Evaluación molecular de la Capreomicina durante la fase

de iniciación de la síntesis proteica en el ribosoma de E. coli

Item Type info:eu-repo/semantics/bachelorThesis

Authors Candusso - Carbone, Alessandra

Publisher Universidad Peruana de Ciencias Aplicadas (UPC)

Rights info:eu-repo/semantics/openAccess; Attribution-

NonCommercial-ShareAlike 4.0 International

Download date 07/10/2023 15:09:49

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 UNIVERSIDAD PERUANA DE CIENCIAS APLICADAS

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA ACADÉMICO DE MEDICINA

Evaluación molecular de la Capreomicina durante la fase de iniciación de la

síntesis proteica en el ribosoma de E. coli.

TESIS

Para optar el título profesional de Médico Cirujano

AUTOR

Candusso Carbone, Alessandra (0000-0002-5888-5652)

ASESORES

Sánchez Castro, Ana Elena (000-0003-3861-3083)

Milón Mayer, Pohl Luis (0000-0001-6679-5473)

Lima, Febrero de 2022

 DEDICATORIA

A mi familia, por el apoyo incondicional y la motivación para continuar cada día.

1
 AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a Fondecyt, que por medio del convenio 154-2017-Fondecyt esta

investigación fue financiada, y al Centro de Investigación de la Facultad de Ciencias de la
Salud de la UPC, por brindarnos los equipos de laboratorio que sirvieron para la realización
de la investigación

2
RESUMEN

La tuberculosis es una enfermedad muy prevalente en el Perú y los casos de tuberculosis

multidrogorresistente (MDR) están en aumento. La capreomicina es un antibiótico péptido
cíclico utilizado anteriormente en el esquema de segunda línea de tratamiento para
tuberculosis MDR. El mecanismo molecular de acción conocido de este fármaco es la
inhibición de la fase de elongación de proteínas. En esta investigación utilizamos el
microorganismo E. coli, por ser un gold standard para estudios mecanísticos de antibióticos
y un espectofotómetro , llamado Stopped-flow, para evidenciar los cambios conformaciones
del factor de iniciación 3 fluorescente (IF3DL). Se observó que la unión de capreomicina a la
subunidad menor 30S del ribosoma promueve el acercamiento de los dominios de IF3DL, el
cual fue evidenciado como una disminución de fluorescencia. Esta reacción fue dependiente
de concentración, encontrándose una mayor disminución de la fluorescencia en función del
aumento de capreomicina. Cuando se añadió el factor de iniciación 1 (IF1) al complejo 30S-
IF3DL, la unión de capreomicina también resultó en un acercamiento de los dominios de
IF3DL, pero ligeramente menor que la que ocurre en ausencia de IF1. Los parámetros
cinéticos entre los complejos 30S – IF3DL en ausencia o presencia de IF1 con capreomicina
indican que el acercamiento de los dominios de IF3DL es independiente de IF1. En
conclusión, capreomicina induce un acercamiento de los dominios de IF3, lo que podría
afectar su función.

Palabras clave: Capreomicina, factor de iniciación 3, fase de iniciación, fluorescencia,

Stopped-flow

3
Molecular evaluation of Capreomycin during initiation phase of bacterial protein synthesis.

ABSTRACT

Tuberculosis is a prevalent disease in Peru and cases of multridrugresistant tuberculosis

(MDR – TB) are increasing. Capreomycin is a ciclic peptide antibiotic, that was used before
in the second line treatment of multidrugresistant tuberculosis. The known molecular
mecanism of action is the inhibition of the elongation phase of protein synthesis. In this
study, we used the microorganism E. coli, because it is a gold standard to study antibiotic
mechanism of action and a spectrophotometer, called stopped-flow, to show conformational
changes of the initiation factor 3 (IF3). It was shown that binding of capreomycin to the
small subunit 30S brings IF3 domains into proximity, which seems like a decrease of
fluorescence. This effect was found to be concentration dependent, finding a greater
fluorescence decrease when the concentration of capreomycin was higher. When initiation
factor 1 (IF1) was added to the 30S – IF3DL complex with capreomycin, a further decrease
of inter domain distance was observed; yet, slightly less than in absence of IF1. The kinetic
analysis of capreomycin binding in the presence or absence of IF1 shows that IF3 DL inter
domain distance reduction is IF1 – independent. In conclusion, capreomycin induces a
reduction of the inter domain distance of IF3, which is expected to perturb its main fidelity
function.

Keywords: Capreomycin, initiation factor 3, initiation phase, fluorescence, stopped-flow

4
TABLA DE CONTENIDO

1 Introducción ................................................................................................................... 7

2 Objetivos...................................................................................................................... 10

3 Materiales y métodos ................................................................................................... 11

3.1 Tipo de estudio................................................................................................................ 11

3.2 Organismo modelo.......................................................................................................... 11

3.3 Lugar de estudio.............................................................................................................. 11

3.4 Consideraciones analíticas .............................................................................................. 11

3.5 Métodos experimentales ................................................................................................. 12

3.5.1 Fase preparativa ....................................................................................................................... 12
3.5.2 Fase analítica ........................................................................................................................... 13

3.6 Recolección y análisis de datos ...................................................................................... 14

4 Resultados.................................................................................................................... 15

4.1 Aproximación experimental y controles ......................................................................... 15

4.2 Capreomicina provoca un acercamiento de los dominios de IF3 en el ribosoma ........... 17

4.3 El cambio conformacional de IFDL unido a 30S a diferentes concentraciones de

capreomicina ................................................................................................................................ 18

4.4 Los cambios conformacionales de IF3DL en el complejo 30S – IF3DL – IF1 son
dependientes de concentración .................................................................................................... 19

4.5 Comparación del cambio conformacional de IF3DL con capreomicina, en presencia o

ausencia de IF1 en el complejo. ................................................................................................... 20

4.6 Los parámetros cinéticos de la unión de capreomicina a complejos de iniciación

muestran similitudes .................................................................................................................... 21

4.7 Representación gráfica de los resultados del experimento ............................................. 22

5 Discusión ..................................................................................................................... 23

6 Conclusiones................................................................................................................ 26

7 Referencias Bibliográficas ........................................................................................... 27

5
ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS

Figura 1. Caracterización de la señal de IF3DL para los ensayos cinéticos ........................ 15

Figura 2. Controles de IF3DL y sus movimientos en el ribosoma ...................................... 17
Figura 3. Titulación de Capreomicina al complejo 30S, IF3DL ......................................... 18
Figura 4. Titulación de Capreomicina al complejo de iniciación 30S, IF1, IF3DL ............ 19
Figura 5. Comparación del efecto de Capreomicina en el complejo de iniciación 30S e
IF3DL en presencia y ausencia de IF1 ................................................................................ 20
Figura 6. Representación gráfica del complejo de pre - iniciación IF3DL, IF1 y la
subunidad 30S ..................................................................................................................... 22

Tabla 1. Parámetros cinéticos de la unión de Capreomicina a complejos pre-incubados de

iniciación 30S ...................................................................................................................... 21

6
1 INTRODUCCIÓN

La tuberculosis (TB) es una enfermedad causada por Mycobacterium tuberculosis, que

presenta principalmente manifestaciones pulmonares y extrapulmonares (cerebrales, óseas e
intestinales) (1–3). Es una de las principales infecciones causantes de muerte y el número de
casos absolutos continúa incrementado, independientemente de la disminución en un 2 a 3%
de la incidencia (4–6). La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha evidenciado que a
nivel mundial las personas que reciben tratamiento activo contra TB desarrollan cuadros de
resistencia (6). El 20% de las personas que reciben tratamiento contra esta enfermedad
desarrollan cuadros de tuberculosis multidrogorresistente (TB-MDR, resistente a isoniacida
y rifampicina) y el 9.7% desarrollan cuadros de tuberculosis extensamente resistente (TB-
XDR) (2,7). En el año 2019, la OMS reportó un incremento anual del 10% de casos de TB-
MDR en el mundo (2). En el Perú, la incidencia total de tuberculosis en el 2019 fue 119 por
100,000 pobladores y la incidencia de TB-MDR fue de 7.3 por 100,000 pobladores (8). De
los casos de TB-MDR, el 6.3% fueron casos nuevos y el 20% fueron casos tratados
previamente en el año 2019 (8). Así como en el mundo, en Perú también se evidencia una
tendencia a la alta de los casos de TB-MDR (8). En el año 2017 se notificaron 1335 casos,
en el año 2018 se notificaron 1679 casos y en el año 2019 se notificaron 1464 casos (9). Si
bien es cierto se evidencia que en el año 2019 hubo menos casos respecto al caso anterior,
al comparar la data de los años anteriores, se observa que la tendencia es al alza.

Para el tratamiento de tuberculosis pansensible, se utilizan cuatro antibióticos: rifampicina,

isoniacida, pirazinamida y etambutol. Estos cuatro se utilizan los dos primeros meses de
tratamiento (10). Durante el tiempo restante del tratamiento, por lo general cuatro meses, se
utilizan solo rifampicina e isoniacida (10). En casos donde se genere resistencia a isoniacida
y/o rifampicina, se debe iniciar el tratamiento con antibióticos de segunda línea (11–13).
Esta línea de tratamiento esta compuesto por antibióticos divididos en cuatro grupos: un
antibiótico del grupo A (Fluoroquinolonas), un antibiótico del grupo B (aminoglucósidos y,
previamente, capreomicina), y algún otro agente de segunda línea (grupo C y D) (11,13). La
OMS realizó ajustes a los esquemas de tratamiento contra tuberculosis en el 2019 donde
destituye al fármaco Capreomicina del esquema de tratamiento, debido al alto riesgo de falla
del tratamiento o recaídas en tratamientos de larga data (11).

7
La resistencia a antibióticos es un problema de salud pública global (4,14). Las bacterias
patógenas logran desarrollar mecanismos de defensa frente al tratamiento, a una velocidad
mayor de la que se desarrollan nuevos antibióticos o se mejoran antibióticos existentes (15).
Esta situación es muy alarmante, ya que los microorganismos se están desarrollando
resistencia a los antibióticos más usados (14). Específicamente para TB, la resistencia
antibiótica en la tuberculosis va en aumento y, al requerir de un largo tratamiento, tiene un
mayor potencial mortal (4). Esta mortalidad aumentaría si los casos de TB-MDR
aumentaran, causando un número absoluto de muertes aún mayor del que ya causa (4). La
OMS enfatiza en la importancia de la búsqueda de nuevos antibióticos o mejorar los
existentes para combatir la resistencia antibiótica emergente en el mundo (16). Uno de los
blancos llamativos para la identificación de nuevos antibióticos es la inhibición de la síntesis
de proteínas bacteriana.

Más de la mitad de los antibióticos utilizados en tratamientos inhibe la síntesis de proteínas

de las bacterias (17,18). Más del 60% de ellos, atacan el ribosoma y afectan principalmente
la fase de elongación de la síntesis de proteínas (18). Los inhibidores de la fase de iniciación
son escasos, y ninguno de uso clínico, a pesar de ser la fase más distinta entre procariotas y
eucariotas en la síntesis de proteínas (18,19). Esto permitiría el desarrollo de antibióticos con
menos efectos adversos y, adicionalmente, no se han identificado mecanismos de resistencia
para estos inhibidores (18). En la fase de iniciación se forma el complejo de iniciación 70S
(70S IC), indispensable para la codificación de una proteína mediante el reconocimiento
previo del codón del ARN mensajero (ARNm) y el anticodón del ARN de transferencia, que
incluye un grupo formilo, (fMet-ARNtfMet) en la subunidad ribosomal 30S (19–21). Para
lograr un reconocimiento correcto y eficaz tres proteínas, conocidas como factores de
iniciación (IF), cumplen múltiples funciones (18). Durante la iniciación, IF1 e IF3 aseguran
la correcta formación del complejo de iniciación, mientras que IF2 recluta al fMet-
ARNtfMet (21,22). Durante la unión de los IFs, se forma el pre-complejo de iniciación 30S
(30S PIC) que, una vez que ocurra el adecuado reconocimiento codón-anticodón, forma el
complejo de iniciación (30S IC). Una vez unida la subunidad 50S, los IFs se disocian (20,22).
Recientemente, se ha estudiado cómo ciertos antibióticos específicos de la fase de
elongación (tetraciclinas y aminoglucósidos) también afectan la fase de iniciación,
perjudicando la formación de los complejos mencionados (23,24).

8
Capreomicina (CAP) es un antibiótico péptido cíclico que forma parte del grupo de
tuberculomicinas (10). Como efecto principal y conocido en la síntesis de proteínas, la
capreomicina inhibe la fase de elongación (25). Se une a la subunidad menor 30S del
ribosoma e interactúa con la subunidad 50S, bloqueando la síntesis de proteínas en el
ribosoma y tiene acción contra micobacterias (10,22,25,26). En primer lugar, evita la
transposición del ARNt, evitando la unión de otros aa-ARNt (25). También CAP impide la
unión de factores de elongación y debilita la actividad GTPasa en la fase de elongación (25).
Sin embargo, no se ha determinado la capacidad de inhibición de CAP en la fase de
iniciación. Al unirse a la subunidad menor 30S podría afectar otras fases de la síntesis de
proteínas. La afectación de la fase de iniciación por antibióticos es un mecanismo que ha
pasado desapercibido. Hasta el momento, se sabe que no se ha generado resistencia a los
antibióticos dirigidos a la fase de iniciación (18). Este estudio es relevante porque este nuevo
mecanismo de acción de capreomicina podría llevar al desarrollo de nuevas drogas
especificas para la fase de iniciación de la síntesis de proteínas.

En el presente estudio se evaluó la interacción de la capreomicina en la formación de

complejos de iniciación de la síntesis de proteínas en tiempo real. Para visualizar el cambio,
se utilizó un IF3 doblemente marcado (IF3DL) como sensor de cambios conformacionales
del factor y/o de la subunidad menor 30S (24,27).

9
2 OBJETIVOS

Objetivo principal:
- Evaluar cambios conformacionales de IF3 unido a la subunidad menor del
ribosoma 30S generados por la unión de la capreomicina en E. coli.

Objetivos secundarios:
- Evaluar los efectos de la unión de capreomicina a subunidades 30S unidas al factor
de iniciación 3 (IF3)
- Evaluar los efectos de la unión de capreomicina a subunidades 30S unidas a los
factores de iniciación 1 y 3 (IF1 e IF3)
- Comparar los efectos de la unión de las subunidades 30S con IF3 y subunidades
30S con IF3 e IF1, a distintas concentraciones de capreomicina

10
3 MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Tipo de estudio
El presente estudio realizado es considerado un tipo de estudio experimental de investigación
bioquímica in vitro. Estos experimentos fueron realizados en un ambiente controlado fuera
de un organismo vivo (28).

3.2 Organismo modelo

Los experimentos se realizaron in vitro con compuestos aislados del organismo modelo E.
coli BL21 (DE3) pLys. Este tiene como características un bajo potencial de patogenicidad y
empleo frecuente para estudios bacteriológicos, en especial para evaluación de antibióticos
y determinación de sus mecanismos moleculares de acción. El organismo seleccionado
permite realizar experimentos teniendo en cuenta los protocolos de bioseguridad nivel 1,
disponibles en UPC.

3.3 Lugar de estudio

El estudio se realizó en el Laboratorio de Biomoléculas del Centro de Investigación de la
Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Peruana de Ciencias Aplicadas (UPC),
Lima, Perú.

El laboratorio cuenta con estándares de bioseguridad 1, equipado para realizar investigación

en biología molecular, biología celular, bioquímica y proteómica. Por ende, cumple con los
requisitos de infraestructura y experiencia para realizar este proyecto.

3.4 Consideraciones analíticas

El presente estudio midió efectos conformacionales del factor de iniciación IF3 unido al
ribosoma, en función de distintas concentraciones de capreomicina (29). Dichos cambios se
midieron en dos intermedios de la fase de iniciación de la síntesis de proteínas (30S +IF3DL
y 30S+IF1+IF3DL). De consecuencia, la variable independiente en todos los experimentos
fue la concentración de capreomicina (5 µM, 10 µM, 20 µM, 50 µM, 100 µM). Por otro
lado, las variables dependientes fueron los cambios de distancia en IF3 (medidos a través de
cambios de fluorescencia, ver métodos) en dos intermediarios de la fase de iniciación: I) IF3

11
+ 30S, II) IF3 + IF1 + 30S. Cada medición se realizó entre 5 y 7 veces, con el fin de establecer
un promedio y su respectiva desviación estándar.

3.5 Métodos experimentales

Esta investigación se desarrolló en dos fases: la primera es la fase preparativa, en la cual se
obtuvieron todos los materiales biológicos necesarios para el proyecto. En la segunda fase
se realizaron las mediciones analíticas de interacción entre la capreomicina y los complejos
de la iniciación de la síntesis de proteínas.

3.5.1 Fase preparativa

Materiales utilizados:

Para realizar los ensayos de cinéticas rápidas, se necesitaron los siguientes compuestos:

E. coli BL23: es una cepa de E. coli comercial, perteneciente a la cepa ATCC-BAA-1025,

utilizada para estudios microbiológicos. IF1, IF2, IF3 e IF3DL: Las proteínas se expresaron
y purificaron en el Centro de Investigación de Ciencias de la Salud en UPC. Adicionalmente,
se utilizó IF3DL como señal para observar cambios intramoleculares en IF3 en el tiempo; esta
molécula ha sido utilizada previamente en otros estudios, por lo que la señal ha sido
previamente estandarizada (24). Las cuatro proteínas tenían un alto grado de pureza.
Subunidades ribosomales 30S y 50S, y fMet-tRNAfMet: Fueron producidas por
investigadores colaboradores en el Instituto Kurchatov, Gatchina, Rusia. mRNA: Fue
sintetizado químicamente por la empresa Trilink Biotechnologies y obtenido de forma
comercial.

3.5.1.1 IF3 y marcación fluorescente

El factor de iniciación 3 (IF3) es una proteína, que posee dos dominios, uno C terminal y
uno N terminal, unidos por un conector rico en lisinas (24,27). Para poder identificar sus
cambios conformacionales, se realizó un doble marcado con fluoróforos para poder
evidenciar los cambios de fluorescencia (IF3DL) (24,27). La proteína IF3E166C contiene dos
cisteínas, una en el dominio amino terminal y otra en el dominio carboxilo terminal. Para
modificar cada uno de dichos dominios con un fluoróforo específico, se utilizó la reactividad
de las cisteínas para unirlas con grupos maleimido de los fluoróforos. La conjugación de
estos genera un enlace covalente.

12
Las preparaciones de IF3E166C se dializaron extensivamente en buffer de marcación
fluorescente (50 mM Hepes, pH: 7.1, 100 mM NH4CL, 10% glicerol, 0.5 mM TCEP) en un
D-Tube™ Dialyzer Maxi (Merck) para remover los rastros de 2 – mercaptoetanol. Este
agente reductor inhibe fuertemente el acoplamiento con cisteínas de fluoroforos unidos a
maleimida. El dominio C – terminal se marcó en la cisteína recombinante (166), con un
exceso de 10 veces de maleimida Atto-540Q (Atto – tec) por 20 minutos. La reacción se
detiene por la adición de 6 mM de 2 – mercaptoetanol. IF3CTD540Q se purificó de
colorantes no reaccionados en una columna HiTrap SP HP. Posteriormente se dializó, como
se mencionó, en un buffer de marcación con la adición de 2 M de Urea para exponer la
cisteína del dominio amino terminal.

La desnaturalización de IF3CTD540Q mediante 2 M de Urea lleva a la exposición de la

cisteína, que normalmente está oculta en la posición 65 del dominio amino terminal. Esta
proteína se incubó con un exceso molar de 20 veces de Atto-488 maleimido por 1 hora a
temperatura ambiente. IF3CTD540Q – NTD488 (IF3DL) se purificó de los colorantes sin
reaccionar, utilizando la columna HiTrap SP HP (Merck). Posteriormente se dializó contra
el buffer de almacenamiento (Hepes pH: 7.1, 100 mM NH4Cl, 10% glicerol, 6 mM 2 –
mercaptoetanol) y se almacenó en pequeñas alícuotas a -80 ºC. La pureza y eficiencia del
etiquetado se observó en 15% SDS-PAGE, donde la fluorescencia se vio bajo un
transiluminador UV, y las proteínas totales se vieron por tinción azul Coomassie.

3.5.2 Fase analítica

3.5.2.1 Stopped – Flow
El método de mediciones cinéticas a flujo detenido se conoce como Stopped – Flow. Se
utilizó el instrumento SX-20 de Applied Photophysics, el cual mezcla volúmenes iguales de
dos soluciones aproximadamente 90 µL cada una. Se utilizó la longitud de onda de
excitación para Atto – 488 igual a 470 nm, y la medición de la fluorescencia emitida se
realizó utilizando un filtro óptico de 515 nm de longitud de onda. Se registraron mil puntos
en muestreo logarítmico por 5-10 seg de cada reacción. Asimismo, cada reacción se midió
entre cinco y siete veces para posteriormente promediarlas. Todas las reacciones utilizaron
el buffer TAKM7 (Tris 20 mM (pH 7,5), 70 mM NH4Cl, KCl 30 mM, 7 mM MgCl2) y se
midieron a 25°C. Diversos complejos de iniciación que contenían IF3DL se mezclaron con
Capreomicina a distintas concentraciones en el stopped – flow. Se utilizaron regresiones no
lineales con funciones exponenciales para estimar las constantes cinéticas y la magnitud del

13
cambio observado. Los cambios conformacionales de IF3DL resultan en cambios de
fluorescencia (18,24). Dichos cambios fueron medidos por el instrumento en función del
tiempo desde que se mezclan Capreomicina con los respectivos complejos 30S unidos a
IF3DL.

3.5.2.2 Métodos analíticos de rutina

Se utilizó electroforesis en dos tipos de geles: acrilamida para proteínas y agarosa para
evidenciar la presencia de ácidos nucleicos (ADN). Es un método principalmente cualitativo
que permitirá evaluar la existencia o ausencia de una proteína o un acido nucleico en las
muestras intermedias de la fase preparativa. Por otro lado, plásmidos y proteínas se
cuantificaron mediante la espectrofotometría de absorbancia. Este método evalúa la
absorbancia de una luz a longitudes de onda especificas en muestras líquidas. El resultado
obtenido en este procedimiento es cuantitativo y permite estimar las concentraciones del
material que se esta midiendo. Todos los métodos arriba mencionados se realizarán con
protocolos estandarizados (30).

3.6 Recolección y análisis de datos

Los datos de los experimentos fueron registrados en Microsoft Excel 2011. Se utilizó el
software Graphpad Prism v.9.05 para estimar las constantes cinéticas. Asimismo, los
métodos analíticos fueron ejecutados tres veces. De esta manera, se sacó un promedio y
desviación estándar.

14
4 RESULTADOS
4.1 Aproximación experimental y controles

A C
5
30S

Fluorescence (a.u)
4

3
Buffer
2

1
IF3 dark
0
0 1 2
Time (s)

IF3N
Fluorescencia
Alx488

Atto540Q

IF3C Fluorescencia

Figura 1. Caracterización de la señal de IF3DL para los ensayos cinéticos. (A) Representación de IF3DL
(Figura verde (IF3C) y rosada (IF3N)) unido a la subunidad 30S del ribosoma (figura delineada). (B)
Representación de los dos dominios marcados con fluoróforos de IF3DL, con ambos dominios alejados o
abierto (alta fluorescencia) y con ambos dominios cerca o cerrado (baja fluorescencia). Alx488 (rosado)
es un fluoróforo donador y Atto540Q (verde) es un fluoróforo receptor. El acercamiento del Atto540Q
resulta en alta absorción de la fluorescencia emitida por el Alx488, reduciendo la fluorescencia medida
en la reacción. (C). Unión (negro) y disociación (turquesa) de IF3DL a la subunidad menor 30S del
ribosoma. La señal en color rojo refleja el control de IF3DL en ausencia de la subunidad menor 30S.

Capreomicina (CAP) se une la subunidad ribosomal menor 30S en proximidad al sitio de

interacción del dominio C terminal de IF3 (IF3C) (Figura 1A) (25). En consecuencia, la
unión de CAP podría modificar la disposición de IF3. Para medir los cambios
intramoleculares de IF3 y la interacción posible con CAP, se utilizó una variante de IF3

15
modificada con compuestos fluorescentes (IF3DL) que permite medir cambios de distancia
entre sus dominios a través de cambios de fluorescencia medidos en tiempo real (Figura 1B)
(24). Cuando IF3DL cambia su conformación, tenemos dos posibles escenarios: si los dos
dominios de IF3DL se alejan, incrementa la fluorescencia, y si se acercan, la fluorescencia
disminuye (Figura 1B) (24).

Para verificar que IF3DL reporta los estados conformacionales del factor en la subunidad 30S,
se realizó un ensayo de unión y disociación de IF3DL a la subunidad 30S. Estudios previos
han identificado que cuando IF3 se une a la subunidad ribosomal 30S los dominios pasan de
un estado compacto a una conformación alargada, donde ambos dominios se alejan (24,31)
(Figura 1B). De manera opuesta, para poder observar la disociación de IF3DL del ribosoma
cuando se encuentra pre-unido, el complejo 30S-IF3DL se mezcló con una concentración en
exceso de diez veces de IF3 no fluorescente (IF3 dark). En el resultado se observa una
disminución de fluorescencia en el tiempo que indica el acercamiento de los dominios de
IF3DL, que ocurre una vez que el factor está disociado de la subunidad 30S (Figura 1C)
(24,27). La especificidad de la señal se observa cuando IF3DL se mezcló con buffer TAKM7
en ausencia de subunidades 30S y resultó en ningún cambio de fluorescencia medible en el
tiempo (Figura 1C). Los resultados indican que IF3DL reporta al menos dos estados en
función de la distancia entre sus dominios y que la aproximación experimental permite
observar la transición entre ellos, que coincide con lo estipulado anteriormente en la
literatura (24,27).

16
4.2 Capreomicina provoca un acercamiento de los dominios de IF3DL en el ribosoma

A B
4 STREP 0.8
Fluorescence (a.u)

Fluorescence (a.u)
3 0.6

(-) IF1
2 0.4
CAP

1 0.2 (+) IF1

IF1

0 0.0
0 2 4 0 2 4
Time (s) Time (s)

Figura 2. Controles de IF3DL y sus movimientos en el ribosoma. (A) Comparación de los cambios
conformacionales de IF3DL durante la unión de estreptomicina (turquesa), capreomicina (rojo) e IF1
(negro). (B) Comparación de la unión de Capreomicina al complejo ribosomal 30S IF3DL en presencia
(negro) y ausencia (rojo) de IF1.

Cuando IF3 está unido a la subunidad 30S, toma diferentes conformaciones durante la unión
de IF1, IF2, mRNA y tRNA de iniciación (fMet-ARNtfMet) (31). IF1 actúa estabilizando la
unión de los factores de iniciación y la subunidad 30S, provocando el movimiento de IF3C
hacia el sitio P y, a su vez, IF3N forma el espacio donde se unirá el ARNt (31). Una vez
unido el fMet-ARNtfMet, IF3N se desplaza hacia la subunidad 30S (31). Adicionalmente,
estudios anteriores muestran que los antibióticos Kanamicina (KAN) y Estreptomicina
(STREP) causan cambios conformacionales en IF3DL unido al 30S (24). Para verificar como
responde IF3DL, unido a la subunidad 30S a la unión de capreomicina (CAP), se mezclaron
complejos ribosomales 30S-IF3DL con CAP (Figura 2A). Se observa que CAP disminuye la
fluorescencia en el tiempo, lo que se traduce en un acercamiento de los dominios de IF3DL
(Figura 2B). STREP se utilizó como control al ser reportado previamente que aleja los
dominios de IF3DL (24); se observó el aumento de fluorescencia en el tiempo. Por otro lado,
se realizó el control con IF1 para observar el máximo distanciamiento entre los dominios de
IF3. Se observó que la unión de IF3 con IF1 acerca más los dominios de IF3 que la unión de
CAP con el ribosoma (Figura 2A).

Asimismo, se comparó la unión de IF3+CAP en presencia o ausencia de IF1, donde se

obtuvo que la presencia de IF1 produce una mayor variación de la fluorescencia. La unión
de IF1 a complejos similares a los utilizados con CAP resultó en una reducción de

17
fluorescencia en el tiempo con una mayor amplitud a aquella observada con el antibiótico.
Esto podría indicar que la unión de IF1 causa un cambio conformacional en IF3DL mayor
que CAP (Figura 2B). Se puede concluir que, a diferencia de STREP, CAP causa una
disminución de la fluorescencia, traduciéndose como un acercamiento de los dominios de
IF3.

4.3 El cambio conformacional de IFDL unido a 30S a diferentes concentraciones de

capreomicina

Figura 3. Titulación de Capreomicina al complejo 30S, IF3DL. (A) Comparación de los cambios
conformacionales de IF3DL durante la unión de CAP a diferentes concentraciones (CAP 5 µM, CAP 10
µM, CAP 20 µM, CAP 50 µM, CAP 100 µM). (B) Comparación del cambio conformacional máximo de
IF3DL (eje Y, amplitud) durante la unión de CAP a diferentes concentraciones. (C) Velocidad del cambio
conformacional de IF3DL en la primera reacción, (D) Velocidad del cambio conformacional de IF3DL en
la segunda reacción.

Al haber identificado que capreomicina induce cambios conformacionales en IF3DL, había

que determinar si estos cambios son de acuerdo con la concentración del antibiótico o no,

18
como indicador de especificidad de la interacción. De esta forma, se midió el cambio
conformacional de IF3DL en función de la concentración de capreomicina, combinando
IF3DL, 30S y capreomicina a diferentes concentraciones y se analizó con Stopped – Flow.
La fluorescencia disminuye conforme se aumenta la concentración de capreomicina (Figura
3A), lo que indica que el cambio conformacional de IF3DL es dependiente de concentración.
Esto también es observable cuando se evalúa el cambio conformacional máximo a diferentes
concentraciones de capreomicina. Por otra parte, se identificó que la velocidad del cambio
conformacional de IF3DL unido a 30S tiene dos momentos: la primera reacción y la segunda
reacción (figura 3C y 3D). La primera reacción (kfast) es constante a diferentes
concentraciones de capreomicina, lo que indica que, sin importar cual sea la concentración
de CAP, la velocidad de unión va a ser igual. A diferencia de la segunda reacción (Kslow),
que sí es dependiente de concentración, es decir que la velocidad de unión aumenta, a medida
que aumenta la concentración de CAP. Es de esta forma que podemos decir que IF3DL unido
a 30S sufre cambios conformacionales dependientes de concentración y la velocidad a la que
ocurre este cambio es, en un inicio, independiente de concentración y posteriormente
dependiente de concentración.

4.4 Los cambios conformacionales de IF3DL en el complejo 30S – IF3DL – IF1 son
dependientes de concentración

Figura 4. Titulación de Capreomicina al complejo de iniciación 30S, IF1, IF3DL. (A) Comparación de
los cambios conformacionales (eje Y, amplitud) de IF3DL durante la unión de CAP a diferentes
concentraciones (CAP 5, CAP 10, CAP 20, CAP 50, CAP 100 en µM). (B) Comparación del cambio
conformacional máximo de IF3DL durante la unión con CAP a diferentes concentraciones. (C) Velocidad
del cambio conformacional de IF3DL.

Al momento de realizar los controles (Figura 2), se observó que CAP indujo cambios
conformacionales de IF3DL en unión a 30S-IF1. Para identificar si la concentración de CAP

19
está relacionada, se mezcló CAP a diferentes concentraciones con complejos pre-incubados
de 30S – IF3DL – IF1. Se observó que, a mayor concentración de CAP, mayor cambio de
fluorescencia de IF3DL, por lo que el efecto es dependiente de la concentración de manera
similar a aquella dependencia observada en ausencia de IF1 (Figura 4A). De igual forma,
esto es evidenciable al comparar el cambio conformacional máximo de IF3DL con
capreomicina (Figura 4B). A diferencia del complejo 30S – IF3DL, el complejo 30S – IF3DL
– IF1 presenta únicamente una reacción, lo que significa que se presenta un solo cambio
conformacional de IF3DL (Figura 4C). El cambio conformacional en esta reacción también
es dependiente de concentración. Con los experimentos realizados anteriormente, se observó
que CAP induce cambios en la conformación de IF3DL, lo que podría indicar que se estaría
alterando la función de este factor. Asimismo, este cambio es proporcional a la concentración
de capreomicina.

4.5 Comparación del cambio conformacional de IF3DL con capreomicina, en presencia o

ausencia de IF1 en el complejo.

Figura 5. Comparación del efecto de Capreomicina en el complejo de iniciación 30S e IF3DL en presencia
y ausencia de IF1. (A) Comparación de fluorescencia máxima (eje Y, amplitud) en función de las
concentraciones de CAP (µM) (B) Comparación de velocidad de cambio de conformación en función de
las concentraciones de CAP.

Se realizaron las titulaciones de capreomicina en los complejos, en presencia o ausencia de

IF1 (Figuras 3 y 4). Se comparó la fluorescencia máxima a diferentes concentraciones de
capreomicina y la velocidad máxima de cambio de conformación, de ambos experimentos.
Podemos observar que, respecto a la fluorescencia máxima (Figura 5A), en las

20
concentraciones más bajas, el cambio de fluorescencia es muy similar. A concentraciones
medias de capreomicina, los cambios con IF1 son mayores que sin IF1. Sin embargo, a
concentraciones más altas, los cambios de fluorescencia son ligeramente mayores sin IF1.
Respecto a la velocidad del cambio conformacional (Figura 5B), podemos observar una
mayor velocidad de cambio de conformación sin IF1 que con IF1. Esto podría indicar que,
en relación con el cambio conformacional, no hay diferencia. A pesar de que la velocidad
del cambio conformacional es mayor en ausencia de IF1, las diferencias son muy reducidas
y podrían caer en la variabilidad experimental.

4.6 Los parámetros cinéticos de la unión de capreomicina a complejos de iniciación

muestran similitudes
Vmax (s-1) (error estándar) Km (µM) (error estándar)
30S – IF3DL 2.9 (0.4) 27 (9)
30S – IF3DL – IF1 2.4 (0.4) 24 (10)
Tabla 1. Parámetros cinéticos de la unión de Capreomicina a complejos pre-incubados de iniciación
30S

El Vmax es la velocidad máxima de la reacción, en este caso, del cambio de conformación de

IF3DL durante la unión de capreomicina. El Km es un parámetro cinético que se define como
la concentración de sustrato en la que la velocidad de la reacción es la mitad del Vmax. Para
una reacción de dos pasos, donde el primero requiere la unión rápida de ligandos y, este es
seguido por un cambio conformacional o catálisis de menor velocidad, como en el caso de
capreomicina, la Km corresponde a la Kd, indicando también la afinidad entre compuestos
(32). Estos dos valores son inversamente proporcionales, es decir, si el Km es alto, la
afinidad es baja y, por ende, será necesaria una menor cantidad de sustrato, en este caso,
antibiótico. El valor de Vmax en el complejo 30S – IF3DL es mayor que en el complejo 30S –
IF3DL – IF1, esto podría indicar que la velocidad del cambio de conformación de IF3DL es
más rápida en el complejo sin IF1. Por otro lado, podemos observar que el Km del complejo
sin IF1 es mayor que con IF1, sin embargo, el error asociado a este tipo de mediciones no
permite asegurar que las diferencias son reales. Podríamos concluir que CAP es mas afín al
complejo con IF1. Sin embargo, el error estándar es de aproximadamente 10 en ambos casos,
lo que nos indica que el Km en ambos casos es casi el mismo. Esto nos da pie a concluir que
IF1 no interfiere en el efecto que capreomicina tiene sobre el complejo 30S – IF3DL.

21
4.7 Representación gráfica de los resultados del experimento

A B

Figura 6. Representación gráfica del complejo de pre - iniciación IF3DL, IF1 y la subunidad 30S. (A)
Representación de la unión de IF3DL (verde y rosada) IF1 (naranja) y la subunidad 30S (delineado negro),
donde IF3DL sufre un cambio de conformación esperado (B) Representación de la unión de IF1, IF3DL,
30S y Capreomicina (celeste), donde IF3DL cambia su conformación por el efecto que capreomicina ejerce
sobre este.

En los resultados experimentales se evidenció los cambios conformacionales de IF3 DL

inducidos por capreomicina, independientemente de la presencia o ausencia de IF1. En
ambos casos, IF3DL mostró una disminución de la fluorescencia, lo que significa que sus
dominios se acercan. Para evidenciar estos resultados de una manera gráfica, se realizó una
representación del complejo y del sitio de unión de capreomicina en el ribosoma (sitio A).
Aquí podemos observar que en la unión de 30S con IF1 e IF3DL existe una distancia entre
ambos dominios de IF3DL (flecha roja). Con la unión de CAP, IF3DL acorta la distancia entre
ambos dominios. Esto indica que los dominios de IF3DL no pueden alejarse como pasaría sin
capreomicina. Con esto podemos concluir que, debido a la cercanía del sitio de unión de
capreomicina y del sitio de unión de IF3DL, este ultimo resulta afectado, mostrando un
cambio conformacional que podría estar interrumpiendo su función, y, de esta forma, siendo
incapaz de mantener la fidelidad de la fase de iniciación de la síntesis de proteínas
dependiente de ribosomas.

22
5 DISCUSIÓN
Los resultados de la presente tesis indican que capreomicina induce una perturbación en IF3,
en presencia o ausencia de IF1 y dependiente de concentración. Esta perturbación es
evidenciada como el acercamiento de los dominios de IF3, con lo que se evitaría que IF3
realice los cambios dinámicos durante la fase de iniciación, esenciales para ejercer su
función de control de la fidelidad (27,31). Este nuevo mecanismo es importante en
perspectiva de los antibióticos, ya que podría ser utilizado para la creación de antibióticos
específicos para la fase de iniciación y, de esta manera, intentar combatir la resistencia
antibiótica.

La resistencia a antibióticos es una amenaza creciente en el mundo, lo que nos está llevando
a la existencia de súper – microorganismos (resistentes a todos los medicamentos). Estos
microorganismos resistentes generalmente se encuentran en los ambientes hospitalarios,
pero actualmente es frecuente verlos, también, en la comunidad (18). La poca investigación
en nuevos antibióticos, el uso indiscriminado de ellos, tanto en la medicina como en la
industria agrónoma, nos lleva a este gran problema (33). Esto es un llamado de atención para
el desarrollo de nuevos medicamentos, ya sea buscando nuevos mecanismos de acción para
antibióticos específicos o creación de nuevos compuestos. Por medio de la purificación de
antibióticos existentes que no se utilizan por ser muy tóxicos, es decir, poseen muchos
efectos adversos, se puede generar nuevos antibióticos mejorados con menos efectos
adversos. De esta forma, obtenemos más medicamentos para contribuir a la lucha contra este
problema creciente. Se debe redirigir el uso de antibióticos industriales y de uso médico,
educar a la población sobre la automedicación con antibióticos y aumentar la investigación
en nuevos mecanismos antibióticos para mitigar este problema (33).

Más del 60% de antibióticos tienen como blanco el ribosoma (18). Estos pueden dividirse
en antibióticos contra la subunidad menor 30S y antibióticos contra la subunidad mayor 50S
(20). A su vez, los antibióticos contra la subunidad menor 30S se subdividen en antibióticos
cuya unión es en el centro de codificador, y antibióticos que se unen al sitio P y E (20). El
centro codificador incluye el sitio A, parte del 30S y la hélice 44 del ARNr 16S (20). En este
grupo de antibióticos podemos encontrar las tetraciclinas, aminoglucósidos (gentamicina,
estreptomicina) y péptidos cíclicos que forman parte de la clase tuberactinomicina
(Capreomicina) (20). Las tetraciclinas evitan la unión del ARNt al sitio A (18). De esta
forma, evitan el inicio de la síntesis de proteínas (20). Negamicina evita la translocación del

23
ARNt del sitio A al sitio P, fijándolo al sitio A, lo que tiene como consecuencia la mala
codificación de proteínas (20). Estreptomicina y gentamicina inducen cambios en
nucleótidos del ARNr 16S, con lo que se incrementa la codificación errada (20).
Estreptomicina cambia la conformación de la hélice 37, y de esta forma disminuye la
selectividad del aa – ARNt por el sitio A, con lo que aumentan los errores en la formación
de la proteína (18). Asimismo, gentamicina también se une a la subunidad 50S y puede
inhibir el reciclaje de ribosomas (20). Las tuberactinomicinas modifican la dinámica del
ribosoma y, de esta forma, inhiben la síntesis proteica (20).

Capreomicina se une a ambas subunidades, evitando la formación del complejo de

iniciación, además de evitar que el ARNt se trasloque del sitio A al sitio P (10). A diferencia
de lo anteriormente reportado, nuestros resultados evidencian que capreomicina afecta
directamente la fase de iniciación al perturbar a IF3, más allá de lo conocido durante la fase
de elongación y la formación del complejo de iniciación.

Como se evidenció en la fase experimental y en la revisión de literatura disponible,

utilizando el Stopped – Flow con IF3DL, pudimos evidenciar los cambios conformacionales
de IF3DL en tiempo real (24,27). Se ha evidenciado que IF3 sufre varios cambios
conformacionales al unirse a la subunidad 30S, evidenciando un aumento de fluorescencia
(27). Asimismo, evidenciamos cambios conformacionales de IF3 al unirse a unirse el IF1 y
también al unirse capreomicina (disminución de fluorescencia). Los hallazgos referentes al
cambio conformacional de IF3DL en presencia de IF1 son compatibles con los reportados en
la literatura (24,27). Sin embargo, el cambio conformacional de IF3DL en presencia de
capreomicina es novedoso. Esto podría indicar que, al estar comprometida la movilidad de
los dominios de IF3, estaría interrumpiendo la capacidad de este factor para mantener la
fidelidad de la fase de iniciación de la síntesis de proteínas (24). Es por esto, que podría
considerarse a capreomicina como un antibiótico contra la fase de iniciación de la síntesis
de proteínas.

Los experimentos in vitro tienen como cualidad el control de las variables para su
realización. Al ser nuestros resultados obtenidos in vitro podrían no ser reproducibles in vivo,
debido a que existen factores externos que no podemos controlar o identificar, que podrían
afectar la interacción entre capreomicina y el ribosoma. De la misma manera, las condiciones
mínimas e indispensables para poder trabajar con cultivos de Mycobacterium tuberculosis
son contar con un laboratorio microbiológico con un nivel de bioseguridad tipo III y que el

24
personal de laboratorio debe estar certificado (34). Estas dos situaciones significan para
nosotros limitaciones, además de la lentitud del cultivo para el crecimiento de las
micobacterias llegándose a tardar varias semanas a meses (35). Asimismo, M. tuberculosis
posee una membrana plasmática, pared rica en complejos peptidoglicano-arabinogalactano,
que es más resistente a lisozimas y a antibióticos que actúan sobre la pared celular, una
membrana externa, llamada también micomembrana, que es no es simétrica, y una cápsula,
que es la más externa de las capas (36). Es así como el gold standard para investigaciones
experimentales en laboratorio es la bacteria Escherichia coli (E. coli), debido a sus
principales características microbiológicas. Dentro de estas características microbiológicas
se toma en cuenta que es la bacteria más estudiada en el planeta, posee un rápido crecimiento
llegando a tardarse algunas horas, posee menor grado de patogenicidad que M. tuberculosis
y, al poseer una membrana celular, la obtención de los productos biológicos necesarios es
más accesible (37). Por estas características, E. coli es ampliamente utilizada para estudios
moleculares de interacción entre antibióticos y sus respectivos blancos moleculares y
requiere un nivel de bioseguridad tipo I (3).

Aún quedan interrogantes por resolver, como la reproducibilidad de los resultados in vivo y
en la micobacteria y la posible implicancia de capreomicina en otros momentos de la síntesis
de proteínas.

25
6 CONCLUSIONES
El presente estudio buscaba evaluar los cambios conformacionales que la unión de
capreomicina al complejo 30S-IF3 podría causar. Nuestros resultados concluyen que la
capreomicina perturba dos reacciones de la fase de iniciación de la síntesis de proteínas en
E. coli, el posicionamiento de IF3 en la subunidad 30S y de manera similar el
posicionamiento del factor en presencia de IF1. Estos hallazgos indicarían que la función de
IF3 podría estar comprometida por la presencia de capreomicina. IF3 es una molécula
dinámica que asume diversas conformaciones en el 30S para asegurar un correcto inicio de
la síntesis de proteínas. La unión de capreomicina perturba la correcta disposición de IF3.

- Durante la unión de capreomicina al complejo 30S – IF3DL ocurre un acercamiento

de los dominios de IF3, medido a partir de una marcada disminución de la
fluorescencia. El acercamiento de los dominios se refleja en una disminución de 0.8
± 0.05 unidades de fluorescencia con una velocidad máxima de 2.9 ± 0.4 s–1 y una
Km de 27 ± 9 µM.
- La unión de capreomicina al complejo 30S – IF3DL – IF1 se evidencia un cambio
conformacional similar al observado en ausencia de IF1, observándose una
disminución de la fluorescencia en el tiempo. El acercamiento de los dominios de
IF3 en presencia de IF1 logra un valor máximo de 0.6 ± 0.05 y una velocidad máxima
de 2.4 ± 0.4 s–1. La Km de la reacción en presencia de IF1 fue de 24 ± 10 µM.
- Las reacciones estudiadas a concentraciones crecientes de capreomicina indican que
el cambio conformacional de IF3 es dependiente de concentración del antibiótico.
Sin embargo, se halló que la velocidad del cambio conformacional de IF3 unido a
30S se realiza en dos pasos, una independiente de concentración y una dependiente
de concentración, mientras que la velocidad del cambio conformacional en el
complejo 30S – IF3DL – IF1 se realiza en un solo paso y es dependiente de
concentración. Los parámetros cinéticos de ambos complejos en presencia de
capreomicina fueron comparados, observando poca diferencia entre ellos. Esto
quiere decir que los cambios conformacionales en IF3DL inducidos son
independientes de la presencia de IF1.

26
7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Seaworth BJ, Griffith DE. Therapy of Multidrug-Resistant and Extensively Drug-
Resistant Tuberculosis. Schlossberg D, editor. Microbiol Spectr [Internet]. 2017 Mar
10;5(2). Available from:
https://journals.asm.org/doi/10.1128/microbiolspec.TNMI7-0042-2017

2. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2019 [Internet]. Geneva;

2019. Available from: https://www.who.int/teams/global-tuberculosis-
programme/tb-reports

3. Gonzàlez-Martin J. Microbiología de la tuberculosis. Semin la Fund Española

Reumatol [Internet]. 2014 Jan;15(1):25–33. Available from:
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1577356614000025

4. Furin J, Cox H, Pai M. Tuberculosis. Lancet [Internet]. 2019 Apr;393(10181):1642–

56. Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0140673619303083

5. Ankrah AO, Glaudemans AWJM, Maes A, Van de Wiele C, Dierckx RAJO, Vorster
M, et al. Tuberculosis. Semin Nucl Med [Internet]. 2018 Mar;48(2):108–30.
Available from: https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0001299817301009

6. García-Gonzalez, R. Cervantes-García, E. Reyes-Torres A. Tuberculosis, un desafío

del siglo XXI. Rev Latinoam Patol Clínica. 2016;63(2):91–9.

7. Alarcón V, Alarcón E, Figueroa C, Mendoza-Ticona A. Tuberculosis en el Perú:

Situación epidemiológica, avances y desafíos para su control. Rev Peru Med Exp
Salud Publica [Internet]. 2017 Jun 30;34(2):299. Available from:
https://rpmesp.ins.gob.pe/index.php/rpmesp/article/view/2384

8. World Health Organization. Tuberculosis Profile: Perú [Internet]. 2020 [cited 2020
Oct 25]. Available from:
https://worldhealthorg.shinyapps.io/tb_profiles/?_inputs_&lan=%22EN%22&iso2=
%22PE%22

9. Ministerio de Salud del Perú. Perfil de la Tuberculosis - Perú [Internet]. 2021 [cited
2022 Feb 12]. Available from:
http://www.tuberculosis.minsa.gob.pe/DashboardDPCTB/PerfilTB.aspx

27
10. Vianna JF, S. Bezerra K, I. N. Oliveira J, Albuquerque EL, Fulco UL. Binding
energies of the drugs capreomycin and streptomycin in complex with tuberculosis
bacterial ribosome subunits. Phys Chem Chem Phys [Internet]. 2019;21(35):19192–
200. Available from: http://xlink.rsc.org/?DOI=C9CP03631H

11. World Health Organization. WHO treatment guidelines for drug-resistant

tuberculosis [Internet]. 2019. Available from:
https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250125/9789241549639-
eng.pdf;jsessionid=3F6975E1371F872F1CDE93E2872AB5BD?sequence=1

12. Pai M, Behr MA, Dowdy D, Dheda K, Divangahi M, Boehme CC, et al. Tuberculosis.
Nat Rev Dis Prim [Internet]. 2016 Dec 22;2(1):16076. Available from:
http://www.nature.com/articles/nrdp201676

13. Dijkstra JA, van der Laan T, Akkerman OW, Bolhuis MS, de Lange WCM, Kosterink
JGW, et al. In Vitro Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to Amikacin,
Kanamycin, and Capreomycin. Antimicrob Agents Chemother [Internet]. 2018 Jan
8;62(3). Available from: https://aac.asm.org/content/62/3/e01724-17

14. Frieri M, Kumar K, Boutin A. Antibiotic resistance. J Infect Public Health [Internet].
2017 Jul;10(4):369–78. Available from:
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1876034116301277

15. Fabbretti A, Gualerzi CO, Brandi L. How to cope with the quest for new antibiotics.
FEBS Lett [Internet]. 2011 Jun 6;585(11):1673–81. Available from:
http://doi.wiley.com/10.1016/j.febslet.2011.04.029

16. World Health Organization. Antimicrobial Resistance [Internet]. 2020. Available

from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antimicrobial-resistance

17. Arenz S, Wilson DN. Blast from the Past: Reassessing Forgotten Translation
Inhibitors, Antibiotic Selectivity, and Resistance Mechanisms to Aid Drug
Development. Mol Cell [Internet]. 2016 Jan;61(1):3–14. Available from:
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1097276515008102

18. Giuliodori AM, Spurio R, Milón P, Fabbretti A. Antibiotics Targeting the 30S
Ribosomal Subunit: A Lesson from Nature to Find and Develop New Drugs. Curr
Top Med Chem [Internet]. 2019 Jan 16;18(24):2080–96. Available from:

28
 http://www.eurekaselect.com/166603/article

19. Gualerzi CO, Pon CL. Initiation of mRNA translation in bacteria: structural and
dynamic aspects. Cell Mol Life Sci [Internet]. 2015 Nov 11;72(22):4341–67.
Available from: http://link.springer.com/10.1007/s00018-015-2010-3

20. Lin J, Zhou D, Steitz TA, Polikanov YS, Gagnon MG. Ribosome-Targeting
Antibiotics: Modes of Action, Mechanisms of Resistance, and Implications for Drug
Design. Annu Rev Biochem [Internet]. 2018 Jun 20;87(1):451–78. Available from:
https://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev-biochem-062917-011942

21. Rodnina M V. Translation in Prokaryotes. Cold Spring Harb Perspect Biol [Internet].
2018 Sep;10(9):a032664. Available from:
http://cshperspectives.cshlp.org/lookup/doi/10.1101/cshperspect.a032664

22. Arenz S, Wilson DN. Bacterial Protein Synthesis as a Target for Antibiotic Inhibition.
Cold Spring Harb Perspect Med [Internet]. 2016 Sep;6(9):a025361. Available from:
http://perspectivesinmedicine.cshlp.org/lookup/doi/10.1101/cshperspect.a025361

23. Barrenechea V, Vargas-Reyes M, Quiliano M, Milón P. A Complementary

Mechanism of Bacterial mRNA Translation Inhibition by Tetracyclines. Front
Microbiol [Internet]. 2021 Jun 28;12. Available from:
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2021.682682/full

24. Chulluncuy R, Espiche C, Nakamoto J, Fabbretti A, Milón P. Conformational

Response of 30S-bound IF3 to A-Site Binders Streptomycin and Kanamycin.
Antibiotics [Internet]. 2016 Dec 13;5(4):38. Available from:
http://www.mdpi.com/2079-6382/5/4/38

25. Lin Y, Li Y, Zhu N, Han Y, Jiang W, Wang Y, et al. The Antituberculosis Antibiotic
Capreomycin Inhibits Protein Synthesis by Disrupting Interaction between Ribosomal
Proteins L12 and L10. Antimicrob Agents Chemother [Internet]. 2014
Apr;58(4):2038–44. Available from:
http://aac.asm.org/lookup/doi/10.1128/AAC.02394-13

26. Maus CE, Plikaytis BB, Shinnick TM. Mutation of tlyA Confers Capreomycin
Resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother [Internet].
2005 Feb 1;49(2):571–7. Available from:

29
 http://aac.asm.org/cgi/doi/10.1128/AAC.49.2.571-577.2005

27. Nakamoto JA, Spurio R, Konevega AL, Fabbretti A, Milón P. The complete,
functional and dynamic cycle of the bacterial Initiation Factor 3. bioRxiv [Internet].
2019 Jan 1;579326. Available from:
http://biorxiv.org/content/early/2019/03/16/579326.abstract

28. MPKB. Differences between in vitro, in vivo and in silico studies [Internet]. [cited
2019 Apr 22]. Available from:
https://mpkb.org/home/patients/assessing_literature/in_vitro_studies

29. Blount ZD. The unexhausted potential of E. coli. Elife [Internet]. 2015 Mar 25;4.
Available from: https://elifesciences.org/articles/05826

30. Green M, Sambrook J. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 4th ed. New York;
2012.

31. Nakamoto JA, Evangelista W, Vinogradova DS, Konevega AL, Spurio R, Fabbretti
A, et al. The dynamic cycle of bacterial translation initiation factor IF3. Nucleic Acids
Res [Internet]. 2021 Jul 9;49(12):6958–70. Available from:
https://academic.oup.com/nar/article/49/12/6958/6308496

32. Bernasconi C. Relaxation kinetics. California: Academic Press, INC; 1976.

33. Dodds DR. Antibiotic resistance: A current epilogue. Biochem Pharmacol [Internet].
2017 Jun;134:139–46. Available from:
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0006295216304671

34. Ministerio de Trabajo y Promoción del Empleo. Eficacia y seguridad del esquema
acortado para el tratamiento de la Tuberculosis Multidrogorresistente [Internet].
Lima, Perú; 2018. p. 1–45. Available from:
http://www.essalud.gob.pe/ietsi/pdfs/directivas/DICT_REC_002_SDEPFYOTS_20
18.pdf

35. Organización Mundial de la Salud. Manual de Bioseguridad en el laboratorio de

Tuberculosis. 2013. p. 1–55.

36. Kalscheuer R, Palacios A, Anso I, Cifuente J, Anguita J, Jacobs WR, et al. The
Mycobacterium tuberculosis capsule: a cell structure with key implications in

30
 pathogenesis. Biochem J [Internet]. 2019 Jul 31;476(14):1995–2016. Available from:
https://portlandpress.com/biochemj/article/476/14/1995/219627/The-
Mycobacterium-tuberculosis-capsule-a-cell

37. Liu B, Furevi A, Perepelov A V, Guo X, Cao H, Wang Q, et al. Structure and genetics
of Escherichia coli O antigens. FEMS Microbiol Rev [Internet]. 2020 Nov
24;44(6):655–83. Available from:
https://academic.oup.com/femsre/article/44/6/655/5645236

31