Después se continúa con la fijación de la muestra, por medio del uso del mechero (tener cuidado

de no romper la lámina).

Después de tener la muestra lista para la tinción empezamos agregando cristal violeta y lo

dejamos reposar por 60s aproximadamente, y seguimos con un enjuague en agua de baja presión.

El siguiente paso es agregar yodo a la muestra y dejarlo reposar por 60s y luego enjuagar con

agua a baja presión , siguiente a esto agregamos una solución de alcohol al 95% durante 30s y

después enjuagamos, y como último paso de la tinción agregamos safranina y dejamos reposar

durante 60s para después realizar el último enjuague de agua a baja presión, por último se limpia

el exceso de agua y líquidos de la muestra con ayuda de toallas de cocina, ya después se termina

con la debida observación en el microscopio con los objetivos de 4x,10x,40x y 100x

acordándonos de hacer el adecuado uso del aceite de inmersión (Labs, 2023)

Las bacterias Gram + tienen una estructura conformada por:

• Pared celular que aporta rigidez y se compone de una capa gruesa de peptidoglicano o
mureína conformados por una cadena lineal de dos azúcares la N-acetilglucosamina
(NAGA) y el ácido N-acetil murámico (NAM) (Lucana & Huanca, 2014).
• Dos ácidos teicoicos:
1. Ácido Lipoteicoico: Está unido a la membrana plasmática y está en la parte interna de
la pared celular.
2. Acido teicoico: Unido solamente al peptidoglicano y se halla en la superficie de la
bacteria (Mollinedo & Gonzáles, 2014).
• En la Membrana Celular se pueden encontrar mesosomas de dos tipos:
1. Centrales o septales que estarían implicados en la replicación del ADN y participan
en la división celular formando el tabique entre ambas células.
2. Laterales que permiten un mejor contacto de su membrana al momento de expulsar
proteínas (Lucana & Huanca, 2014).
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Por su parte, las Gram – tienen una estructura conformada por:

• Pared Celular, constituida por las siguientes estructuras:

1. Membrana Plasmática, formada por fosfolípidos proteínas y enzimas, participan en la
producción de energía para la célula y se encargan del transporte/movimiento.
2. Peptidoglicano, al igual que las Gram +, aportan rigidez y le da forma de coco, bacilo
o espirilo, es muy delgada y está igualmente conformada por una cadena lineal de N-
acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico, unidas por puentes peptídicos.
3. Espacio Periplásmico o periplasma, este separa las dos membranas (membrana
plasmática y membrana externa), contiene enzimas hidrolíticas (fosfatasas, proteasas,
lipasas, nucleasas y enzimas metabolizadoras de carbohidratos), necesarias para la
degradación y metabolismo de moléculas grandes.
4. Membrana externa la cual se une a la pared a través de lipoproteínas, no permite el
ingreso de moléculas grandes que puedan dañar a las células, entre ellas las toxinas,
proteasas, peptidasas, entre otras, y también excluye sustancias hidrofóbicas. Su zona
interna está compuesta de fosfolípidos y la externa de moléculas anfipáticas (poseen
parte hidrofóbica e hidrofílica), llamadas lipopolisacáridos o endotoxinas.
5. Proteínas, tienen Porinas, que forman poros a través de los cuales pasan moléculas
hidrofílicas y actúan como barrera ante antibióticos hidrofóbicos. Además, cuentan con
lipoproteínas (unen el peptidoglicano con la membrana externa a través de un enlace
covalente) y proteínas de transporte.
6. Lipopolisacáridos, o endotoxinas, contienen el Lípido A, un núcleo o central R y el
antígeno O, estas moléculas son las principales estimulantes del sistema inmunitario,
producir la fiebre y estados de shock endotóxico que pueden conducir a la muerte.
• Cápsula y Capa de Limo, encontradas en algunas Gram -, la unión de esta cápsula que es
una capa de proteínas o polisacáridos, junto a la capa de limo (formada cuando la adhesión
no es fuerte o hay poca uniformidad/grosor), forman el llamado glucocálix.
• Flagelos, responsables del desplazamiento en medios líquidos de las bacterias para evitar
sustancias que la perjudiquen y permitir llegar a los nutrientes.
• Fimbrias, estructuras rectas y más finas que un flagelo, facilitan la adhesión a otras
bacterias (Mollinedo & Gonzáles, 2014).
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7. Conclusiones

• En el procedimiento realizado en el simulador pudimos adquirir conocimiento

relacionado con los utensilios y cantidades de sustancias utilizadas durante este mismo

• Por medio del simulador se logró observar con claridad las diferencias entre las bacterias

Gram positivas y Gram negativas y por lo cual la razón del color de su tinción

• En la práctica virtual se pudo realizar y observar las tinciones de Gram positivos y Gram

negativos dándonos como resultado evidenciar las diferencias entre ambas bacterias
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Referencias

(s.f.).

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actividades biologicas. Obtenido de

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C3%ADa_(Sin_l%C3%ADmites)/4%3A_Estructura_celular_de_bacterias%2C_arqueas_

y_eucariotas/4.4%3A_Paredes_celulares_de_procariotas/4.4B%3A_Membrana_Externa_

Gram-Negativa

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Humana, L. d. (22 de Abril de 2008). Preparación de solución salina por fosfatos. Obtenido de

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estabilizada-con-pvp-para-coloracion-de-

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