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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TUMBES

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS


ESCUELA DE AGROINDUSTRIAS

“EVALUACIÓN DE DOS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE


LA ENZIMA PAPAÍNA A PARTIR DE LA PAPAYA”

PROYECTO DE TESIS
PRESENTADO POR:

GUARNIZ CHAMBA, Carlos Roberto

En cumplimiento de los requisitos de la asignatura de


Metodología de la Investigación Científica.

TUMBES – PERÚ
2016
DEDICATÓRIA

El presente trabajo está dedicado a mis padres que día a día me apoyan y dan aliento
a seguir el arduo camino que me espera, a aquellos mentores que me han tomado bajo
sus enseñanzas y logran transmitir sus conocimientos y sirven de guía para poder continuar
mi investigación.

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AGRADECIMIENTOS

A Dios, quien medio la vida y me ha acompañado durante mis estudios, dándome


inteligencia y salud.

A mis padres y hermanos, quienes me han brindado su apoyo todo el tiempo.

Al Ingeniero José Luis Cabrera Reyes, mi docente que con su paciencia prestada y
dedicación me enseño que la vida universitaria no es fácil.

A mis amigos de la universidad.

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ÍNDICE
DEDICATÓRIA ................................................................................................................. 2
AGRADECIMIENTOS ...................................................................................................... 3
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................. 5
I. PLANTEAMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN ........................................................... 6
1.1. Situación problemática .................................................................................... 6
1.2. Formulación del problema ............................................................................... 6
1.3. Justificación...................................................................................................... 6
1.4. Antecedentes .................................................................................................... 7
1.5. Limitaciones...................................................................................................... 7
1.6. Objetivos ........................................................................................................... 8
II. MARCO TEÓRICO .................................................................................................... 9
2.1 ANTECEDENTES DE INVESTIGACIÓN ............................................................ 9
2.2 ENZIMA PAPAÍNA ............................................................................................. 9
2.2.1 Marco histórico. ................................................................................................ 9
2.2.2 Generalidades de la papaína...........................................................................10
2.2.3 Usos..................................................................................................................11
2.2.4 El látex de la papaya. .......................................................................................11
2.2.5 Aplicaciones industriales. ...............................................................................12
2.2.6 Aislamiento. .....................................................................................................13
2.2.7 Propiedades físicas. ........................................................................................14
2.2.8 Composición química y estructura. ...............................................................14
2.2.9 Estabilidad. ......................................................................................................15
2.2.10 Activación de la papaína..............................................................................16
2.2.11 Sitio activo. ...................................................................................................17
2.2.12 Especificidad. ...............................................................................................17
2.2.13 Tipos de papaína ..........................................................................................18
III. MARCO METODOLÓGICO ..................................................................................19
3.1. Nivel y tipo de investigación ...........................................................................19
3.2. Hipótesis ..........................................................................................................19
3.3. Variables ..........................................................................................................19
3.4. Métodos............................................................................................................19
3.4.1. Método por microondas ...........................................................................19
3.4.2. Metodo de extracción a partir del latex de la papaya .............................21
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................26

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INTRODUCCIÓN

Las enzimas son biocatalizadores, agentes de origen biológico que aceleran la velocidad
a la cual ocurren las reacciones químicas al disminuir los requerimientos de energía de
activación necesaria para dichas reacciones.
Debido a la importancia que las enzimas han adquirido desde hace ya mucho tiempo y a
las múltiples aplicaciones en que pueden ser empleadas, el proceso de purificación de
estas se ha convertido en un tema de investigación constante. A través del tiempo los
métodos de purificación se han ido perfeccionando tratando de cubrir aspectos importantes
en la obtención de las enzimas como la concentración obtenida y el mantenimiento de la
actividad enzimática. Las proteasas más utilizadas en la historia han sido las derivadas de
plantas y animales. La mayoría de las enzimas proteolíticas de origen vegetal son de tipo
cisteínico, como la papaína utilizadas en numerosas industrias.
Las enzimas no se consumen en el proceso, por lo que una molécula de enzima sigue
actuando. La catálisis enzimática como se denomina a la acción de las enzimas es
eficiente, altamente específica, puede llevarse a cabo en condiciones relativamente suaves
como temperatura ambiente y pH neutro y permite un control muy preciso de la reacción.
Por ello, la aplicación de las enzimas a la industria se constituye en uno de los primeros
procesos biotecnológicos de la química moderna. Las enzimas han encontrado un gran
número de aplicaciones en la industria, una de las clases de enzimas con mayor amplitud
de aplicación son las proteasas. Las proteasas son enzimas que provocan la hidrólisis o
digestión de otras proteínas en fragmentos más pequeños y en ciertas condiciones pueden
ser usadas para la síntesis de nuevos compuestos de interés farmacéutico. Una de las
proteasas cuyo uso se encuentra muy difundido es la papaína.
La papaína se encuentra en la pulpa y en el látex y se colecta haciendo cortes sagitales en
los frutos verdes, este fluye después de hacer cortes superficiales, para coagularse en la
superficie del fruto después de algunos minutos, en un proceso similar a lo que ocurre con
las heridas.

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I. PLANTEAMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN

1.1. Situación problemática


En la actualidad la papaya en el departamento de Tumbes solo se ve como un
producto cualquiera que se vende en el mercado sin darle ningún un proceso
agroindustrial o un valor agregado. Pero estudios afirman que tiene una enzima llama
papaína que es muy beneficiosa en muchos ámbitos como en la salud y en el
ablandamiento de la carne.
Para poder darle un uso adecuado a esta enzima primeramente debemos saber
cómo extraerla usando uno de los tantos métodos que existen para que así podamos
aplicarla en uno de los ámbitos que nombramos.
Según el Instituto Nacional de Estadística e Informática (INEI) en Tumbes, la
producción de plátano, limón y papaya se incrementó en diciembre del 2016 respecto
a similar mes del 2015. Uno de esos productos que presentaron comportamiento
positivo fue papaya con un aumento de 83, 7%. (Fuente: Diario Correo). Pero
suponiendo que de todo esto se logrará procesar un 60% de papaya y de modo
artesanal para elaborar jugos, fruta confiada por parte de los universitarios, ensalada
de frutas, entre otros.

1.2. Formulación del problema


¿Cuál es el resultado de la evaluación de dos métodos de extracción de la enzima
papaína a partir de la papaya?
1.3. Justificación
En el proyecto se pretende realizar la evaluación de dos métodos de extracción de la
enzima papaína, una proteasa que se extrae de la papaya verde; este cultivo por sus
ventajas agroclimáticas se produce durante todo el año en Perú.
El estudio es de gran interés debido a que la enzima es empleada en distintas áreas
como en la alimentaria, farmacéutica y textil, entre otras; ya que gracias a sus
diferentes propiedades es utilizada por las industrias quienes aprovechan al máximo
sus cualidades para la elaboración de una gama de productos de alto consumo por
la sociedad.
El presente trabajo se justifica debido a la falta de interés que tienen las personas
acerca de la papaya y los beneficios que tiene ésta pues si hablamos en lo que es
salud, la enzima de la papaína tiene propiedades antioxidantes y antiparasitarias,
esto actualmente seria de mucha ayuda por los muchos problemas estomacales e

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intestinales que se presentan, por otro lado ayuda a ablandar la carne como por
ejemplo de bobino para que sea más fácil su digestión.
1.4. Antecedentes
Existen diversos trabajos sobre la papaya y la enzima que queremos extraer. Estos
trabajos solo hacen referencia a una parte del proceso, pero son de vital importancia
para el desarrollo del presente trabajo.
 AGUIRRE E., CASTILLO P., Extracción y Estudio Comparativo de las
Enzimas Proteolíticas del Fruto Toronche (Carica-Stipulata) y de la Papaya
(Carica-Papaya) y su Aplicación en la Industria Alimenticia. Escuela
Superior Politécnica del Litoral, Guayaquil, Ecuador. 1-7.
 CARRERA, J., Módulos de Biotecnología, Enzimas Industriales,
Biorreactores, Variables de Control, Guías de Laboratorio y Biotecnología
Agrícola y Vegetal. Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad del
Cauca. (2002).
 CARRERA, J., Producción y Aplicación de Enzimas Industriales, Facultad
de Ciencias Agropecuarias, Departamento de Ingeniería Agroindustrial,
Universidad del Cauca, Popayán, Grupo de investigación Asubagroin,
Director. Vol 1 No.1 Marzo 2003.
 Chávez, Enzimología, Editorial Goudelias, 1998.
 Enzimas Proteolíticas, Modificación Proteica Postraduccional y destino y
recambio de proteínas, 2009. Disponible en:
 http://enzimologia.fcien.edu.uy/teoricos%202009/Peptidasas%201.pdf.
Consultado, 28 Oct. 2010.
 GACESA, P., HUBBLE, J., Tecnología de las Enzimas. Acribia. Zaragoza-
España, 1990.
 Rincón, M. & Meneses, O. (1995). Inmovilización de la papaína. Tesis para
optar el título de Ingeniero químico. Universidad de Antioquia. Medellín.
Rossi, L. Industria de la papaína: ¿Un negocio papaya? Recuperado de:
 http://www.upch.edu.pe/facien/dcbf/bioaplicada/PAPAINA.ppt#269,7, LA
PAPAINA.
1.5. Limitaciones
 Un factor que limita el trabajo son los escasos recursos para poder realizar
uno de los procesos.
 La limitada información actual que existe hacen que el trabajo se convierta
cada vez más experimental.

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 Este proyecto aún no se realiza en nuestro departamento así que no habrá
demasiada ayuda en lo que sería maquinaria o técnica.
1.6. Objetivos

Objetivo general:

 Evaluar dos métodos utilizados para extraer la enzima papaína a partir de la


papaya.

Objetivos específicos:

 Contribuir a la sociedad dando a conocer lo beneficioso que es la papaína.


 Evaluar el proceso más confiable y económico para la obtención de la papaína.
 Precisar el uso que tendrá esta enzima.
 Dar a conocer la papaína como componente nutricional al consumidor.
 Identificar las propiedades de la papaína.

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II. MARCO TEÓRICO
2.1 ANTECEDENTES DE INVESTIGACIÓN
Según (Barahona. 1983) en el continente Americano los países de Estados Unidos,
México y Chile son los mayores productores de la enzima papaína extraída del fruto
papaya.
La industrialización de frutas en nuestro país está limitada hacia la exportación de
jugos, concentrados, conservas y mermeladas, sin considerar otros principios activos
que contienen las frutas como subproductos, sean estos proteicos o enzimáticos los
cuales pueden ser usados como colorantes, clarificantes, saborizantes y coadyuvantes
de 14 ciertas reacciones químicas en la elaboración de otros productos (Aguirre, E).
La papaya al pertenecer a la familia de las caricáceas contiene en su composición
papaína que es una enzima proteolítica utilizada en la industria cervecera y en la
industria cárnica (Barahona. 1983).
La papaína bruta, contiene un poco de agua, glúcidos, ácidos orgánicos y una mezcla
de enzimas, dónde destacan las denominadas proteasas que actúan rompiendo los
enlaces peptídicos en cualquier lugar de la cadena peptídica en la que se hallen
situados (endopeptidasas).También contiene pequeñas cantidades de otros enzimas:
papaya peptidasa A, lipasa y lisozima (enzima que rompe las paredes de las células
bacterianas). (Chávez, 1998).
2.2 ENZIMA PAPAÍNA
2.2.1 Marco histórico.
Se ha sabido que desde hace muchos años los pueblos de la India Occidental
prensaban piezas de carne entre las hojas de papaya, con el objeto de
suavizarla. En Barbados se añadían masas de frutas verdes a la carne que de
otra manera no se podía cocer. Los nativos también usaban el jugo de la papaya
con propósitos cosméticos; así, frotaban ya sea el jugo solo o el jugo mezclado
con agua o pigmentos en sus pieles, para obtener así un tono de piel más
saludable y suave.
El jugo de la papaya también fue usado por los indígenas contra:
- El eczema
- Las verrugas
- Los parásitos intestinales
- Las ulceras y otras llagas
- La difteria
- Múltiples afecciones de la piel

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2.2.2 Generalidades de la papaína
Es una proteína de 212 aminoácidos, que se encuentran enrollados en 2 partes
separadas por un puente que tiene un lugar activo con un grupo tiol (SH) libre.
Es una enzima de baja especificidad que hidroliza tanto las proteínas como los
péptidos de pequeño tamaño, amidas y ésteres. Preferentemente actúa sobre
los aminoácidos básicos, Leu, Gly, Arg, Lis y Phe; su ecuación es (EC 3.4.22.2).
(Taboas, S. 2002).
La papaína que se extrae de la papaya es una enzima proteolítica, es decir, con
capacidad para digerir las proteínas de los alimentos. Similar a la pepsina, una
enzima que está en nuestro jugo gástrico.
Esta enzima se consigue por la extracción del látex, que es un líquido blanco
obtenido mediante cortes en los frutos inmaduros a la superficie de la papaya.
Luego, en laboratorio, se separa la enzima y se purifica hasta alcanzar un nivel
óptimo de calidad para la comercialización y uso.
Las enzimas papaína y quimopapaína son las principales proteasas del látex (10
y 45% de la proteína soluble), el cual contiene también lisozima (20%). (Carrera,
J. 2002).

Figura 1. Estructura de la enzima Papaína.


Fuente: Enzimas Proteolíticas, 2009.

Figura 2. Cys25, His159 y Asn175 forman la tríada catalítica.


Fuente: Enzimas Proteolíticas, 2009.

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2.2.3 Usos
Al ganado vacuno que se sacrificará se le inyecta la papaína media hora antes,
para suavizar aún más la carne que normalmente es suave; la carne tratada con
papaína nunca se debe comer medio cocida, debe ser cocinada suficientemente
para inactivar la enzima; la lengua, hígado y riñones de animales inyectados se
deben comer rápidamente después de cocinarlos por ser alimentos altamente
perecederos. En la industria se utiliza para rasurar las pieles antes de la
coloración y sirve como elemento adjunto en el proceso del caucho. Es aplicada
en el hígado de los atunes antes de la extracción del aceite que de esta forma
es enriquecido en vitaminas A y D2. Se le encuentra en las pastas de dientes,
cosméticos y detergentes, así como en fármacos para auxiliar la digestión.
(Morton, J.F. 1987).
Las enzimas importantes para ablandar carne son proteasas de origen vegetal o
de microorganismos (Bacillus subtilis y Aspergillus oryzae). Las enzimas se
inyectan antes del sacrificio al animal o se trata la carne con las enzimas antes
de cocerla, con lo que se logra un franco ablandamiento sin provocar una
proteólisis importante. (Cabra, J.1997).
La papaína actúa atacando por proteólisis las fibras musculares y los
compuestos del tejido conectivo tales como el colágeno y la elastina, logrando
así un relajamiento en los enlaces peptídicos de las proteínas. (ROSI, L. 2007).
La enzima es muy apreciada en la industria cosmética se aprovecha su poder
desmanchador y cicatrizante.
En la industria farmacéutica resalta su última utilización en medicinas para la
digestión, disolver membranas en difteria y reducir la hinchazón, fiebre y
adhesiones post cirugía.
2.2.4 El látex de la papaya.
El látex se encuentra bajo la cáscara de la papaya verde y plenamente desarrollada.
Este látex está contenido en unos pequeños vasos largos que se encuentran
justamente debajo de la piel. Cuando estos vasitos son cortados, exudan un líquido
claro como el agua, el cual se vuelve opaco por su exposición al aire, siendo este
líquido la fuente más importante de papaína. Aunque todas las partes de la planta
contienen látex, en plantaciones comerciales para obtener papaína, solo los frutos
verdes, maduros y sin cortar son usados para la extracción del látex, porque las
exudaciones de estos frutos son más vigorosas que de cualquier otra parte de la
planta.

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El látex de papaya consiste en una mezcla de proteasas o enzimas. Schack demostró
la existencia de cuatro componentes principales con actividad proteolítica:
- Papaína
- Quimiopapaína
- Lisozima
- Material no caracterizado en las proteínas solubles del látex
Juntas estas proteínas son más o menos el 64% de las proteínas solubles del látex.
La fracción denominada quimiopapaína es el componente proteolítico más abundante
en el extracto. La papaína fue cristalizada por primera vez por Ball et. Al. En 1937.
Cabe mencionarse también que la extracción del látex no daña la pulpa del fruto,
pudiendo utilizarse este al madurarse, para consumo fresco o considerar la posibilidad
de enlatarlo en forma de trozos o rodajas, fabricar mermeladas, vinagre, néctar, etc.,
ya sea para consumo interno o para exportación.
2.2.5 Aplicaciones industriales.
La papaína es una enzima proteolítica que tiene muchas aplicaciones y funciones en
una gran variedad de industrias.
- Industria de la cerveza: La industria cervecera utiliza el 75% de los
suministros mundiales totales de papaína, esta se utiliza para clarificar o
estabilizar la cerveza contra el frio, o sea para prevenir la formación de
niebla o enturbiamiento debido al frio en esta. La niebla debido al frio
consiste en partículas muy pequeñas, las cuales resultan de exponer la
cerveza a una temperatura menor de 10 ºC. La cantidad de niebla formada
aumentara a medida que el periodo de almacenamiento aumente o a
medida que la temperatura disminuya.
Este problema existe debido a que la cerveza producida es almacenada por
largos periodos de tiempo a temperaturas muy bajas.
La composición de la niebla debida al frio varía de cerveza en cerveza. Esta
generalmente consiste en taninos, carbohidratos y proteínas. La porción de
taninos de esta niebla generalmente consiste de polifenoles.
La porción de carbohidratos consiste en compuestos de bajo peso molecular
como glucosa, xilosa y arabinosa. El uso de papaína tiende a hidrolizar la
fracción proteínica de la niebla debida al frio, la cual es la causante esencial
de esta turbidez; en pocas palabras, las proteínas se pueden disolver
gracias a la papaína y, en consecuencia la niebla u opacidad desaparece.
- Posibilidades potenciales de utilización de la papaína: Otras posibles
aplicaciones que tiene la papaína son: La posibilidad de usarla en la

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fabricación de quesos, en la coagulación de la leche, en la fabricación de
margarina exenta de efecto cuajante, en la panificación, en laboratorios
bacteriológicos, en investigación de proteínas, en la industria del papel, etc.
Una aplicación nueva, que es potencialmente muy grande, pero que es
todavía de poca importancia hoy en día, es en la proteólisis de productos
como la soya y el pescado.
2.2.6 Aislamiento.
El látex de la papaya contiene una mezcla de enzimas, la composición de este y
algunas de las características de sus fracciones enzimáticas se muestran en el
siguiente cuadro.

Tabla N° 1. Características de las enzimas del látex de papaya.


PESO PUNTO CONCENTRACIÓN
ENZIMA
MOLECULAR ISOELÉCTRICO DEL LÁTEX
Papaína 21,000 8.75 10%
Quimiopapaína 36,000 10.10 45%
Lizosima 25,000 10.50 20%

La papaína puede separarse del resto de enzimas y prepararse rápida y


económicamente, en una forma cristalina, en un estado de pureza bueno y en
cantidades razonables, a partir del látex seco comercial. Se han desarrollado muchos
métodos para aislar la papaína del resto de enzimas, entre ellos cabe mencionar el
desarrollado por Kimmel y Smith, que es uno de los métodos más usados de extracción
de papaína.
Este procedimiento comprende una extracción del látex, eliminación del material
insoluble en el extracto a un pH=9, precipitaciones con sulfato de amonio, seguidas de
tres recristalizaciones. La papaína pura obtenida por este método contiene tres
componentes:
- Papaína activa
- Papaína no activable
- Papaína activable

Por este método se obtienen aproximadamente de 6 a 7 mg de papaína pura por gramo


de látex seco. En general, lo que se busca en la purificación del látex seco es:
- Reducir el contenido de componentes no proteolíticos, para obtener una
fracción con mayor actividad proteolítica.

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- Separar la papaína u otro componente del resto de enzimas o compuestos con
actividad proteolítica (o al menos incrementar la proporción de esta).
- Obtener un producto más estable para incrementar su vida de almacenamiento.
- Obtener un producto estéril para una aplicación específica.

La papaína aislada representa solo una parte menor del total de actividad proteolítica,
esto se debe a que hay otra enzima proteolítica presente en el látex en una proporción
considerablemente mayor, que también ha sido aislada en forma cristalina por medio
de un procedimiento diferente, siendo esta la quimiopapaína. La suma de las
actividades de estas dos enzimas cristalinas representa casi el total de la actividad
proteolítica del látex fresco.
2.2.7 Propiedades físicas.
De acuerdo a Balls Y Lineweaver, la papaína cristalina se presenta en forma de agujas
bajo el microscopio. Algunas veces, presenta otra forma de cristales, laminas largas
con caras hexagonales alargadas, menos solubles en agua. La papaína cristalina es
soluble en agua y en alcohol etilico o metilico al 70% y notablemente estable en
solucion de urea 9.0 M, pero puede ser precipitada facilmente (Salting out) en solucion,
especialmente a bajas temperaturas.

Tabla N° 2. Propiedades fisicas de la papaína


PROPIEDAD VALOR
Punto isoeléctrico pH= 8.75
Constante de sedimentación 2.42 ± 0.04 seg
Constante de difusión 10.27 ± 0.13×107 cm2 seg-1
Peso molecular 23,350 Daltons
Rotación óptica (pH= 5.7, 25ºC) -66.7

2.2.8 Composición química y estructura.


La papaína es funcionalmente clasificada como una enzima hidrolasa y proteasa tiolica.
Fue la primera enzima reconocida como miembro de una clase de enzimas proteolíticas
que necesitan un grupo sulfhidrilo libre para desarrollar su actividad. La base de datos
SCOP (siglas en inglés para Clasificación Estructural de Proteínas) coloca a esta
enzima en la clase de las Proteasas Cisteínicas (Superfamilia: Proteasas Cisteínicas).

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La papaína existe como un monómero, consistente de 212 residuos. Es una proteína
simple conteniendo solamente aminoácidos y desprovista de carbohidratos. Todos los
aminoácidos usuales están presentes con excepción de la metionina.
La composicion elemental de la papaína cristalina ha sido reportada que contiene un
16.1% de nitrogeno y un 1.2% de azufre. La composicion de aminoacidos reportada
por Smith y Kimmel se muestra en siguiente cuadro:

Tabla N° 3. Composición en aminoácidos de la papaína


AMINOÁCIDO % DE PROTEÍNA
Tirosina 14.71
Acido glutámico 12.43
Acido aspártico 11.32
Glicina 8.60
Valina 8.43
Arginina 7.75
Leucina 6.10
Alanina 6.08
Isoleucina 6.05
Serina 5.91
Lisina 5.67
Prolina 5.11
Triptofano 4.68
Treonina 3.89
Treonina 3.16
Histidina 0.85

2.2.9 Estabilidad.
La enzima cristalina muestra un alto grado de estabilidad. Como cristales en
suspensión en solución de cloruro de sodio, puede mantenerse a 4 ºC por varios meses
sin pérdida detectable de su actividad. Sin embargo la propiedad más notable de la
papaína es su estabilidad cuando se expone a altas temperaturas, solventes orgánicos
y reactivos los cuales pueden causar la desnaturalización de otras enzimas.
Algunaspropiedades y factores que influyen en la acción de la papaína son:
- Temperatura: Es de recordar que los nativos del trópico ablandaban su carne
hirviéndola con pedazos de papaya verde o con su jugo; este fenómeno fue reportado
por numerosos investigadores de este campo desde hace mucho tiempo. Las enzimas
proteolíticas son tradicionalmente poco estables al calor, pero la papaína es
relativamente la enzima más estable en un rango de temperatura amplio, propiedad
que no es compartida por otras proteasas vegetales.

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Wurtz encontró que una muestra de papaína todavía retiene actividad después de
haber sido calentada a 105º C. Esto se basa en el descubrimiento de que la papaína
resiste calor seco a 100º C por 3 horas.
Sin embargo cuando se usó papaína en solución, su actividad fue destruida por
calentamiento a 82.5ºC, esto se debe a que la papaína es más estable en estado sólido
que en solución.
- pH del medio: Una de las peculiaridades de la papaína es su actividad proteolítica
en un amplio rango de condiciones de pH. Declaraciones recientes muestran que la
papaína es activa en un medio acido, neutro y básico, cubriendo esta actividad un
rango de pH de 3 a 12.
En efecto este es probablemente el rango efectivo más amplio de pH que el de
cualquier otra enzima proteolítica. También se ha reportado que el óptimo de
estabilidad de la papaína en solución es del rango de pH de 5 a 6. La acción óptima
de papaína sobre caseína ha sido encontrada a un pH de 6.5 y 7.
- Efecto del almacenamiento: La papaína pierde la actividad durante su
almacenamiento, especialmente cuando esta se encuentra en solución.
Se han reportado perdidas de actividad de preparaciones comerciales de papaína que
se han almacenado durante varios meses o durante un año, y también de muestras de
papaína de diversos grados de pureza que han perdido en promedio, cerca de un 30%
de su actividad en 3-6 meses, cuando se han mantenido a 25ºC.
El método de preparación de la papaína es muy importante en relación a su estabilidad
durante el almacenamiento. Estudios especiales sobre la estabilidad de la papaína han
confirmado que mucha de la actividad del látex se pierde durante el secado y su
subsecuente almacenamiento.

2.2.10 Activación de la papaína.


La papaína es activada por agentes reductores y desactivada por agentes oxidantes.
Los agentes más comunes usados son cisteína cianuro y sulfuros. Es importante
enfatizar que aunque la papaína requiere activación, no es requerida la presencia
continua del activador, la efectividad del sistema activador depende de cual sistema
buffer sea utilizado. Esta variabilidad del sistema buffer es eliminada si el EDTA (ácido
etilendiaminotetracetico) es usado en unión del agente reductor.
Varios agentes como el yodo, bromo, peróxido de hidrógeno diluido y oxígeno
atmosférico inactivan la papaína bajo ciertas condiciones.Estos efectos han sido
explicados por la naturaleza del grupo “tiol” de la enzima, el cual es activo en estado
reductor e inactivo en estad oxidado.

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2.2.11 Sitio activo.
La interacción entre enzima y sustrato ocurre en la superficie de la molécula de
papaína en un surco el cual está situado entre las dos partes de la molécula. La cadena
lateral de cisteína 25 se encuentra en la ranura, si el grupo SH de la cisteína no se
encuentra libre, ya sea por bloqueo por metales pesados, por agentes alquilantes o
por formación disulfitica, la actividad de la enzima desaparece completamente.
Cercano al grupo sulfhídrico se encuentra el anillo imidazolico de la histidina 159, el
cual se encuentra unido a su vez a través de puentes de hidrogeno, con la cadena
lateral de asparagina 175; dándole forma a la triada catalítica que forma el sitio activo
de la papaína.

Figura. Triada catalítica de la enzima papaína.

2.2.12 Especificidad.
Se ha conocido desde hace muchos años que la papaína puede producir una
degradación de la proteína en muchos sustratos, más que cualquier otra proteasa
vegetal conocida. La papaína tiene una amplia especificidad, así puede hidrolizar
sustratos sintéticos que son los generalmente usados para tripsina, quimiotripsina o
pepsina. La papaína es también muy activa en la hidrólisis de amidas y ésteres. La
papaína hidroliza las amidas de la arginina, lisina, glutamina, histidina, glicina y
tirosina, todas ellas α-amino sustituidas.

La amplia variedad de enlaces peptídicos hidrolizados por la papaína puede ser


superficialmente interpretado como indicativo de un bajo grado de especificidad de la
enzima. Sin embargo, numerosos estudios han demostrado que factores gobernando
la especificidad de la papaína no pueden ser discernidos a partir del examen de su
acción sobre pequeños sustratos sintéticos o sobre péptidos pequeños elegidos al
azar.

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Debido a su amplia especificidad, la papaína no ha sido comúnmente usada para la
hidrólisis de proteínas y polipéptidos muy largos, sin embargo, ha sido excesivamente
valiosa para la hidrólisis de péptidos de moderado tamaño cuando estos no contienen
enlaces del tipo susceptible a las ampliamente utilizadas tripsina y quimiotripsina.

La aplicación de sustratos sintéticos simples en el estudio de la especificidad de


enzimas proteolíticas ha resultado con grandes progresos para el entendimiento de la
acción de la papaína. Usando dichos sustratos se ha encontrado que los preparados
comerciales de papaína no atacan los dipéptidos, o si lo hacen, lo hacen muy despacio.
Kimmel y Smith, han reportado que el ácido carbobenzoxi-L-glutamico es un inhibidor
de la papaína en la región de pH de 3.9 4.5; también se ha demostrado que el ácido
carbobenzoxi-L-aspartico produce inhibición similar.

2.2.13 Tipos de papaína


Los principales tipos de papaína que actualmente se venden en el mercado
internacional son:
- Papaína Cruda: Esta se obtiene por el secado del látex al sol o en hornos rústicos.
Es un producto de baja calidad, baja estabilidad biológica y por lo tanto de vida corta
y de una actividad proteolítica relativamente baja (aproximadamente 350 unidades
tirosina/mg), su rendimiento a partir del látex fresco es de un 20% en peso
aproximadamente.
- Papaína Semirefinada: Es obtenida por secado del látex bajo condiciones
controladas. Sin embargo su vida es limitada a 6-8 meses, su rendimiento a partir del
látex es de un 25% en peso aproximadamente y su actividad proteolítica es más bajo
que de la papaína completamente refinada (450-500 unidades tirosina/mg). Su color
es blanco.
- Papaína Refinada: Este producto es biológicamente estable y completamente libre
de materia extraña, y tiene una actividad proteolítica más alta que las anteriores (800-
1000 unidades tirosina/mg y más). Generalmente es obtenida a través de un proceso
de secado por aspersión al vacio (método de Bourdart); a grandes rasgos la secuencia
de operaciones que sigue este látex son: Homogenización, clarificación, filtración
sobre placas clarificantes, concentración, filtración esterilizante y atomización. La
relación de látex fresco a papaína que se vende refinada es de 6:1 o 7:1. Es la papaína
más purificada que se vende actualmente en el mercado internacional. También
existen otros métodos para su obtención, como el de fraccionamiento alcohólico.

18
III. MARCO METODOLÓGICO
3.1. Nivel y tipo de investigación
La realización de este trabajo se fundamentó en dos tipos o niveles de
investigación:
Investigación aplicada: Este tipo de investigación permitió desarrollar los
conocimientos teóricos; para verificar la teoría de la realidad mediante pruebas
prácticas que confirmen la información bibliográfica. De tal manera que en el
laboratorio se puedan realizar ensayos de extracción y concentración de la enzima
papaína, basándose en documentos teóricos comprobados y con las
modificaciones correspondientes evaluando la funcionalidad del concentrado
obtenido a través de los resultados de actividad enzimática, que servirán como
base para continuar con la investigación sobre el tema de estudio.

Investigación Experimental: El nivel de investigación experimental utilizará los


conocimientos obtenidos de la experiencia práctica que se desarrollará en el
laboratorio, de acuerdo a los resultados de los ensayos que se llevaran a cabo, se
realizará un seguimiento de la metodología con la finalidad de mejorar el proceso
utilizado e identificar las características fundamentales del proceso evitando que
otros factores intervengan en el desarrollo del trabajo.

3.2. Hipótesis
El método de extracción de la enzima papaína con mejores resultados es la
extracción por medio de microondas, pues la concentración enzimática es mayor
y mucho más fácil de realizar, aunque la cantidad se da en porcentajes. El otro
método al contrario toma mucho más tiempo pero determinas el porcentaje y la
calidad de la enzima.
3.3. Variables
Variable Independiente: Concentrado que contiene papaína.
Variable Dependiente: Determinación de la actividad enzimática.
3.4. Métodos

3.4.1. Método por microondas


Materiales
Las papayuelas Carica Papaya L.; se seleccionaron aquellos frutos que no habían
alcanzado su índice de madurez final -según la carta de la FAO, hasta un 40% de

19
color amarillo-. La extracción de papaína se rea lizó utilizando etanol grado
analítico marca Merck.
Métodos
Caracterización de la fruta. Las frutas fueron aleatorizadas para disminuir el
porcentaje de error y fueron caracterizadas fisicoquímicamente (peso, altura, pH,
sólidos solubles y acidez titulable), de acuerdo con los métodos reportados en la
AOAC, 2007.

Extracción de la enzima.
Inicialmente se efectuó la limpieza y desinfección de las papayuelas; seguido a
esto, se separó la corteza de la fruta en delgadas capas evitando tomar parte del
fruto, se cortaron en pequeños trozos y según el peso obtenido de la cáscara por
papayuela se distribuyeron en los vasos de precipitación adicionando a cada uno
un peso aproximado de 6g. La extracción se inició con la adición de 13.5mL de
etanol analítico a cada vaso de precipitación que contenía las cáscaras y
posteriormente fue llevado a un microondas SAMSUNG de 1300W, durante 30 s
y 390 W en tres momentos para completar una cantidad total de 40.5mL del
solvente por beaker. La solución obtenida fue filtrada y rotoevaporada en un
equipo BÛCHI R-114 a 60°C durante 45 minutos aproximadamente. Finalmente,
se calculó el porcentaje de rendimiento mediante la siguiente ecuación:

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 (𝑔)


%𝑅𝑒𝑛𝑑𝑖𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑐𝑖ó𝑛 = 𝑥100
𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑟𝑡𝑒𝑧𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑓𝑟𝑢𝑡𝑎 (𝑔)

Resultados y discusión
Extracción de la enzima. La tabla 1 muestra los resultados del porcentaje de
rendimiento obtenido después de la rotoevaporación.
Tabla 1. Rendimiento de los extractos obtenidos después de la rotoevaporación.

Esta investigación demuestra que es posible desarrollar un método diferente de


extracción y mejorar eficiencia con una sola fase, el cual permite que haya una
disminución en la exposición de la enzima; caso contrario con los actuales
procesos que constan hasta de tres fases lo que puede ocasionar disminución en

20
la actividad enzimática y su posterior efecto en las aplicaciones que tiene la
papaína. El método de extracción de papaína por microondas es viable.
3.4.2. Método de extracción a partir del látex de la papaya

Métodos Experimentales
Extracción del Látex de la fruta
 Limpiar y desinfectar el área de trabajo y los utensilios a utilizar para el
proceso de extracción del látex.
 Colocarse guantes plásticos desechables para evitar alguna irritación en la
piel.
 Para la extracción del látex de papayas se seleccionan frutos verdes y
completamente desarrollados.
 Lavar las frutas de papayas que van a ser utilizadas para el proceso,
secarlas bien con papel toalla para evitar contaminaciones.
 Pesar las frutas de papayas, para determinar el rendimiento del látex
extraído una vez procesado.
 El fruto puede recibir varias incisiones repetidamente a intervalos de tres a
cinco días, hasta que la aparición del látex comience a disminuir.

 Todas las incisiones deben ser hechas verticalmente y no más de 4 sangrías


deben hacerse a un fruto al mismo tiempo, de 1 a 2 mm de espesor cada
incisión.
 Se colocan recipientes bajo las frutas para la recepción del látex y su
concentración. Estos pueden ser de diferentes materiales o formas.
Procesamiento del látex.
El látex debe ser procesado inmediatamente después de ser extraído del fruto, ya
que el objetivo principal es preservar la actividad proteolítica de la enzima.
Para la operación de secado debe transcurrir el menor tiempo posible después del
la recolección, a fin de que la actividad del látex no disminuya. El secado se puede
hacer de diferentes formas: a pleno sol, utilizando una estufa, un secador de
cabina con bandejas, o cualquier otro tipo de horno o fuente de calor.
A continuación detallare cada uno de los pasos a seguir en el procesamiento del
látex con el secado con estufa.
 Prender la estufa a una temperatura de 50 ºC.
 Pesar la caja petri.
 Una vez el látex extraído en una caja petri, colocarlo en la estufa por
aproximadamente 3 a 4 horas dependiendo de la cantidad de látex.

21
 Chequear cada determinado tiempo el látex dentro de la estufa.
 En el momento en el que el látex no se pegue y este en forma granulada,
esto quiere decir que el proceso de secado ha finalizado.
 Pesar la caja petri con el látex ya seco.
 Colocar el polvo en un mortero y molerlo, hasta que los gránulos de látex
seco se pulvericen.
 Colocar el polvo en un recipiente de vidrio oscuro bien sellado.
 Colocar el recipiente en la refrigeradora, para un mejor mantenimiento de la
enzima
Determinación de Actividad Enzimática.
Para la determinación de la actividad enzimática, se detallaran a continuación los
dos métodos, utilizados para comprobar la existencia de la enzima papaína y su
efectividad.
a) Método de coagulación de leche (Balls and Hoover).
Hay diferentes métodos de comprobación de actividad de una enzima. Este
método confía en la capacidad de la papaína en coagular la leche, los análisis
se realizaran en 10 mililitros de leche deshidratada, a diferentes
concentraciones de papaína (0.0025, 0.005, 0.01 y 0.02) gramos por mililitro
de ácido acético, una vez preparada la solución de papaína con ácido agregar
a la leche (0.5, 1, 2, 4, 6 y 7) mililitros respectivamente. Esterilizar los
instrumentos que se van a utilizar en el autoclave por 45 minutos, y luego
colocarlos en la estufa a 120ºC por 30 minutos para eliminar residuos de agua.
Se deja enfriar a temperatura ambiente (28 ± 2 ºC).
 Pesar 7.75 gramos de leche en polvo.
 Colocar 54 mililitros de agua en un vaso de precipitación.
 Diluir la leche en el agua y calentarla a 30ºC en un baño de agua y
mantener esta temperatura, en una cocineta eléctrica.
 Pesar las diferentes cantidades del polvo de látex seco (0.0025, 0.005,
0.01 y 0.02) gramos por mililitros de ácido acético.
 A una cantidad determinada de leche (10 mililitros), agregar las
cantidades de la solución de látex seco diluido en ácido acético (0.5, 1, 2,
4, 6 y 7) mililitros.
 Mezclar el contenido a fondo y controlar el tiempo que demora para
detectar la coagulación de la leche (formación de coágulos).

22
 El tiempo tomado para alcanzar esta etapa, de cuando el polvo de látex
seco diluido en el ácido fue agregado a la leche, se registra para cada
uno de los experimentos.
 Las diversas cantidades de muestra del polvo de látex seco usado deben
dar una gama de los tiempos de coagulación entre 20 y 150 segundos
para los resultados óptimos.
b) Método de determinación de proteínas en Leche. Este método se basa
en la descomposición de los compuestos de nitrógeno orgánico por
ebullición con ácido sulfúrico. El hidrógeno y el carbón de la materia
orgánica se oxidan para formar agua y dióxido de carbono. El ácido
sulfúrico se transforma en sulfato, el cual reduce el material nitrogenado a
sulfato de amonio. El amonio se libera después de la adición de hidróxido
de sodio y se destila recibiéndose en una solución de ácido sulfúrico 0.1N.
Se titula el nitrógeno amoniacal con una solución valorada de hidróxido de
sodio 0.1N. En este método se usa el sulfato de cobre como catalizador y
el sulfato de sodio para aumentar la temperatura de la mezcla y acelerar
la digestión. Este método consta de tres etapas, la primera etapa
preparación de la muestra, segunda etapa procedimiento para la digestión
y por último la tercera etapa el procedimiento para la destilación.
Primera etapa.
 Agregar al tubo de digestión 15 g de sulfato de sodio y 0,5 g de
sulfato de cobre pentahidratado.
 Calentar la leche a 38°C ± 1°C.
 Mezclar la muestra para homogenizar.
 Pesar 5ml ± 0,1ml de la muestra caliente e inmediatamente
colocarla en el tubo de digestión.
 Adicionar 25ml de ácido sulfúrico.
Segunda etapa.
 Al inicio se fija una temperatura baja en el equipo de digestión (180
a 230°C) para evitar la formación de espuma.
 Se colocan los tubos, con el extractor conectado en el equipo de
digestión. El vacio debe ser suficientemente bueno para eliminar los
vapores.
 Digerir por 30 minutos o hasta que se formen vapores blancos.

23
 Incrementar la temperatura de 410 a 430°C y digerir hasta que se
aclare la solución. Podría ser necesario incrementar la temperatura
en forma gradual, cada 20 minutos, para el control de la espuma.
 Evitar que la espuma dentro del tubo alcance el extractor o llegue a
una distancia de 4-5cm del borde superior del tubo.
 Después de que la solución se acabe (cambie de color azul claro a
verde), continúe en la ebullición cuanto menos por una hora.
 El tiempo aproximado de digestión es de 1,75 a 2,5 horas. Al
término de la digestión, la solución debe ser clara y libre de material
sin digerir.
 Enfriar la solución a temperatura ambiente (aproximadamente por
25 minutos).
 La solución digerida debe ser líquida con pequeños cristales en el
fondo del tubo (la cristalización excesiva indica poco ácido sulfúrico
residual al fin de la digestión y podría generar bajos resultados.
Para reducir las pérdidas de ácido durante la digestión, reducir la
tasa de extracción de vapores).
 Después de enfriar la solución a temperatura ambiente, adicionar
200ml de agua (el blanco puede requerir 150ml) a cada tubo, tape
para mezclar y deje enfriar a temperatura ambiente.
 Cuando se adiciona agua a temperatura ambiente se pueden
formar algunos cristales, para después integrarse nuevamente a la
solución; esto es normal.
 Los tubos se pueden tapar para llevar a cabo la destilación
posteriormente.
Tercera etapa.
 Coloque la solución de hidróxido de sodio al 45% en el depósito de
álcali de la unidad de destilación.
 Ajuste el volumen de dosificación a 70ml de hidróxido de sodio.
 Coloque el tubo de digestión que contiene la solución en la unidad
de destilación.
 Coloque un matraz Erlenmeyer de 500ml con 50ml de la solución
de ácido sulfúrico 0.1N con indicador (rojo de metilo) sobre la
plataforma de recepción, asegurándose que el tubo del
condensador se encuentre dentro de la solución de ácido sulfúrico.

24
 Destilar hasta obtener un volumen de 150ml.
 Retirar el matraz de recepción.
 Titular el destilado con hidróxido de sodio 0.1N utilizando el
indicador de Wesslob o el potenciómetro.
 Registrar el volumen utilizado de hidróxido de sodio con una
exactitud de 0,05ml.
Resultados.
Extracción de Papaína.
En el proceso de extracción del látex de la papaya se obtuvo la siguiente tabla.

Análisis de Actividad Enzimática de la papaína de la Papaya.


En los análisis de actividad enzimática con el método de coagulación de leche (Balls
and Hoover), se obtuvo una gama de tiempos de coagulación a las diferentes
concentraciones de enzima papaína adicionada a la leche, observando que a
medida que aumenta la concentración de papaína diluida en ácido y agregada en
la leche el tiempo de coagulación de la leche disminuye en todos los análisis
realizados.
Para demostrar que la papaína de ambos frutos es activa, se procedió hacer un
análisis de determinación de proteínas en leche, con el método de Kjeldahl.
Los datos obtenidos en estas pruebas en el laboratorio para la leche, al igual que
las pruebas por triplicado del suero proveniente del ácido más cada una de las
papaínas se encuentra en las siguientes tablas.

En la tabla de porcentaje de proteína caseína sin enzima, se puede observar que el


% de caseína en la leche es de 3.789%, mientras que al adicionar ácido acético a
la leche el % de caseína en el suero es de 1.9304% es decir que la proteína ha
disminuido, en comparación con la tabla de porcentaje de proteína caseína en
suero, se puede observar que en el análisis por triplicado en el suero producto de
la adición de la solución de ácido más papaína a la leche ha disminuido.

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