Tesis Completa CD

UNIVERSIDAD DE MURCIA
ESCUELA INTERNACIONAL DE DOCTORADO
Caracterización estructural y funcional de

proteínas quinasas C y su interacción con
proteínas moduladoras y sustratos.
D. Jesús Baltanás Copado

2022
Trabajo realizado en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular A (Grupo de
Biomembranas) de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Murcia, bajo la
dirección del Dr. Juan Carmelo Gómez Fernández y la dirección y tutela de la Dra. María
Senena Corbalán García, para optar al grado de Doctor en Biología Molecular y
Biotecnología con Mención de Doctorado Internacional, por el Graduado Jesús Baltanás
Copado.
.
Esta tesis se ha realizado gracias a la financiación de los siguientes proyectos de
investigación:
− Interacciones de proteínas multidominio con membranas: proteínas quinasas c y

rabfilina-3a como paradigmas, financiado por el Ministerio de economía y
competitividad (BFU2014-52269-P).
− Interacciones de las PKCs con membranas celulares: un ejemplo de posible aplicación
terapéutica financiado por la Fundación Séneca: Agencia de Ciencia y Tecnología de la
Región de Murcia (19409/PI/14).
− Caracterización estructural y funcional de proteínas periféricas de membrana
involucradas en señalización celular y fusión de membranas, financiado por el Ministerio
de economía, industria y competitividad (BFU2017-87222-P).
− Aplicación de métodos de cribado de alto rendimiento para el descubrimiento de
nuevos inhibidores de proteínas quinasas C, financiado por la Fundación Séneca:
Agencia de Ciencia y Tecnología de la Región de Murcia (20885/PI/18)
− Structural Biology of PKCα Protein Complexes in Cancer. Financiado por el programa
europeo INSTRUCT-ERIC 2018 (PID 7250).
Jesús Baltanás Copado ha desarrollado esta tesis doctoral gracias a la financiación salarial
recibida de la beca competitiva para la formación del profesorado universitario del plan
propio de fomento de la investigación de la universidad de Murcia para 2018, y opta a la
mención de doctorado internacional gracias a la estancia realizada en la Universidad de
Oxford en Reino Unido financiada por las ayudas a la movilidad de estancias de larga
duración del programa INSTRUCT-ERIC 2018 (PID 7250).
.
ÍNDICE
.
.
ÍNDICE
AGRADECIMIENTOS
RESUMEN
ABSTRACT
ENGLISH REPORT ....................................................................................................... 1
I. INTRODUCTION. ..................................................................................................... 3
II. OBJETIVES.............................................................................................................. 5
III. MATERIAL AND METHODS. ................................................................................... 5
III.1 EXPRESSION AND PURIFICATION OF PKCα, PKCε, PKCζ AND FUSION PROTEINS A, H, E
y D..................................................................................................................................... 5
III.2 SPR (Surface Plasmon Resonance). ............................................................................. 6
III.3 THERMAL SHIFT ASSAY. .............................................................................................. 7
III.4 PROTEIN CRYSTALLIZATION AND X-RAY DIFFRACTION. ............................................... 8
III.5 CRYO-ELECTRON MICROSCOPY. .................................................................................. 9
IV. RESULTS. ............................................................................................................ 10
IV.1 BIOPHYSICAL CHARACTERIZATION OF THE INTERACTION BETWEEN PKCα AND TARGET

PROTEINS FASCIN1 AND RACK1. ...................................................................................... 10
IV.2 STRUCTURAL STUDY OF PKCα BY MEANS OF X-RAY CRYSTALLOGRAPHY. ................. 11
IV.3 STRUCTURAL STUDY OF PKCα BY MEANS OF CRYO-ELECTRON MICROSCOPY. ........... 12
IV.4 DRUG REPOSITION BY USING THE C2 DOMAIN OF PKCα. .......................................... 13
IV.5 STUDY OF THE INTERACTION BETWEEN FASCIN1 AND ACTIN FILAMENTS BY MEANS
OF ELECTRON TOMOGRAPHY. ......................................................................................... 14
V. CONCLUSIONS. .................................................................................................... 15
LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................................... 17
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS. .............................................................. 23
1. EL INICIO DEL ESTUDIO DE LAS PKCs. .................................................................... 25
2. ESTRUCTURA DE LAS PKCs. .................................................................................. 26
2.1 REGIÓN REGULADORA. .............................................................................................. 27

2.2 DOMINIO BISAGRA. REGIÓN V3. ................................................................................ 28
2.3 DOMINIO CATALÍTICO QUINASA. ............................................................................... 29
2.4 REGIÓN V5. ................................................................................................................ 30
3. MODELO CLÁSICO DE ACTIVACIÓN DE LAS cPKCs. ................................................ 31
ÍNDICE
4. FOSFORILACIONES CLAVES EN LA ACTIVACIÓN DE LAS PKCs................................. 33
5. INFORMACIÓN ESTRUCTURAL ACTUAL DE LAS PKCs Y NUEVOS MODELOS DE

ACTIVACIÓN PROPUESTOS....................................................................................... 35
6. RACK1 COMO SOPORTE ESTRUCTURAL PARADIGMA DE PKCs. ............................. 42
6.1 ESTRUCTURA DE RACK. .............................................................................................. 42

6.2 RACK1 COMO SOPORTE ESTRUCTURAL PARA LAS PKCs. ............................................. 43
6.3 RACK1 EN LA ORGANIZACIÓN ESPACIAL Y TEMPORAL DE PROTEÍNAS ........................ 43
6.4 INTERACCIÓN DE RACK CON PKC. .............................................................................. 45
6.5 RACK1 COMO DIANA TERAPÉUTICA. .......................................................................... 45
7. FASCIN1 COMO SUSTRATO PARADIGMA DE PKCs. ............................................... 47
7.1 ESTRUCTURA DE FASCIN1. ......................................................................................... 47

7.2 FASCIN1 Y ORGANIZACIÓN DEL CITOESQUELETO. ...................................................... 48
7.3 MECANISMO DE INTERACCIÓN ENTRE FASCIN1 Y F-ACTINA. ...................................... 48
7.4 FASCIN1, CITOESQUELETO, METÁSTASIS Y CÁNCER. ................................................... 50
7.5 INTERACCIÓN ENTRE FASCIN1 Y PKC. ......................................................................... 51
7.6 FASCIN1 COMO DIANA TERAPÉUTICA. ....................................................................... 52
8. IMPLICACIONES FISIOLÓGICAS DE LAS PKCs. ........................................................ 53
8.1 PROLIFERACIÓN CELULAR Y CICLO CELULAR. .............................................................. 55

8.2 DIFERENCIACIÓN CELULAR. ........................................................................................ 56
8.3 MORFOLOGÍA Y MOVILIDAD CELULAR. ...................................................................... 57
8.4 APOPTOSIS CELULAR.................................................................................................. 58
9. IMPLICACIÓN EN ENFERMEDADES Y DIANAS TERAPÉUTICAS. .............................. 59
10. PKC Y CÁNCER. ................................................................................................... 61
10.1 INTRODUCCIÓN. PMA E INICIO DEL ESTUDIO DE PKC EN CÁNCER. ............................ 61

10.2 PKCs. ¿SUPRESORES DE TUMORES U ONCOGENES? ................................................. 61
10.3 PKCs APARECEN MUTADAS EN MUCHOS TIPOS DE CÁNCER. .................................... 63
11. OBJETIVOS. ........................................................................................................ 65
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS. ................................................................... 67
1. MÉTODOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR. ................................................................. 69
1.1 VECTORES DE EXPRESIÓN. ......................................................................................... 69

1.1.1 Vector de Expresión pET28. .....................................................................................................69
1.1.2 Vector de Expresión pET15b. ...................................................................................................70
ÍNDICE
1.1.3 Vector de expresión pGEX4T. ..................................................................................................71

1.1.4 Vector de expresión pFastBacDual. .........................................................................................72
1.2 SISTEMA DE EXPRESIÓN EN BACULOVIRUS BAC-TO-BAC PARA LAS PROTEÍNAS PKCs. 74
1.3 DISEÑO DE LAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN. ..................................................................... 77
1.4 REACCIÓN DE GIBSON ASSEMBLY. ............................................................................. 81
1.4.1 CONSTRUCCIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN. ....................................................................81
1.4.2 GENERACIÓN DE MUTANTES. ..................................................................................................84
2. CULTIVOS CELULARES. ......................................................................................... 85
2.1 CÉLULAS DE INSECTO SF9. .......................................................................................... 85

2.1.1 CULTIVO DE CÉLULAS SF9. .......................................................................................................86
2.1.2 TRANSFECCIÓN DE CÉLULAS SF9..............................................................................................87
2.1.3 AMPLIFICACIÓN VIRAL EN CÉLULAS SF9. .................................................................................87
2.2 CÉLULAS MCF-7. ......................................................................................................... 88
2.2.1 MEDIO DE CRECIMIENTO PARA LA LÍNEA MCF-7 Y SUBCULTIVO. ...........................................88
3. MÉTODOS BIOQUÍMICOS. .................................................................................... 89
3.1 ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA. SDS-PAGE. ........................................ 89

3.2 TINCIÓN DE GELES CON COOMASSIE BRILLIANT BLUE. ............................................... 91
3.3 ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS. .................................................................. 91
3.4 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS. ........................................ 92
3.5 PREPARACIÓN DE MEZCLAS LIPÍDICAS. ...................................................................... 93
Vesículas multilamelares (MLV). .......................................................................................................93
Vesículas unilamelares pequeñas (SUV). ..........................................................................................93
3.6 CROMATOGRAFÍA. ..................................................................................................... 94
Cromatografía de afinidad. ...............................................................................................................94
Cromatografía de intercambio iónico (IEX).......................................................................................95
Cromatografía de filtración en gel. ...................................................................................................96
4. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS......................................................... 96
4.1 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PKCα, PKCε, PKCζ y PROTEÍNAS DE FUSIÓN A, H, E y D.

........................................................................................................................................ 96
4.2 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE RACK1. ................................................................... 100
4.3 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE FASCIN1-WT Y FASCIN1-S39D. ................................ 102
4.4 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE DOMINIOS C2. ........................................................ 105
5. TÉCNICAS BIOFÍSICAS. ........................................................................................ 107
5.1 SPR. ......................................................................................................................... 107

5.2 THERMAL SHIFT ASSAY Y POLIDISPERSIDAD MEDIANTE LA PLATAFORMA UNcle. .... 112
5.3 ESPECTROMETRÍA DE MASAS NATIVA...................................................................... 116
5.4 ENSAYOS DE ENTRECRUZAMIENTO. ......................................................................... 117
5.5 ENSAYOS DE FRET. ................................................................................................... 120
5.6 ENSAYOS DE SEDIMENTACIÓN LIPÍDICA. .................................................................. 123
ÍNDICE
6. TÉCNICAS CON CÉLULAS MODELO DE CÁNCER DE MAMA. ................................. 124
6.1 ENSAYOS DE PERFUSIÓN ACOPLADOS AL MICROSCOPIO CONFOCAL. ...................... 124

6.2 MICROSCOPÍA CONFOCAL........................................................................................ 126
7. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA ESTRUCTURAL. ............................................................. 128
7.1 CRIOMICROSCOPÍA ELECTRÓNICA. ........................................................................... 128

7.1.1 TINCIÓN NEGATIVA. .............................................................................................................. 128
7.1.2 PREPARACIÓN DE LAS REJILLAS DE CRYO-EM. ...................................................................... 131
7.1.3 ANÁLISIS DE DATOS. DE PARTICLE PICKING A REFINADO 3-D............................................... 137
7.1.4 PRINCIPIO BÁSICO DE LA CRYO-EM. TRANSFORMACIÓN DE FOURIER. ................................ 141
7.2 CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X. ................................................................................. 143
7.2.1 CRIBADOS DE CRISTALIZACIÓN PARA LA FORMACIÓN DE CRISTALES POR DIFUSIÓN DE
VAPOR. SITTING DROP. .................................................................................................................. 143
7.2.2 PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X................................................... 147
7.3 TOMOGRAFÍA POR MEDIO DE CRIOMICROSCOPÍA ELECTRÓNICA. ........................... 149
CAPÍTULO III. CARACTERIZACIÓN BIOFÍSICA DE LA INTERACCIÓN ENTRE PKCα Y
PROTEÍNAS DIANA MEDIANTE THERMAL SHIFT ASSAY........................................... 153
1 INTRODUCCIÓN. ................................................................................................. 155
2 RESULTADOS. ..................................................................................................... 156
2.1 PKCα. ....................................................................................................................... 157

2.2. FASCIN1. ................................................................................................................. 161
2.3. PKCα-Fascin1. ......................................................................................................... 165
2.4. PKCα-RACK1. .......................................................................................................... 171
3 DISCUSIÓN. ......................................................................................................... 174
CAPÍTULO IV. CARACTERIZACIÓN BIOFÍSICA DE LA INTERACCIÓN ENTRE PKCα Y

PROTEÍNAS DIANA POR MEDIO DE SPR, MS NATIVA Y ENSAYOS DE
ENTRECRUZAMIENTO. ........................................................................................... 181
1 INTRODUCCIÓN. ................................................................................................. 183
1.1 Surface Plasmon Resonance (SPR). .......................................................................... 183

1.2 Espectrometría de masas nativa (MS) y entrecruzamiento químico. ........................ 185
2 RESULTADOS. ..................................................................................................... 186
2.1. MEDIDA DE LA AFINIDAD ENTRE PKCα-FASCIN1 EN LAS DIVERSAS COMBINACIONES

DE ADITIVOS POR MEDIO DE SPR. ................................................................................. 186
2.2. DETERMINACIÓN DEL MODELO CINÉTICO DE UNIÓN ENTRE PKCα-FASCIN1 POR
MEDIO DE SPR. .............................................................................................................. 187
ÍNDICE
2.3. ESPECTROMETRÍA DE MASAS NATIVA PARA PKCα, FASCIN1 Y EL COMPLEJO PROTEICO

PKCα-FASCIN1. .............................................................................................................. 191
2.4. ESTUDIO DE LA UNIÓN ENTRE LOS COMPLEJOS PKCα-FASCIN1 y PKCε-RACK1
MEDIANTE ENSAYOS CON ENTRECRUZADORES. ............................................................ 196
3 DISCUSIÓN. ......................................................................................................... 199
CAPÍTULO V. DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE PKCα Y

PROTEÍNAS CON LAS QUE INTERACCIONA POR MEDIO DE CRISTALOGRAFÍA DE
RAYOS X. ............................................................................................................... 205
1 INTRODUCCIÓN. ................................................................................................. 207
2 RESULTADOS. ..................................................................................................... 208
2.1 CRISTALIZACIÓN DE LA PROTEÍNA PKCα Y LOS COMPLEJOS PROTEICOS PKCα-FASCIN1

Y PKCα-RACK1. .............................................................................................................. 208
2.2. COLECCIÓN DE DATOS DE CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X PARA LA PROTEÍNA PKCα Y
LOS COMPLEJOS PROTEICOS PKCα-FASCIN1 Y PKCα-RACK1 Y DETERMINACIÓN
ESTRUCTURAL. .............................................................................................................. 220
2.3. ESTABILIDAD COLOIDAL Y ESTUDIO DE POSIBLES POTENCIALES CONDICIONES PARA
OPTIMIZAR. ................................................................................................................... 227
2.4. OPTIMIZACIÓN DE CONDICIONES PARA LA CRISTALIZACIÓN DE LA PROTEÍNA PKCα Y
LOS COMPLEJOS PROTEICOS PKCα-FASCIN1 Y PKCα-RACK1. .......................................... 229
2.5. COLECCIÓN DE DATOS DE CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X PARA LOS CRISTALES
OBTENIDOS EN LAS CONDICIONES DE OPTIMIZACIÓN. .................................................. 242
2.6 CRISTALIZACIÓN DE PKCƐ, PKCζ Y LAS CONSTRUCCIONES UNIDAS COVALENTEMENTE.
...................................................................................................................................... 243
2.7. COLECCIÓN DE DATOS DE CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X. ....................................... 247
3 DISCUSIÓN. ......................................................................................................... 251
CAPÍTULO VI. DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DEL COMPLEJO

PKCα-FASCIN1 POR MEDIO DE CRIOMICROSCOPÍA ELECTRÓNICA. ......................... 257
1 INTRODUCCIÓN. ................................................................................................. 259
2 RESULTADOS. ..................................................................................................... 262
2.1 CRIOMICROSCOPÍA ELECTRÓNICA Y RECOLECCIÓN DE DATOS PARA LA PROTEÍNA PKCα

JUNTO CON RACK1 Y FASCIN1. ...................................................................................... 262
2.2 ESTUDIOS DE ESTABILIDAD Y POLIDISPERSIDAD DE LAS PROTEÍNAS UNIDAS
COVALENTEMENTE PKCa Y FASCIN1 POR MEDIO DE FLUORESCENCIA, DLS Y SLS
EMPLEANDO LA PLATAFORMA UNcle. ........................................................................... 266
2.3 TINCIÓN NEGATIVA CON MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA PARA LAS MUESTRAS DE PKC
UNIDAS COVALENTEMENTE A FASCIN1 POR MEDIO DE CONECTORES. .......................... 269
ÍNDICE
2.4 ANÁLISIS POR MEDIO DE CRIOMICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE LAS CONSTRUCCIONES

DE PKCα-FASCIN1 UNIDAS COVALENTEMENTE POR MEDIO DE CONECTORES. ............... 274
3 DISCUSIÓN. ......................................................................................................... 289
CAPÍTULO VII. ESTUDIO DE LA UNIÓN ENTRE FASCIN1 Y F-ACTINA POR MEDIO DE

TOMOGRAFÍA CRIOELECTRÓNICA (CRYO-ET). ........................................................ 297
1 INTRODUCCIÓN. ................................................................................................. 299
2 RESULTADOS. ..................................................................................................... 302
2.1 FASCIN1-S39D CON ACTIVIDAD NO NUCLEADORA COMO CANDIDATA A

INTERACCIONAR CON LOS FILAMENTOS DE F-ACTINA PARA ESTUDIAR EL MODELO DE
UNIÓN ENTRE F-ACTINA Y FASCIN1. .............................................................................. 302
2.2 OTROS MUTANTES DE FASCIN1 CON ACTIVIDAD NO NUCLEADORA COMO
CANDIDATOS A DECORAR LOS FILAMENTOS DE F-ACTINA PARA ESTUDIAR EL MODELO DE
UNIÓN ENTRE F-ACTINA Y FASCIN1. .............................................................................. 306
3 DISCUSIÓN. ......................................................................................................... 312
CAPÍTULO VIII. RESCATE Y REPOSICIONAMIENTO DE FÁRMACOS QUE SE UNEN AL

BOLSILLO DE UNIÓN A PIP2 EN EL DOMINIO C2 DE PKCα. ....................................... 319
1.- INTRODUCCIÓN. ............................................................................................... 321
2. RESULTADOS. .................................................................................................... 323
2.1 BÚSQUEDA DE FÁRMACOS POR MEDIO DE BASES DE DATOS DE INTERACCCIÓN

FÁRMACO-PROTEÍNA (MTiOpenScreen: iPPI-Lib y Diverse-Lib). ..................................... 323
2.2 DETERMINACIÓN DE LA UNIÓN DEL DOMINIO C2 DE PKCα A LA MEMBRANA POR
MEDIO DE ENSAYOS BIOFÍSICOS Y ENSAYOS CELULARES. .............................................. 328
2.2.1. ENSAYOS DE FRET PARA ESTUDIAR LA UNIÓN DE FÁRMACOS AL DOMINIO C2 DE PKCα. .. 328
2.2.2. ENSAYOS DE SEDIMENTACIÓN LIPÍDICA PARA ESTUDIAR LA UNIÓN DE FÁRMACOS AL
DOMINIO C2 DE PKCα. ................................................................................................................... 340
2.2.3. ENSAYOS DE CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X PARA ESTUDIAR LA UNIÓN DE FÁRMACOS AL
DOMINIO C2 DE PKCα. ................................................................................................................... 347
2.3. ESTUDIO DEL EFECTO DE FÁRMACOS A TRAVÉS DE LA OBSERVACIÓN DE
DESPLAZAMIENTO A MEMBRANA DE PKCα POR MEDIO DE ENSAYOS DE PERFUSIÓN
ACOPLADOS A MICROSCOPÍA CONFOCAL. ..................................................................... 354
3. DISCUSIÓN. ........................................................................................................ 359
CAPÍTULO IX. DISCUSIÓN GENERAL Y CONCLUSIONES. ........................................... 363
DISCUSIÓN FINAL. ......................................................................................................... 365

CONCLUSIONES. ............................................................................................................ 373
REFERENCIAS ......................................................................................................... 377
A mis padres Ana y Manuel
a mi hermana Ana
a mi sobrino Marcos
a Pape
Quiero mostrar especial agradecimiento a mis directores de Tesis Juan Carmelo
Gómez Fernández y María Senena Corbalán García. En particular a mi tutora y directora
Marisén por acercarme al camino de la investigación desde su pasión y dedicación
absoluta y a su apoyo y ayuda incondicional durante estos años de doctorado.
Quisiera agradecer también a mis compañeros de laboratorio Virginia, Sonia,

Claudio, Paulo, Alessio, Emilio M., Jesús y David con los que tantos momentos hemos
compartido. Especialmente a David, no solo compañero de doctorado, pero también
compañero de carrera, máster, piso y aventuras… y más importante; gran amigo. ¡Gracias
por estar ahí siempre que lo he necesitado y saber que lo estarás siempre que lo necesite!
No quisiera olvidar tampoco a mis compañeros de carrera Paco y Ricardo, que

desde el momento en el que nos conocimos han estado apoyándome dentro y fuera del
laboratorio y han hecho que este camino sea mucho más ameno y divertido. ¡Gracias!
También quiero mostrar mi más profundo agradecimiento a Tere y MD, quienes

al inicio de mi incursión en el doctorado se mostraron ampliamente dispuestas a ayudarme
en todo lo que necesité y todavía lo siguen haciendo cada vez que lo necesito. ¡Gracias!
Siempre recordaré todos los momentos de enseñanza y de risas, especialmente junto con
mi compañera del Protein Team MD.
A Pape, del que tanto aprendí y del que me hubiera gustado seguir aprendiendo
más lecciones vitales por siempre. Siempre nos acompañarás en nuestro corazón y
memoria.
A la nueva incorporación de la familia, Marcos, que nació allá cuando empecé a

escribir las primeras líneas de este manuscrito y que me motivó a seguir adelante, luchar,
intentarlo, equivocarme y mejorar cada día.
Por último, y no menos importante, a mis padres y hermana, sin ellos y su apoyo
vital absoluto nada de lo que soy y he conseguido hoy sería posible.
¡Gracias a todos, conocidos, amigos y familia quienes me han ayudado, apoyado

y han hecho más fácil este periplo!
“Ever tried.
Ever failed.
No matter.
Try again.
Fail again.
Fail better.”
Samuel Beckett
RESUMEN
En la presente Tesis Doctoral se ha llevado a cabo el análisis biofísico y estructural

de importantes proteínas pertenecientes a la familia de las quinasas PKCs. Además,
también se ha relacionado el estudio con proteínas con las que interaccionan, Fascin1, un
importante sustrato de PKCα con un papel fundamental en la dinámica espaciotemporal
dentro del citoesqueleto de F-actina y, por otra parte, una proteína con un papel
fundamental en la localización celular en membrana de las PKCs, RACK1. Todo ello en
conjunto con diversas combinaciones de aditivos (CaCl2, el éster de forbol P13A, ADP y
MgCl2), que tienen importancia modulando la actividad de estas quinasas.
Por medio de técnicas de cristalografía de rayos X y criomicroscopía electrónica,

se realizó un amplio estudio de cribados de cristalización y preparación de rejillas de
CryoEM para las quinasas PKCs junto con las proteínas moduladoras y sustratos
anteriormente mencionados. Desafortunadamente, no se obtuvieron cristales con la
presencia de alguna de las PKCs objeto de estudio ni datos por medio de CryoEM que
permitiera la determinación estructural atómica o casi atómica de las proteínas PKCs. No
obstante, a través de CryoEM conseguimos determinar condiciones preliminares, que
resultaron en clasificaciones 2D en las que podíamos interpretar un posible modelo de
interacción para el complejo PKCα-Fascin1 y con un gran potencial de poder determinar
estructuralmente a nivel atómico dicho complejo mediante la mejora de la toma de datos
inicial.
También se realizaron diversas técnicas biofísicas tales como Thermal Shift Assay
que permitieron inferir modos de unión diferentes para PKCα y Fascin1 dependiendo de
la combinación de aditivos añadidos al medio. Por medio de SPR también se determinó
que la mayor afinidad entre Fascin1 y PKCα se producía con la versión silvestre de
Fascin1 junto con todos los aditivos que se probaron (CaCl2, el éster de forbol P13A y
ADP-MgCl2).
Estudios de tomografía por medio de CryoEM permitieron determinar la unión de

Fascin1 a los filamentos de F-actina de forma discreta mediante el empleo de un mutante
de Fascin1 que afecta a uno de los dos sitios principales de interacción con F-actina. En
la actualidad, el proyecto se encuentra en una fase avanzada previa a la determinación
estructural atómica de dicha interacción.
Por otra parte, también se realizaron ensayos de rescate de fármacos que fueran
capaces de interaccionar con el bolsillo de unión a PIP2 del dominio C2 de PKCα y que
pudiera tener algún efecto en la capacidad de la quinasa en reconocer la membrana. Sin
embargo, después de realizar ensayos biofísicos de FRET y sedimentación lipídica, así
como ensayos celulares acoplados a microscopía confocal, no se consiguió asignar a
ninguno de los fármacos un papel interfiriendo en la habilidad de la proteína reconociendo
la membrana. No obstante, por medio de cristalografía de rayos X se determinó que uno
de los compuestos estudiados era capaz de interaccionar con el bolsillo de unión al
fosfoinosítido PIP2.
A pesar de los enormes retos estructurales que presentan estas proteínas PKCs
(asimetría, pequeño tamaño y la capacidad de adoptar múltiples conformaciones haciendo
de ellas proteínas muy flexibles) y que hacen que hasta la fecha no haya información
estructural completa para ninguna de sus isoformas, se ha conseguido obtener
información de gran valor y con potencial de poder avanzar con el estudio estructural para
acercarnos a la resolución atómica del complejo PKCα-Fascin1. Esto podría ayudar a
resolver el gran problema que existe hoy día en el desarrollo de fármacos específicos de
diana para esta familia de quinasas y así poder luchar contra el cáncer, una de las
principales enfermedades en las que las proteínas PKCs se encuentran involucradas.
ABSTRACT
In the present Doctoral Thesis, the biophysical and structural analysis of important
proteins belonging to the PKC kinase family has been carried out. In addition, the study
has also been related to proteins with which they interact, Fascin1, an important substrate
of PKCα with a fundamental role in the spatiotemporal dynamics within the F-actin
cytoskeleton and, on the other hand, a protein with a paramount role in the cellular
localization in the membrane of PKCs, RACK1. All of this in conjunction with various
combinations of additives (CaCl2, the phorbol ester P13A and ADP-MgCl2), which are
important in modulating the activity of these kinases.
By means of X-ray crystallography and cryo-electron microscopy techniques, an

extensive study of crystallization screenings and preparation of CryoEM grids for PKCs
kinases together with the modulatory proteins and substrates was performed.
Unfortunately, no crystals were obtained with the presence of any of the PKCs under
study neither information by CryoEM that would allow atomic or near-atomic structural
determination of the PKCs proteins. Nevertheless, through CryoEM we managed to
determine preliminary conditions, resulting in 2D classifications in which we could
interpret a possible interaction model for the PKCα-Fascin1 complex. Thus, with a great
potential to be able to structurally determine the protein complex by improving the initial
data acquisition.
We also performed several biophysical techniques such as Thermal Shift Assay

that allowed us to infer different binding modes for PKCα and Fascin1 depending on the
combination of additives added to the medium. By SPR, it was also determined that the
highest affinity between Fascin1 and PKCα occurred with the wild-type version of
Fascin1 together with all the additives tested (CaCl2, the phorbol ester P13A and ADP-
MgCl2).
Cryo-electron microscopy tomography studies allowed us to determine the

binding of Fascin1 to F-actin filaments in a discrete manner by using a Fascin1 mutant
affecting one of the two main sites of interaction with F-actin. The project is currently at
an advanced stage prior to the atomic structural determination of this interaction.
On the other hand, drug rescue assays were also carried out for pharmacological
substances that could be able to interact with the PIP2-binding pocket of the C2 domain
of PKCα and that could influence the ability of the kinase to recognize the membrane.
However, after performing biophysical assays such as FRET and lipid sedimentation
assays, as well as cellular assays coupled to confocal microscopy, none of the drugs under
study could be assigned with a role in disrupting the ability of the protein to recognize
the membrane. However, by X-ray crystallography it was determined that one of the
compounds under study was able to interact with the PIP2 binding pocket.
Despite the enormous structural challenges presented by these PKC proteins

(asymmetry, small size and the ability to adopt multiple conformations making them very
flexible proteins) and the fact that to date there is no complete structural information for
any of their isoforms, it has been possible to obtain highly valuable information with the
potential to advance in the structural determination at an atomic resolution for the protein
complex PKCα-Fascin1. This could help to overcome the big issue that exists today in
the development of specific drugs for this family of kinases and thus be able to fight
cancer, one of the main diseases in which PKC proteins are involved.
ENGLISH REPORT
ENGLISH REPORT
I. INTRODUCTION.
Protein kinase C is a family of very related serine/threonine protein kinases that

regulate a myriad of biological processes in the cell. This group of enzymes belong to the
AGC kinases family. In this classification of proteins we can find: PKA (protein kinase
A), PKB (protein kinase B), PKD (protein kinase D), PKG (protein kinase G) and PKC,
where they belong the proteins under study in this Thesis (Pearce et al., 2010). The PKC
family is formed by 10 members encoded by 9 different genes in mammals. Each isoform
of these PKCs can be expressed in different kind of cell types. Besides, different PKCs
can be expressed in the same cell types, turning these proteins into a very ubiquitous kind
of enzymes (Mellor & Parker, 1998).
Regarding their structure, PKC proteins consist in a catalytic kinase domain

located in C-terminal, that binds ATP and substrates, and a regulatory domain located in
N-terminal with different domains that enable the protein to interact with different lipids
located in the membranes. Besides, the regulatory region, depending on the isoenzyme,
can also bind Ca2+. Both regions are highly conserved. According to their primary
structure and biochemical analysis, these proteins can be divided into 3 subfamilies, they
all differ in the cofactors they require for their activation (Steinberg, 2008):
• Classic PKCs (cPKCs): PKCα, PKCβI, PKCβII and PKCγ. They need calcium,
DAG (diacylglycerol) and PS (phosphatidyl serine) for them to be activated.
• New PKCs (nPKCs): PKCε, PKCη, PKCδ and PKCθ. They only require DAG
for their activation.
• Atypical PKCs (aPKCs): PKCζ and PKCι (human)/ λ (mouse). They require
nor calcium, nor DAG neither PS for their activation.
PKC isoenzymes are activated by a great variety of hormones (such as adrenaline

or angiotensin), growth factors (for instance, epidermal growth factor or insulin) and
neurotransmitters (for example, dopamine and endorphin). All these stimuli, when
binding to their membrane receptors, activate members of the phospholipase C (PLC)
family, that can hydrolyze PIP2 (phosphatidylinositol-4,5-biphosphate) into DAG and IP3
3
ENGLISH REPORT
(inositol-1,4,5-triphosphate). DAG is a lipid that have a pivotal role as a second

messenger and anchor the PKCs into the membrane via their C1 domains. Calcium levels
increase in the cytosol on account of that IP3 enables the liberation of calcium from the
endoplasmic reticulum. This rise of DAG and calcium triggers the translocation of PKC
proteins from the cytosol to the membrane, where they can interact with their anchor
proteins, receptors of activated C kinase (RACK) (Csukai & Mochly-Rosen, 1999).
Up to now there is only structural information available for the catalytic domains
of the PKCs βII, θ y ι (Grodsky et al., 2006; Messerschmidt et al., 2005; Takimura et al.,
2010; Xu et al., 2004), the C2 domain of the PKCs α, βII, δ, η and ε (García-García et al.,
2001; Guerrero-Valero et al., 2009; Littler et al., 2006; Pappa et al., 1998; Sutton &
Sprang, 1998; Verdaguer et al., 1999) and the C1 domains of the PKCs α (Hommel et al.,
1994), γ (Xu et al., 1997) and δ (Zhang et al., 1995) on their own or binding phorbol esters
and related analogs.
More recently, the structure of PKC βII has been obtained. However, it could not
be considered the full-length structure of the protein on account of the electron density
was only very clear for the C1B, C2, the kinase domain and the C- terminal tail.
Nonetheless, the structure did not have a good electron density for the pseudo-substrate
region, the C1A domain and for any of the regions that link one domains with each other
(Leonard et al., 2011).
Cancer is one of the leading causes of death worldwide. It has been well stablished
that PKCs proteins are involved in tumorigenesis, converting them into important targets
for therapy. Due to their ubiquity and multifunctionality, it is very difficult to classify
them as oncogenes or tumor suppressors. So far, this group of enzymes are a high
potential target for anti-cancer drugs, but no successful approach is available up to date.
The lack of 3D structural information of full-length PKCs is one of the big challenges we
still face, and perhaps, one of the reasons why most of the PKC inhibitors entering clinical
trials turn out to be ineffective (Michie & Nakagawa, 2005; Mochly-Rosen et al., 2012).
4
ENGLISH REPORT
II. OBJETIVES.
1. Biophysical characterization of the interaction between PKCα and RACK1.

2. Biophysical characterization of the interaction between PKCα and Fascin1.
3. Characterization of the 3D structure of PKCα, PKCε and PKCζ by means of X-ray
crystallography or cryo-electron microscopy.
4. Characterization of the 3D structure of the complexes PKCα-RACK1 via X-ray
crystallography or cryo-electron microscopy.
5. Characterization of the 3D structure of the complexes PKCα-Fascin1 by means of X-
ray crystallography or cryo-electron microscopy.
6. Repositioning of drugs that may have an effect in the function and structure of PKCα
with a possible pharmacological value to treat different diseases.
7. Biochemistry characterization of the binding of the compounds rescued to PKCα.
8. Study of the effect of the binding of different drugs in subcellular location and signaling
of PKCs.
9. Study of the structural basis of the interaction between Fascin1 and F-actin filaments
via Cryo-ET.
III. MATERIAL AND METHODS.
III.1 EXPRESSION AND PURIFICATION OF PKCα, PKCε, PKCζ AND FUSION

PROTEINS A, H, E y D.
For the expression of the PKCs proteins, 2 liters Erlenmeyer flasks were used
containing 500 ml of Insect Express medium (Lonza) supplemented with L-glutamine
and antimitotic antibiotic (Gibco®), with the SF9 insect cells. When cells reached a
concentration of 2x106 cells/ml, the flasks were infected with 10 MOI from the viral pass
3, corresponding to each of the PKC proteins. Afterwards, cells were incubated with the
virus in a shaking incubator 100 rpm/27ºC for 48 hours. Then, cells were harvested
through centrifugation 7500 rpm/15’ when cellular death was around 20%.
5
ENGLISH REPORT
The purification process started with the lysis of the pellet coming from 500 ml
medium of SF9 cells incubated for 48 hours with the virus. Lysis buffer was 25 mM Tris
pH 8.1% Triton X100 and 300 mM NaCl. Besides, it was supplemented with commercial
phosphatase and protease inhibitors (Deltaclon). The pellet was resuspended and then
incubated in ice for 15 minutes. After that, it was undergone to a sonication process 10
sec/10x, intensity no. 4. After sonication, the sample was centrifuged 15000 rpm/50 min/4
ºC, SN was recovered, and imidazole (20 mM) was added in it.
Then, the SN was introduced in a HisGraviTrap column (GE Healthcare). Once

SN passed through the column, elution took place by applying an imidazole gradient
(from 30 mM to 480 mM). This way, the protein of interest was eluted.
The fractions with the protein of interest were collected in a single pool. This pool
was diluted to a total volume of 50 ml in the buffer; 25 mM Tris pH 8, 0.1 mM EGTA,
0.5 mM DTT, 50 mM NaCl and loaded into an ionic exchange column HiPrep Q FF 16/10
(GE Healthcare). For this purpose, two different buffers were needed, binding buffer: 25
mM Tris pH 8, 0.1 mM EGTA, 0.5 mM DTT, 50 mM NaCl and elution buffer: 25 mM
Tris pH 8, 0.1 mM EGTA, 0.5 mM DTT, 1 M NaCl.
Next, the protein was collected, and buffer was exchanged using a HP26/10
desalting column (GE Healthcare), previously equilibrated with the buffer 25 mM Tris
pH 8, 0.1 mM EGTA, 0.5 mM DTT, 50 mM NaCl. Before final concentration, 5%
glycerol and 0,025% Octyl-b-D-thyoglucopiranoside (OTG) was added to the protein
pool. Protein was aliquoted and flash frozen to -80ºC using liquid nitrogen or a mix of
dry ice and ethanol.
III.2 SPR (Surface Plasmon Resonance).
The SPR phenomenon occurs when surface plasmon waves are excited at a
metal / liquid interface. Light is directed towards and reflected from the side of the surface
that is not in contact with the sample, the SPR produces a reduction in the intensity of the
reflected light at a specific combination of angle and wavelength. The binding events
cause changes in the refractive index of the surface layer that result in changes in the SPR
signal (Pattnaik, 2005).
6
ENGLISH REPORT
In this Thesis, it was used the SCK (single cycle kinetic) method. This method
had 7 different cycles: the 3 first cycles were start-up cycles (injection of buffer to
equilibrate the system and minimize the background noise), cycles 4 and 6 were the SCK
cycles with the injection of the buffer and the double reference, and cycles 5 and 7 were
cycles where the injection of the analyte in increasing concentrations took place.
The basic pipeline of the assay was as follows:
1. Coupling of anti-6xHis Ab to a CM5 sensor chip.

2. Ligand injection: 6xHis-PKCα.
3. Analyte injection: Fascin1WT or Fascin1S39D (0.625-1.25-2.5-5-10 µM SCK) in
the presence of the different combination of ligands:
-1st Condition: CaCl2.
-2nd Condition: CaCl2 + phorbol ester.
-3rd Condition: CaCl2 + ADP-MgCl2.
-4th Condition: CaCl2 + phorbol ester + ADP-MgCl2.
4. Dissociation: buffer containing EGTA.
5. Regeneration buffer: 10 mM glycine-HCl pH 2.1.
III.3 THERMAL SHIFT ASSAY.
UNcle technology (Unchained labs) is a platform that enables the measurement

of stability, aggregation and polydispersity of the protein of interest by measuring UV of
the intrinsic Trp residues, as well as SLS (static light scattering, measured at two different
wavelengths 266 and 473 nm) and DLS (dynamic light scattering) when the protein
undergoes a temperature shift from 15 to 95ºC.
The main parameters considered when doing the assays in the Thesis were as follows:
- Tm, fusion temperature. This parameter is measured through the intrinsic

fluorescence of the protein coming from the aromatic amino acids that the protein
normally exposes towards the hydrophilic environment. As temperature rises, the
protein can suffer structural modifications and denaturalization that can expose
new amino acids that at the beginning of the assay were hidden in the hydrophobic
core (Miotto et al., 2019).
7
ENGLISH REPORT
- Tagg, aggregation temperature. The aggregation of the protein throughout the

assay can be determined by means of SLS (small light scattering) measuring at
two different wavelengths at the same time to detect small and big particles (266
nm for sensitivity and 473 nm for a dynamic range). For these measures, samples
are hit with a laser, and the intensity reflected at 90º is detected (Minton, 2007).
- Size and polydispersity. These measurements were done via DLS. By means of
Dynamic Light Scattering, the hydrodynamic size of the proteins and small
molecules in solution can be measured. Through DLS, UNcle identifies the
presence of aggregates or impurities as well as it can confirm the size of the
protein of interest (Lorber et al., 2012).
III.4 PROTEIN CRYSTALLIZATION AND X-RAY DIFFRACTION.
X-ray crystallization has been the most important structural biology technique
throughout history. Unlike CryoEM, for this technique it is needed for the protein to form
crystals. For this purpose, different crystallization screenings narrowing down a great deal
of different conditions were carried out so we could achieve the crystal formation
(Thomas, 2012).
Vapor diffusion process explains the phenomenon in which crystals are formed.
In this process, a droplet of protein at an appropriate concentration is mixed with the
precipitant solution and incubated in the top of a sealed chamber where there is also the
reservoir containing the precipitant solution from the screening at the bottom of the
chamber. Due to concentration is smaller in the droplet with the protein, vapor diffusion
takes place from the droplet towards the reservoir of the screening. In this process,
metastable and nucleation phase can occur, and it will be then, when crystals can be
formed (Forsythe et al., 2002).
When crystals are obtained, they can be frozen, stored and taken to the
synchrotron where an electron beam is to hit the crystal. Depending on the atomic
distribution of the atoms in the crystals, the electron diffraction pattern is different and
unique for each protein. By means of mathematical and computerized mechanisms this
8
ENGLISH REPORT
pattern can be turned into an electron density where the atomic model can be determined
if resolution is good enough. In this final process and, as it occurred with CryoEM,
Fourier transformations are paramount (Thomas, 2012).
In this Thesis, the phase problem that appears in the X-ray crystallization (and
does not in CryoEM) was solved by molecular replacement since there were structural
information related to the proteins under study in the PDB (protein data bank) (Evans &
McCoy, 2008; Millane & Arnal, 2015; Taylor, 2003).
III.5 CRYO-ELECTRON MICROSCOPY.
Cryo-electron microscopy is a structural biology technique that allows the

determination of the structure of molecules when they undergo a cryogenization process,
and after that expose to an electron beam in high vacuum conditions (Bai et al., 2015).
The main pipeline starts as in the other biology structure techniques by sample
preparation. It must be highly purified protein, where it is important for the protein to be
a homogenic specimen. After that, negative staining is a preliminary way to get an idea
of how the protein looks like in the CryoEM grids. This way, we can check if the protein
behaves like discrete particles, whether our protein is stable as well as we can assess the
particle size and shape (De Carlo & Harris, 2011).
If protein looks fine, after carrying out negative staining, next step will involve a
diagnostic Cryo-EM microscope. For this purpose, a mid-range Cryo-EM microscope
such as the Glacios (Thermo Scientific, 200 kV) will be needed. This time, unlike in the
negative stain, it is needed to prepare CryoEM grids by plunge freezing them in liquid
ethane using a Vitrobot (Tecnai, FI). This is an instrument that contains a chamber where
different parameters (temperature, blot force, humidity, blot time and waiting time) can
be tuned up to prepare the frozen grids to be observed in the microscope. Again, we must
make sure that protein stability is fine, for that goal, a good ice layer formation is
paramount, and it can be achieved by trial and error changing different parameters when
it comes to grid preparation. Not only stability is a parameter to be narrowed down in this
phase, but the particle size and particle distribution versus concentration are other
9
ENGLISH REPORT
important features we have to asses in order to ensure a good data acquisition (Passmore
& Russo, 2016).
Once initial parameters are tuned up, initial Cryo-EM data collection can take
place. First step involves the collection of the particles in the micrographs taken from the
grids. Different population of particles that have similarities in shape and size are
organized then in 2D classes. These 2D classes represent distinct projections of different
viewpoints of the protein when it got frozen and hit by the electron beam. After that, by
means of Fourier transformations the 2D classes can be turned into a 3D model. If data
acquisition is good enough, we can reach atomic resolution (Nogales & Scheres, 2015).
If the 3D model is adequate using the mid-range CryoEM microscope, data

collection can be carried out through a high resolution CryoEM microscope that could
enable a better data acquisition and a better resolution of the final structure.
IV. RESULTS.
IV.1 BIOPHYSICAL CHARACTERIZATION OF THE INTERACTION

BETWEEN PKCα AND TARGET PROTEINS FASCIN1 AND RACK1.
Stability, aggregation and polydispersity of the samples PKCα, Fascin1 and

RACK1 in the presence of different combination of additives were measured using UNcle
technology. The study of the interaction between PKCα/Fascin1 using the UNcle
instrument (Unchained Labs) showed two different possible binding models between the
proteins according to the additives added in the different conditions that were proven.
• First, model A for the complex PKCα/Fascin1 alongside CaCl2, phorbol

ester P13A and ADP-MgCl2 and on the other hand the complex with CaCl2
and ADP-MgCl2. In this model of interaction, thermal shift data showed
that the region with the Trp residues of PKCα would be exposed to the
hydrophilic medium, and Fascin1 would be interacting with PKCα in other
surface where these aromatic residues were not located.
10
ENGLISH REPORT
• Secondly, model B, for the conditions where it was added CaCl2 and on
the other hand CaCl2 and phorbol ester P13A. In this model, the surface of
PKCα that showcases the Trp residues would be hidden by the direct
interaction with Fascin1.
Besides, DLS and SLS data analysis showed that Model A was more stable and
Model B less polydisperse. In addition, both PKCα-Fascin1 complex models A and B,
showed a higher stability and a lesser polydispersity than PKCα alone.
The affinity between PKCα and Fascin1WT/Fascin1S39D in the presence of

different combination of additives were measured by means of SPR. SPR analysis showed
that the lower value for Kd (nM) (and it meant that it represented the higher affinity) was
of 0.31 nM for PKCα-Fascin1WT when CaCl2, phorbol ester P13A and ADP-MgCl2 were
added. On the other hand, the higher value for Kd (and it meant it represented the lower
affinity) was of 837 nM for PKCα-Fascin1WT when only CaCl2 was added to the
complex. Considering the statistics data for the different complexes in combination with
additives, it could be observed a tendency to fit the kinetic of the binding between PKCα
and Fascin1 to a two-state reaction model. This kinetic model implies that the complex
must undergo a conformational change before the binding is fulfilled.
IV.2 STRUCTURAL STUDY OF PKCα BY MEANS OF X-RAY

CRYSTALLOGRAPHY.
For the structural determination of PKCα, several crystallization screenings were

tried narrowing down a great deal of precipitant conditions. For this, we tried different
PKCs isoenzymes in combination with different additives (CaCl2, phorbol ester P13A
and ADP-MgCl2) and partner proteins (Fascin1 and RACK1).
PKCα is highly asymmetric and a multidomain protein that makes it more prone
to be flexible and adopting different conformations. These starting conditions make it
more complicated to get crystals of the protein. In order to sort out this issue, we worked
with partner proteins (RACK1 and Fascin1) alongside our goal protein. Besides, we
performed the conditions that showed the maximum affinity when we analyzed the
11
ENGLISH REPORT
binding of PKCα-Fascin1WT via SRP. This way, we could shift the equilibrium to an
active state in which PKCα is interacting with its substrate. Hence, the complex could
improve in terms of symmetry and in addition, we could intercept the catalytic active
protein interacting with the partner protein, ruling out possible intermediate interactions.
Nonetheless, after several trials and carrying out multiple crystallization

screenings, no crystal for PKCα or the complexes PKCα-Fascin1WT or PKCα-RACK1
were found. For this reason, it was performed the optimization of different conditions
where we could observe hits that were plausible candidates to render crystals. This
optimization process is done moving around the crystallization phase diagram and trying
to shift the equilibrium to the metastable and nucleation phase where crystal can be
formed. In the end, no PKCα crystals were obtained, and we could only spot rod-shaped
crystal that were identified by molecular replacement as Fascin1 crystals.
IV.3 STRUCTURAL STUDY OF PKCα BY MEANS OF CRYO-ELECTRON

MICROSCOPY.
First, CryoEM grids where PKCα and Fascin1 were added in a separate way at
equimolar concentrations were carried out. In these first grids, when carrying out data
acquisition, interesting preliminary results were gotten. We could spot 2D classes that
were very similar in shape and size with the interaction model between PKCα-Fascin1WT
we proposed. Nonetheless since the affinity of PKCα for Fascin1 seemed to be fleeting,
it was engineered different constructs in which PKCα was covalently linked to Fascin1
with a linker. So, new CryoEM assays were done this way.
For these new constructions of the fusion proteins, we could accomplish very
interesting results in which we could see models of 2 and 3 spheres when it came to
analyzing the 2D classes. The model of 2 spheres could correspond to Fascin1 and the
catalytic domain of PKCα. In this model we got the impression that the interaction
between the spheres was not occurring, or it was taking place at an intermediate level of
interaction. On the other hand, the model of 3 spheres corresponded to Fascin1, the
catalytic domain of PKCα and the C1 and C2 domains of PKCα that, when they got
organized, they could be detected as a third sphere. In this model, it was clearer that the
interaction was taking place on account of the proximity of the spheres in the 2D classes.
12
ENGLISH REPORT
Besides, when adding all the additives that are known to have an effect in the catalytic
activity of PKCα (CaCl2, phorbol ester P13A and ADP-MgCl2) the equilibrium was
shifted towards 2D classes with more models of 3 spheres interacting instead of 2 sphere-
interacting models.
Despite the sheer interesting preliminary results, on account of issues related with
grid preparation that rendered bad ice formation, we could not achieve an appropriate
data acquisition that enable to get enough information of all the particles needed to build
a proper 3D model. This was a bottleneck in the process in order to fulfill a final atomic
resolution given the asymmetry and the different intermediates of interaction that the
complex seemed to adopt.
IV.4 DRUG REPOSITION BY USING THE C2 DOMAIN OF PKCα.
Pharmacological rescue of drugs was carried out using structural information

available regarding the PIP2 pocket of the C2 domain of PKCα. For this, we used the data
base MTiOpenScreen that stores information of thousands of drugs that have been tried
in different clinical trials and for some reason most of them have been proven ineffective
for the purpose they initially had. Introducing the structural information of the PIP2 pocket
of the C2 domain of PKCα in the data base, it gave a list of drugs ordered from the most
likely to interact with the target to the less likely to bind this region located in the C2
domain.
Since the PIP2 pocket plays a detrimental role in binding the C2 domain to the
membrane, once we purchased the drugs available on top of the list from different
companies, we carried out different biophysical and cellular assays to test if the binding
of the drug to the C2 domain was happening and if it could hamper the binding of the C2
domain to the membrane.
After several trials using cell and biophysical techniques, only the method X-ray
crystallization showed that one of the drugs was binding to the PIP2 pocket. This could
mean that the interaction did not hamper the binding with the membrane as we saw in the
13
ENGLISH REPORT
different cell and biophysical assays but could have an effect in the correct activation of
the protein. Hence, downstream effects are to be studied.
IV.5 STUDY OF THE INTERACTION BETWEEN FASCIN1 AND ACTIN

FILAMENTS BY MEANS OF ELECTRON TOMOGRAPHY.
Though there is several information regarding to the mechanism of interaction

between Fascin1 and the filaments of F-actin (it is well characterized 2 binding sites in
Fascin1 that crosslink F-actin), there is no structural information for this binding. Since
actin filaments bundle together in the 3D space, it is needed cryo-electron tomography
for the structural determination of the binding between both molecules (Yang et al.,
2013).
The determination of the structure regarding the binding of Fascin1 to F-actin at

an atomic resolution would be not possible using Fascin1WT on account of it forms heavy
packed bundles of F-actin filaments. That is why we tried different mutants that affect the
binding capacity of the 2 well known areas of Fascin1 that interact and crosslink the F-
actin filaments. By this way, we could reduce the capacity of the binding of the protein,
so Fascin1 would be decorating the F-actin filaments in a more discrete way that could
make it easier to determine the structure of the complex (Jansen et al., 2011).
When we tried the Fascin1 mutant S39D that affect the binding site 2 of Fascin1
to F-actin, after data acquisition and data processing we could not spot Fascin1 binding
actin in the filaments both in the 2D classes and the final 3D model.
However, when we tried the mutant A of Fascin1 (K150E, R151E y K313E) that
affects the biding site 1, it ended up in very interesting preliminary results where we could
spot discrete bundle of filaments of F-actin decorated with Fascin1. Besides, the way this
interaction was observed in the tomograms suits very similarly to the bioinformatic model
of interaction between both molecules we proposed by means of the software ClusPro.
So far, the process of data acquisition is being tuned up. Preliminary results were adequate
and could render valuable atomic resolution of the binding.
14
ENGLISH REPORT
V. CONCLUSIONS.
1. Thermal Shift Assays analysis for the PKCα-Fascin1 complex shows two
different denaturalization patterns that adjust to two different models. Model 1 for
conditions 1 and 2 (Condition 1: CaCl2, phorbol ester and ADP-MgCl2 and
Condition 2: CaCl2 and ADP-MgCl2). Model 2 for conditions 3 and 4 (Condition
3: CaCl2 and Condition 4: CaCl2 and phorbol ester.
2. Stability measures by means of SLS resulted in a higher stability for Model 1 of

the complex PKCα-Fascin1. Likewise, stability for the complex PKCα-Fascin1,
was higher than for PKCα in the presence of CaCl2, phorbol ester and ADP-MgCl2
3. Polydispersity studies by means of DLS showed that Model 2 represented a

protein complex less polydisperse than Model 1. The condition with the lowest
value of polydispersity, was when only CaCl2 was added.
4. Model A would be depicting a way of interaction in which Fascin1 would be

interacting with PKCα in a different surface where this kinase showcases the Trp
residues to the surface. While in Model B, Fascin1 would be interacting with the
area where PKCα exhibits the Trp amino acids to the hydrophilic medium.
5. Affinity values for the complexes PKCα-Fascin1WT and PKCα-Fascin1S39D

measured by SPR, showed that affinity was higher for Fascin1WT in comparison
with the mutant Fascin1S39D. This was maximum for the condition where all the
additives were present: CaCl2, phorbol ester P13A and ADP-MgCl2.
6. Biophysical studies by SPR showed that the kinetic model that suits the best for
the interaction between PKCα-Fascin1 is the 2-state reaction. This model implies
a conformational change before both proteins fulfill the interaction.
7. Native MS assays showed one low intensity peak that could fit the interaction of
the complex PKCα-Fascin1.
15
ENGLISH REPORT
8. Preliminary crosslinking assays using BS3, showed that complexes formation for
PKCα-Fascin1 and PKCα-RACK1 were feasible. Then, this interactome is
possible to be studied by XL-MS.
9. After carrying out a great deal of crystallization screenings in combination with

different proteins and additives and after trying different approaches for the
optimization of potential hits, we did not get any crystals for the protein PKCα
alone or in combination with its partner proteins Fascin1 and RACK1.
10. CryoEM conditions carried out during this Thesis were close for the atomic
resolution determination of the structure of PKCα. Nonetheless, an increase in the
quality of the data acquisition is needed to take the project one step further.
11. The Fascin1 mutant S39D, affecting the binding site 1 for F-actin filaments,
showed no bundling activity and it ended up in only single filaments not decorated
with Fascin1 using CryoET. This indicates that this altered region is pivotal in the
binding to actin and site 2 is not strong enough to compensate the disfunction.
12. The Fascin1 mutant A (K150E, R151E and K313E) that have mutations in the
binding site 2 of F-actin, showed very interesting preliminary results when
analyzing alongside F-actin filaments via CryoET. Actin filaments were
decorated in a discrete way by Fascin1 molecules. This interaction needs to be
studied to try and reveal the way both molecules interact at an atomic level.
13. Among all the drugs rescued in this Thesis that allegedly could interact with the
target PKCs proteins, we could see, using X-ray crystallography, that drug α1 was
able to interact in a specific way with the PIP2 pocket of the C2 domain.
16
LISTA DE ABREVIATURAS
ADN: Ácido desoxirribonucleico
ADP: Adenosina 5’-difosfato
Amp: Ampicilina
aPKCs: PKCs atípicas
ATP: Adenosina 5’-trifosfato
BCM: Media baricéntrica
BSA: Albúmina de suero bovino
CBR: Región de unión a calcio
CTF: Función de transferencia de contraste
CCD: Dispositivo de carga acoplada
CO2: Dióxido de carbono
cPKCs: PKCs convencionales
CryoEM: Criomicroscopía electrónica
CryoET: Tomografía por medio de criomicroscopía electrónica.
DAG: Diacilglicerol
DiC8: dioctanoil-sn-glicerol
DHPE: 1,2-Dihexadecanoil-sn-Glicero-3-Fosfoetanolamina
DLS: Dispersión dinámica de luz
DTT: Ditiotritol
EDTA: Ácido etilenodinitrilotetraacético
EGTA: Ácido etilenglicol-bis(β-aminoetil éter)-N,N,N’,N’-tetraacético
EM: Microscopía electrónica
ER: Receptor de estrógenos
FPLC: Cromatografía líquida rápida de proteínas
FRET: Transferencia de energía de resonancia de fluorescencia
FT: Flow through
GST: Glutatión S-transferasa
HBA: Puentes de hidrógenos aceptores
HBD: Puentes de hidrógenos dadores
HR1: Región de homología 1
IEX: Cromatografía de intercambio iónico
IGFBPs: Proteínas de unión a los factores de crecimiento similares a insulina
IMAC: Cromatografía de afinidad de unión a metal
IP3: Inositol-1,4,5-trifosfato
19
iPP: Interacción proteína-proteína
IPTG: Isopropil-1-tio-β-D-galactopiranósido
Ka: Constante de asociación
Kan: Kanamicina
Kd: Constante de disociación
kDa: Kilodalton
LB: Medio Luria-Bertani
LRC: Región rica en lisinas
MCK: Cinética de multi-ciclo
MDR: Resistencia multidroga
MLV: Vesículas multilamelares
NMR: Resonancia magnética nuclear
MOI: Multiplicidad de infección
MR: Reemplazo molecular
MS: Espectrometría de masas
mTOR: diana de rapamicina en células de mamífero
MW: Peso molecular
nPKCs: PKCs nuevas
OD: Densidad óptica
OTG: Octil-b-D-tioglucopiranosido
P13A: Phorbol 13-acetate
P: Pellet
PB1: Phox y Bem 1
PBS: Tampón fosfato salino
PC: Fosfatidilcolina
PCCD: Bases de datos de complejos proteicos cristalizados
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
PCT: Test de pre-cristalización
PDB: Protein data bank
PDK1: proteína 3-fosfoinositida dependiente de la proteína quinasa-1
PDPK1: Quinasa-1 dependiente de fosfoinosítido
PFU: Unidades formadoras de placa
PIP2: Fofatidilinositol-4,5-bifosfato
PIP3: Fosfatidil inositol-3,4,5-trifosfato
20
PKA: Proteína quinasa de A
PKC: Proteína quinasa C
PKD: Proteína quinasa D
PKG: Proteína quinasa de tipo G
PKN: Proteínas relacionadas con PKC
PLA: Fosfolipasa A
PLC: Fosfolipasas C
PMA: Forbol-12-miristato-13-acetato
POPC: 1-Palmitil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfocolina
POPS: 1-Palmitil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina
PPI: Interacción proteína-proteína
PR: Receptor de progesterona
PS: Pseudosustrato
PSA: Persulfato amónico
rpm: Revoluciones por minuto
RUs: Unidades arbitrarias de resonancia
S: Sobrenadante
SB5x: Tampón de carga concentrado 5 veces
SCK: Cinética de un único ciclo
SDS: Dodecil-sulfato sódico
SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes en
presencia del detergente SDS
SEC: Cromatografía de exclusión molecular
SLS: Dispersión estática de luz
SN: Sobrenadante
SOC: Medio de cultivo SOC
SPR: Resonancia del plasmón superficial
SUV: Vesículas unilamelares pequeñas
shRNA: ARN de horquilla corta
Tagg: Temperatura de agregación
TB: Terrific broth
TE: Tampón Tris/EDTA
TEMED: N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina
Tm: Temperatura de fusión
21
TNFα: Factor de necrosis tumoral alfa
TPSA: Área de la superficie polar topológica
Trp: Triptófano
(v/v): Relación volumen/volumen
VPP: Volta phase plate
(w/v): Relación peso/volumen
XL-MS: Espectrometría de masas con entrecruzadores
UV: Ultravioleta
WB: Western Blot
WT: Tipo silvestre
22
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN
Y OBJETIVOS.
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS.
1. EL INICIO DEL ESTUDIO DE LAS PKCs.
Las proteínas quinasas C (PKC) comprenden una familia de proteínas de tipo

serina/treonina quinasas muy relacionadas entre sí y que regulan una gran variedad de
eventos biológicos en la célula. Esta gran familia de enzimas se engloba dentro de la
superfamilia de las AGC quinasas donde podemos encontrar PKA (proteína quinasa A),
PKB (proteína quinasa B), PKD (proteína quinasa D), PKG (proteína quinasa G) y la
PKC, en la que se centra el estudio de esta Tesis (Pearce et al., 2010). La familia de las
quinasas PKC está formada por 10 miembros codificados por 9 genes diferentes en
mamíferos. Cada isoforma de estas PKCs se expresa en diversos tipos celulares, a su vez,
diferentes tipos de PKCs se pueden expresar en los mismos linajes celulares, convirtiendo
estas quinasas en una familia de enzimas muy ubicuas (Mellor & Parker, 1998).
Se determinaron por primera vez en 1977 a partir de extractos de cerebro de rata,

describiéndose como quinasas citoplasmática activadas por calcio y reguladas por
fosfolípidos que eran capaces de fosforilar histona y protamina (Takai et al., 1977). El
mismo grupo de investigación que realizó su descubrimiento, poco después determinó
que el diacilglicerol (DAG) tiene un papel muy importante en su activación (Takai et al.,
1979). A partir de entonces, estas proteínas se han estado estudiando de manera activa
durante más de cuatro décadas y hoy se consideran como los transductores alostéricos por
antonomasia en la señalización de lípidos como segundos mensajeros (Newton, 1995;
Nishizuka, 1992).
El descubrimiento en su implicación en multitud de enfermedades tales como

cáncer, las ha convertido en una de las dianas terapéuticas más importantes objeto de
estudio de múltiples laboratorios y compañías farmacéuticas. Esto no es de extrañar
teniendo en cuenta que a día de hoy son las quinasas mas estudiadas con diferencia, con
la cifra de más de 60.000 citaciones en PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/), de
las cuales 10.000 están relacionadas con cáncer (Cooke et al., 2017).
25
2. ESTRUCTURA DE LAS PKCs.
Con respecto a su estructura, de forma general, las proteínas PKCs presentan un

dominio catalítico quinasa C-terminal que une ATP y sustratos, y un dominio regulatorio
N-terminal con motivos específicos de unión a membrana y según que isoformas también
a Ca2+, ambas regiones altamente conservadas. Basándose en su estructura primaria y
análisis bioquímico, estas proteínas se pueden dividir en tres subfamilias (Figura I.1),
todas ellas difieren en los cofactores que requieren para su activación (Steinberg, 2008):
• PKC clásicas o convencionales (cPKCs): PKCα, PKCβI y PKCβII, PKCγ.

Requieren calcio, DAG (diacilglicerol) y PS (fosfatidil serina) para su activación.
• PKC nuevas (nPKCs): PKCε y PKCη; PKCδ y PKCθ. Solo requieren DAG
para su activación.
• PKC atípicas (aPKCs): PKCζ y PKCι (humano)/ λ (ratón). No requieren ni

calcio ni DAG ni PS para su activación.
Figura I.1. Clasificación clásica de las PKCs. Esquema donde se representa la organización estructural de
los principales dominios de cada una de las isoformas de las PKCs clásicas, nuevas y atípicas. Se muestran
los dominios C1A, C1B, C2, PS (pseudosustrato), V3 (bisagra), C3 y C4 (dominio catalítico) y región
variable V5. También se muestra con una P roja los sitios consenso de fosforilación en el Loop de
activación, Turn Motif y motivo hidrofóbico. Se indica los sitios de fosforilación T500, T641 y S660
conservados para la cPKC, PKCβII. En la zona de la derecha, se muestra el grado de respuesta por parte de
los dominios C1 y C2 para las diversas PKCs por parte de los activadores DG, PS, Ca2+ y PIP2, siendo (++)
el máximo grado de respuesta y (-) una respuesta nula (Corbalán-García & Gómez-Fernández, 2006;
Steinberg, 2008).
Además del esquema clásico, algunos autores introducen un cuarto grupo de

clasificación de las isoenzimas PKCs. Este es el de las quinasas relacionadas con PKC
26
(PKN), concretamente hasta la fecha hay descritos 3 tipos: PKN1, PKN2 y PKN3 (Pearce
et al., 2010).
2.1 REGIÓN REGULADORA.
La región reguladora mantiene la proteína en un estado inactivo mediante su unión

al dominio catalítico (Corbalán-García & Gómez-Fernández, 2006). Cabe destacar la
región pseudosustrato (PS) situada en el extremo N-terminal y que precede al dominio
C1 en todas las familias de PKCs (Figura I.1). Se trata de una región autoinhibidora con
una región consenso de fosforilación, donde la región fosfoaceptora Serina/Treonina está
reemplazada por una alanina. Esta región pseudosustrato, controla la actividad quinasa
mediante la ocupación y el bloqueo del bolsillo de unión al sustrato en ausencia de una
señal activadora, manteniendo una conformación cerrada-inactiva (Orr & Newton, 1994;
Soderling, 1990).
Los dominios regulatorios de las PKCs nuevas (nPKCs) y convencionales

(cPKCs) contienen un doble dominio C1 (C1A y C1B). Estos dominios C1,
estructuralmente son dedos de zinc y cada uno presenta seis cisteínas y dos histidinas que
coordinan dos iones Zn2+, que son fundamentales para su correcta función y plegamiento.
Los dominios C1 le otorgan la capacidad de unir DAG (diacilglicerol) y el potente
promotor de tumores PMA (forbol-12-miristato-13-acetato) en el mismo lugar donde se
une el diacilglicerol (Das & Rahman, 2014).
Por otro lado, las nPKCs y las cPKCs, presentan un dominio C2 que permite la
unión a fosfolípidos aniónicos. Estos dominios C2 son capaces de coordinar de 2 a 3 iones
calcio, lo que provoca cambios electrostáticos y conformacionales en su estructura. Este
dominio esta formado por 8 láminas beta antiparalelas distribuidas en forma de barril
beta. En el caso de las cPKCs, su dominio C2 se une con una preferencia moderada a
lípidos tales como PS de una manera Ca2+ dependiente y de manera mucho más fuerte y
específica a lípidos como PIP2. En las cPKCs, el dominio C2 se encuentra a continuación
del dominio C1, lo que hace que estas isoformas sean sensibles a su activación por Ca2+.
Por su parte, el dominio C2 de las nPKCs que precede al doble dominio C1, no sensible
a calcio, ni capaz de unirse de manera específica a membrana (Bell & Burns, 1991;
27
Corbalán-García et al., 2007; Johnson et al., 2000; Mellor & Parker, 1998; Newton, 2001;
Nishizuka, 1992; Ohno & Nishizuka, 2002; Ron & Kazanietz, 1999; Sharkey et al., 1984).
Con respecto a las aPKCs, no contienen un dominio C2 (por lo que no responden

a calcio) y presentan un único dominio C1 atípico que no es sensible ni a DAG ni a PMA,
pero sí es capaz de interaccionar con ceramida. Además, presentan un dominio de tipo
PB1 (Phox and Bem 1) localizado en su extremo N-terminal y que media interacción
proteína-proteína con otras proteínas de soporte estructural que contienen el mismo tipo
de dominios PB1, tales como p62, partitioning defective-6 (PAR-6) y MEK. La actividad
de las aPKCs está regulada principalmente por la interacción entre proteínas y la
fosforilación por medio de quinasa-1 dependiente de fosfoinosítido (PDPK1), que al igual
que las PKC es una AGC quinasa (Moscat & Diaz-Meco, 2000; Moscat et al., 2006).
Por otro lado, las PKN comparten un modo de regulación alostérico dependiente
de proteínas G y contienen un dominio denominado región de homología 1 (HR1) en
lugar del dominio PB1. Junto al dominio HR1, en su región reguladora presentan un
dominio C2 no sensible a calcio y a continuación presentan el dominio catalítico de
actividad quinasa. En la activación de las PKN interviene la interacción bivalente de los
dominios HR1 y HR2 presentes en las proteínas GTPasas Rho o Rac que promueven su
activación mediante la liberación de su dominio pseudosustrato (Flynn et al., 1998;
Shibata et al., 1996).
2.2 DOMINIO BISAGRA. REGIÓN V3.
El dominio regulatorio se encuentra unido al dominio catalítico por una región

denominada región bisagra (Figura I.1). El dominio bisagra de algunas PKCs se ha visto
que es diana de rotura por medio de caspasas a través de interacciones proteína-proteína.
Las PKCs δ, θ, ε y ζ son sometidas a rotura dependiente de caspasas en respuesta a un
amplio rango de señales apoptóticas. Por su parte, por ejemplo, las PKCs PKCλ y PKCι
no tienen secuencias de homología con las regiones bisagra de las PKCs que si se someten
a dicho corte y por lo tanto carecen de esta característica (Frutos et al., 1999; Steinberg,
2008).
28
El corte de la región bisagra resulta en la liberación del dominio catalítico que se

libera de la regulación autoinhibitoria de la conformación completa de la PKC. Aunque
este modelo se ha asociado a una activación automática de PKC, el modelo es válido solo
si los dominios quinasas ya son intrínsecamente óptimos para su actividad, lo que
conlleva señalizaciones adecuadas en el entorno celular y las fosforilaciones en los sitios
claves de activación (Hamaguchi et al., 2003; Smith & Smith, 2002). Este domino
también tiene un papel importante en la interacción con otras proteínas tales como βI
integrina, en la regulación de la quimiotaxis y migración (Ng et al., 1999; Parsons et al.,
2002).
2.3 DOMINIO CATALÍTICO QUINASA.
Figura I.2. Regiones consenso claves conservadas en diversas isoenzimas de las PKCs dentro del dominio
catalítico (Steinberg, 2008).
El dominio catalítico (Figura I.2), por su parte, contiene el sitio de unión a ATP,
los sitios consenso de fosforilación, interacciona con el sustrato y es responsable de la
actividad fosfotransferasa (Steinberg, 2008). En su estructura podemos diferenciar dos
subdominios o lóbulos, con el sitio activo localizado en la hendidura entre ambos lóbulos:
- Un lóbulo pequeño N-terminal, compuesto por 5 láminas beta y una hélice α

prominente denominada hélice αC. Esta es la región característica rica en glicinas que
une ATP, con la secuencia consenso GXGXXG. En esta región, también destaca una
lisina invariable que tiene importancia en la estructura para la transferencia del grupo
fosfato.
29
- Por su parte, el lóbulo mayor se denomina lóbulo C (por su posición relativa en

C-terminal) y es predominantemente de tipo α hélice, donde se localizan diferentes
regiones con un papel en la activación y regulación de las PKCs. Concretamente,
encontramos el loop de activación que posiciona el magnesio y los péptidos sustrato para
la catálisis y se encuentra seguido del dominio V5 en el extremo N-terminal. El loop de
activación, es una región conservada de 20 a 30 aminoácidos localizado en la hendidura
del dominio quinasa. Esta zona es flexible, asume una diferente orientación en el estado
activo e inactivo de la enzima y forma parte de la superficie de unión al sustrato (Huse &
Kuriyan, 2002; Newton, 2003). Un residuo gatekeeper localizado en la secuencia que
conecta ambos lóbulos del dominio quinasa, controla el acceso a una cavidad preexistente
en el bolsillo de unión a ATP. Este residuo está conservado como un aminoácido
hidrofóbico en el quinoma humano (Denzel et al., 2003).
De forma clásica dentro de este dominio catalítico, también se emplea la

nomenclatura de dominio C3 y dominio C4 dentro del dominio quinasa para referirse
respectivamente al lóbulo de unión a ATP y al lóbulo de unión al sustrato (Newton, 1995).
2.4 REGIÓN V5.
También cabe destacar otra región en la estructura de las PKC y es el dominio V5

(variable 5) (Figura I.1). Esta región consiste en un tramo de 50 a 70 aminoácidos
localizado en el extremo C-terminal, en el centro catalítico de la enzima, que contienen
los sitios conservados turn motif y la región hidrofóbica (regiones que son diana de
importantes fosforilaciones postraduccionales en la activación de la proteína). Además,
esta zona presenta de 7 a 12 residuos en el extremo carboxilo que son muy variables en
extensión y presenta secuencias muy específicas dependiendo de la isoforma de la PKC.
Estas regiones altamente variables en C-terminal, se han explotado como epítopos para
desarrollar anticuerpos específicos para las distintas isoformas de estas quinasas. Aunque
al inicio del estudio de las PKCs esta región V5 fue hasta cierto punto ignorada, hoy en
día ha cobrado más importancia ya que se ha visto que tiene importancia en la función
concreta de isoformas reconociendo de manera específica a determinados sustratos. Esto
sugiere a su vez, que estas regiones pueden representar dianas terapéuticas de gran interés
ya que son regiones muy importantes en la función de las PKCs y además muy específicas
30
en cada isoenzima (Ferreira et al., 2012; Ferreira et al., 2011; Kim et al., 2008; Kim et al.,
2011; Palaniyandi et al., 2011; Yang & Igumenova, 2013).
Varios estudios en la literatura actual sugieren que esta región V5 juega al menos
tres papeles fundamentales dentro de las PKCs: estabiliza el subdominio quinasa por
medio de interacciones intramoleculares con su región N-terminal (Grodsky et al., 2006;
Leonard et al., 2011; Takimura et al., 2010), participa en las interacciones de tipo
autoinhibitorias junto con los componentes de los dominios regulatorios en N-terminal
(Kazanietz & Lemmon, 2011; Kheifets & Mochly-Rosen, 2007; Solodukhin et al., 2007;
Stensman & Larsson, 2007) y media la localización subcelular de las isoformas de PKC
interaccionando de forma específica con proteínas adaptadoras especificas de cada
isoforma (Stebbins & Mochly-Rosen, 2001).
En el estado no activo de la enzima, la región V5 ocupa la región catalítica de la

enzima previniendo su activación por DAG (Newton, 2003). Debido a que esta región es
muy flexible no hay información estructural al respecto, aunque hay estudios que
predicen que adopta una estructura en forma de lámina beta (Kheifets & Mochly-Rosen,
2007).
3. MODELO CLÁSICO DE ACTIVACIÓN DE LAS cPKCs.
El mecanismo tradicional de activación de las cPKCs se basa en los estudios de la

PKCα que, de forma basal, se encuentra en reposo en el citosol. Las proteínas quinasas C
se activan para fosforilar sus sustratos cuando sus dominios regulatorios se encuentran en
un entorno de señalización propicio. Todas estas señales desencadenan la liberación de la
secuencia pseudosustrato del sitio activo, permitiendo el acceso del sustrato al bolsillo
del dominio catalítico. En el caso de las cPKCs, las señales son DAG, Ca2+ y fosfolípidos
(Mochly-Rosen et al., 2012).
Las isoenzimas PKCs se activan por una variedad de hormonas (tales como
adrenalina o angiotensina), factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento
epidérmico e insulina) y neurotransmisores (como dopamina y endorfina). Todos estos
estimulantes, cuando se unen a sus respectivos receptores de membrana, activan a
31
miembros de la familia de las fosfolipasas C (PLC) que hidrolizan PIP2 (fofatidilinositol-

4,5-bifosfato) un fosfolípido de membrana, generando DAG e IP3 (inositol-1,4,5-
trifosfato). DAG es un lípido que actúa como segundo mensajero y es necesario para
anclar las PKCs a la membrana a través de su dominio C1. Hay que recordar que, como
se ha comentado anteriormente, algunas isoformas de las PKC no solo requieren de DAG
pero también de Ca2+ para su activación (Takai et al., 1979). Los niveles de calcio
aumentan en el citosol debido a que junto con el DAG también se genera IP3, que
favorece la liberación de calcio mediante su interacción con los canales de calcio del
retículo endoplasmático. Este aumento de DAG y calcio promueven las PKCs a su
translocación a la membrana donde interaccionan con sus proteínas de anclaje, receptores
de quinasas C activadas (de sus siglas en inglés, RACK) (Csukai & Mochly-Rosen, 1999)
(Figura I.3).
Una vez la proteína PKC se ha plegado correctamente mediante la colaboración

de la chaperona Hsp90 y de su co-chaperona Cdc37, puede ser fosforilada por las quinasas
mTORC2 y PDK-1, previo a la unión a la membrana plasmática (Gould et al., 2009).
Primero, tiene lugar una unión débil electrostática a la membrana, pero una vez que se
acerca y se ancla a la membrana, la proteína PKC difunde en el plano de la bicapa, donde
el dominio C1A interacciona con DAG. La PS y el PIP2 de membrana, a través de un
primer contacto del dominio C2 con la bicapa lipídica, juegan un papel importante
permitiendo la disrupción de la unión electrostática entre los dominios C1 y C2. De esta
manera, se acaba liberando el dominio C1 para su unión con DAG. Esta primera
interacción con DAG se puede considerar débil, y es cuando se coordinan los dos
dominios C1 y C2 cuando se produce una unión más fuerte a la membrana y desencadena
un cambio estructural en la proteína, que libera el dominio auto-inhibitorio
pseudosustrato del bolsillo de unión al sustrato y produce la activación de la PKC. Una
vez unida a RACK y a los lípidos de membrana (y a calcio en las isoformas que lo
requieren), PKC está activada y llevará a cabo fosforilaciones en diversos sustratos
cercanos que desencadenarán una serie de respuestas celulares aguas abajo (Figura I.3)
(Corbalán-García & Gómez-Fernández, 2014; Mochly-Rosen et al., 2012; Newton,
2018).
32
Figura I.3. Modelo de activación de las cPKCs. Se puede observar como la proteína PKC se puede unir a
la membrana por medio del reconocimiento de lípidos sin la necesidad de estar activada. Una vez PKC está
activada por medio de las fosforilaciones claves en su estructura por medio de mTORC2 y PDK-1 en los
sitios clave turn motif, motivo hidrofóbico y loop de activación, así como cuando se encuentra en el entorno
adecuado con Ca2+, DAG y PIP2 disponible, es capaz de anclarse a la membrana en un estado activado y
llevar a cabo la fosforilación de sustratos cercanos desencadenando la señalización aguas abajo (Newton,
2018).
También hay estudios que demuestran que el PIP2 por sí solo juega un papel clave
en el anclaje a membrana y activación de las PKCs a partir del dominio C2 de ciertas
isoenzimas de las cPKCs, pudiendo liberarse la región pseudosustrato sin la colaboración
con los dominios C1 (Corbalán-García & Gómez-Fernández, 2014).
4. FOSFORILACIONES CLAVES EN LA ACTIVACIÓN DE LAS PKCs.
Es importante resaltar que las proteínas quinasas C ganan su actividad catalítica y

son competentes para responder a lípidos de membrana que actúan de segundos
mensajeros, después de ser sometidas a 3 fosforilaciones secuenciales en su dominio
catalítico en el caso de las cPKCs y nPKCs y 2 fosforilaciones en el caso de las aPKCs y
PKNs (Figura I.4) (Messerschmidt et al., 2005; Parekh et al., 2000).
Centrándonos en las cPKCs y las nPKCs, estos dominios de fosforilación están

muy conservados entre todos los miembros de la familia de las PKCs. La primera
fosforilación, ocurre en la Ser/Thr del loop de activación cerca de la entrada al sitio activo
del núcleo quinasa, por medio de la proteína quinasa-1 dependiente de 3-fosfoinosítido
33
(PDK1). Esta fosforilación introduce una carga negativa que alinea los residuos del
bolsillo catalítico y estabiliza la conformación activa de la enzima (Chou et al., 1998; Le
Good et al., 1998). Una vez PDK1 ha llevado a cabo su fosforilación, debe liberarse del
extremo C-terminal para producirse la maduración completa de la enzima. Esta primera
fosforilación, desencadena otras dos fosforilaciones ordenadas en el extremo C-terminal
de la proteína en la región V5. La segunda fosforilación ocurre en el turn motif
(denominado así porque el sitio de fosforilación se encuentra en el apéndice de un giro
en la estructura) y la tercera, en el motivo hidrofóbico (denominado de esta manera
porque el sitio de fosforilación está flanqueado por residuos hidrofóbicos) por medio del
complejo de rapamicina 2, mTORC2 (Facchinetti et al., 2008; Ikenoue et al., 2008).
Figura I.4. Localización de las 3 fosforilaciones representadas en un modelo tridimensional, que se tienen
que producir para generar una conformación activa de las PKCs. Las regiones de fosforilación se encuentran
rodeadas en rojo. 1. Loop de activación. 2. Turn motif. 3. Motivo hidrofóbico (Pearce et al., 2010).
34
Con respecto a esta dos últimas fosforilaciones, aún quedan dudas del mecanismo
exacto que las lleva a cabo puesto que también hay evidencias previas de que se puede
producir por un mecanismo de autofosforilación de la misma proteína (Newton, 2003;
Parekh et al., 2000). Sin embargo, está cobrando más importancia la involucración del
complejo mTORC2 en estas últimas fosforilaciones. Estas modificaciones favorecen la
transición de un estado latente inactivo de las PKCs a un estado catalíticamente activo de
la proteína (Newton, 2018).
5. INFORMACIÓN ESTRUCTURAL ACTUAL DE LAS PKCs Y NUEVOS

MODELOS DE ACTIVACIÓN PROPUESTOS.
A nivel estructural, cabe destacar que hoy en día, aunque existe mucha
información de una gran variedad de fragmentos provenientes de diversas isoformas de
las PKCs, no existe en la literatura la estructura en su conformación completa de ninguna
de las isoenzimas que conforman la familia de las PKCs. Se han resuelto las estructuras
por separado de los dominios catalíticos de las PKCs βII, θ y ι (Grodsky et al., 2006;
Messerschmidt et al., 2005; Takimura et al., 2010; Xu et al., 2004), el dominio C2 de las
PKCs α, βII, δ, η and ε (García-García et al., 2001; Guerrero-Valero et al., 2009; Littler
et al., 2006; Pappa et al., 1998; Sutton & Sprang, 1998; Verdaguer et al., 1999) y los
dominios C1 de las PKCs α (Hommel et al., 1994), γ (Xu et al., 1997) y δ (Zhang et al.,
1995) por sí solas o unidas a análogos de éster de forbol. Esta información ha sido difícil
de integrar debido a la dificultad que entraña la cristalización de las PKCs en su
conformación completa. Además de los retos que suponen de por sí la cristalización de
proteínas flexibles multidominio, las muestras de PKCs adecuadas para cristalización
deben estar estequiométricamente fosforiladas en el loop de activación, el turn motif y el
sitio hidrofóbico. También se debe evitar la proteólisis de la región denominada V3 que
conecta el dominio catalítico y regulatorio. Por otro lado, para ciertas isoformas, se
requieren de iones Zn2+ para mantener el dominio C1 estable. Adicionalmente, estas
proteínas son altamente asimétricas lo que dificulta su inclusión en unidades de repetición
simétricas que cristalicen de forma adecuada. Además de que son estructuras
multidominio que pueden adoptar multitud de conformaciones (Leonard et al., 2011).
Hasta la fecha, la estructura más completa resuelta de la familia de las PKCs se

corresponde con la isoenzima PKCβII. La estructura de esta proteína PKCβII se
35
determinó a una resolución de 4 Å por medio de la técnica de cristalografía de rayos X

(Figura I.5), donde se reveló una inesperada conformación de un estado intermedio en el
proceso de activación. En este modelo intermedio de activación la región estructural
NFD, no comentada hasta el momento, juega un papel muy importante. Esta región NFD
es una zona de conexión entre el dominio catalítico y el sitio de fosforilación del turn
motif, que a nivel estructural adopta una forma predominantemente de alfa hélice (Figura
I.5) (Leonard et al., 2011).
Figura I.5. Representación estructural del cristal procedente de PKCβII conseguido por el grupo de
investigación de Hurley y Leonard. Los dominios que se pudieron determinar por medio de cristalografía
de rayos X con resolución atómica fueron el dominio C1B, el dominio C2, el dominio quinasa y la región
C-terminal. El dominio C1A, la región pseudosustrato y regiones de conexión entre regiones no se pudo
resolver con resolución atómica (< 4 Å) (Leonard et al., 2011).
La estructura resuelta por el grupo de Leornard, Hurley y colaboradores, sin

embargo, planteaba un problema que alentó el debate dentro de la comunidad científica.
36
Esto era que, la densidad electrónica de esta isoenzima resultó muy clara para los
dominios C1B y C2, para el dominio quinasa y el tallo C-terminal. Sin embargo, la
estructura carecía de una densidad electrónica adecuada para resolver de forma clara la
región pseudosustrato, el dominio C1A, así como cualquiera de las regiones de conexión
que unen unos dominios con los otros. Esto hizo difícil determinar que módulos proteicos
correspondían a un polipéptido y a su unidad asimétrica correspondiente, lo que abría la
puerta a la interpretación de la información estructural dentro del cristal a dos posibles
conformaciones (Leonard et al., 2011).
De cualquier manera, la determinación estructural multidominio de PKCβII

supuso un hito científico para la familia de las PKCs, que para la fecha en la que se
determinó, estaba siendo sujeta a un estudio como diana farmacológica contra la diabetes,
concretamente usando el fármaco ruboxistaurina (Das Evcimen & King, 2007).
En este modelo intermedio de activación, el grupo de Hurley y Leonard propone

a raíz de su investigación estructural (Kazanietz & Lemmon, 2011), que el sitio quinasa
activo está accesible al sustrato. Aun así, este estado semi-abierto activo, se corresponde
a un estado de baja actividad puesto que el residuo Phe629 de la cadena lateral del sitio
de unión a ATP del dominio NFD, está separado del sitio activo y unido en estrecho
contacto al dominio C1B y dominio catalítico, manteniéndose así un estado inactivo. El
residuo Phe629 de este dominio se sabe que normalmente forma parte del sitio activo y
se une a la adenina del ATP en la conformación catalíticamente activa de las PKCs
(Takimura et al., 2010). De esta manera, la estructura quedaría de tal modo que el dominio
C1B interacciona con la hélice NFD en una conformación de baja actividad, que se
revierte a una completa actividad cuando la proteína interacciona con la membrana. Así,
el dominio NFD que se sitúa en la región C-terminal de las AGC quinasas funcionaría
como una región moduladora en estrecho contacto con el dominio C1B (Figura I.6).
37
Figura I.6. A) En la figura se puede ver a nivel de representación de estructura primaria la localización del
motivo NFD en la región C-terminal. B) Por otra parte, en la zona inferior, se puede ver a nivel
tridimensional como el dominio C1B se encuentra abrazado por la hélice NFD en este modelo intermedio
de activación (Kazanietz & Lemmon, 2011).
Una vez que la proteína se une a la membrana, en primer lugar, el dominio C1A
interaccionaría con DAG, lo que ayudaría a la liberación de la región pseudosustrato del
bolsillo catalítico de la enzima. Posteriormente, la unión de una segunda molécula de
DAG al dominio C1B resultaría en la recolocación del residuo Phe629 de la hélice NFD
en su posición catalíticamente activa, lo que llevaría a la PKC a su conformación
completamente activa y realizaría las fosforilaciones pertinentes de sus dianas celulares
y la subsecuente señalización aguas abajo (Figura I.7).
38
Figura I.7. Se muestra de forma esquemática el modelo completo de activación de las cPKCs propuesto por
el grupo de Leonard y Hurley. En primer lugar, el dominio C2 de la proteína PKC se uniría a la membrana
por medio de su unión a PIP2 y PS en coordinación con Ca2+. Posteriormente, la unión secuencial de los
dos dominios C1A y C1B a DAG de membrana, produciría una recolocación en la estructura liberando el
dominio NFD. De esta manera, el residuo Phe629 quedaría libre en el sitio catalítico para su unión a ATP
en el proceso de fosforilación (Leonard et al., 2011).
Teniendo en cuenta lo comentado anteriormente, la disposición simétrica en el

cristal revelaba dos posibles formas de contacto entre el dominio C2 y el dominio
catalítico (Antal, Callender, et al., 2015). Uno de estos modelos, involucraba una
conformación abierta en el que el dominio C2 se encuentra separado del núcleo quinasa
en un estado intermedio de activación de PKC, donde los investigadores proponen una
serie de uniones intramoleculares, con una importancia en el modelo de activación de la
enzima (Kazanietz & Lemmon, 2011; Leonard et al., 2011). Y, por otro lado, un segundo
modelo más cerrado con una interacción intramolecular del dominio C2 con el dominio
quinasa. En un primer momento el grupo de Leonard y Hurley descartó este segundo
modelo, ya que según su hipótesis esto crearía un impedimento estérico del dominio C2
con el dominio catalítico. Definiéndolo así, como biológicamente irrelevante (Figura I.8).
Sin embargo, en la literatura, distintos investigadores demuestran que ese modelo,

en el que el dominio C2 interacciona con el dominio catalítico, es posible (Banci et al.,
2002; Conrad et al., 1994; Corbalán-García et al., 2003; Edwards & Newton, 1997a,
1997b; Feng et al., 2000; Kheifets & Mochly-Rosen, 2007). Además, dicho modelo
también estaba apoyado por modelos informáticos de docking por parte del grupo de
investigación de Antal y colaboradores, así como por toda la bibliografía citada
39
anteriormente, donde por ejemplo ensayos de mutagénesis sobre dichas regiones

demostraban que estas interacciones intramoleculares son posibles (Antal, Callender, et
al., 2015). Todo esto reavivó el debate sobre si verdaderamente el modelo estructural que
propuso Leonard y colaboradores era el modelo relevantemente biológico y explicaba de
forma correcta el modo por el cual esta isoenzima se activa.
Figura I.8. Dos posibles interpretaciones del cristal procedente de la investigación de Leonard et al. Modelo
1. Conformación abierta (Leonard et al., 2011). Modelo 2. Conformación cerrada (Antal, Callender, et al.,
2015). Estructuras realizadas por medio de PyMOL.
En este nuevo modelo basado en el re-análisis de la estructura previa de la proteína

PKCβII (Figura I.8, Modelo 2), se propone una nueva superficie de contacto
intramolecular de auto-inhibición para asegurar el estado cerrado inactivo en ausencia de
señales externas y activadores. En este modelo, no solo la región pseudosustrato se
encuentra cerrada sobre la estructura, si no que, además, el dominio C2 se cierra también
sobre el dominio catalítico interaccionando directamente con el dominio quinasa y el tallo
C-terminal. El grupo de investigación de Antal y colaboradores apoyó además su teoría
por medio de programas informáticos de modelado y por medio de estudios de
mutagénesis dirigida en estas regiones de contacto. Así se analizó que los residuos D382
del dominio catalítico y E655 del tallo C-terminal interaccionan con los residuos del
dominio C2, K209 y K205 respectivamente. Estas interacciones por medio de puente de
40
hidrógeno la primera y electroestática la segunda, serían claves para mantener el estado

cerrado de la proteína (Figura I.9) (Antal, Callender, et al., 2015).
Figura I.9. Modelo de activación de las cPKCs propuesto por el grupo de investigación de Antal y Hudson
(Antal, Hudson, et al., 2015). Una vez activada la PKC por medio de las fosforilaciones clave (B), junto
con las señales adecuadas tales como la presencia de Ca2+, la proteína se une a la membrana a través del
dominio C2 donde el PIP2 juega un papel clave (C). En este paso, el dominio C2 se separa del dominio
catalítico para interaccionar con PIP2 de membrana. Posteriormente (D), las uniones del dominio C1A y
C1B a DAG de membrana producen cambios conformacionales que terminan de abrir el sitio activo,
separando la región pseudosustrato del sitio auto-inhibitorio para promover la actividad quinasa.
Con toda esta información, se planteó un modelo de activación para las isoenzimas
clásicas (Figura I.9) en el que en primer lugar la proteína fosforilada se encuentra en un
estado cerrado semi-activo, donde el dominio C2 interacciona con el dominio catalítico
de la proteína, así como el dominio pseudosustrato también se encuentra en contacto con
el bolsillo de unión al sustrato. Cuando el calcio se une al dominio C2 y este dominio
interacciona con la membrana, esto empuja el equilibrio hacia una conformación abierta
donde el dominio C2 se separa del dominio catalítico. Esto es debido a que en estas
circunstancias el dominio C2 interacciona con lípidos aniónicos de membrana (PIP2) y
PS en una forma calcio dependiente. En un segundo paso, la unión del DAG al dominio
C1B reposiciona la región pseudosustrato y la separa del dominio catalítico, generando
41
una conformación totalmente activa de la PKC, abriendo el bolsillo catalítico a la entrada

del sustrato (Antal, Hudson, et al., 2015).
Desde un punto de vista terapéutico, analizar cuales son las interacciones

intramoleculares que tienen lugar de forma natural en las PKCs, es esencial en el diseño
de pequeñas moléculas o péptidos que puedan interferir con estos estados inactivos o
activos de las enzimas, para bien abrir la estructura y activarla o cerrar el dominio a un
estado inactivo según la patología y la actividad de PKC que se desee regular.
6. RACK1 COMO SOPORTE ESTRUCTURAL PARADIGMA DE PKCs.
6.1 ESTRUCTURA DE RACK.
A nivel estructural, RACK1 pertenece a la familia de proteínas que contienen

repeticiones de residuos triptófano (W) y aspartato (D). Estas moléculas reciben el
nombre de proteínas de tipo repetición WD40, debido a que tienen tramos de polipéptidos
de 40 a 60 aminoácidos en los cuales, cada repetición se pliega en una lámina beta
antiparalela de 4 hojas cada una. Esta superestructura se denomina propulsor beta (beta
propeller) (Ruiz Carrillo et al., 2012).
Figura I.10. Estructura básica de RACK1 desde dos perspectivas diferentes. Se muestran los residuos WD
característicos que definen este tipo de estructuras. Los residuos W (azul) y D (cian) se muestran en modo
de esferas en la estructura. Imagen realizada por medio de PyMOL (PDB: 4AOW).
42
Concretamente, RACK1 presenta 7 láminas beta dispuesta alrededor de un eje

central, en forma de toroide (su estructura se asemeja a un cilindro con un canal central
que atraviesa la molécula de forma paralela). Cada lámina beta contiene una secuencia
donde hay un triptófano muy conservado, donde el grupo indol se encuentra embebido
entre dos láminas adyacentes. Su estructura se determinó en 2012 por medio de
cristalografía de rayos X (Figura I.10) (Ruiz Carrillo et al., 2012).
6.2 RACK1 COMO SOPORTE ESTRUCTURAL PARA LAS PKCs.
RACK1 es una proteína de 37 kDa expresada de forma ubicua en mamíferos

(Chou et al., 1999) y que está involucrada en señalización celular (Ron et al., 1999),
crecimiento (Hermanto et al., 2002) y desarrollo (McLeod et al., 2000). RACK1 tiene una
localización citosólica (Yarwood et al., 1999) y nuclear (Ron et al., 2000) y está
desprovista de actividad enzimática. Las proteínas RACK empezaron a recibir mucha
atención una vez se vio su relación con las proteínas PKCs. De hecho, la principal
característica de RACK1 es funcionar de soporte estructural para este tipo de proteínas,
facilitando la formación de complejos supramoleculares (Adams et al., 2011).
La capacidad de anclar proteínas de RACK1 ha sido extensamente documentada

y además de PKC (Stebbins & Mochly-Rosen, 2001), se han visto más de 80 proteínas
con las que son capaces de interaccionar tales como la fosfodiesterasa específica de AMP-
cíclico (PDE4D5) (Yarwood et al., 1999) y la tirosina quinasa Src (Mamidipudi et al.,
2004; Yaka et al., 2003). Además, RACK1 puede actuar como cofactor enzimático y
como una proteína lanzadera para las proteínas con las que interacciona (Ron et al., 1999).
6.3 RACK1 EN LA ORGANIZACIÓN ESPACIAL Y TEMPORAL DE

PROTEÍNAS
La organización espacial y temporal en la transducción de señales, es esencial para

determinar la velocidad y precisión de los eventos de señalización que tienen lugar. En
este caso, las proteínas adaptadoras son fundamentales en la organización de enzimas de
señalización cerca de los sitios donde se encuentran sus sustratos y lejos de otros para
optimizar la precisión y velocidad de los procesos celulares. En este apartado, nos
centramos en el papel de las proteínas adaptadoras RACK que determinan la función
43
específica de las proteínas quinasas C (PKCs). Como se ha comentado anteriormente, las

proteínas de los receptores de quinasas C activadas (RACK), son una familia de proteínas
asociadas a membrana que ayudan a anclar a las PKCs a la bicapa lipídica. Así, estas
proteínas RACK actúan como soportes estructurales para localizar a las PKCs en
determinados microdominios de membrana en proximidad con sus activadores alostéricos
y sustratos intracelulares concretos (Csukai & Mochly-Rosen, 1999).
El grupo de investigación de Mochly-Rosen, propuso que las células son capaces

de expresar un único tipo de proteína RACK (con determinadas localizaciones
subcelulares) para cada isoenzima de las PKCs y, que las interacciones entre PKC-RACK
son esenciales para las respuestas celulares específicas de isoformas. Hasta la fecha,
proteínas con estas características (enzimas que se unen de manera selectiva solo a la
conformación activada de las PKCs y reclutan la proteína a un determinado
compartimento de la membrana), solo se han identificado para PKCβ (RACK1) y PKCε
(RACK2 o Beta-COP). En el caso de RACK1 no solo une PKCβII, pero también la SRC
tirosina quinasa, integrina y fosfodiesterasa. En el caso de RACK2, la proteína RACK
específica de PKCε, es una proteína que se encuentra en la cubierta de vesículas y está
involucrada también en la liberación del contenido vesicular y en la comunicación célula-
célula (Csukai et al., 1997; Mackay & Mochly-Rosen, 2001; Schechtman & Mochly-
Rosen, 2001).
Como se ha comentado, estas proteínas RACK comparten 7 motivos estructurales

repetidos de tipo WD40, similares a los dominios de interacción proteína-proteína que se
encuentran en las subunidades beta de las proteínas G heterotriméricas. En el caso de
RACK1, el sitio de unión a la PKCβ (SIKIWD) se localiza en el sexto motivo WD40 y
es homólogo en secuencia en otras 3 repeticiones WD40 en esta proteína (Ron & Mochly-
Rosen, 1995). Las proteínas RACK no son únicamente adaptadores para proteínas PKCs,
sino que además también funcionan como proteínas adaptadoras para otras enzimas de
señalización. Teniendo en cuenta que algunas de las proteínas con las que interacciona
RACK, tales como las PKCs, tienen un papel fundamental en el crecimiento celular, la
modulación de la interacción con las proteínas RACK puede ayudar a elucidar las rutas
de señalización intrínsecas en procesos de crecimiento celular y podrían ayudar además
al desarrollo de nuevas dianas terapéuticas en la lucha contra el cáncer (Duff & Long,
2017; Schechtman & Mochly-Rosen, 2001).
44
6.4 INTERACCIÓN DE RACK CON PKC.
Las proteínas RACK son capaces de interaccionar con las PKCs a través del
dominio C2. En el caso de PKCβ, el sitio de unión de RACK1 al dominio C2 de la PKC
se determinó por análisis de homología con sinaptotagmina (Mochly-Rosen et al., 1992),
otra proteína que contiene dominios C2 y es capaz de interaccionar con RACK1 (aunque
con una interacción 100 veces de menor afinidad). Las tres regiones que se predijeron
para interaccionar con RACK van desde los aminoácidos 186-198 (sitio βC-1
MDPNGLSDPYVKL), 209-216 (sitio βC-2 KQKTKTIK) y 218-226 (sitio βC-3
SLNPEWNET) (Banci et al., 2002; Kheifets & Mochly-Rosen, 2007).
En el caso de la PKCε, se determinó también que además del dominio C2, la

región V1 localizada aguas arriba del dominio C2 tiene un papel fundamental en la
interacción con la proteína RACK. En este caso, las conclusiones se determinaron
mediante el uso de péptidos que se unían de manera concreta a ciertas regiones de PKC.
Así, se determinó que cuando estos péptidos bloqueaban esta región V1, la unión se veía
drásticamente disminuida (Csukai et al., 1997).
Como se ha comentado anteriormente, la región V5 C-terminal también tiene un

papel clave en la unión PKC-RACK (Stebbins & Mochly-Rosen, 2001).
De esta manera, se puede concluir que, aunque no se conoce de forma clara el
mecanismo de interacción entre RACK-PKC, diversas regiones de las PKCs son capaces
de coordinar la unión con la proteína RACK. La determinación estructural de PKC en
complejo con RACK podría ser clave para desentrañar la naturaleza de esta interacción.
6.5 RACK1 COMO DIANA TERAPÉUTICA.
Hasta la fecha, ya se han realizados estudios primarios en células de corazón de

ratones donde diversas isoenzimas de PKC tiene papeles claves. Concretamente,
estudiando PKCε en cardiomiocitos de cultivos de células de ratón, para la que se conoce
que tiene un papel importante en el crecimiento del miocardio, se han desarrollado
péptidos que mimetizan el sitio de unión a RACK y que se unen por tanto de forma
específica a PKC (péptidos activadores, denominado péptidos pseudo-RACK o
ψεRACK). Por otro lado, también se han estudiado péptidos que mimetizan el sitio de
45
PKC que interacciona con RACK y que se unen a RACK para impedir su unión con PKC
(péptidos inhibidores, denominados péptidos εV1) (Figura I.11) (Kheifets & Mochly-
Rosen, 2007; Mochly-Rosen et al., 2000; Palaniyandi et al., 2009).
Figura I.11 Un ejemplo de RACK como diana terapéutica. El uso de péptidos activadores o inhibidores se
pueden emplear como terapia para alterar la actividad normal de PKC (A). Se pueden desarrollar péptidos
que activan las PKCs (B) o bien péptidos que inhiben la actividad de las PKCs (C) y que pueden tener una
gran importancia en la lucha contra diversos tipos enfermedades, tales como afecciones cardiológicas
(Palaniyandi et al. 2009). En gris se representa el estado inactivo de PKC y en azul el estado activado de
PKC para cada uno de los eventos descritos.
Aunque todavía queda un gran camino que avanzar en los ensayos clínicos, esto
podría tener una gran importancia para diversas enfermedades cardiovasculares (fallo
cardiaco, hipertrofia cardiaca, fibrosis del miocardio e inflamación del miocardio) donde
se ha visto que diversas isoenzimas de PKC pueden estar sobreexpresadas o bien con una
expresión más baja que en tejidos sanos (Belin et al., 2007; Braz et al., 2004; Churchill
et al., 2008; Olson et al., 2008; Vijayan et al., 2004).
Actualmente, se han desarrollado también estudios con este tipo de péptidos con
la zona de reconocimiento de PKC-RACK como diana para estudiar otros tipos de
alteraciones tales como diabetes, enfermedades inmunológicas o cáncer (Kheifets &
Mochly-Rosen, 2007).
46
7. FASCIN1 COMO SUSTRATO PARADIGMA DE PKCs.
7.1 ESTRUCTURA DE FASCIN1.
El genoma de mamíferos codifica para 3 isoformas de Fascin: FSCN1 (Fascin1),

la isoforma en la que nos centramos en este apartado, la más estudiada y ampliamente
expresada en tejido mesenquemático y nervioso. Por otro lado FSCN2 y FSCN3, que
codifican para Fascin2 y Fascin3 y que se expresan de forma específica en células
retinales y testiculares respectivamente (Yamakita et al., 2009).
Figura I.12 Estructura general de Fascin1 (PDB: 1DFC) (Sedeh et al., 2010).
A nivel estructural, Fascin1 pertenece a la familia de proteínas trébol beta y

consiste en 4 repeticiones en tándem del dominio trébol beta (beta-trefoil). Los 4
dominios se empaquetan formando una estructura tetraédrica distorsionada compuesta
por dos lóbulos. Los dominios F1 (residuos 8-139) y F2 (residuos 140-260) forman el
primer lóbulo, mientras que los dominios F3 (residuos 261-381) y F4 (residuos 382-493)
forman el segundo lóbulo (Ponting & Russell, 2000; Sedeh et al., 2010). Cada uno de
estos dominios beta-trefoil están formados por seis dobles horquillas beta (Figura I.12)
(L. Chen et al., 2010).
47
7.2 FASCIN1 Y ORGANIZACIÓN DEL CITOESQUELETO.
Fascin1 es una proteína con un papel muy importante en el citoesqueleto. El

citoesqueleto de F-actina participa de forma activa en las células en un gran número de
procesos celulares como migración, endocitosis y división. En todos estos casos las
células usan un conjunto de proteínas accesorias (entre ellas Fascin1) para regular la
dinámica espacio-temporal de los filamentos de F-actina y conseguir la función celular
adecuada (Adams, 2004).
En el caso de la migración, hay dos tipos de filamentos protusivos de F-actina que

son estructuras claves para dicho proceso: los lamelopodios dendríticos con forma de
láminas (Matsudaira, 1994; Pantaloni et al., 2001; Pollard & Borisy, 2003; Small et al.,
2002) y los filopodios dinámicos con forma de espícula (Faix & Rottner, 2006;
Mallavarapu & Mitchison, 1999; Vignjevic et al., 2006). Fascin1 fue inicialmente
caracterizada como una proteína de 55 kDa de unión a F-actina procedente de extractos
de ovocitos de erizos de mar (Kane, 1975) y es una proteína muy conservada a lo largo
de la evolución con la identificación de ortólogos en un gran número de especies (Duh et
al., 1994). Es interesante destacar que la expresión de Fascin1 humana es baja o incluso
ausente en células epiteliales adultas, pero está altamente expresada en los estados
embrionarios (Grothey et al., 2000; Hashimoto et al., 2005).
Posteriormente, se le asignó un papel fundamental en el ensamblaje de filopodios,

lamelopodios, dendritas y microespículas. Los filopodios permiten a las células que
migran, desplazarse por sus alrededores y determinan la dirección de migración y su
destino final. Dentro de los filopodios, Fascin1 es la principal proteína que hace
entrecruzamiento con los filamentos de F-actina (Machesky & Li, 2010; Otto et al., 1979).
7.3 MECANISMO DE INTERACCIÓN ENTRE FASCIN1 Y F-ACTINA.
Aunque el mecanismo de interacción entre F-actina y Fascin1 aun no está del todo
claro a nivel molecular, se sabe que Fascin1 contiene dos sitios de unión a F-actina
localizados en posiciones N- y C-terminal de la proteína facilitando así la eficacia de
entrelazamiento entre los filamentos adyacentes de F-actina en los filopodios. Estos
48
entrelazamientos, generan a partir de filamentos flexibles de F-actina, paquetes rígidos

ordenados que proporcionan rigidez mecánica (Adams, 2004; Ono et al., 1997; Tilney et
al., 1998). Por medio de técnicas bioquímicas y estructurales, se ha podido ver que
Fascin1 normalmente empaqueta entre 10 y 30 filamentos de F-actina paralelos, para
formar filopodios de entre 60 y 200 nm de espesor (Mattila & Lappalainen, 2008).
Además, también se han podido mapear con exactitud los sitios de interacción entre
Fascin1 y F-actina (Yang et al., 2013).
Mediante un conjunto de ensayos de mutagénesis dirigida, cristalización de rayos

X y tomografía por medio de cryoEM (criomicroscopía electrónica), el grupo de
investigación de Yang (Yang et al., 2013) determinó que Fascin1 (proteína de cuatro
dominios) presenta dos sitios principales y un tercero con menor importancia de unión a
F-actina (Figura I.13).
• El sitio 1 está formado por residuos pertenecientes al dominio 1 y al dominio 4

(donde los residuos K22, K43 y R398 juegan un papel muy importante).
• El sitio 2 está formado por residuos localizados en el dominio 1 y dominio 2 de

Fascin1 (los aminoácidos K150, R151, K313 tienen una función muy importante).
• Y, por último, hay un tercer sitio con menor importancia en la unión, que está
formado por residuos localizados en el dominio 3 (los residuos R271, K353, K358
tienen gran importancia en esta interacción).
49
Figura I.13. Se muestran los principales sitios por los que Fascin1 interacciona con F-actina, mostrados
sobre su superficie (Yang et al., 2013).
7.4 FASCIN1, CITOESQUELETO, METÁSTASIS Y CÁNCER.
Fascin1 tiene un papel clave en mantener los paquetes de F-actina en filopodios,

microvellosidades de ovocitos y dendritas de células dendríticas. Todo ello, juega un
papel directo en migración celular, adhesión a la matriz celular e interacciones célula-
célula. También tiene Fascin1 un papel menor asociado con paquetes de F-actina
citoplasmáticos que ayudan a mantener la arquitectura interna de la célula (Adams, 2004).
Además de tener papeles claves en la formación y mantenimiento de las estructuras ricas
en F-actina de las células, Fascin1 también se ha visto involucrada viéndose aumentada
en expresión en muchos tipos de cáncer. Ello sugiere que esta proteína también puede
contribuir funcionalmente a la progresión de enfermedades, especialmente en cáncer por
medio de la metástasis (Hashimoto et al., 2007).
Para realizar metástasis, las células requieren diseminarse del tumor primario a un
órgano distante, por medio del torrente sanguíneo, y establecer un tumor secundario
mediante la colonización por metástasis (Chaffer & Weinberg, 2011). La remodelación
de los filamentos de actina en el citoesqueleto es muy importante para promover a las
50
células cancerígenas a realizar migración, invasión y diseminación por metástasis. Dentro

de las proteínas alteradas que regulan la F-actina de forma normal, Fascin1 tiene gran
importancia potenciando los mecanismos que caracterizan el cáncer en metástasis
(Adams, 2004; Hashimoto et al., 2005; Machesky & Li, 2010). La sobreexpresión de
Fascin1, se relaciona con cuadros clínicos más críticos y de menor supervivencia en
diferentes tipos de cáncer (L. Chen et al., 2010; Pelosi, Pasini, et al., 2003; Pelosi,
Pastorino, et al., 2003; Puppa et al., 2007; Yoder et al., 2005; Zhao et al., 2014).
7.5 INTERACCIÓN ENTRE FASCIN1 Y PKC.
Además de F-actina, Fascin1 se une a otras proteínas que pueden modular su

actividad y función, y que, de esta manera, pueden ser determinantes en su desregulación
a la hora de favorecer la progresión de metástasis en cáncer, por ejemplo. Las proteínas
más caracterizadas implicadas en estas funciones son las PKCs, concretamente las
isoformas α y γ, que se unen a Fascin1 y la fosforilan en el residuo serina 39 en el extremo
N-terminal de unión a F-actina (Adams, 2004). Esta fosforilación resulta en una
disminución en la función nucleadora de Fascin1 en los paquetes de los filamentos de
actina en los filopodios (Yamakita et al., 1996).
La interacción entre Fascin1 y PKC, está mediada por la región reguladora,

concretamente del dominio C1B en la región comprendida por los residuos 102 a 151
(Anilkumar et al., 2003).
51
Figura I.14. Rutas principales en las que se ve involucrada Fascin1 a nivel de proteína y transcripcional. En
la zona de la derecha (enmarcado en rojo), podemos ver su relación con PKC, que tiene un papel
fosforilando Fascin1 en su residuo S39 disminuyendo la capacidad nucleadora de F-actina (Hashimoto et
al., 2011, J. of Pathol).
7.6 FASCIN1 COMO DIANA TERAPÉUTICA.
Todo esto convierte a Fascin1 en una diana terapéutica idónea para la lucha contra
el cáncer. Hoy cabe destacar un fármaco que se ha estado probando con éxito, se trata de
la migrastatina, un compuesto que se usa para prevenir metástasis en tumores y que es un
producto natural producido por Streptomyces (Nakae et al., 2000; Woo et al., 2002).
También se han desarrollado análogos sintéticos de la migrastatina tales como la
macroketona, que junto con la migrastatina son inhibidores potentes de células
migratorias en tumores metastásicos y que se han probado con éxito en ratones (Gaul et
al., 2004; Ju et al., 2008; Njardarson et al., 2004; Shan et al., 2005).
52
El grupo de investigación de L. Chen y colaboradores, mostraron por medio de

técnicas de cristalografía de rayos X que la migrastatina se une de forma específica a una
de las regiones de unión de Fascin1 con F-actina, inhibiendo la actividad de metástasis.
Esta unión tiene lugar en una región comprendida por los residuos (E391, H392, K471,
G472, D473, H474, A488), localizados en el sitio 1 de unión a F-actina (L. Chen et al.,
2010).
Más recientemente, otro grupo de investigación realizó un cribado de alto

rendimiento probando multitud de fármacos y resultaron positivos varios de ellos para
inhibir la actividad formadora de paquetes de F-actina de la proteína Fascin1.
Centrándose en uno de estos compuestos y realizando diversos experimentos en líneas
celulares así como con ratones, demostraron la especificad del fármaco en su papel anti-
metastático evitando la interacción entre Fascin1 y F-actina (Huang et al., 2015).
También cabe destacar una publicación más reciente donde se llevó a cabo el
diseño de fármacos inhibidores específicos contra Fascin1 y que se presentan como
potenciales candidatos como agentes contra la metástasis. Este diseño dirigido permite
generar fármacos con afinidad nanomolar por Fascin1, buenas capacidades
fisicoquímicas y la capacidad de inhibir la capacidad empaquetadora de filamentos de
actina por parte de Fascin in vitro (Francis et al., 2019).
La búsqueda de dianas terapéuticas que actúen en la unión de Fascin1 a F-actina

o de PKC a Fascin1, pueden ser claves para arrojar luz acerca de la lucha contra el cáncer.
De nuevo, la determinación estructural que ayude a entender mejor los mecanismos de
interacción entre PKC y Fascin1 y por otro lado Fascin1 y F-actina son de vital
importancia para este objetivo.
8. IMPLICACIONES FISIOLÓGICAS DE LAS PKCs.
Desde su descubrimiento, se ha visto que esta familia de proteínas tiene un papel

clave en eventos de transducción de señales involucradas en funciones celulares
fundamentales tales como desarrollo celular (Otte et al., 1991), memoria (Alkon, 1989),
diferenciación (Cutler et al., 1993; Denning, 2004), proliferación (Murray et al., 1993;
Oka & Kikkawa, 2005), carcinogénesis (Ashendel, 1985), apoptosis (Gavrielides et al.,
53
2004; Gutcher et al., 2003; Martelli et al., 2004), adhesión (Kitajima et al., 1999),
migración (Jiang et al., 2005), secreción de iones (Del Castillo et al., 2005) y función
barrera (Farhadi et al., 2006).
Dentro de las implicaciones fisiológicas, para comprender la complejidad de la

función de las PKCs, vamos a comentar sus funciones celulares más importantes. Se van
a mostrar ejemplos claves de las isoenzimas de PKCs, sus implicaciones bioquímicas
desde un punto de vista fisiológico y su papel en enfermedades tales como cáncer.
Específicamente, a continuación, se comenta el papel de diversas isoenzimas de las PKCs
en proliferación celular, ciclo celular, diferenciación, morfología, movilidad y apoptosis
celular (Figura I.15).
Figura I.15. La complejidad de las PKCs se muestra en su implicación en multitud de procesos celulares y
rutas de señalización (Kang, 2014).
54
8.1 PROLIFERACIÓN CELULAR Y CICLO CELULAR.
La participación de los miembros de la familia de las PKCs en la regulación y

progresión del crecimiento y ciclo celular se estableció de forma clara desde los inicios
del estudio de las PKCs. Así, se vio que estas quinasas participan en procesos de
señalización del crecimiento e inducción de la mitosis (Dicker & Rozengurt, 1978;
Rozengurt, 1986; Takuwa et al., 1988), descubrimientos que fueron consistentes con la
identificación de la enzima como uno de los principales receptores del promotor de
tumores PMA, que es un éster de forbol (Castagna et al., 1982; Kikkawa et al., 1983;
Leach et al., 1983).
La proliferación celular es uno de los procesos que pueden ser regulados de

manera positiva y negativa por influencia de las isoformas de PKC. PKCα es la isoforma
más estudiada en este campo y de forma general se puede decir que inhibe la
proliferación. Esta proteína, media la detención de ciclo celular en fase G1 mediante
mecanismos que incluyen la hidrofosforilacón de proteínas Rb, disminución de la
expresión de la ciclina D1 y la inducción de las proteínas p21 y p27 (Clark et al., 2004;
Detjen et al., 2000; Frey et al., 2000; Frey et al., 1997). Sin embargo, también puede
actuar en pro de la proliferación mediando en la transcripción de genes involucrados en
la progresión del ciclo celular (Soh & Weinstein, 2003).
Por su parte, en las nPKCs, también podemos encontrar ejemplos de que

diferentes isoformas muestran distintos efectos en proliferación. La idea concebida hasta
el momento es que PKCδ regula de forma negativa y PKCε de forma positiva la
proliferación. PKCδ influye en la progresión del ciclo celular evitando que las células
entren en fase S (Ashton et al., 1999; Fukumoto et al., 1997) y en fase M (Watanabe et
al., 1992). También se ha visto en PKCδ un efecto favoreciendo la proliferación debido
a su habilidad para activar la ruta de las MAPK quinasas (Keshamouni et al., 2002; Ueda
et al., 1996). De forma general, en muchas isoenzimas de las PKCs que se han estudiado,
se observa un efecto dual controlando el ciclo celular, que va a depender del contexto
celular, la sincronización determinada con otros eventos celulares, la duración de la
activación de la PKC durante el ciclo celular y el tipo concreto de isoenzimas
involucradas.
55
La PKCε puede promover la entrada al ciclo celular mediante la regulación

transcripcional de genes involucrados en la transición de fases G1-S (Bae et al., 2007;
Soh & Weinstein, 2003). También se ha sugerido que PKCε interacciona con proteínas
Ras para promover la proliferación celular (Perletti et al., 1998).
Además, hay publicaciones que indican ambas funciones anti- y pro- proliferación
para la PKCη. Esta proteína, potencia la progresión de ciclo celular aumentando la
expresión de ciclinas en G1 (Fima et al., 2001) y aumenta la proliferación afectando en
la señalización Akt/mTOR (Aeder et al., 2004) y ERK/Elk1 (Uht et al., 2007). Sin
embargo, también se han estudiado efectos negativos en la progresión del ciclo celular
para PKCη (Ohba et al., 1998).
Las aPKCs también pueden favorecer o reprimir la proliferación. PKCι es

requerida para la proliferación de células de glioma (Patel et al., 2008) y se asocia con
Cdk7, promoviendo la activación de esta proteína que favorece la progresión del ciclo
celular (Acevedo-Duncan et al., 2002). PKCζ por su parte, reduce la proliferación en
fibroblastos mediante la interferencia con la señalización ERK (Short et al., 2006). Sin
embargo, estudios de sobreexpresión y silenciamiento han mostrado efectos favoreciendo
la proliferación para PKCζ también (Ghosh et al., 2002; Martin et al., 2002).
8.2 DIFERENCIACIÓN CELULAR.
La familia de las PKCs también tiene un efecto importante en la diferenciación.

Este papel se estudió con el descubrimiento de los promotores de tumores ésteres de
forbol y su efecto estimulando la maduración de células promielocíticas HL-60
(Huberman & Callaham, 1979). Esto se esclareció más adelante cuando se vio que las
isoenzimas PKCβ son claves en este efecto (Macfarlane & Manzel, 1994). Otro
descubrimiento temprano fue determinar que los ésteres de forbol inducían diferenciación
neuronal en células de neuroblastoma cultivadas (Påhlman et al., 1981). Más tarde, se
atribuyó a PKCε este papel promotor de diferenciación en ese tipo de células modelo
cultivadas (Hundle et al., 1995). Una característica esencial del programa de
diferenciación neuronal es el establecimiento de la polaridad celular con una separación
axonal y compartimentos dendríticos. Las isoformas atípicas de PKC juegan un papel
crucial en este proceso (Etienne-Manneville & Hall, 2001; Nishimura et al., 2004).
56
El desarrollo de queratinocitos también es otro proceso regulado por las PKCs

donde las isoformas nuevas tienen papeles únicos. PKCη es la isoforma involucrada en
este papel mediante la interacción con la proteína Fyn y por medio de la inhibición del
complejo CDK2 (Cabodi et al., 2000). Por otro lado, la isoforma relacionada con ésta,
PKCε promueve el desarrollo de células escamosas en carcinomas (Verma et al., 2006).
PKCδ, otra isoforma presente en queratinocitos también puede favorecer la
diferenciación de estas células, donde la fosforilación en un residuo tirosina parece tener
un papel clave en las células transformadas (Joseloff et al., 2002). Por otro lado, cuando
se sobreexpresan las isoenzimas nuevas, tienen la capacidad de promover el programa de
diferenciación de los queratinocitos (Efimova et al., 2002).
Dentro de las PKCs clásicas, se han sugerido efectos contrarios en la

diferenciación de las células epiteliales del intestino, donde PKCα promueve la salida del
ciclo celular (Frey et al., 2000), mientras que PKCβII favorece la continuación de la
proliferación (Murray et al., 1999).
8.3 MORFOLOGÍA Y MOVILIDAD CELULAR.
También se determinó con el uso de ésteres de forbol, los cambios en morfología

y movilidad de una gran cantidad de tipos celulares. Muchos de estos efectos se han
confirmado más tarde ser causados por diversas isoformas de las PKCs. En muchos casos,
las proteínas PKCs promueven la formación de protrusiones, expansión celular y pueden
suprimir las fibras de estrés (Larsson, 2006). También hay muchos otros ejemplos donde
las isoenzimas de PKC pueden estimular la formación de este tipo de fibras de expansión
(Massoumi et al., 2002; Woods & Couchman, 1992).
Las PKCs también participan en efectos morfológicos de importancia para la

función celular. Por ejemplo, PKCε estimula el crecimiento en procesos celulares, en el
caso de células neuronales puede madurar la formación de axones y dendritas (Zeidman
et al., 1999). Las PKCs también se han visto involucradas en la regulación del crecimiento
direccional de los conos de crecimiento en respuesta a compuestos químicos atrayentes y
repelentes (Xiang et al., 2002). Otro papel importante para las PKCs es el de regular la
polaridad celular, este es un proceso crucial para la función de una gran cantidad de tipos
57
celulares. Esta función está mediada por aPKCs en conjunto con proteínas de tipo PAR
(Joberty et al., 2000; Lin et al., 2000).
La mayoría de las isoformas de PKC se han sugerido que son capaces de promover
la migración, aunque también hay evidencias de efectos antimigratorios. Concretamente,
PKCα se ha visto implicada en efectos favorables de migración en diversos tipos celulares
incluyendo células endoteliales (Harrington et al., 1997), células de cáncer de mama (Ng
et al., 1999) y células de fibrosarcoma (Ng et al., 2001).
8.4 APOPTOSIS CELULAR.
Las isoformas de las PKCs son importantes reguladores de la muerte y

supervivencia celular. Las PKCs clásicas y atípicas se relacionan generalmente con la
supervivencia, mientras que las nuevas isoformas presentan efectos más específicos de
isoforma. En general se podría decir que PKCδ es pro-apoptótica mientras que PKCε es
antiapoptotica. Muchas isoformas de PKC, incluyendo PKCδ, ε, θ y ζ son sustratos de
caspasas, enzimas que promueven los programas celulares que llevan a la muerte celular.
Las caspasas son capaces de escindir las PKCs en la zona de bisagra, de esa manera
liberando un dominio catalítico constitutivamente activo y que de forma general presenta
actividad pro-apoptótica (Datta et al., 1997; Emoto et al., 1995; Hoppe et al., 2001).
La PKCδ es la isoforma que mas estrechamente se ha asociado con los eventos

pro-apoptóticos. La activación proteolítica de PKCδ por medio de caspasas se asocia de
forma directa con apoptosis (Ghayur et al., 1996). Esta activación de PKCδ, a su vez
activa a la caspasa 3 y funciona como un bucle de retroalimentación en el proceso de
muerte celular (Anantharam et al., 2002; Blass et al., 2002). La fosforilación en un residuo
tirosina (Blass et al., 2002) y la localización concreta de PKCδ (DeVries-Seimon et al.,
2007; Gomel et al., 2007), parece determinar su efecto apoptótico, donde la localización
nuclear y mitocondrial de PKCδ son promotores muy fuertes de apoptosis.
En general la PKCδ media la fosforilación de numerosas proteínas para promover

la apoptosis (Bharti et al., 1998; Cross et al., 2000; Yoshida et al., 2003). En las
mitocondrias, la activación de PKCδ puede liderar la liberación de citocromo c y
58
disminuir el potencial de membrana mitocondrial (Matassa et al., 2001; Sumitomo et al.,

2002).
9. IMPLICACIÓN EN ENFERMEDADES Y DIANAS TERAPÉUTICAS.
El descubrimiento de la activación de las PKCs por ésteres de forbol (promotores

de tumores derivados de plantas) (Castagna et al., 1982), junto con posteriores hallazgos
que ayudaron a entender el papel de estas quinasas en todos los procesos fisiológicos
mencionados, fue clave para localizar estas proteínas en el punto de mira de la
investigación mundial durante décadas en su involucración en diversas enfermedades así
como en la búsqueda de dianas terapéuticas (Goekjian & Jirousek, 2001; Mochly-Rosen
et al., 2012; Swannie & Kaye, 2002).
Desde que se inició el estudio de las PKCs, cabe destacar su importancia en una
gran cantidad de enfermedades (Tabla I.1) como diversos tipos de cáncer (Michie &
Nakagawa, 2005; Totoń et al., 2011), patologías psiquiátricas y neuropatías tales como
desórdenes bipolares (Manji & Lenox, 2000), derrames cerebrales (Bright & Mochly-
Rosen, 2005), Parkinson (Burguillos et al., 2011; Zhang et al., 2007), demencia (Sun &
Alkon, 2010), Alzheimer (Alkon et al., 2007; Garrido et al., 2002) o procesos de dolor
(Sweitzer et al., 2004). Por otra parte, enfermedades dermatológicas como psoriasis
(Maioli & Valacchi, 2010), enfermedades autoinmunes (Varin et al., 2012), múltiples
afectaciones cardiovasculares (Bowling et al., 1999; Koyanagi et al., 2007; Palaniyandi
et al., 2009; Simonis et al., 2003), diabetes (Ishii et al., 1996), fallos pulmonares
(Dempsey et al., 2007) y fallos en el riñón (Li & Gobe, 2006; Tuttle, 2008).
También se ha determinado que enzimas PKCs individuales exhiben diferentes

distribuciones de tejido, localización celular y propiedades bioquímicas, una indicación
de que cada miembro de la familia juega diferentes papeles, lo que se traduce en ultimo
termino en relaciones únicas con enfermedades (Way et al., 2000).
El hecho de participar en procesos fisiológicos tan importantes hace que

desregulaciones en su actividad se traduzca en una implicación en una gran multitud de
enfermedades, lo que convierte a estas proteínas en importantes dianas terapéuticas.
Aunque se han desarrollado una gran variedad de inhibidores y activadores contra las
59
proteínas PKCs, existen diferentes problemas que hoy tienen que resolverse para poder
sacar el máximo partido a estas dianas terapéuticas que tanta importancia tienen en
diversas enfermedades que afectan a millones de personas alrededor del mundo. La falta
de selectividad se sitúa como la mayor problemática de la efectividad de estos fármacos,
en las que la elevada homología entre todas las isoenzimas de las PKCs hace difícil el
desarrollo de dianas especificas de isoforma. Para resolver este problema, se tiene que
continuar en el estudio estructural de las conformaciones completas de estas enzimas, de
las que actualmente no hay ninguna isoforma completa caracterizada completamente a
nivel tridimensional (Leonard et al., 2011). También se tiene que llevar a cabo un mayor
estudio y caracterización de los mecanismos de activación e inhibición de los fármacos
disponibles actualmente. Además, el diseño de fármacos dirigido contra estas proteínas
será de gran ayuda para avanzar en este campo (Carter & Kane, 2004; Hofmann, 2004;
Irie et al., 2005; Kazanietz, 2005; Mochly-Rosen et al., 2012).
Dentro de las enfermedades en las que participan las proteínas PKCs, en este
documento nos vamos a centrar en una de las enfermedades que más muertes causan en
el mundo cada año; el cáncer, donde muchas isoformas de PKC juegan un papel clave en
estos procesos cancerosos.
Tabla I.1. Implicaciones de diversas isoenzimas de PKC en enfermedades (Mochly-Rosen et al., 2012).
60
10. PKC Y CÁNCER.
10.1 INTRODUCCIÓN. PMA E INICIO DEL ESTUDIO DE PKC EN CÁNCER.
Un hito importante en el avance del estudio de las PKCs y cáncer fue el

descubrimiento de un conjunto de sustancias promotoras de tumores colectivamente
denominadas como ésteres de forbol que son fuertes activadores de las PKCs. Los ésteres
de forbol tales como el PMA, son potentes promotores de tumores, y constituyen el
componente biológicamente activo de fitotoxinas de la savia de la familia de plantas
tropicales Euphorbiacear (Castagna et al., 1982).
Más tarde, se vio que algunas de las conclusiones que se obtuvieron a partir del
uso del PMA tuvieron que ser reajustadas puesto que aunque inicialmente se consideraron
activadores específicos de las PKCs, también se vio que podían tener como diana otras
proteínas con dominios C1 (Kazanietz, 2002).
Cuando se profundizó en el estudio de las proteínas quinasas de tipo C, se observó

que estas isoenzimas que transducen una gran cantidad señales juegan un papel muy
importante en múltiples procesos celulares, incluyendo controlar el balance entre
supervivencia celular y muerte. De esta manera, su fallo en su regulación se ha asociado
a numerosas enfermedades tales como tumores de diversa índole (Mochly-Rosen et al.,
2012).
10.2 PKCs. ¿SUPRESORES DE TUMORES U ONCOGENES?
En la bibliografía se encuentran evidencias de que la actividad de las PKCs

suprime las señales de supervivencia y por ello funcionando como supresores de tumores.
También, mutaciones en PKCs asociadas a cáncer provocan generalmente perdida de
función, asignándole por tanto un papel supresor de tumores, y por ende funcionando
como oncogenes cuando pierden dicha capacidad tras sufrir la mutación. Sin embargo,
por otro lado, en la bibliografía también se han estudiado eventos contrarios, asignando a
diversas isoenzimas sus papeles de oncogén. De esta forma, se encuentran evidencias de
que diversas isoenzimas actúan disminuyendo la capacidad proliferativa de los tumores
61
y, al contrario, otras isoenzimas aumentando el carácter tumorigénico de la célula (Antal,

Hudson, et al., 2015; Cooke et al., 2017; Reyland, 2007).
Así, por ejemplo PKCι se propuso como supresor de tumores en cáncer de pulmón
y de ovarios (Justilien et al., 2014; Regala et al., 2005; Zhang et al., 2006), o PKCε como
oncogén por su habilidad de transformar células de fibroblastos de rata (Cacace et al.,
1993). Sin embargo, para la mayoría de las isoenzimas, suele haber evidencias
conflictivas en cuanto a si actúan como oncogenes o supresores de tumores. Así, PKCγ
se considera supresor de tumores por sus efectos pro-apoptóticos favoreciendo apoptosis
(Reyland, 2007). No obstante, en la bibliografía también se encuentra que PKCγ es capaz
de promover la progresión del tumor en cáncer de pulmón y de páncreas en determinados
contextos (Mauro et al., 2010; Symonds et al., 2011). De forma similar, tanto la
sobreexpresión como la perdida de función de PKCζ disminuyen la capacidad
tumorogénica tanto en ratones como en líneas celulares (Luna-Ulloa et al., 2011; Ma et
al., 2013). De la misma manera, PKCα se reportó ser capaz de inducir y suprimir la
proliferación de células en cáncer de colon (Walsh et al., 2004; Wu et al., 2013).
Estos hechos que pueden parecer a veces contradictorios y que hoy generan
controversias entre diferentes grupos de investigación, se esclarecieron más adelante
estudiando las proteínas PKCs y su muy compleja relación con el ciclo celular. Tal y
como se ha comentado en las implicaciones fisiológicas anteriormente, la activación de
diferentes isoenzimas de PKC pueden tener efectos bivalentes dependiendo del entorno,
tipo de señalización celular e incluso dentro de la línea celular estudiada (Figura I.16)
(Cooke et al., 2017).
Esta complejidad de la regulación de las PKCs vista hasta este punto en el

desarrollo de la introducción, hace que no tenga sentido establecer dogmas en cuanto a
los papeles e implicaciones de las PKCs en enfermedades y establecer si son promotores
o supresores de tumores. Así, todos los estudios tienen que tomarse dentro del contexto
donde se han desarrollado (Cooke et al., 2017). De esta forma, incluso el mismo éster de
forbol que desde sus inicios fue determinado como un promotor de tumores, podría
estimular o inhibir la proliferación o incluso desencadenar la respuesta apoptótica
dependiendo del entorno celular en que se estudie (Griner & Kazanietz, 2007).
62
Figura I.16. Las proteínas PKCs puede actuar como un promotor de tumores o como un supresor de tumores
según el contexto celular en el que se estudien (Cooke et al., 2017).
10.3 PKCs APARECEN MUTADAS EN MUCHOS TIPOS DE CÁNCER.
Son numerosos los casos en los que se asocian mutaciones de pérdida de función
de isoformas de las PKCs con cáncer. Estudios exhaustivos recientes, muestran la
existencia de más de 1000 mutaciones conocidas repartidas entre cPKCs, nPKCs y aPKCs
presentes en muestras de pacientes con distintos tipos de cáncer, en la mayoría de los
casos heterocigóticas (Tabla I.2). Del total de mutaciones, se han estudiado cerca de 50
de estas alteraciones y los estudios señalan que todas estas mutaciones son de tipo perdida
de función, por ello asignando un papel supresor de tumores a las isoformas
correspondientes. Cabe destacar que la corrección de una de estas mutaciones mediante
la herramienta de edición de genoma CRISPR en líneas celulares de cáncer procedentes
de un paciente con cáncer de colon, resultó en la supresión del crecimiento celular
63
independiente de anclaje y redujo el tamaño del tumor en animales modelo (Antal,

Hudson, et al., 2015; Newton & Brognard, 2017).
Por otro lado, cambios en los niveles de expresión o estado de activación en las
isoenzimas de las PKCs, se han relacionado con numerosos tipos de cáncer (Gordge et
al., 1996) y, en muchos ejemplos, se ha observado una relación entre niveles elevados de
PKC y agresividad (Ways et al., 1995).
Como resultado, las PKCs se han estudiado durante años como dianas para el
tratamiento de cáncer. Los beneficios de usar inhibidores de PKCs para controlar el
cáncer se han estudiado desde tiempo atrás y hoy en día sigue siendo un campo de gran
interés en el que queda mucho por avanzar (Fields & Murray, 2008; Leskow et al., 2011).
Tabla I.2. Resumen de algunas de las mutaciones más representativas relacionadas directamente con
isoformas de PKCs encontradas en muestras de pacientes con diversos tipos de cáncer, desde cáncer
colorrectal hasta cáncer de mama (Newton & Brognard, 2017).
64
11. OBJETIVOS.
Los objetivos de esta Tesis Doctoral son los siguientes:
1. Estudiar a nivel biofísico la interacción entre PKCα y RACK1.

2. Estudiar a nivel biofísico la interacción entre PKCα y Fascin1.
3. Determinar la estructura tridimensional de PKCα, PKCε y PKCζ por medio de
cristalografía de rayos X y criomicroscopía electrónica.
4. Determinar la estructura tridimensional del complejo PKCα-RACK1 por medio
de cristalografía de rayos X y criomicroscopía electrónica.
5. Determinar la estructura tridimensional del complejo PKCα-Fascin1 por medio
de cristalografía de rayos X y criomicroscopía electrónica.
6. Reposicionamiento de fármacos que puedan tener un efecto en PKCα con un
posible valor farmacológico para tratar enfermedades causadas por esta.
7. Caracterización bioquímica de la unión de los fármacos seleccionados a PKCα.
8. Caracterización a nivel de biología celular sobre el efecto de los fármacos
seleccionados en la localización y señalización de PKCα.
9. Estudiar a nivel estructural la naturaleza de la unión entre Fascin1 y F-actina por
medio de CryoEM.
65
CAPÍTULO II. MATERIALES Y
MÉTODOS.
CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS.
1. MÉTODOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR.
1.1 VECTORES DE EXPRESIÓN.
Para llevar a cabo la clonación de los fragmentos de ADN de interés, se usaron

diversos vectores que ayudarían a la obtención de las proteínas recombinantes generadas
en los diversos métodos de expresión que se explican a continuación.
1.1.1 Vector de Expresión pET28.
El plásmido pET28 (Plasmid for Expression by T7 RNA polymerase), es un vector

diseñado para la expresión de proteínas empleando el sistema bacteriano E.coli. En
conjunción con E.coli presentan un sistema de expresión que se basa en el operón lac, y
de esta manera, se puede inducir la producción proteica con la adición de isopropil-β-D-
1-tiogalactopiranósido (IPTG). Este vector presenta una región de clonación múltiple con
varias secuencias diana de enzimas de restricción. Esta zona está precedida por el
operador del operón lac y una secuencia promotora que es reconocida por la RNA
polimerasa del fago T7. Contiene además una secuencia codificante para un tallo de 6
histidinas junto con la proteína recombinante, que facilita la purificación posterior de la
proteína mediante el empleo de cromatografía de afinidad, así como un condón STOP de
la transcripción. El sistema se hace completo una vez se introduce en organismos (E. coli,
cepa BL21 DE3) que expresen el gen de la ARN polimerasa del fago T7 bajo el control
del promotor lac que es inducible por IPTG. El plásmido también contiene el gen lacI,
cuya proteína codificante inhibe de forma constitutiva el sistema a menos que se
encuentre en el medio algún análogo de la lactosa tal como el IPTG. Además, presenta
un gen de resistencia a kanamicina (Figura II.1).
El dominio C2 de PKCα y el mutante para el sitio de unión a calcio (D246A,

D248A) fueron clonados usando este vector para su expresión y purificación.
Tabla II.1. Oligonucleótidos empleados para la clonación del dominio C2 de PKCα en el vector pET28.
Proteína Oligo Forward Oligo Reverse
Dominio C2 5’CAAGAATTCACACAGAGAAGAGG 5’CAAAAGCTTTCATCCTTCTGGAATGGG
69
Figura II.1. Mapa del vector pET28a. Imagen obtenida de https://www.addgene.org/.
1.1.2 Vector de Expresión pET15b.
Este vector es muy semejante en sus propiedades al vector pET28 salvo por la
excepción de que presenta un gen de resistencia a ampicilina en lugar de a kanamicina
(Figura II.2).
La proteína RACK1 fue clonada en este vector para su expresión y purificación.
Tabla II.2. Oligonucleótidos empleados para la clonación de RACK1 en el vector pET15b.

RACK1 5’AGCCATATGCTCGAG 5’AGCCATATGCTCGAG
ACTGAGCAGATGACCCTT ACTGAGCAGATGACCCTT
70
Figura II.2. Mapa del vector pET15b. Imagen tomada de https://www.addgene.org/.
1.1.3 Vector de expresión pGEX4T.
El plásmido pGEX4T, es un sistema optimizado para la expresión de proteínas en

E.coli que confiere resistencia a ampicilina. Se caracteriza porque tiene una serie de
elementos como los ya comentados en el caso de los vectores pET28 y pET15b, tales
como el sistema de control de la expresión por medio del operón lac complementado con
la T7 RNA polimerasa aportada por la cepa de E.coli BL21 DE3 donde se transforma el
vector.
A diferencia de los dos vectores ya comentados anteriormente, este vector aporta

un tallo de fusión a la proteína diferente a la cola 6xHis basado en el GST, glutatión S-
transferasa que también facilita la purificación de las proteínas por medio de
cromatografía de afinidad a columna (Figura II.3).
La proteína Fascin1 y los mutantes FascinS39D, Mutante A (K150E, R151E y

K313E) y Mutante B (R271E, K353E y K358E) se clonaron en este vector, empleando
los siguientes oligonucleótidos:
71
Tabla II.3. Oligonucleótidos empleados para la clonación de Fascin1 en el vector pGEX-4T.

FASCIN1 5’GTTCCGCGTGGATCCACCGCCAA 5’GTCGACCCGGGAATTCTTAGTACTCC
CGGCACAGCC CAGAGCGAGGC
Figura II.3 Mapa del vector pGEX. Imagen obtenida de https://www.addgene.org/.
1.1.4 Vector de expresión pFastBacDual.
Las principales características de este vector se explican en detalle justo

continuación en el siguiente apartado en el sistema de clonación relacionado con este
vector (Figura II.4).
72
Figura II.4. Mapa del vector pFastBac DUAL. Imagen obtenida de https://www.addgene.org/.
Las proteínas PKCα, PKCε y PKCζ se clonaron en el vector pFastBacDual.
Tabla II.4. Oligonucleótidos empleados para la clonación de PKCα, PKCε y PKCζ en el vector
FastBacDual.

PKCα 5´CGTGGTTCCGAATTCGCTGACG 5´ACTTCTCGACAAGCTTTTATACTGCACT
TTTACCCGGCC TTGCAAGATT
PKCε 5’AAAGGCCTACGTCGACTGGTAG 5’GATTCGAAAGCGGCCGCTTAGGGCATC
TGTTCAATGGCCTT AGGTCTTCACC
PKCζ 5’CGTGGTTCCGAATTC 5’AGTGAGCTCGTCGACTTACACGGACTCC

CCCAGCAGGACCGACCCC TCAGCAGA
El proceso de clonación para las proteínas de fusión (Proteína de fusión A:

construcción covalentemente unida NT-Fascin1WT-PKCα-CT, Proteína de fusión D:
construcción covalentemente unida NT-Fascin1S39A-PKCα-CT, Proteína de fusión E:
construcción covalentemente unida NT- PKCα-Fascin1S39A-CT y Proteína de fusión H:
construcción covalentemente unida NT- PKCα-Fascin1WT-CT) por medio de este vector
de expresión se explican en apartados siguientes.
73
1.2 SISTEMA DE EXPRESIÓN EN BACULOVIRUS BAC-TO-BAC PARA LAS

PROTEÍNAS PKCs.
Las proteínas que se expresaron empleando el sistema de baculovirus Bac-to-Bac

fueron las siguientes:
-PKCα.
-PKCƐ.
-PKCζ.
-Proteína de fusión A: construcción covalentemente unida NT-Fascin1WT-PKCα -CT.
-Proteína de fusión D: construcción covalentemente unida NT-Fascin1S39A-PKCα -CT.
-Proteína de fusión E: construcción covalentemente unida NT- PKCα-Fascin1S39A-CT.
-Proteína de fusión H: construcción covalentemente unida NT- PKCα-Fascin1WT-CT.
Para la expresión de las proteínas PKCs y las proteínas de fusión que la

incorporaban, se empleó el sistema Bac-to-Bac de expresión en baculovirus que ofrece
un método rápido y eficiente para generar baculovirus recombinantes (Ciccarone et al.,
1998). Este método se desarrolló por Monsanto y se basa en la transposición de un casete
de expresión en un vector lanzadera de baculovirus (bácmido) que se propaga en E. coli
(Luckow et al., 1993). Los principales componentes de este sistema de expresión en
baculovirus Bac-to-Bac son:
- El principal componente lo constituye el vector pFastBac. Donde se lleva a cabo

la clonación del gen de interés. La expresión del gen de interés está controlada por un
promotor específico de baculovirus. Presenta dos promotores fuertes de baculovirus (PH
y p10) que permiten la expresión simultánea de dos proteínas. Conteniendo para ello dos
sitios de clonación múltiple, dianas para diversas enzimas de restricción. Estos casetes de
expresión en los plásmidos pFastBac, están flanqueados en ambos extremos por brazos
de Tn7, que permiten la inserción del gen de interés por medio del proceso de
transposición. Este vector contiene genes de resistencia a gentamicina y ampicilina, así
como un tallo de 6xHis que precede al sitio de policlonación que facilita la purificación
de la proteína de interés por medio de cromatografía de afinidad.
74
- El segundo componente más importante, es la cepa de E. coli DH10Bac, que se

usa como el hospedador para el vector pFastBac. Contiene el vector lanzadera de
baculovius (Bácmido) con los sitios diana mini-attTn7 y un plásmido ayudante. Permite
la generación del bácmido recombinante después de la transposición de la expresión del
constructo procedente del vector pFastBac. Este proceso de transposición tiene lugar
gracias a las proteínas de transposición (transposasas) generadas por medio del plásmido
ayudante, que además aporta resistencia a tetraciclina. Los bácmidos contienen también
un gen de resistencia a kanamicina (Kan) y un segmento de ADN que codifica para LacZ
que funciona como un gen marcador. Este gen codifica para la beta-galactosidasa, de tal
modo que las colonias que crezcan en presencia de un sustrato cromogénico tal como
Bluo-Gal o X-Gal junto con el inductor IPTG generarán un fenotipo azul.
Como se ha comentado, el sistema hace uso de la ventaja que presenta la

transposición específica de lugar mediada por los transposones Tn7, para simplificar y
potenciar el proceso de generar un bácmido recombinante de ADN.
Así, después del proceso de clonación e inserción de la proteína de interés en el

vector pFastBac, posteriormente se transformaban las células DH10Bac con el vector
pFastBac siguiendo el protocolo de Bac-to-Bac Baculovirus Expression System de
Invitrogen en placas con X-Gal (40 µg/ml), tetraciclina (10 µg/ml), gentamicina (7 µg/ml)
e IPTG (80 µg/ml). Se dejaban incubar las placas durante 24 horas a 37ºC en estufa.
Posteriormente, se seleccionaban varias colonias blancas que son las que se esperan
contengan la inserción de nuestro gen de interés con los mini-Tn7 en el sitio mini-attTn7.
De esta manera se irrumpe el gen LacZ y con ello impidiendo la codificación para
betagalactosidasa. Así, se hace imposible el metabolismo de X-Gal del medio de cultivo
para generar un fenotipo azul (Figura II.5).
75
Figura II.5. Esquema del proceso completo del sistema Bac-To-Bac explicado en párrafos anteriores.
Imagen obtenida de https://www.thermofisher.com/es/es/home/brands/invitrogen.html
Con las colonias blancas seleccionadas, se hace un restreak en placas con las
mismas condiciones a la anteriores para asegurar el fenotipo blanco deseado. Con estas
colonias, se aísla el bácmido recombinante con el protocolo de miniprep. Se realiza PCR,
empleando dos oligos específicos que se unen a los extremos de la región donde se espera
insertar nuestro ADN de interés, para posteriormente analizar en gel de agarosa que el
tamaño se corresponde con el de la construcción que estamos interesados en expresar. De
la misma manera, también se analiza por medio de secuenciación el material genético de
la miniprep para asegurar que el marco de lectura y la secuencia son correctos sin ninguna
posible mutación que comprometa la correcta expresión de la proteína (Figura II.6).
76
Figura II.6. A) Ejemplificación de la inserción del gen de interés con sus sitios Tn7R procedente del vector
pFastBac, en el bácmido de ADN en el sitio mini-attTn7. B) Para comprobar que nuestro gen se ha insertado
correctamente, se emplearon los primers pUC/M13 reverse y pUC/M13 forward. Por medio de PCR, se
comprobó que el tamaño del fragmento de ADN era el esperado realizando electroforesis en gel de agarosa,
así como se determinó posteriormente por secuenciación que la secuencia completa es la correcta. Imagen
obtenida de https://www.thermofisher.com/es/es/home/brands/invitrogen.html
Una vez se haya confirmado que el bácmido recombinante contiene el gen de

interés, podemos transfectar el material genético en las células de insecto SF9, para
generar el baculovirus recombinante. Así, a partir del stock de glicerol previo al examen
de las colonias blancas por medio de PCR y secuenciación, se realizó un proceso de
Maxiprep para tener suficiente material genético y así poder realizar la transfección del
material genético en células de insecto SF9. Después de que el stock de baculovirus se
amplifique y sea titulado, estos stocks con el virus amplificado se pueden usar para
infectar células de insecto SF9 y expresar ya a gran escala nuestras proteínas
recombinantes de interés.
1.3 DISEÑO DE LAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN.
La naturaleza de la unión entre Fascin1 y PKCα se determinó como fuerte pero

muy transitoria. Esto se pudo comprobar especialmente por medio de CryoEM donde
cuando se añadían las proteínas por separado era complicado captar eventos de unión
entre las moléculas. De esta manera, finalmente se decidió a llevar a cabo la estrategia de
77
expresar de manera conjunta y unidas de forma covalente mediante un conector las

proteínas PKCα y Fascin1. Así, se podría desplazar el equilibrio a la interacción entre
ambas proteínas al encontrarse mucho más cerca entre ellas que si se añadiesen por
separado en solución a la mezcla de CryoEM.
Para el diseño del conector y la elaboración de las proteínas de fusión unidas

covalentemente por medio de un nexo, nos basamos en la bibliografía en una publicación
que reunía todas las proteínas unidas por conector que habían sido determinadas
estructuralmente por medio de técnicas de biología estructural hasta la fecha.
Concretamente, nos basamos en un ejemplo en el que había una quinasa que unida por
medio de un conector a su sustrato, resultó exitosa en la determinación de su estructura
por medio de técnicas estructurales (Reddy Chichili et al., 2013).
Tabla II.5. Se muestra un listado de diversos ejemplos de complejos proteicos caracterizados a nivel
estructural, aplicando la estrategia de unión covalente por medio de un conector. Concretamente, se puede
ver el ejemplo de una quinasa (quinasa FAK de adhesión focal o PTK2) que resultó exitosa para este
enfoque y en el que nos basamos para la elaboración de nuestro conector (Reddy Chichili et al., 2013).
El conector estaba basado en una cadena de 26 aminoácidos, formados por una

combinación de residuos Gly y Ser. Concretamente su secuencia era la siguiente:
GSGSGSGSGGSGGSGSGSGSGGSGGS. De modo que se adquirió dicho conector con
estas características a la casa comercial GeneScript (Figura II.7).
Figura II.7. Secuencia de ADN completa para el conector que se empleo en esta estrategia (GeneScript).
Imagen obtenida por medio del programa SnapGene viewer.
78
En la elaboración de las construcciones de proteínas unidas covalentemente por

medio del conector, probamos diversas estrategias para intentar potenciar nuestras
posibilidades de determinar la estructura de nuestro complejo proteico. Para ello, se
probaron las combinaciones en las que la proteína PKCα ocupaba tanto el lugar N- como
C-terminal y a la vez se probaron dos versiones de Fascin1, Fascin1WT y el mutante de
Fascin1S39D. En resumen, se probaron las siguientes construcciones:
- Proteína de fusión A: construcción covalentemente unida NT-Fascin1WT-

PKCα-CT.
- Proteína de fusión D: construcción covalentemente unida NT-
Fascin1S39A-PKCα -CT.
- Proteína de fusión E: construcción covalentemente unida NT-PKCα-
Fascin1S39A-CT.
- Proteína de fusión H: construcción covalentemente unida NT-PKCα-
Fascin1WT-CT.
Se llevó a cabo además la predicción estructural de las proteínas de fusión para

ver su organización tridimensional por medio del servidor Robetta (Kim et al., 2004).
Como se puede observar en las imágenes siguientes, el conector queda a una distancia
adecuada para que no sea demasiado corto como para impedir que se pueda llevar la
interacción entre ambas proteínas. De la misma manera, no queda demasiado largo como
para dificultar que las proteínas se encuentren y facilitar que, aunque la unión entre las
dos proteínas sea transitoria, pueda ser más fácil que se produzca un hecho de interacción
que si se añaden de forma separada (Figura II.8 y Figura II.9).
79
Figura II.8. Se muestra un ejemplo de modelado para el caso de las proteínas de fusión A y D (Nt -Fascin1-
conector-PKCa-Ct), donde Fascin1 se encuentran en el extremo N-terminal. En la representación, no se
modelan 16 aminoácidos del conector, así como 23 aminoácidos del extremo N-terminal de PKCa. C1-C2:
dominios C1 y C2 y cat: dominio catalítico de PKCa. Imagen representada por medio de PyMOL.
Figura II.9. Se muestra un ejemplo de modelado para el caso de las proteínas de fusión E y H (Nt-PKCa-
conector -Fascin1S39A-Ct), donde Fascin1 se encuentran en el extremo C-terminal. En la representación
no se modelan 44 aminoácidos del extremo N-terminal de PKCa. C1-C2: dominios C1 y C2 y cat: dominio
catalítico de PKCa. Imagen representada por medio de PyMOL.
80
1.4 REACCIÓN DE GIBSON ASSEMBLY.
1.4.1 CONSTRUCCIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE FUSIÓN.
Para la clonación de las proteínas unidas covalentemente se siguió la estrategia de

Gibson Assembly. En esta reacción, varios productos de PCR con regiones solapantes en
los extremos entre ellos y con el vector donde se introducen, se incuban con el plásmido
vacío y linealizado pFastBac. En este caso, los productos de PCR se corresponderían para
varios segmentos, que contendrían la información para PKCα, el conector y Fascin1.
Estos segmentos tendrían todos ellos regiones solapantes entre ellos y con los extremos
del vector donde se inserta. Así que, finalmente, se obtendría el vector cerrado y
ensamblándose dentro los productos de PCR según la proteína de fusión que
estuviésemos clonando en cada caso (Gibson et al., 2009).
Para ello, la reacción de ensamblaje de Gibson emplea 3 reacciones enzimáticas

en una única reacción: 5’ exonucleasa, actividad de ADN polimerasa para la extensión en
3’ y actividad ADN ligasa. La actividad 5’ exonucleasa digiere las secuencias en sus
extremos 5’ y expone las secuencias complementarias para alinearlas en el lugar donde
se inserta el fragmento. La actividad polimerasa entonces rellena los huecos que se
quedan en las regiones alineadas. Por último, la actividad ADN ligasa sella las zonas de
corte y une de forma covalente los fragmentos de ADN unos con otros (Figura II.10)
(Gibson et al., 2009).
81
Figura II.10. Esquema básico de la reacción de Gibson. El vector linealizado sobre el que estamos
interesados en insertar nuestros fragmentos se incuba con los fragmentos de ADN que se han amplificado
por PCR (en el ejemplo de esta figura se muestran 2 fragmentos para insertarse en el vector). Los oligos de
PCR han sido diseñados de tal manera que los fragmentos producto de PCR adoptan en sus extremos
secuencias solapantes con los extremos del vector y entre las propias secuencias de inserción para que el
ensamblaje final quede establecido según se haya diseñado. Se incuba el vector linealizado, junto con los
fragmentos a introducir y las 3 enzimas de Gibson durante 1 hora a 50ºC, se transforman células
competentes y se recogen colonias para analizar que presentan la secuencia de interés. Imagen obtenida de
la web https://international.neb.com/applications/cloning-and-synthetic-biology/dna-assembly-and-
cloning/gibson-assembly.
Las reacciones de PCR para el ensamblaje por medio de la reacción de Gibson se

realizaron de la siguiente manera:
Para las proteínas:

-Proteína de fusión A: construcción covalentemente unida NT-Fascin1WT-PKCα-CT.
-Proteína de fusión D: construcción covalentemente unida NT-Fascin1S39A-PKCα-CT.
• PCR1:
- Oligonucleótido Fd, al inicio de la secuencia de Fascin y solapando con el
vector PFastBac (se empleó Fascin1 WT o Fascin1 S39 como molde
dependiendo de la construcción):
CCTGGTCCCCCGTGGTTCCGAATTCACCGCCAACGGCACAGCCGAG
- Oligonucleótido Rv, únicamente ocupando el C-terminal de Fascin1:
82
GTACTCCCAGAGCGAGGCGG
• PCR2:
- Oligonucleótido Fd, al inicio de la secuencia del conector, con zona de
solapamiento en C-terminal de Fascin1:
CCGCCTCGCTCTGGGAGTACGGCAGCGGTTCGGGAAGCGGTTC
- Oligonucleótido Rv, al final de la secuencia del conector, con zona de

solapamiento con N-terminal de PKCα:
TTGGCCGGGTAAACGTCAGCGCTTCCGCCCGAGCCACCGC
• PCR3:
- Oligonucleótido Fd, ocupando únicamente la región N-terminal de PKCα:
GCTGACGTTTACCCGGCCAA
- Oligonucleótido Rv, en C-terminal de PKCα solapando al final del vector

pFastBac:
TCCTCTAGTACTTCTCGACAAGCTTTTATACTGCACTTTGCAAGA
Para las proteínas:

• PCR1:
- Oligonucleótido Fd, en N-terminal de PKCα solapando con el principio
del vector pFastBac:
CCTGGTCCCCCGTGGTTCCGAATTCGCTGACGTTTACCCGGCCAA
- Oligonucleótido Rv, ocupando únicamente la zona C-terminal de PKCα:

TACTGCACTTTGCAAGATTG
• PCR2:
- Oligonucleótido Fd, en N-terminal del conector solapando con la zona C-
terminal de PKCα:
83
CAATCTTGCAAAGTGCAGTAGGCAGCGGTTCGGGAAGCGGTTCG
- Oligonucleótido Rv, en C-terminal del conector solapando con la zona N-

terminal de Fascin1:
TCGGCTGTGCCGTTGGCGGTGCTTCCGCCCGAGCCACCGC
• PCR3:
- Oligonucleótido Fd, en N-terminal de Fascin1 (se empleó Fascin1WT o
Fascin1S39 como molde dependiendo de la construcción):
ACCGCCAACGGCACAGCCGA
- Oligonucleótido Rv, en C-terminal de Fascin1, solapando con la región

del vector pFastBac:
TCCTCTAGTACTTCTCGACAAGCTTTTAGTACTCCCAGAGCGAGGCGG
Tal y como se ha explicado anteriormente, los fragmentos de PCR para la

formación de cada construcción se incubaban con los vectores vacíos linealizados
pFastBac dual durante 1 hora a 50ºC, junto con la mezcla de reacción de Gibson Asembly.
Posteriormente, se transformaban en células ultra competentes, se seleccionaban
colonias, se extraía ADN por medio del protocolo de minipreps y se secuenciaba la
secuencia completa para asegurar que la inserción y la construcción estaba en su total
extensión correcta. Para, posteriormente, continuar con el proceso de clonación Bac-to-
Bac explicado anteriormente.
1.4.2 GENERACIÓN DE MUTANTES.
GENERACIÓN DEL MUTANTE DE FASCIN1 S39D.
En la generación del mutante S39D para Fascin1, en el que la serina en posición

39 sería sustituida por un residuo aspártico, se consultó los codones más usados por E.
coli y así se decidió sustituir el codón AGC que codifica para Ser por el codón GCG para
Asp. Este proceso de mutagénesis dirigida se realizó de nuevo mediante el empleo del
protocolo de Gibson (Gibson et al., 2009) de la siguiente manera:
84
Se requerían 4 cebadores para realizar dos PCRs:
• PCR1:
1. Forward al inicio de la secuencia de Fascin1:
ATCGGATCTGGTTCCGCGTGGATCCACCGCCAACGGCACAGCCGA
2. Reverse en el sitio de la mutación, que incluía la mutación S39D (se marca en rojo
el sitio de la mutación):
TCTTCTTCAGCGCGCTGGCGGACGCGTTCACCT
• PCR2:
3. Forward en el sitio de la mutación, que incluía la mutación S39D (se marca en
rojo el sitio de la mutación):
GTCCGCCAGCGCGCTGAAGAAGAAGCAGATCTG
4. Reverse al final de la secuencia de Fascin1:
TCGAGTCGACCCGGGAATTCTTAGTACTCCCAGAGCGAGGCGGGG
De esta manera, se incubarían los dos segmentos de PCR junto con el vector vacío
de Fascin1 para ensamblar en su interior la secuencia de Fascin1 con la mutación incluida
para la posición 39 mediante la reacción de Gibson.
El mutante del sitio del calcio del dominio C2 de la PKCα, así como los mutantes
A y B de Fascin1, se llevo a cabo mediante la misma estrategia.
2. CULTIVOS CELULARES.
2.1 CÉLULAS DE INSECTO SF9.
Las células SF9 (Figura II.11) son células de insecto procedentes del tejido de
ovario de Spodoptera frugiperda depositadas por primera vez en 1983 por G. Smith, C.
Cherry y M.D. Summers ampliamente empleadas desde entonces para la replicación de
baculovirus y expresión de proteínas recombinantes. Presentan una morfología
característica de forma esférica y cierta apariencia granular capaz de fijarse fuertemente
a superficies, creciendo bien tanto en monocapa como en cultivo en suspensión. A
diferencia de otros sistemas de expresión como E. coli, las células de insecto SF9
85
presentan la ventaja de que son capaces de introducir modificaciones post-traduccionales

tales como fosforilaciones, que tal y como se han comentado en el desarrollo de la Tesis,
tienen un papel fundamental en la activación y funcionamiento correcto de las proteínas
PKCs. La temperatura idónea para este tipo de células oscila entre 26-28ºC y no necesita
la aplicación de fuente de CO2 (Kost et al., 2005; Vaughn et al., 1977).
Figura II.11. Células SF9. La micrografía de la izquierda muestra las células después de un subcultivo (baja
densidad) y en la micrografía de la derecha podemos observar un cultivo de alta densidad celular (Imagen
tomada de https://www.lgcstandards-atcc.org).
2.1.1 CULTIVO DE CÉLULAS SF9.
Después de descongelar los viales de SF9, el primer paso fue sembrar 10 millones
de células en monocapa en frascos de 75 cm2. Después de alcanzar la confluencia, se
levantan las células con un proceso mecánico golpeando el frasco fuertemente contra una
superficie sólida hasta conseguir que se despeguen las células casi en su totalidad.
Después de dos pases en este tipo frascos en crecimiento en monocapa, se puede pasar al
cultivo suspensión. Para ello se comienza aplicando una concentración celular de 0.5-1
millones de células por mililitro de cultivo y cada vez que alcancen los 2-4 millones de
células por mililitro de cultivo, diluirlo de nuevo a 0.5-1 millones de células. Una vez
crecen de forma adecuada, las células presentan una tasa de duplicación de
aproximadamente 2x a las 24 horas. Para el cultivo de las células SF9 se emplea el medio
Insect Xpress de Lonza suplementado con L-glutamina.
86
2.1.2 TRANSFECCIÓN DE CÉLULAS SF9.
Para la transfección de células SF9, se requiere que estas tengan una alta viabilidad
(> 95%) y se encuentren en fase logarítmica de crecimiento con una densidad de
aproximadamente 1.5 millones de células por mililitro antes del procedimiento de
transfección. Para ello, se empleaban placas de 6 pocillos, con el objetivo de sembrar el
número de células suficientes para al día siguiente obtener aproximadamente un 80% de
confluencia en la placa. Para la transfección, se usaron cantidades de ADN de entre 2.5 y
5 µg así como una cantidad del agente de transfección TransIT-insect (Mirus) de entre
2.5 y 5 µl. Las mezclas de transfección se incubaban durante 15 minutos y se añadían a
cada pocillo con las células. Se incubaba durante 72 horas. Durante este proceso, a las 24
horas, si la transfección ha ocurrido de manera adecuada, se debe ver que las células
aumentan de tamaño. A las 48 horas paran de crecer, adquieren una apariencia más
granular, se separan de la monocapa y empiezan a lisarse. A las 72 horas se recoge el
primer sobrenadante (P1A), y se añade de nuevo medio de cultivo a los pocillos de
transfección y se incuba durante otras 72 horas. Transcurridas estas 72 horas adicionales,
de nuevo, se recoge el segundo sobrenadante (P1B) que se empleará para generar el pase
2 viral. Las células restantes en los pocillos donde se han realizado las transfecciones se
recogen y tras su lisado se analizan por medio de WB para comprobar que están
expresando la proteína recombinante de interés.
2.1.3 AMPLIFICACIÓN VIRAL EN CÉLULAS SF9.
El pase viral 1 procedente del sobrenadante de transfección P1B, no tiene

capacidad infectiva suficiente para poder comenzar a llevar a cabo la infección y
producción de proteínas a gran escala, por ello es necesario llevar a cabo una
amplificación del virus. Así, el siguiente paso es generar el pase P2 viral. El título inicial
viral procedente de la transfección de las células SF9 oscila entre 1x106 y 1x107 pfu/ml
lo que supone un bajo título viral. Mediante la generación de un segundo pase viral P2,
el stock viral asciende a 1x107/1x108 pfu/ml, y con un tercer pase viral este título viral
asciende hasta 1x108/1x109 pfu/ml. De esta manera, se prepara stock viral P2 a partir del
primer sobrenadante recogido de la transfección SN P1B, y se prepara stock viral P3 a
partir de este último pase viral P2. Para ello se sigue la siguiente fórmula:
Inóculo requerido (ml) = (MOI (pfu/células) x número de células) / título del stock
viral (pfu/ml).
87
2.2 CÉLULAS MCF-7.
Las células MCF-7 (Figura II.12), son una línea celular que proceden de una
muestra aislada del tejido epitelial de la glándula mamaria de una mujer caucásica de 69
años en 1970. El individuo presentaba un adenocarcinoma de mama metastásico de
derrame pleural. MCF-7 es el acrónimo de “Michigan Cancer Foundation-7”, que hace
referencia a la institución de Detroit en donde esta línea celular fue establecida por
primera vez allá en 1973 (Soule et al., 1973). Las células MCF-7 se comenzaron a usar
como un modelo no invasivo en los estudios de cáncer de mama. La línea se obtuvo de la
American Type Culture Collection (ATCC, HTB-22). Estas células mantienen las
características del epitelio mamario en estado diferenciado tales como la capacidad de
reaccionar al estradiol a través de los receptores de estrógeno citoplasmático (ER+) y son
capaces de crecer en grupo.
Esta línea celular en particular tiene una alta cantidad de este receptor ER
haciéndolas extremadamente útiles para estudiar los diversos mecanismos relacionados
con estas hormonas. Las células MCF7 además expresan altos niveles de p70S6K que
podría actuar como marcador para mTOR y PDK-1. Otras características a destacar
dentro de esta línea son que su crecimiento puede ser inhibido por medio del tratamiento
con el Factor de Necrosis Tumoral a (TNFa) y son capaces de secretar las Proteínas de
Unión a los Factores de Crecimiento similares a la Insulina (IGFBPs) (Sugarman et al.,
1985).
2.2.1 MEDIO DE CRECIMIENTO PARA LA LÍNEA MCF-7 Y SUBCULTIVO.
El medio de cultivo empleado para el crecimiento y mantenimiento de las células

MCF-7 fue DMEM sin rojo fenol con 4500 mg/L de glucosa. El medio estaba
suplementado con un 10% (v/v) de suero bovino fetal (FCS), antibióticos (penicilina 50
unidades/ml y estreptomicina 50 μg/ml), piruvato de sodio 110 mg/ml y glutamina 2 mM.
Las células MCF-7 se incubaron en una atmósfera de 37ºC y 7.5% de CO2. El

medio fue cambiado cada dos días. Las células se diluyeron al alcanzar aproximadamente
el 80% de confluencia después de los 5 días. Las células MCF-7 que crecían pegadas en
monopaca, se despegaban de la superficie del frasco mediante el procedimiento
88
enzimático añadiendo tripsina/EDTA (0.25% tripsina/0.53 mM). Concretamente, se

incubaban 2 minutos a 37ºC. Después del proceso de tripsinización las células se
recogieron, se añadía 8 ml de medio de cultivo y se sometían a centrifugación 200g/5
minutos para eliminar el sobrenadante y añadir medio de crecimiento fresco.
Normalmente se diluían en una proporción que variaba entre 1:2 y 1:3, según la
planificación de los experimentos y se volvían a sembrar en los frascos de cultivo.
Figura II.12. Células MCF-7. La micrografía de la izquierda muestra las células después de un subcultivo
de baja densidad y en la micrografía de la derecha podemos observar un cultivo de alta densidad celular
(Imagen tomada de https://www.lgcstandards-atcc.org).
3. MÉTODOS BIOQUÍMICOS.
3.1 ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA. SDS-PAGE.
La electroforesis de proteínas SDS-PAGE es una de las principales técnicas más

utilizadas para la separación de proteínas por tamaño molecular. El SDS favorece a la
desnaturalización de la proteína, así como aporta una carga negativa que es proporcional
al tamaño de la proteína. Este es un método práctico, rápido y que necesita una cantidad
de proteína del orden de microgramos para su identificación posterior en el gel.
89
El sistema utilizado para la electroforesis en esta Tesis Doctoral fue el

MiniProtean III de BioRad Laboratories, CA, Estados Unidos, siguiendo el método
desarrollado por Laemmli en 1970. Este sistema está conformado por una fuente de
alimentación que genera un campo eléctrico mediante dos electrodos, uno positivo
(cátodo) y uno negativo (ánodo) creándose entre ellos una diferencia de potencial. Una
cubeta en cuyos extremos se sitúan los electrodos y dentro de la cubeta se coloca el
soporte electroforético con los geles de poliacrilamida. Se requiere además un tampón de
electroforesis que es necesario para proveer los iones que favorecen la transmisión de la
corriente aplicada y para mantener el pH constante evitando que el entorno anódico se
acidifique y el catódico se basifique a lo largo del proceso de electroforesis.
Durante la realización de la presente Tesis Doctoral se prepararon geles entre 10%

(p/v) y 17% (p/v) de acrilamida/bisacrilamida atendiendo al tamaño de las proteínas con
la que se estuviera trabajando. Para la realización de los geles, primero se forma el gel
separador que se deposita en la zona inferior y es donde las muestras se separan según su
carga y tamaño. La mezcla de acrilamida-bisacrilamida fue disuelta en tampón 0.375 M
Tris-HCl pH 8.8, 0.2% (w/v) SDS. Una vez polimerizado el gel separador se añadió el
gel concentrador que se deposita en la zona superior del gel y hace que todas las proteínas
se concentren en la interfase entre ambos tipos de geles y entren al mismo tiempo en el
gel separador. El gel concentrador se prepara al 5% de acrilamida en 0.125 M Tris-HCl
pH 6.8, 0.2% (w/v) SDS. Las mezclas de los geles polimerizan con la adición de PSA
0.064% y TEMED 0.064%. El tampón de electroforesis está formado por Tris-HCl 25
mM pH 8.3, glicina 192 mM y 0.1% (p/v) SDS. Las muestras para cargar en las diferentes
calles de los geles se prepararon añadiendo 5x tampón de Laemmli (0.25 M Tris pH 6.8,
10% (w/v) SDS, 50% glicerol, 0.5 M DTT, 0.25% azul de bromofenol), después se
someten a choque térmico (90ºC durante 5 minutos), para asegurar su completa
desnaturalización. Entonces, las muestras se cargaron con micropipeta en los geles y se
separaron a 100 V a través del gel concentrador y posteriormente el voltaje fue
incrementado hasta 150 V para la separación en el gel separador. Para determinar el peso
molecular de las proteínas se utilizó una mezcla de marcadores formado por proteínas
patrón de peso molecular conocido. Durante este trabajo se empleó el marcador Page
Ruler TM Plus Prestained (Thermo Fisher Scientific), que contiene una mezcla de nueve
proteínas cuyos pesos moleculares oscilan de 10 a 250 kDa.
90
3.2 TINCIÓN DE GELES CON COOMASSIE BRILLIANT BLUE.
Los geles obtenidos por medio de la electroforesis SDS-PAGE se incubaron en

una solución de azul de Coomassie Brilliant Blue G-250 0.25% (w/v) en metanol 50%
(v/v) y ácido acético 10% (v/v) durante 15 minutos. Posteriormente fueron desteñidos
con una disolución de metanol 40% (v/v) y ácido acético 10% (v/v) para visualizar las
bandas de las proteínas y asignarles un peso molecular en comparación con la escalera de
peso molecular.
3.3 ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
Los geles de agarosa donde se realizaba la electroforesis se prepararon a la

concentración adecuada para cada caso concreto (según la longitud total del fragmento
de ADN a separar se preparaban entre el 0.7% y 1%). Para preparar la mezcla del gel de
agarosa, se diluyó la cantidad de agarosa determinada en tampón de electroforesis TAE
(Tris-acetato 40 mM, EDTA 2 mM, pH 8.5), la mezcla fue hervida y depositada en un
casete para la formación del gel una vez solidificada. Se añadía del orden de 2 µl de Serva
DNA staining por cada 100 µl de mezcla preparada. Este es un colorante que se emplea
en sustitución al bromuro de etidio, mucho menos tóxico y que ayuda a revelar el
resultado final.
Las muestras de ADN cargadas en el gel se preparaban mediante la adición de

tampón de carga (azul de bromofenol 0.25% (p/v), glicerol 30% (v/v), Tris 0.5 mM pH
8.0). El glicerol favorece el depósito de la muestra, por su parte el colorante indica el
avance del frente durante la electroforesis. Para determinar el tamaño de las muestras
cargadas se usó un marcador de peso molecular (Gene Ruler Plus DNA Ladder, Thermo
Fisher Scientific).
La electroforesis se realizó aplicando una corriente de 90 V durante 60 minutos.

Para visualizar el ADN separado mediante electroforesis en gel de agarosa, se coloca el
gel en un transiluminador de luz UV y se capta la imagen con una cámara digital KODAK.
Las bandas fueron analizadas con el paquete de procesamiento de imagen Fiji del
programa ImageJ-NIH (Schneider et al., 2012).
91
3.4 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS.
Espectrofotometría UV.
La concentración de proteína se determinó midiendo la absorbancia de las

preparaciones proteicas a la longitud de onda de 280 nm en un espectrofotómetro (Nano
Photometer bio Nova). Esto se debe a que las proteínas tienen un pico de absorción
máxima a 280 nm debido a las características aromáticas de los aminoácidos aromáticos
Tirosina (λmax 275 nm) y Triptófano (λmax 278 nm y 287 nm). Por su parte, el
aminoácido fenilalanina (λmax 258 nm) y los puentes disulfuro también pueden
contribuir a la absorción en esa longitud de onda, aunque en menor medida. Es una técnica
rápida y que además necesita de un volumen pequeño de muestra. Para obtener medidas
fiables hay que tener algunas consideraciones como que la muestra esté lo
suficientemente pura y que no presente ningún componente no proteico con un espectro
de absorción similar (por ejemplo, esto puede ocurrir si hay contaminación con ácidos
nucleicos). En este sistema de medida se debe conocer la secuencia exacta de aminoácidos
de la proteína y el coeficiente de extinción molar de la proteína.
Mediante la Ley de Lambert-Beer es posible estimar la concentración de proteína:
C= Grosor cubeta (cm-1) * Abs280nm * E280 (M-1 *cm-1)
Densitometría por comparación con una proteína de concentración conocida.
De la misma manera y puesto que los ensayos biofísicos y de biología estructural

realizados en la Tesis Doctoral requerían ser muy exactos a la hora de conocer la
concentración determinada de proteína con la que trabajábamos, se realizó una segunda
medida de contraste para conocer la concentración de las proteínas lo más cercana posible
a la realidad.
Puesto que la tinción por Coomassie brilliant blue (Sigma Aldrich) funciona como
una técnica cuantitativa, esto significa que se pueden comparar las bandas de coomassie
correspondientes a distintas calles dentro del mismo gel y compararlas en términos de
concentración proteica. Así, para determinar la concentración de las proteínas, éstas se
92
corrían en SDS-PAGE junto con una proteína patrón de peso molecular y concentración
conocida tales como BSA comercial (Thermo Fishser). Posteriormente, mediante el
paquete de procesamiento de imagen Fiji del programa ImageJ-NIH (Schneider et al.,
2012), por medidas de densitometría de píxeles, se podía ajustar la concentración final a
la que estaba nuestra preparación proteica, teniendo en cuenta los volúmenes cargados en
el gel y factores de dilución.
3.5 PREPARACIÓN DE MEZCLAS LIPÍDICAS.
Los lípidos empleados para preparar las diversas mezclas lipídicas que se usaron
durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral se adquirieron en la empresa Avanti Polar
Lipids, Alabama (Estados Unidos). Las diversas mezclas lipídicas se realizaron
disolviendo los diferentes lípidos que venían liofilizados en cloroformo:metanol (2:1). En
el caso de las vesículas lipídicas con DHPE, este fosfolípido se disolvía en DMSO. Se
emplearon 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1-palmitoil-2-oleoil-
sn-glicero3-fosfoserina (POPS) y 1-α-phosphatidilinositol-4,5-bisfofato (PI(4,5)P2). Se
prepararon mezclas compuestas por POPC/POPS/PIP2 (65:25:10). Las mezclas lipídicas,
después de ser preparadas se secaban con un flujo de nitrógeno y posteriormente se
mantenían bajo vacío durante 3 horas para conseguir evaporar todos los disolventes
orgánicos que pudieran interferir con los ensayos biofísicos. Los lípidos secos finalmente
eran resuspendidos en los tampones propicios para los ensayos en los que se usaban,
sonicados fuertemente para conseguir la disolución de la totalidad del lípido.
Vesículas multilamelares (MLV).
Para preparar vesículas MLV, la mezcla lipídica resuspendida en su tampón

correspondiente se sometían a periodos de incubación a una temperatura superior a la
temperatura de transición (-80ºC) y posteriormente deshielo durante 3 veces.
Vesículas unilamelares pequeñas (SUV).
Para la preparación de vesículas unilamelares pequeñas, se partía de vesículas

multilamelares (MLV). Estas mezclas eran sometidas a varios ciclos de ultrasonicación
empleando un sonicador de tipo punta (Cole-Parmer Instrument, Co. Chicago) hasta
93
conseguir que la mezcla adquiriera una apariencia clara. Después, las mezclas se sometían
a un proceso de centrifugación 26000 g/5’ para separar las posibles MLV restantes y
eliminar las partículas de titanio desprendidas del sonicador.
3.6 CROMATOGRAFÍA.
Se trata de una técnica que permite la separación de los componentes de una

mezcla. El método se basa en poner en contacto dos fases mutuamente inmiscibles que
no reaccionan químicamente. Una de las fases es móvil y la otra estacionaria. La mezcla
para separar se deposita en la fase estacionaria, mientras que la fase móvil atraviesa el
sistema desplazando a los componentes de la mezcla. A medida que la fase móvil se
desplaza por la fase estacionaria tiene lugar una absorción selectiva. De esta manera,
aquellos elementos de la fase móvil que presentan una mayor afinidad de absorción con
la fase estacionaria quedarán retenidos en las zonas superiores de la columna de
separación y aquellos componentes que muestran una menor afinidad quedarán retenidos
en las capas más inferiores. Debido a esta diferente movilidad, se consigue separar los
componentes de la mezcla en bandas o zonas discretas que pueden analizarse de manera
cualitativa y/o cuantitativa. Este evento de migración de los componentes de la mezcla a
lo largo de la fase estacionaria recibe el nombre de elución y el tiempo que tarda un
componente en ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención. Ésta, es una
propiedad individual para cada compuesto en una fase móvil y estacionaria específicas.
Dependiendo del tipo de cromatografía, la fase estacionaria puede ser un sólido o un
líquido anclado a un soporte sólido, mientras que la fase móvil puede ser un líquido o un
gas.
Durante la realización de la presente Tesis Doctoral se han realizado las siguientes

técnicas de cromatografía basadas en el empleo de un sistema FPLC (Fast Protein Liquid
Chromatography).
Cromatografía de afinidad.
Este tipo de cromatografía se basa en la capacidad de reconocimiento entre dos

moléculas específicas. Una de estas moléculas se ancla a la matriz de la columna de
cromatografía con la que pretendemos purificar una proteína del resto. La molécula de
94
afinidad acompañante estará unida de manera covalente a la proteína que deseamos

purificar, de tal manera que se consigue una unión específica con la proteína de interés.
Cromatografía de afinidad de unión a metal (IMAC).
Este tipo de cromatografía se fundamenta en la capacidad de interacción a metales

divalentes que presentan algunos aminoácidos, principalmente cisteína e histidina que
están expuestos en la superficie de la proteína.
Durante esta Tesis Doctoral se emplearon columnas HisGraviTrap (GE

Healthcare) cargadas con iones Ni2+ capaces de retener proteínas con tallos de 6 histidinas
(6xHis).
Cromatografía de afinidad de unión a GST.
Este tipo de cromatografía se basa en la capacidad de unión a la proteína GST,

que está expuesta en la superficie de la proteína. De esta manera se hace uso de la proteína
glutatión-S-transferasa y de su capacidad natural de reconocer su sustrato glutatión.
En el desarrollo de esta Tesis Doctoral se emplearon columnas GSTrap (GE

Healthcare) cargadas con glutatión sefarosa.
Cromatografía de intercambio iónico (IEX).
Este tipo de cromatografía se basa en la propiedad de separar moléculas por carga.

Teniendo una matriz que esté cargada de manera positiva o negativa, se pueden separar
proteínas atendiendo a su carga. Se hace distinción de dos tipos de cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de intercambio aniónico (la matriz está cargada de
forma positiva de modo que quedan retenidas en la columna las proteínas cargadas
negativamente) y cromatografía de intercambio catiónico (la matriz está cargada de forma
negativa de modo que quedan retenidas en la columna las proteínas cargadas
positivamente).
En el desarrollo de la presente Tesis Doctoral se empleó la columna HiPrep Q FF

16/10 (GE Healthcare) que es una columna de intercambio aniónico.
95
Cromatografía de filtración en gel.
Este tipo de cromatografía también recibe el nombre de cromatografía de

exclusión molecular (SEC) y es uno de los métodos más empleados para la separación de
proteínas por tamaño. Las columnas empleadas para llevar a cabo este tipo de
cromatografía están rellenas de un gel, que constituye la fase estacionaria y que puede ser
de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados (sephadex), agarosa (sepharosa),
poliacrilamida... Esta fase estacionaria forma una matriz hidratada de poro de diámetro
determinado. De manera que, cuando se pasa la mezcla de moléculas con un tamaño
superior al de los poros de las partículas que constituyen la matriz, estas se mueven a lo
largo de la fase estacionaria a través de los espacios que quedan entre las partículas de la
matriz y aquellas que son más pequeñas y son capaces de penetrar en los poros, se verán
retrasadas por la fase estacionaria en mayor medida cuanto menor sea su tamaño
atravesando el camino más tortuoso y por tanto tardando más en eluir. De este modo, las
moléculas eluyen de forma inversa a su tamaño molecular.
Durante la realización de esta Tesis Doctoral se recurrió a la técnica de

cromatografía de filtración en gel empleando las columnas HP26/10 (GE Healthcare),
HiLoad 16/60 S75 (GE HealthcareEurope) y Superdex 200 HR 10/30 (GE Healthcare).
4. EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS.
Para poder realizar todas las técnicas biofísicas y de biología estructural que se
desarrollan en esta Tesis Doctoral, fue necesario conseguir altas cantidades de proteína,
con un alto grado de pureza (> 95%) así como que las muestras fuesen homogéneas. Para
conseguir una muestra que cumpliese con estos requisitos se emplearon técnicas como la
cromatografía de afinidad y de exclusión de tamaño entre otras, tal y como se ha
comentado anteriormente para conseguir la purificación de las proteínas de interés.
4.1 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PKCα, PKCε, PKCζ y PROTEÍNAS DE

FUSIÓN A, H, E y D.
Este apartado hace referencia a las siguientes proteínas:
96

- PKCα.
-PKCƐ.
-PKCζ.
La expresión de la proteína se realizó usando matraces Erlenmeyer de 2 litros, que

contenían 500 ml de medio Insect Express (Lonza) suplementado con L-glutamina y
antibiótico antimicótico, con células de insecto SF9. Cuando las células alcanzaban una
concentración de 2x106 células/ml, se infectaban con 10 MOI del pase 3 viral
correspondiente a cada una de las proteínas. Las células se dejaban incubar con el virus
en agitación a 100 rpm/27ºC y se recolectaban por medio de centrifugación a 7500
rpm/15’ a las 48 horas cuando la muerte celular rondaba el 20%.
El proceso de purificación comienza con la lisis del pellet procedente de 0.5 l de

cultivo de células SF9 con 50 ml del tampón de lisis (25 mM Tris pH 8, 1% Triton X100,
300 mM NaCl), al que se le añaden además los cócteles de inhibidores de fosfatasa y
proteasa comerciales de Deltaclon. El pellet resuspendido en el tampón de lisis se incuba
15 min en hielo. Posteriormente, la muestra con la proteína se reparte en 2 tubos en hielo,
sometidos a sonicación 10-15 segundos (10x) en intensidad nº 4 (sonicador de tipo punta,
Cole-Parmer Instrument). Tras la sonicación, la muestra se somete a centrifugación 15000
rpm/50 min/4ºC, se recupera el SN en un tubo de 50 ml en hielo y se le añade imidazol
(20 mM). El SN se filtraba con un filtro de 0.45 µm.
A continuación, el SN procedente del lisado se hace pasar por la columna

HisGraviTrap (GE Healthcare), previamente equilibrada con tampón de lisis e imidazol
(20 mM). Una vez equilibrada la columna, se pasa el SN por la columna His GraviTrap.
Después se lava la columna con 10 ml de tampón de unión. Y a continuación se aplica el
gradiente de imidazol de 30 mM a 480 mM, para liberar la fracción unida a la columna y
recuperar la proteína de interés.
97
Se recogen fracciones de 1 ml de la elución de la columna HisGraviTrap y se

forma el pool con nuestra proteína de interés. Esta muestra se diluye en 50 ml totales de
tampón 25 mM Tris pH 8, 0.1 mM EGTA, 0.5 mM DTT, 50 mM NaCl y se carga en la
columna de intercambio iónico HiPrep Q FF 16/10 (GE Healthcare). Para este proceso se
necesitaban dos tampones diferentes, el tampón de unión: 25 mM Tris pH 8, 0.1 mM
EGTA, 0.5 mM DTT, 50 mM NaCl y por otro lado el tampón de elución: 25 mM Tris pH
8, 0.1 mM EGTA, 0.5 mM DTT, 1 M NaCl.
En el siguiente paso y tras recolectar la proteína procedente de la columna HiPrep

Q FF 16/10, la alta concentración de NaCl se intercambia empleando la columna
HP26/10, previamente equilibrada con el tampón 25 mM Tris pH 8, 0.1 mM EGTA, 0.5
mM DTT, 50 mM NaCl.
En el último paso antes de concentrar la proteína, se añade al pool 5% glicerol y

0.025% Octil-b-D-tioglucopiranosido (OTG). Antes de añadir proteína al filtro de
concentración, se equilibra con el tampón que contiene glicerol y ODT. La proteína se
puede concentrar hasta 10-15 mg/ml.
Congelar a -80ºC en ese tampón con el método de congelación ultra-rápida,

normalmente sumergiendo las muestras alicuoteadas en tubos eppendorfs, en nitrógeno
líquido. A falta de éste, una combinación de hielo seco y etanol genera una mezcla lo
suficientemente fría (-77ºC) para conseguir una congelación ultra-rápida evitando la
formación de cristales de hielo que puedan comprometer la estabilidad de la proteína.
98
Figura II.14. Se muestra el grado de pureza de las diversas construcciones proteicas con las que se trabajó
en la realización de esta Tesis Doctoral, en geles de SDS-PAGE teñidos con coomassie. En la izquierda se
muestra el marcador de peso molecular y a continuación los geles con las proteínas de interés PKCα, PKCε,
PKCζ, proteína de fusión A, proteína de fusión D, proteína de fusión E y proteína de fusión H. En cada gel
aparecen además junto con las proteínas de interés dos calles de la proteína BSA a concentraciones
diferentes que posteriormente ayudaría a la determinación de la concentración proteica.
Figura II.15. Cromatograma a partir de exclusión molecular (SEC) para PKCα en su último paso de
purificación. Se muestra, además, en la zona de la derecha el gel de poliacrilamida donde se analizan las
fracciones del pico de elución de la proteína de interés. Por su alta capacidad hidrofóbica no se pudo obtener
un cromatograma de SEC para las proteínas de fusión.
99
4.2 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE RACK1.
La expresión de proteína se realiza en matraces Erlenmeyer de dos litros con 500

ml de medio TB (Terrific Broth). En primer lugar, se inocula con el stock de glicerol ya
generado con las células ultracopetentes BL21 (DE3) de E. coli que expresan nuestra
proteína de interés, 15 ml de medio de cultivo TB (Terrific Broth) y 100 µg/ml Amp. Se
deja crecer durante toda la noche en incubador 37ºC/180 rpm. Al día siguiente, se añaden
los 15 ml de este cultivo a un matraz Erlenmeyer con 500 mL de medio TB
complementado con 100 µg/ml Amp. Las células se incubaban a 37ºC en agitación (180
rpm) hasta alcanzar una densidad óptica de OD600 = 0.6-0.8.
Una vez alcanzada la OD deseada, bajar temperatura de los matraces hasta 30ºC
y entonces inducir la producción de proteína con 0.5 mM IPTG durante 6 h a 30ºC/180
rpm. Una vez transcurrido ese tiempo, centrifugar 7000 rpm/30 min para pelletizar las
bacterias. Se elimina el SN y el pellet se lava resuspendiéndolo en PBS, transferir de
nuevo el contenido a un tubo falcon y centrifugar 4500 rpm/30 min. Retirar SN y congelar
el pellet a -80ºC hasta que se comience la purificación.
El proceso de purificación de la proteína comienza con la lisis de los pellets. Para

ello se emplean 50 ml de tampón de lisis para células procedentes de 1L de cultivo TB.
El tampón de lisis está constituido por 25 mM Tris pH 8.5, 500 mM NaCl, 0.5 mM DTT
y 10% glicerol. Además, se le añaden los inhibidores de proteasas: 10 mM benzamidina,
1 mM PMSF y 10 µg/ml inhibidor de tripsina.
Las células se lisan a continuación con ultrasonicación (10 ciclos x 10 segundos)

en volúmenes de 12 ml (potencia 4) (sonicador de tipo punta, Cole-Parmer Instrument).
Después se lleva a cabo la centrifugación a 14.000 rpm en JA-20/4ºC/30 min. Una vez
finalizada la centrifugación se pasa el SN a un tubo falcon de 50 ml en hielo, se le añade
imidazol a una concentración final de 20 mM y se filtra el contenido con un filtro de 0.45
µm.
El lisado filtrado se pasa por una columna His GraviTrap (GE healthcare)
equilibrada previamente con tampón de lisis e imidazol (20 mM). Una vez cargada toda
la proteína en la columna, se lava la columna con 10 ml de lisis con imidazol.
100
El siguiente paso es eluir la proteína de interés, para recoger la fracción unida a la

columna con un gradiente de imidazol de 75 mM a 500 mM. Se recolectan fracciones de
1 ml y se genera el pool con las fracciones donde resida la proteína de interés. El imidazol
se intercambia con una columna HP 26/10 (GE healthcare) acoplada a un sistema AKTA
FPLC previamente equilibrada con el tampón: 25 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 1 mM
DTT, 3% glicerol.
Después, se recogen las fracciones que contienen nuestra proteína de interés y se

someten a digestión con trombina (0.01 U/µg) durante 2 h/18ºC en rotación, para eliminar
el tallo de 6-Histidinas. Una vez finalizada la digestión con trombina, se incuba 30 min a
4ºC con 60 µl de resina de p-aminobenzamidina para eliminar la trombina. Para
deshacerse de la resina junto con la trombina, se centrifuga 15 min/ 4800 rpm/4ºC. En
este punto se añade CaCl2 (0.5 mM) a la solución con la proteína.
El siguiente paso es concentrar la proteína con filtros Millipore 10K (Millipore

Inc., Bedford, MA) hasta 0.5 ml. Para cargar en columna de cromatografía de exclusión
molecular (SEC), HiLoad 16/60 S75 Increase (GE Healthcare) pre-equilibrada con
tampón 25 mM Tris pH 8.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT, 3% glicerol, 0.5 mM CaCl2. Se
recogen las fracciones que se correspondan con nuestra proteína pura de interés después
de chequear en gel de poliacrilamida. La proteína se concentra finalmente hasta
aproximadamente 5 mg/ml y se congela a -80ºC.
101
Figura II.16. Se muestra grado de pureza de la proteína RACK1 en su último paso de purificación, en gel
de SDS-PAGE teñido con coomassie. En la izquierda, se muestra el marcador de peso molecular, a
continuación, el gel con la proteína de interés RACK1. Aparecen además en el gel dos calles de la proteína
BSA junto con la proteína de interés a concentraciones diferentes que posteriormente ayudaría a la
determinación de la concentración proteica.
Figura II.17. Cromatograma a partir de exclusión molecular (SEC) para RACK1 en su último paso de
fracciones del pico de elución de la proteína de interés.
4.3 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE FASCIN1-WT Y FASCIN1-S39D.

ml de medio 2YT. En primer lugar, se inocula a partir del stock de glicerol ya generado
102
con las células ultracompetentes BL21 (DE3) de E. coli que expresan nuestra proteína,
15 ml de medio de cultivo 2YT con 100 µg/ml Amp y se deja crecer durante toda la noche
37ºC/180 rpm. Al día siguiente se añaden esos 15 ml de este cultivo a matraces con 500
ml de medio 2YT y 100 µg/ml Amp. Las células se incuban a 37ºC en agitación (180
rpm) hasta alcanzar una densidad óptica de OD600 = 0.6-0.8.
Una vez alcanzada la OD deseada, se reduce la temperatura de los matraces hasta

25ºC y entonces se induce la producción de proteína con 0.5 mM IPTG durante 6h a
25ºC/180 rpm. Una vez transcurrido ese tiempo, se centrifuga a 7000 rpm/30 min para
peletizar las bacterias. Se elimina el SN y el pellet se lava resuspendiéndolo en PBS,
transferir de nuevo el contenido a un tubo falcon y centrifugar 4500 rpm/30 min. Retirar
SN y congelar el pellet a -80ºC hasta comenzar la purificación.
La purificación comienza con la lisis de los pellets. Se emplean 50 ml de tampón

de lisis para el pellet procedente de 1 litro de medio de cultivo 2YT. La composición del
tampón de lisis es PBS, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 1% TritonX-100, 1 mM EDTA e
inhibidores de proteasas: 10 mM benzamidina, 1 mM PMSF y 10 µg/ml inhibidor de
tripsina. Las células se lisan con ultrasonicación (10 ciclos x 10 segundos) en volúmenes
de 12 ml (potencia 4) y en hielo. Centrifugar a 14000 rpm JA-20/60 min/4ºC.Transferir
el SN a un tubo limpio y filtrar con un filtro millipore 10k de 0.45 µm (Millipore Inc.,
Bedford, MA).
El siguiente paso es transferir el sobrenadante procedente del lisado por la

columna de afinidad GSTTrapHP 5 ml (GE Healthcare), previamente equilibrada con el
tampón de unión (PBS y 1 mM DTT). La proteína eluye una vez se aplica un gradiente
con el tampón de elución: 20 mM glutatión, 25 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM
DTT.
Se recoge el pico de proteína procedente de la elución en la columna GSTTrapHP,

y se pasa por la columna HiTrap 26/10, previamente equilibrada con 25 mM Tris pH 7.5,
100 mM NaCl y 1 mM DTT para intercambiar el exceso de glutatión.
El siguiente paso después de recoger la proteína procedente de la columna HP26-

10, es llevar a cabo la digestión con trombina (0.01 U/µg protein), 120 min/25ºC en
103
agitación. Una vez cortado el tallo, incubar con 100 µL de resina p-aminobenzamidina
45 min/4ºC en agitación. Centrifugar 4500 rmp/15 min/4ºC y recoger el SN.
Esta mezcla proteica que contiene nuestra proteína sin el tallo de GST y los tallos
libres de GST, se pasa de nuevo por la columna GSTTrapHP, equilibrada con el tampón
de unión: 25 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM DTT (en el que ahora se une solo
los tallos de GST libres, pasando por el FT (flow through) nuestra proteína de interés sin
el tallo). Posteriormente, se aplica el tampón de elución: 20 mM glutatión, 25 mM Tris
pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, para separar de la columna los tallos de GST que se
han separado por afinidad de nuestra proteína.
El último paso de purificación pasará la proteína a través de la columna de

exclusión molecular HiLoad 16/60 S75 Increase (GE Healthcare), pre-equilibrada con 25
mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM DTT. Se recoge el pico proteico de interés y se
concentra con filtros de concentración (Millipore) hasta 5-10 mg/ml. Finalmente se
alicuotea y congela la muestra proteica a -80ºC hasta el momento de su empleo.
Figura II.18. Se muestra grado de pureza de la proteína Fascin1 en su último paso de purificación, en gel
de SDS-PAGE teñido con coomassie. En la izquierda se muestra el marcador de peso molecular y a
continuación el gel con la proteína de interés Fascin1. Aparecen además en el gel dos calles de la proteína
BSA junto con la proteína de interés a concentraciones diferentes que posteriormente ayudaría a la
determinación de la concentración proteica.
104
Figura II.19. Cromatograma a partir de exclusión molecular (SEC) para Fascin1 en su último paso de
fracciones del pico de elución de la proteína de interés.
4.4 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE DOMINIOS C2.

ml de medio LB (Luria-Bertani). En primer lugar, se inocula a partir del stock de glicerol
ya generado con las células ultracompetentes BL21 (DE3) de E. coli que expresan nuestra
proteína, 15 ml de medio de cultivo LB (Terrific Broth) con kanamicina (50 ug/ml), y se
deja crecer durante toda la noche a 37ºC/180 rpm. Al día siguiente, se añaden esos 15 ml
de cultivo a los 500 ml de medio LB y kanamicina (50 µg/ml). Las células se incubaban
a 37ºC en agitación (180 rpm) hasta alcanzar una densidad óptica de OD600 = 0.6-0.7.
Una vez alcanzada la OD deseada, se disminuye la temperatura de los matraces

hasta los 30ºC, y se induce la producción de proteína con 0.5 mM IPTG durante 5h a
37ºC/180 rpm. Una vez transcurrido ese tiempo, se centrifuga 7000 rpm/30 min para
pelletizar las bacterias. Se elimina el SN y el pellet se lava resuspendiéndolo en PBS,
transferir de nuevo el contenido a un tubo falcon y centrifugar 4500 rpm/30 min. Retirar
SN y congelar el pellet a -80ºC hasta el día de la purificación.
105
La purificación comienza con la lisis de los pellets. Para ello se emplean 50 ml de

tampón de lisis para el pellet procedente de 1L de medio de cultivo LB. La composición
del tampón de lisis es de 25 mM Hepes pH 7.4, 300 mM NaCl e inhibidores de proteasas
(10 mM Benzamidina, 1 mM PMCSF y 10 µg/ml inhibidor de tripsina). Las células se
lisan con ultrasonicación (10 ciclos x 10 segundos) en volúmenes de 12 ml (potencia 4)
y en hielo. Centrifugar a 14000 rpm JA-20/60 min/4ºC.Transferir el S/N a un tubo limpio
y filtrar con filtro 10k de 0.45 µm (Millipore).
El lisado filtrado se pasa por una columna His GraviTrap (GE healthcare)
equilibrada previamente con tampón de lisis e imidazol (20 mM). Una vez cargada toda
la proteína en la columna, se lava la columna con 10 ml de lisis con imidazol (20 mM).
El siguiente paso será eluir nuestra proteína, para recoger la fracción unida a la
columna con un gradiente de imidazol de 30 mM a 480 mM. Se recogen fracciones de 1
ml y se genera el pool con las fracciones donde resida nuestra proteína de interés. El
imidazol se intercambia con una columna de intercambio iónico HP 26/10 (GE
healthcare) acoplada a un sistema AKTA pure FPLC previamente equilibrada con el
tampón: 25 mM Hepes pH 7.4 y 100 mM NaCl.
El siguiente paso después de recoger la proteína procedente de la columna HP26-

10, es llevar a cabo la digestión con trombina (0.01 U/µg), 120 min/25ºC en agitación.
Una vez cortado el tallo, incubar con 100 µl de resina p-aminobenzamidina 45 min/4oC
en agitación. Centrifugar 4500 rpm/15 min/4ºC para eliminar la resina y recoger el SN.
El último paso de purificación pasa la proteína a través de la columna exclusión

molecular HiLoad 16/60 S75 Increase (GE Healthcare), pre-equilibrada con 25 mM
Hepes pH 7.4, 100 mM NaCl. Se recoge el pico proteico de interés y se concentra con
filtros de concentración (Millipore) hasta una concentración de en torno 5-10 mg/ml.
Finalmente se congela la proteína a -80ºC hasta su empleo. Previamente a la congelación,
se añade glicerol (10%) como agente crioprotector.
106
Figura II.20. Se muestra el grado de pureza de la proteína del dominio C2A de PKCα en su último paso de
purificación, en gel SDS-PAGE teñido con coomassie. En la izquierda se muestra el marcador de peso
molecular y, a continuación, la proteína de interés, el dominio C2 de PKCα. Aparecen además en el gel dos
calles de la proteína BSA junto con la proteína de interés a concentraciones diferentes que posteriormente
ayudaría a la determinación de la concentración proteica.
5. TÉCNICAS BIOFÍSICAS.
5.1 SPR.
Los biosensores con detección por Resonancia del Plasmón de Superficie (SPR)
permiten obtener información cinética de la interacción entre un ligando y un receptor a
tiempo real. Se caracterizan por su simplicidad, sensibilidad y selectividad. El uso de esta
técnica se remonta a finales de los años 60 para el estudio de procesos superficiales en
metales, la detección de interacciones biomoleculares con esta técnica versa de principios
de los años 80 por parte de Liedberg, Nylander y Lundström (Hoa et al., 2007; Yesudasu
et al., 2021).
El fundamento del SPR se basa en un fenómeno óptico que tiene lugar en una
superficie metálica cuando existe un cambio en el índice de refracción de dos medios
distintos. Cuando se produce una variación en la masa de la superficie, por ejemplo, una
interacción entre dos moléculas, se origina un cambio en el índice de refracción y, por lo
tanto, el ángulo de la luz reflejada a la cual se produce la resonancia entre la luz y el
plasmón de superficie varía. La diferencia es proporcional a la cantidad de sustrato unido
a la superficie, mientras que la velocidad a la que tiene lugar el cambio de ángulo depende
de la cinética de la interacción (Figura II.21) (Amendola et al., 2017; Pattnaik, 2005).
107
Figura II.21. Esquema general de detección de un biosensor por SPR. El fenómeno de SPR ocurre cuando
las ondas del plasmón de superficie son excitadas en una interfase metal/líquido. La luz se dirige hacia y se
refleja desde el lado de la superficie que no está en contacto con la muestra, el SPR produce una reducción
en la intensidad de la luz reflejada en una combinación específica de ángulo y longitud de onda. Los eventos
de unión causan cambios en el índice de refracción en la capa superficial que se traduce en cambios en la
señal de SPR. Imagen tomada de la web de BioPhysics Core Facilities.
La respuesta de la unión del ligando al receptor se mide en unidades arbitrarias de

resonancia (RUs) y representan la cantidad de materia unida a la superficie, en el caso de
las proteínas, 1000 RU son equivalentes a 1 nmol l -1 mm-2. La cinética de la interacción
se obtiene a partir del cambio de la respuesta frente al tiempo y la relación entre la
respuesta (RU) y el tiempo (t) en segundo determina el sensograma.
Un sensograma representa el resultado de la interacción entre un analito y un

ligando (Figura II.22). El ligando se encuentra inmovilizado en la superficie y una vez el
analito fluye sobre la superficie teniendo lugar la interacción, se genera un aumento en la
señal hasta llegar a un punto en el que la superficie se satura y la señal se estabiliza. En
este momento, comienza la fase de disociación del analito. Por último, se produce la
regeneración de la superficie del chip eliminando todo el analito, quedando la superficie
preparada para una nueva medida.
108
Figura II.22. Se representa un sensograma ejemplificativo, que es la respuesta de un experimento de SPR.

Una vez inmovilizado el ligando en la superficie, el analito fluye sobre la misma y tiene lugar el potencial
de interacción entre ambos, lo que se traduce en un aumento de la intensidad de la señal que se mide en
unidades de resonancia (RUs) hasta llegar a un punto en el que la superficie se encuentra saturada y la señal
se estabiliza. En este momento se inicia la fase de disociación. Por último, se lleva a cabo la regeneración
de la superficie del chip eliminando todo el analito quedando la superficie lista para una nueva medida. La
cinética de la interacción se obtiene analizando las curvas de asociación (Ka) y disociación (Kd) que van
variando a lo largo del tiempo para diferentes concentraciones de analito, pudiéndose obtener la constante
de afinidad K.
La cinética de la interacción se obtiene analizando las curvas de asociación (Ka) y

disociación (Kd).
En el desarrollo de esta Tesis Doctoral se estudió el potencial de interacción entre

la proteína PKCα y el analito Fascin1. La proteína PKCα se acopló a un chip de matriz
de carboximetildextrano por aminas: CM5. Posteriormente los analitos, potenciales
ligandos de esta proteína se inyectaron sobre el chip diluidos en tampón 10 mM Hepes,
150 mM NaCl. Cuando hay unión, la variación de masa producida en la superficie del
chip provoca un cambio en la reflexión que se traduce en un incremento de señal que se
cuantifica como unidades de resonancia (RUs). Tras la asociación, se pasa un tampón de
lavado sobre el chip que produce la disociación de los analitos y en consecuencia se
observa una caída en la señal de RUs en el sensograma. Para llevar la señal a los niveles
basales y preparar al chip para una nueva interacción, se puede inyectar sobre el chip una
solución de regeneración para disociar las moléculas de analito que puedan quedar unidas
109
al ligando. Estos experimentos se llevaron a cabo con un biosensor tipo Biacore T200 en
el laboratorio de biología estructural de Grenoble (Francia).
Debido a que la regeneración no era suficientemente buena en nuestro ensayo, y

no se conseguía obtener que la línea base alcanzara los niveles basales para favorecer un
método MCK (multi cycle kinetis), tuvimos que llevar a cabo un enfoque de tipo SCK
(single cycle kinetics) debido a la naturaleza de la unión de nuestras proteínas.
Como sus nombres indican, las principales diferencias son, que en el caso del
ensayo MCK, cada concentración de analito se añade en ciclos separados. Mientras que
en el ensayo de tipo SCK, las concentraciones de analito se añaden de forma secuencial
en un único ciclo (Figura II.23).
Figura II.23 A) Ejemplo de ensayo de SPR con una cinética de tipo MCK. Cada curva representa un ensayo
diferente a distintas concentraciones del analito. B) Ejemplo de ensayo SCK, en el mismo ensayo (la misma
curva) se añaden concentraciones crecientes del analito. Imagen obtenida de la web Cytiva Life Sciences.
El método SCK que se empleó en esta Tesis Doctoral, tenía 7 ciclos diferentes:
los primeros 3 ciclos eran ciclos de iniciación (start-up) (consistían en la inyección de
tampón para equilibrar el sistema y minimizar el ruido), los ciclos 4 y 6, eran los ciclos
de SCK con la inyección de tampón y la doble referencia. Por su parte, los ciclos 5 y 7
eran los ciclos donde tenía lugar la inyección del analito de la muestra en concentraciones
crecientes.
El esquema básico del ensayo fue el siguiente:
1. Acoplamiento del anticuerpo anti-6xHis al chip del sensor CM5.

2. Inyección del ligando: 6xHis-PKCα.
110
3. Inyección del analito: Fascin1-WT o Fascin1-S39D (a concentraciones 0.625-

1.25-2.5-5-10 µM, SCK) en presencia de las diversas combinaciones de ligandos.
-Condición 1: CaCl2.
-Condición 2: CaCl2 + éster de forbol P13A
-Condición 3: CaCl2 + ADP-MgCl2.
-Condición 4: CaCl2 + éster de forbol P13A + ADP-MgCl2.
4. Disociación: se empleó tampón que contenía EGTA.
5. Regeneración: se empleó el tampón 10 mM glicina-HCl pH 2.1.
Aprovechando el tallo de 6 histidinas que contenía nuestra construcción de PKCα,

se derivatizó el chip con anticuerpos anti-6xHis. De esta manera, uniéndose los
anticuerpos a través del tallo de 6 histidinas se le permite cierta libertad a la proteína para
poder adoptar diversas conformaciones que requiera para poder llevar a cabo la
interacción con su sustrato Fascin1. La derivatización de Fascin1 se descartó
directamente puesto que el sitio de fosforilación se encontraba muy cercano a la etiqueta
de la proteína. De esta manera, evitábamos que ello pudiera generar algún tipo de
problema a la hora de reconocer PKCα y fosforilar ese residuo que es fundamental para
la unión entre ambas proteínas.
Al principio, se determinó que la concentración de PKCα en la que íbamos a

considerar una respuesta adecuada se correspondía con 200-300 RUs. Se probaron
diversas concentraciones de proteína y se determinó que un rango entre 1.4 µM y 14 µM
era adecuado.
Equipo y software empleado fueron:

- Sistema: Biacore T200 (GE Healthcare).
- Sofware del sistema: Biacore T200 control software v4.1 (GE Healthcare).
- Software de análisis: BiaEvaluation T200 software v.3.1 (GE Healthcare).
Parámetros del Biacore: Temperatura 25ºC, células de flujo Fc3 y Fc4, a un flujo
de 60 µl/min.
El analito, tanto para Fascin1WT como para Fascin1S39D, se añadió a las

concentraciones: 0.625, 1.25, 2.5, 5 y 10 µM
111
Parámetros generales de análisis:
-Método: SCK, cinética de un único ciclo.
-Asociación: 120 s/inyección
-Disociación: 1800 s
-Tampón de regeneración: 1M NaCl o EGTA. Tiempo: 30 s. Pulsos: 3
-Equilibrado: 600 s
-Replicados: 2
-Ciclos 4 y 6: concentración cero
-Ciclo 5: Fascin1 WT
-Ciclo 7: Fascin1 S39D
5.2 THERMAL SHIFT ASSAY Y POLIDISPERSIDAD MEDIANTE LA

PLATAFORMA UNcle.
La plataforma UNcle es única al presentar un todo en uno en la misma maquinaria

siendo capaz de medir el espectro de fluorescencia completo, SLS (static light scattering)
y DLS (dynamic light scattering). Así, ofrece toda la información de estabilidad y
agregación proteica usando únicamente 9 µl de muestra por ensayo a una concentración
de 1 mg/ml. De esta manera, las muestras sometidas a incrementos de temperatura (15-
95ºC) tendrán diferentes comportamientos en cuanto a desnaturalización y agregación se
refieren y que podrán ser medidas por medio de la herramienta UNcle.
Los principales parámetros en los que nos fijamos a la hora de elaborar nuestros
ensayos fueron:
- Tm, temperatura de fusión. Este parámetro se determina mediante la medida

intrínseca de la propia fluorescencia (medida en unidades relativas de BCM, barycentric
mean medida en nm) de la proteína a través de sus aminoácidos aromáticos expuestos a
medida que la proteína experimenta cambios conformaciones como resultado de una
rampa de temperatura. A medida que se aumenta la temperatura de una proteína, los
112
enlaces que mantienen la estructura terciaria como un todo, terminan por ceder y se
expone el interior hidrófobo de la proteína al entorno polar del tampón. Así, la manera de
captar este proceso de desnaturalización es por medio del cambio del espectro de emisión
de los nuevos aminoácidos aromáticos expuestos. De esta manera, comparando la
estabilidad de los constructos o comparando diferentes formulaciones, se puede
determinar cuales son las mejores condiciones que nos interesan a la hora de realizar
técnicas de biología estructural. De forma general, se produce un cambio en la intensidad
de la fluorescencia medida en términos de BCM (media baricéntrica), o un cambio en el
pico observable a medida que la proteína se extiende al romperse su estructura terciaria
(Miotto et al., 2019).
La ecuación de BCM se define en el rango de 300 a 450 nm, por lo que cada valor
de longitud de onda (λ) se multiplica por la intensidad de fluorescencia del triptófano (I)
a esa longitud de onda y la suma de ese valor para todas las longitudes de onda entre 300
y 450 se divide por la suma de intensidades en esas longitudes de onda. Esto da como
resultado una longitud de onda máxima "promediada" (λBCM) para un espectro dado que
elimina el ruido y se adapta a los cambios en la forma del espectro (Miotto et al., 2019).
Esto se ejemplifica en la siguiente fórmula:
- Tagg, temperatura de agregación. Se puede determinar como y cuando la

proteína en estudio agrega durante la rampa de temperatura, empleando SLS (small light
scattering) midiendo a dos longitudes de onda diferentes (266 nm para sensibilidad y 473
nm para rango dinámico) al mismo tiempo para detectar tanto pequeñas como grandes
partículas. En estas medidas las muestras son iluminadas con un láser y se mide la
intensidad reflejada a 90º. El SLS se basa en el empleo del fenómeno conocido como
elastic scattering, que ocurre cuando el haz de un láser incide en una partícula y los
electrones de la partícula re-emiten radiación en la misma frecuencia en todas direcciones
(Minton, 2007).
113
- Tamaño y polidispersidad. Estas medidas se realizan por medio de DLS, que es

una herramienta muy sensible para la medida del tamaño hidrodinámico de proteínas y
pequeñas moléculas en solución. Siendo capaz de medir proteínas a concentraciones tan
bajas de 0.05 mg/ml. Mediante el DLS, el sistema UNcle identifica la presencia de
agregados o impurezas y confirma que la molécula bajo estudio es del tamaño esperado.
La polidispersidad es una medida de no uniformidad en nuestras muestras. Si las
partículas no son uniformes en tamaño, se obtendrá una gran polidispersidad. Una baja
polidispersidad, por el contrario, indica una mayor uniformidad en el tamaño de las
partículas. De esta manera, la técnica de DLS mide fluctuaciones de la luz medida de
forma dependiente del tiempo, para darnos información sobre el radio hidrodinámico de
las moléculas y partículas que existen en una solución, la distribución de intensidad,
tamaño ponderado en masa, así como los tamaños de los agregados y su cantidad relativa.
Así, obtenemos la información valiosa sobre el tamaño molecular, polidispersidad
agregación y estimación del peso molecular (Lorber et al., 2012; Shiba et al., 2010).
El DLS de UNcle mide la intensidad de luz dispersa de las partículas a medida

que se mueven en el medio. Esto es debido a que las partículas suspendidas en una
solución impactan con las moléculas del solvente que las rodean y se mueven de forma
aleatoria en un movimiento denominado de tipo Browniano. De esta forma, a medida que
se mide la intensidad de la luz dispersa, se tiene que convertir en una función de
correlación para de esta manera calcular la “no-aleatoriedad” a partir del movimiento de
difusión aleatorio (Lorber et al., 2012).
Figura II.24. Ilustración del principio de la Dispersión Dinámica de la Luz. El movimiento browniano de
las partículas en suspensión hace que la luz láser se disperse a diferentes intensidades. Con el análisis de
las fluctuaciones, que son consecuencia del movimiento browniano de las partículas, se obtiene la velocidad
del movimiento browniano y permite la determinación del coeficiente de difusión y del tamaño de las
partículas mediante la ecuación de Stokes-Einstein (Lorber et al., 2012). Imagen tomada de wiki.anton-
paar.com
114
Ajustando la función de correlación a una única exponencial, se puede calcular el

coeficiente de difusión. Por otra parte, la ecuación de Stokes-Einstein se puede usar
entonces para determinar la media del radio hidrodinámico. Para ello, hay que recordar
que el tamaño medido por DLS se define como el tamaño de una esfera hipotética que
difunde en la misma proporción que las partículas están siendo medidas (Figura II.25)
(Lorber et al., 2012).
Figura II.25. Ecuación de Stokes-Einstein. Rh, radio circular de la partícula. K, constante de boltzmann. T,
temperatura absoluta del fluido. π, 3.14. D, constante de difusión. η, Viscosidad del fluido. Imagen tomada
de la web de UNcle Unchained labs.
Cuando el modelo se ajusta a una única exponencial, la función de correlación

provee el índice de polidispersidad. En términos relativos, está establecido que este índice
puede indicar si una muestra es monodispersa si se mantiene por debajo de 0.25 (Figura
II.26) (Shiba et al., 2010).
Figura II.26. Índice de polidispersidad. Imagen tomada de la web de UNcle Unchained labs.
Así, el DLS de UNcle convierte la función de correlación en una distribución de

intensidad. En el caso de las muestras polidispersas, el algoritmo encaja múltiples
115
exponenciales para determinar la distribución del tamaño con el modelo que mejor encaje
con los resultados experimentales.
Para todo ello, la maquinaria UNcle incorpora detectores de tipo CCD (dispositivo
de carga acoplada), que presentan las ventajas de ser rápidos, tener alta sensibilidad,
especialmente adaptados para aplicaciones relacionadas con UV y además recogen
información del espectro completo que da la información del estado conformacional de
la muestra (https://www.unchainedlabs.com/uncle/).
5.3 ESPECTROMETRÍA DE MASAS NATIVA.
Para la realización de la espectrometría de masas nativa se empleó un instrumento

de tipo LC-MS-Orbitrap (Thermofisher). El primer paso fue disolver las proteínas en
solventes no desnaturalizantes para mantener parte de las proteínas en un estado casi
nativo quaternario en la fase gas. Para todas las condiciones probadas en MS, el tampón
proteico se intercambió por NH4-OAc. Antes del análisis en el espectrómetro de masas
orbitrarp, las muestras eran sometidas a un proceso de ionización en electrospray (ESI).
Aproximadamente 1-2 ul de las muestran eran cargadas en un capilar de vidrio para el
nano-electrospray al cual se le aplicaba un voltaje de entre 1.2 y 1.6 kV. Los datos se
obtuvieron en el instrumento Orbitrap Q Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific), en el
rango de m/z de 400-30000 Th.
El Orbitrap es un analizador de masas de trampa iónica que consta de dos

electrodos exteriores y un electrodo central, lo que le permite actuar como analizador y
detector. Los iones que entran en el Orbitrap se capturan mediante "compresión
electrodinámica", después de lo cual oscilan alrededor del electrodo central y entre los
dos electrodos exteriores. Los diferentes iones oscilan a diferentes frecuencias, dando
lugar a su separación. Al medir las frecuencias de oscilación inducidas por los iones en
los electrodos externos, los espectros de masa de los iones se adquieren mediante la
detección de la corriente de la imagen. Gracias a su configuración, el analizador de masas
Orbitrap es en realidad un analizador de masas de transformada de Fourier (FT), análogo
de la tecnología de resonancia ciclotrónica de iones con FT (ICR), pero con un tamaño
de instrumento más pequeño y un funcionamiento más sencillo (Kaufmann, 2018).
116
Finalmente pudimos analizar y estudiar los picos de nuestras proteínas en su

estado nativo asociados a las diversas relaciones masa/carga de nuestras proteínas, así
como su proporción relativa dentro de la preparación.
5.4 ENSAYOS DE ENTRECRUZAMIENTO.
Para los ensayos de entrecruzamiento desarrollados en esta Tesis se empleó el

entrecruzador BS3 (Bis(sulfosuccinimidyl) suberato) a una concentración final de 5 mM.
Figura II.27. Fórmula química del entrecruzador BS3
Las principales propiedades del BS3 son las siguientes:

• Nombres alternativos: Sulfo-DSS
• Fórmula molecular: C16H18N2O14S2Na2
• Peso molecular: 572.43 g/mol de infrarrojo
• Longitud del brazo del separador: 11.4 Å (8 átomos)
• Número de CAS: 82436-77-9
• Grupos reactivos: ésteres NHS, reaccionan con aminas primarias a pH 7,0-9,0.
Puesto que los principales grupos de reacción son las lisinas que las proteínas
tienen expuestas, se llevó a cabo un estudio a nivel estructural de las proteínas
seleccionadas PKCα, Fascin1, PKCε y RACK1 para asegurarnos que contaban con
lisinas suficientes expuestas en la superficie como para favorecer la unión en las
superficies donde se sabe que la interacción tiene lugar.
En las siguientes imágenes se muestran dos ejemplos en PyMOL para PKCα y

Fascin1 en los que se muestran las lisinas con sus cadenas laterales expuestas en modo
de varillas.
117
Figura II.28. Se representan las cadenas laterales de lisinas dentro de la predicción estructural de PKCα
(ClusPro). Imagen realizada por medio de PyMOL.
Figura II.29. Se representan las cadenas laterales de lisinas dentro de la estructura de Fascin1. Imagen
realizada por medio de PyMOL (PDB: 1DFC).
Se probaron los complejos proteicos PKCα-Fascin1 y PKCε-RACK. Se empleó

una concentración de 0.5 mg/ml para las PKCs, así como su concentración equimolar
118
para sus proteínas compañeras RACK1 (proteína anclaje de PKCε) y Fascin1 (Sustrato
de PKCα).
En primer lugar, los tampones proteicos se intercambiaron por el siguiente

tampón: 20 mM Hepes pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM DTT) con filtro especiales de
diálisis (Thermo Scientific).
Diferentes combinaciones de aditivos se añadieron en las mezclas proteicas.
Para PKCα -Fascin1:

Condición 1. Complejo proteico + CaCl2
Condición 2. Complejo proteico + CaCl2 + éster de forbol P13A
Condición 3. Complejo proteico + CaCl2 + éster de forbol P13A + ADP-MgCl2
Condición 4. Complejo proteico + CaCl2 + ADP-MgCl2
Condición 5. Complejo proteico + ADP-MgCl2
Para PKCε -RACK1:

Condición 1. Complejo proteico + CaCl2 + éster de forbol P13A
Condición 2. Complejo proteico + CaCl2 + éster de forbol P13A + ADP-MgCl2
Condición 3. Complejo proteico + CaCl2 + ADP-MgCl2
Las concentraciones finales para los aditivos fueron: CaCl2 0.2 mM, éster de
forbol P13A 0.2 mM, ADP 2 mM y MgCl2 5 mM.
Las mezclas se incubaron a 25ºC durante 2 horas. Se tomaron muestras a tiempo

cero (antes de añadir el BS3), se añadía BS3 a 5 mM y se recogían muestras a 30’, 1h y
2h. Por último, se añadía SB5x a las muestras, se incubaban 5’ a 90ºC y se analizaban en
un gel de acrilamida PAGE 15%.
119
5.5 ENSAYOS DE FRET.
Los principios de los ensayos de FRET se basan en que si una molécula fluorófora
donadora se encuentra en proximidad (aproximadamente entre 1-10 nm) a un fluoróforo
aceptor, la transferencia de energía al fluoróforo aceptor por medio de interacciones
dipolo-dipolo, compiten con el retorno radiativo (emisión de fotones) de la molécula
donadora a su estado basal. El aceptor, ahora en su estado excitado puede retornar a su
estado basal mediante la emisión de un fotón y, la proporción de fotones emitido por las
moléculas donadora y aceptora definen la eficiencia de la transferencia (Figura II.30 A).
De esta manera el proceso de FRET solo ocurre si el espectro de emisión de la sonda
dadora solapa con el espectro de excitación de la sonda aceptora (Figura II.30 B y Figura
II.31) (Gust et al., 2014).
Figura II.30. A) Diagrama explicando el efecto de la fluorescencia. A) La absorción de un fotón por un

fluoróforo eleva un electrón hasta un estado excitado de energía. En este estado, el electrón baja a un estado
de menor excitación mediante un proceso de relajación vibracional carente de radiación. El estado excitado
es muy inestable, generando un retorno al estado basal en cuestión de nanosegundos. En esta recuperación
al estado basal se produce una liberación de fluorescencia. B) Se muestra el diagrama de Jablonski que
explica el proceso de FRET. Cuando una molécula dadora se encuentra en proximidad (1-10 nm) a una
molécula aceptora, la energía liberada por la molécula dadora es tomada por un aceptor adecuado que se
encuentra en estrecha proximidad, generando la excitación de uno de sus electrones y después a la emisión
de un fotón (Hochreiter et al., 2015).
120
Figura II.31. Se muestran los espectros de absorción y fluorescencia de una pareja ideal de dador y aceptor.
La zona sombreada en marrón se corresponde para la zona de solapamiento entre el espectro de
fluorescencia del dador y el espectro de absorción del aceptor (Gust et al., 2014).
Para los ensayos realizados en esta Tesis Doctoral, se emplearon los fluoróforos
triptófano (aprovechando los propios aminoácidos aromáticos de las proteínas) y el
fosfolípido fluorescente DHPE (Figura II.32). Para los cuales, los espectros de emisión y
absorción solapaban de manera idónea para desarrollar los ensayos (Figura II.33).
Figura II.32. Estructura química del lípido DHPE (Forte Blue). Imagen tomada de https://www.aatbio.com
121
Figura II.33. En la figura se muestran los espectros de emisión y excitación del triptófano (espectros
delimitados con líneas punteadas) y del DHPE (espectros sombreados en gris y violeta). Imagen realizada
a partir de la web www.aatbio.com.
De esta manera, en primer lugar, se puso a punto el ensayo control mediante la

adición de lípidos en volúmenes crecientes a la mezcla proteica para definir un espectro
con los suficientes puntos en la zona de no saturación y distribuidos de forma adecuada
entre ellos. Así, posteriormente una vez incubadas las proteínas con los fármacos, se
pudiese observar con suficiente claridad que la incubación con fármacos pudiese tener
algún efecto en la capacidad de unión de la proteína a la mezcla lipídica con DHPE. De
esta forma, se elaboraron curvas hipérboles de saturación para cada una de las condiciones
control y para cada uno de los fármacos.
Se partió de un stock de lípidos POPC, POPS, PIP2 y DHPE en una proporción

68:25:5:2 a una concentración stock de 1.5 nm. Tras preparar las mezclas lipídicas de tipo
vesículas unilamelares (SUV), se añadía a la cubeta de cuarzo 9 adiciones secuenciales
de 1 µl de la mezcla lipídica (en los que se añadían de 1 a 9 µM de lípido total en la
cubeta). Posteriormente, se añadían 4 adiciones de 2 µl de lípidos cada una (en los que se
añadía de 11 a 17 µM de concentración de lípido en la cubeta) hasta alcanzar la saturación
de la curva. Esto se aplicó tanto para las mezclas proteicas control sin fármaco, así como
para las mezclas proteicas incubadas con cada fármaco. La medida de fluorescencia se
realizaba tanto a tiempo cero antes de añadir ningún lípido, como justo después de añadir
122
cada volumen de lípido con una microjeringa Hamilton y resuspender el contenido de la

cubeta.
Las mezclas del fármaco con la proteína se dejaban incubar durante 5 minutos
antes de tomar la medida a tiempo cero y comenzar a añadir los volúmenes de lípido. Las
concentraciones finales de fármaco oscilaron entre 2-200 mM según el fármaco probado.
Las mediciones de fluorescencia se realizaron por medio de un equipo Bruker

Vector 22 Fourier-transform infrared spectrometer equipado con detector MCT y
empleando una placa ATR de germanio (Specac, Orpington, U.K.) (52 mm × 20 mm × 2
mm), con un ángulo de apertura de 45°. Los espectros fueron grabados con la polarización
paralela y perpendicular del haz incidente usando un polarizador ZnSe (Specac,
Orpington, U.K.) a temperatura ambiente.
5.6 ENSAYOS DE SEDIMENTACIÓN LIPÍDICA.
Se prepararon vesículas multilamerales (MLVs) con mezclas que contenían

POPS/POPC/PIP2 (25:65:10) y fueron tratadas con nitrógeno gaseoso y bajo atmósfera
de vacío durante 3 horas para la eliminación de posibles restos de solventes orgánicos.
Los lípidos secos fueron resuspendidos en el tampón 20 mM Hepes pH 7.4 y NaCl 100
mM.
Para llevar a cabo los experimentos se combinaron el dominio C2 de la proteína

PKCα (tanto la versión WT como el mutante del calcio D246A-D248A) junto con los
fármacos concretos durante 5 minutos a 25ºC. Entonces, se añadía CaCl2 (2.5 mM) y
posteriormente 1 mM de la mezcla lipídica.
La mezcla con los lípidos se incubó durante 5 minutos a 25ºC y a continuación se

centrifugó a 34000xg durante 25 minutos. Pasado este tiempo se separó la fracción
soluble (S, sobrenadante) de la fracción unida a los lípidos (P, pellet) y fue analizada
mediante electroforesis SDS-PAGE con geles de acrilamida al 17% de tamaño del poro.
Los geles fueron teñidos con Commassie Brilliant Blue G250 y la cuantificación final de
123
los resultados para analizar la proporción en el S y P fue llevada a cabo con el paquete de
procesamiento de imagen Fiji del programa ImageJ-NIH (Schneider et al., 2012).
6. TÉCNICAS CON CÉLULAS MODELO DE CÁNCER DE MAMA.
6.1 ENSAYOS DE PERFUSIÓN ACOPLADOS AL MICROSCOPIO

CONFOCAL.
Para estos ensayos se acopló un sistema de perfusión que controla la microfluídica

(OB1 MK3+ microfluidic flow controller, Elveflow) a través de placas de perfusión.
Estas placas están ideadas para este fin, en el que el sistema que aplica un flujo se conecta
a una entrada en las placas que tienen otra salida para recoger el flujo saliente en este
sistema de microfluídica. Estas placas presentaban microcanales centrales en los que se
podían sembrar las células MCF-7 empleadas para estos experimentos y llevar a cabo los
ensayos celulares. Las células se sembraban de tal manera que se alcanzara
aproximadamente un 60% de confluencia el día en el que se realizaba el ensayo de
perfusión antes de aplicar el microfluido en las placas de perfusión.
En este sistema, donde el flujo estaba controlado por un sistema de presión

externo, se hizo uso de dos bombas a través del juego de válvulas del sistema, cada una
conectada a fuentes de llenado diferentes. En una fuente de llenado solo había medio de
cultivo de las células MCF-7 con el que se aplicaría el flujo inicial a las placas antes de
iniciar el ensayo, así como para lavar el sistema después de añadir los fármacos
estimulantes. Y, por otra parte, otro volumen de llenado con los estimulantes ionomicia
(2 µM) y DiC8 (50 µg/ml) diluidos en el medio de cultivo y a las concentraciones finales
a las que se conoce que tienen un efecto de translocación de PKCα a la membrana en
condiciones normales y que se aplicarían cuando se iniciara el experimento. Así, mediante
el control computarizado del sistema, se podía alternar entre una bomba y otra cambiando
el sistema de válvulas.
De esta manera, por medio de este método controlando el flujo adecuado tras
poner a punto todo el sistema, se podía sincronizar cada uno de los ensayos. En primer
lugar, se incubaban células de cáncer de mama MCF-7 con los fármacos
124
correspondientes, así como controles en los que se añadían las concentraciones de DMSO
finales a las que quedaban los fármacos diluidos en el medio tras añadirlos a sus pocillos
de las placas de perfusión. Posteriormente, tras acoplar la placa en el sistema de perfusión
y tenerla conectada al microscopio confocal, se podía estudiar si la estimulación
sincrónica de cada una de las condiciones producía diferencias en cuanto a la
translocación de la proteína PKCα a la membrana. Para ello se comparaba las condiciones
en las que las proteínas habían sido incubadas con fármacos con las condiciones control.
El flujo empleado en el sistema de perfusión fue de 0.1 ml/min.
Los análisis de line profile para cuantificar la cantidad de proteína que se

desplazaba a la membrana en cada uno de los ensayos realizados, se llevó a cabo por
medio del paquete de procesamiento de imagen Fiji del programa ImageJ-NIH (Schneider
et al., 2012) siguiendo el método de Meyer y Oancea (Meyer & Oancea, 2000). Este
método se realizó para cada célula y para determinar la proporción de proteína en
membrana se aplicaba la siguiente fórmula:
En la fórmula, R es el porcentaje de proteína que se mueve hacia la membrana,

Imp es el valor máximo que alcanza la fluorescencia en unidades relativas en la misma
membrana e Icyt es el promedio de fluorescencia en el citosol. Esto se calculaba tal y
como se muestra en la figura siguiente (Figura II.34).
125
Figura II.34. Análisis de la localización de PKCα en membrana plasmática. A) Se muestra una imagen
obtenida con microscopía confocal de células MCF-7 transfectadas con PKCα-EGFP después de haber sido
estimuladas con Dic8 (50 µg/ml) e ionomicina (2 µM). Sobre dicha imagen se traza un segmento en una de
las células abarcando membrana y citosol por medio de Fiji (ImageJ) (línea amarilla en la esquina inferior
derecha en la imagen). B) A partir de la intensidad de cada píxel en la línea trazada, se puede obtener a
través de Fiji una gráfica donde se representa la intensidad de píxel frente a la distancia de la línea trazada.
Sobre dicha gráfica se pueden determinar los valores de Imp y el promedio de Icyt, necesarios para calcular
el valor de R.
6.2 MICROSCOPÍA CONFOCAL.
Aunque Marvin Minsky estableció lo que hoy conocemos como imagen confocal
en 1957, no ha sido hasta estos últimos 20 años cuando la técnica ha alcanzado su máximo
auge. De esta forma, no sería hasta los años 80 cuando se desarrolló el principio de
microscopia láser confocal, técnica con importantes aplicaciones en las ciencias
biológicas (Boyde et al., 1983; Petran et al., 1986).
La principal diferencia con una imagen de fluorescencia convencional es la

iluminación puntual de la muestra mediante el empleo del “pinhole” en un plano óptico
conjugado frente al detector descartando la información que queda fuera del plano focal.
Así se consigue hacer secciones procedentes de un único plano enfocado, de forma que,
si obtenemos una serie de secciones a lo largo de la muestra, esto permite obtener una
reconstrucción tridimensional de la muestra. Debido a este tipo de adquisición, es
necesario una exploración (escaneo) del espécimen para la adquisición de la imagen bi-
o tridimensional (mediante el escaneo de varios planos). El tamaño del plano focal viene
definido como el cuadrado de la apertura numérica (AN) de la lente del objetivo. También
126
viene determinado por las propiedades ópticas del espécimen y el índice de refracción del
ambiente (figura II.35) (Nwaneshiudu et al., 2012).
Figura II.35. Representación del funcionamiento básico de un microscopio confocal láser. Se observa la
luz del láser de excitación que excita a la muestra tras pasar por el pinhole y es filtrada en el espejo dicroico.
La luz que emite la muestra atraviesa de nuevo los espejos dicroicos y el segundo pinhole antes de alcanzar
el detector, siendo así la información de un solo plano la que es captada (Bacallao & Stelzer, 1989). Imagen
tomada de la web https://www.leica-microsystems.com/.
La fuente de luz que usa un microscopio confocal es un láser y de su estabilidad

depende la capacidad de hacer medidas cuantitativas pudiendo corregir por píxel al tomar
la imagen. El sistema AOTF (filtro óptico acústico modulable) lleva a cabo la
modificación del sistema de filtros del microscopio para elegir las longitudes de
excitación y evitar el fotoblanqueado de la muestra, ya que también se utiliza para
desactivar el láser durante los tiempos en los que no se adquiere la imagen (Elliott, 2020).
El detector del microscopio sólo recibe luz de un punto de la muestra, así este
microscopio sólo recibe en cada momento información de un punto del espécimen. Por
lo tanto, para la adquisición de una imagen, se debe desplazar el punto de enfoque
iluminado o bien se debe mover la muestra. En base a estas dos opciones existen dos tipos
de microscopios confocales. Por un lado, el de escaneo estacionario donde la muestra se
127
mueve según el movimiento del escaneo, mientras que los elementos ópticos permanecen
estables y el otro tipo realiza un escaneo por espejo (espectral) donde el punto iluminado
se escanea sobre la muestra fija, conducido por espejos pequeños, rápidos y
galvanométricos (Paddock, 2000).
El equipo utilizado en la realización de esta Tesis Doctoral fue el microscopio de

barrido láser confocal Leica TCS SP8 de la casa comercial Leica, ubicado en el Servicio
de Microscopia del Laboratorio de Investigación Biosanitaria (LAIB) del ACTI. Este
dispositivo está equipado con un láser de onda continua de 405 nm, un láser multilínea
de argón permitiendo excitar a 458, 476, 488, 496 y 514 nm, un láser DPSS amarillo a
561 nm y otro rojo de helio-neón para excitar a 633 nm. El objetivo utilizado fue el de
inmersión en glicerol PL APO 63x/1.3 AN.
7. TÉCNICAS DE BIOLOGÍA ESTRUCTURAL.
7.1 CRIOMICROSCOPÍA ELECTRÓNICA.
7.1.1 TINCIÓN NEGATIVA.
Después de obtener la preparación proteica pura y homogénea, el siguiente paso

antes de comenzar con el proceso de criomicroscopía electrónica propiamente dicho, es
evaluar el estado de la preparación por medio de la técnica de tinción negativa junto con
un microscopio electrónico que para esta primera fase no requiere tener altas
características. En esta técnica la proteína se recubre de una capa de metales pesados
(uranio, molibdeno, tungsteno…) que rodean la proteína como un cascarón. Puesto que
la densidad del agente de tinción es aproximadamente 3 veces mayor que la proteína, esto
proporciona un gran contraste que permite revelar el resultado con microscopios
modestos y con una dosis de electrones no muy elevada (BRENNER & HORNE, 1959).
Esta es una técnica rápida de realizar y clave para evaluar el comportamiento de

la proteína en su distribución en las rejillas de microscopía. La tinción negativa nos va a
dar información de si la proteína se distribuye de forma adecuada y uniforme, de la
probabilidad de que tengamos complejos proteicos, así como información sobre si la
proteína se desnaturaliza o forma agregados. Todas estas condiciones, si aparecen en la
tinción negativa, muy probablemente también nos las encontremos en la CryoEM,
128
haciendo muy difícil la obtención de información estructural de las proteínas problema.

De la misma manera, también permite realizar un cribado primario en el que se puede
probar la proteína en diversas condiciones de pH u otras propiedades del tampón para
determinar cuales son las mejores condiciones en las que continuar con la cryoEM.
Hay que tener en cuenta que por medio de la tinción negativa solo se revela la
superficie que la proteína expone hacia el solvente, y de esta forma solo se detecta la
forma de la proteína, siendo una técnica con un máximo de resolución de 20 Å. De modo
que, la tinción negativa, es una mera técnica de diagnóstico sobre el comportamiento de
nuestra proteína en la rejilla (De Carlo & Harris, 2011).
El protocolo de tinción negativa que se siguió fue el siguiente:
En primer lugar, se tomaron las gradillas Formvar/Carbon 200 mesh Cu (50)

S162, que eran sometidas al proceso de Glow Discharging, empleando el sistema PELCO
easiGlow Glow Discharge system (Ted Pella Inc., USA). El tiempo de glow discharge
tras la optimización se fijó a 45’’. Las gradillas después de haber sido sometidas a glow
discharging se debían usar en un periodo no superior a 30’ para asegurar que el proceso
era el correcto y no se perdía el efecto deseado.
Posteriormente, se depositaban dos gotas de agua destilada (50 ul) y dos gotas de
formato de uranilo (50 ul) en un trozo recortado de parafilm. Se sujetaban las gradillas
usando unas pinzas de anticapilaridad de fuerza inversa con la zona cubierta de carbono
mirando hacia arriba. Es importante usar las pinzas de anti-capilaridad porque de otra
manera las muestras líquidas serán absorbidas por capilaridad hacia las pinzas.
El siguiente paso es aplicar un volumen de 4 µl con la muestra de la proteína

(finalmente después de probar diversas concentraciones proteicas se determinó que para
las proteínas de fusión en las que se centró la tinción negativa, se establecía en un rango
comprendido entre 0.004-0.009 mg/ml) en las gradillas sometidas a glow discharging y
esperar 30’’. Después se secan las rejillas usando papel de filtro, se toca la superficie de
la rejilla en una gota de agua, se seca en papel de filtro de nuevo, tocar de nuevo en una
gota de agua y secar en papel de filtro otra vez.
129
Es entonces, cuando se toca la rejilla con la gota del agente de tinción negativa
(en la tinción negativa llevada a cabo en esta Tesis Doctoral se empleó acetato de uranilo)
y se seca la rejilla con papel de filtro. Posteriormente se toca la rejilla con la segunda gota
del agente de tinción y se espera 30’’. Se seca de nuevo la rejilla en papel de filtro. Por
último, se dejan las rejillas secar en la poyata durante un par de horas. Posteriormente, ya
se pueden almacenar de forma permanente en un porta-rejillas para su observación en el
microscopio.
Después de dejar las rejillas reposar, se trasladaron al módulo de carga de rejillas

del microscopio Tecnai Polara T12 (120 kV) a temperatura ambiente. Los parámetros de
la recolección de datos para las muestras de tinción negativa fueron: exposición: 53 e-
/A2, 35 frames (0,4 s cada uno) y tamaño de píxel 1.35 A/pix. Magnificación 50000x.
Cámara CCD acoplada (FEI).
De esta manera, si los resultados de tinción negativa se consideran exitosos, se

puede seguir en el paso siguiente del flujo de trabajo de la CryoEM. En la siguiente
imagen se enumeran los diversos pasos a seguir en este complejo proceso de la CryoEM
(Figura II.36).
130
Figura II.36. Esquema global del proceso de cryoEM desde la preparación proteica hasta la determinación
de la estructura del modelo. Se puede observar en la columna de la izquierda los principales pasos a seguir
en orden. Cada uno de los pasos se tiene que realizar de forma sucesiva y solo cuando uno se ha completado
de forma exitosa se puede avanzar hacia la siguiente fase. En la segunda columna, se indica para cada uno
de los pasos un ejemplo de los datos obtenidos para el caso que se muestra como ejemplo en la
determinación estructural de ribosomas. Además, en la tercera columna se indican los criterios con los que
tienen que ser evaluados cada uno de los pasos. En la última columna se enumeran el tipo de microscopio
electrónico necesario para cada una de las fases (Passmore & Russo, 2016).
7.1.2 PREPARACIÓN DE LAS REJILLAS DE CRYO-EM.
Una vez se está seguro de que una preparación proteica es monodispersa y estable
en unas condiciones de tampón bien definidas que genera una distribución uniforme de
partículas discretas por medio de tinción negativa, este espécimen se puede evaluar por
medio de la técnica CryoEM propiamente dicha. En el flujo de trabajo realizado en la
presente Tesis Doctoral, el siguiente paso sería la preparación de las rejillas de cryoEM
para un primer cribado y recolección de datos inicial con el empleo del microscopio
131
Glacios de la unidad OPIC de la universidad de Oxford (Thermo Fisher Scientific, 200

kV) equipado con un detector directo de electrones Falcon III, con EPU software. Este
primer microscopio se emplearía para un cribado y análisis de datos preliminar. Aunque
nuestro progreso y acercamiento a la resolución atómica fue muy prometedor, no fue lo
suficiente como para avanzar hasta el siguiente y último tipo de microscopio más
resolutivo. Este último paso, como se indica en el flujo de trabajo de la Figura II.36,
habría sido pasar al uso del microscopio electrónico de transmisión de máxima
resolución, Titan Krios (Thermo Fisher Scientific, 300 kV) equipado con detectores
directos de electrones Falcon III y K2 summit/GIF.
En el primer diagnostico primario con el microscopio Glacios (Thermo Fisher

Scientific, 200 kV), las principales propiedades que se tienen que evaluar son:
1. Concentración proteica y estabilidad.

2. Grosor de la capa de hielo y su uniformidad a lo largo de la rejilla.
3. Fase del hielo. Tiene que ser de tipo uniformemente amorfo y no cristalino.
Las rejillas standard empleadas presentan un tamaño de 3 mm y podrán estar

constituidas de diversos materiales. Generalmente presentan una base de carbono, aunque
también las podemos encontrar de otros materiales como cobre u oro, también pueden
presentan una cubierta de materiales tales como oro o carbono. Además, pueden presentar
cutículas adicionales de materiales como grafeno u óxido de grafeno. También difieren
las unas de las otras en el número y tamaño de cuadrados internos dentro de la rejilla, que
a su vez determinaran las dimensiones de los agujeros internos, con diferentes diámetros
y diversa separación entre ellos según la densidad de estos dentro de los cuadrados.
En otros tipos de rejillas no hay agujeros distribuidos de forma ordenada y

simétrica si no de manera totalmente aleatoria y con tamaños y formas diversas. De modo
que teniendo en cuenta todos estos parámetros existen una gran diversidad de tipos de
rejillas en el mercado y que podemos probar con nuestras preparaciones proteicas.
Generalmente se recomienda usar el mismo material para la base de la rejilla, así

como para la cubierta. Más concretamente usando oro, está demostrado que se mejora la
estabilidad del soporte que ofrece la rejilla y se reduce el movimiento del espécimen
132
durante la fase de la toma de imagen por más de un orden de magnitud y con ello
mejorando la calidad de la imagen obtenida (Russo & Passmore, 2014). De forma general,
se pueden encontrar en la literatura rejillas que se adaptan mejor a determinados tipos de
proteínas según sus propiedades, pero en general se trata de un proceso de ensayo y error
hasta determinar cuales son las rejillas con las que la proteína de interés muestra el mejor
comportamiento y contraste posible (Figura II.37).
Figura II.37. En la figura (A) podemos observar la apariencia de una rejilla (3 mm), que a su vez está
formada por multitud de cuadrados (B) y estos a su ver por diversos agujeros (C), donde se formará la capa
de hielo en donde nuestra proteína se embebe y podrá se analizada por medio de CryoEM (Russo &
Passmore, 2014).
En la siguiente imagen (Figura II.38) se representa una rejilla de CryoEM. Se

puede ver en la región enmarcada en la zona inferior derecha un agujero ampliado en el
que se representa la capa de hielo ideal. Esta capa sería un poco más gruesa en los bordes
del agujero y se hace más fina en la zona central, siendo el grosor ideal de hielo aquel que
es solo ligeramente más grueso que el propio tamaño de la proteína. Este hecho, ayuda a
mejorar la resolución puesto que una capa de hielo de gran espesor dificulta la obtención
de una buena señal de nuestra proteína debido a que los electrones tienen que atravesar
una capa de moléculas de agua mayor (Taylor & Glaeser, 2008).
133
Figura II.38. Durante el proceso de vitrificación, las proteínas se preservan en un estado hidratado nativo
en los agujeros de las rejillas. El contraste de las proteínas embebidas dentro de la capa de hielo vitrificado
es menor, por eso es importante asegurar unas condiciones óptimas para que la capa de hielo sea solo
ligeramente más gruesa que el propio diámetro de la proteína y así maximizar el contraste (Russo &
Passmore, 2014).
Este proceso de vitrificación de la muestra proteica en las rejillas de CryoEM se

realizó empleando un aparato de tipo Vitrobot (FEI Vitrobot tm Mark IV). El hecho de
conseguir la formación de hielo vítreo con una densidad muy semejante a la del agua
líquida fue un proceso muy importante en el avance la técnica y se desarrolló por
Dubochet y colaboradores en los años 80 (Dubochet et al., 1988). En primer lugar,
se seleccionaban el tipo de rejillas que se deseaban probar y se sometían a un proceso
de glow discharging para conseguir que la superficie de las rejillas fuera hidrofílica.
De esta manera, se consigue generar la tensión superficial adecuada para colocar la
gota de proteína y que ésta se extienda de manera uniforme en la zona más brillante
de la rejilla, que es la región que se corresponde con la zona del recubrimiento.
Una vez las rejillas se han sometido a este proceso de glow discharging, se
tomarán con unas pinzas por el mismo extremo, con mucho cuidado debido a la
enorme fragilidad que presentan las rejillas. Estas pinzas se adaptan en el interior de
la cámara del Vitrobot. El vitrobot empleado en esta Tesis se trataba de un Vitrobot
Marck IV (Thermo Fisher Scientific). En esta cámara se pueden fijar las condiciones
que favorezcan la formación de la mejor capa de hielo en las rejillas: humedad,
temperatura, tiempo de secado, tiempo de espera y fuerza de secado, que se irán
134
poniendo a punto por ensayo y error hasta dar con las mejores condiciones de
formación de la capa vítrea de hielo en la rejilla. Una vez las pinzas están sujetando
la rejilla en el interior de la cámara del Vitrobot con todas las condiciones ajustadas,
por uno de los laterales de la cámara, a través de un orificio se introduce una
micropipeta para depositar una gota de 3.5 µl de la solución proteica en la superficie
de la rejilla en la cara donde se encuentra la capa de la cubierta en la rejilla.
Es entonces, cuando se acciona el mecanismo que seca la rejilla (se trata de

dos almohadillas con un papel de filtro especial que se cierran sobre la rejilla en
ambos extremos) con el tiempo y fuerza de secado seleccionados y, acto seguido,
esta sale disparada hacia abajo hasta la copa de vitrificación. Este artilugio sobre el
que se introduce la rejilla por la zona inferior del Vitrobot está constituido por una
base de corcho aislante y de unos materiales de metal que facilitan la fácil conducción
de la temperatura entre el anillo exterior y el centro de la copa. El anillo externo de
este sistema se rellena de nitrógeno liquido, mientras que en la zona interna hay una
copa de cobre conectada con la zona externa de nitrógeno liquido con una araña de
metal y cuando está lo suficientemente fría se puede insuflar con etano gaseoso. Este
gas comenzará a condensarse en la copa de cobre hasta alcanzar la temperatura de
entre -150ºC y -180ºC (a partir de -150ºC se consigue un estado vítreo y por debajo
de -180ºC se solidifica el etano líquido), temperatura a la cual cuando se introduce la
rejilla, se formará una capa de hielo vitrificado.
Las mejores condiciones finales de preparación de las rejillas fueron las siguientes:
-Tipo de rejilla: Quantifoil R 2/1 Au 200Mesh.

-Concentración final de proteína: 0.05 mg/ml.
-Adición de aditivos: CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol P13A.
-Tiempo de Glow Discharging: 2 tiempos consecutivos de 1 minuto.
-Tiempo de secado: 5’’.
-Humedad: 100%.
-Temperatura: 20ºC.
-Volumen de la gota de proteína: 3.5 µl.
-Fuerza de secado: -25.
135
Posteriormente tiene lugar el proceso conocido de clipping. Este proceso se

realiza con un casete especial rellenado con nitrógeno liquido y debe de llevarse a
cabo con sumo cuidado para evitar movimientos bruscos o subir de más las rejillas
por encima de la atmósfera del nitrógeno líquido y que las pondrían en contacto con
aire, con lo que se formarían cristales de hielo que empeorarían las condiciones de la
colección de datos. De esta manera, las rejillas se manipulan a bajas temperaturas
para encajarlas en unos pequeños artilugios de aros con una serie de instrumentos
diseñados para esta tarea. Finalmente, cuando las rejillas se hayan encajado en esta
estructura diminuta de aros, se introducen en el revolver porta-rejillas que se carga
en los microscopios de tipo Glacios o Titan Krios que presentan un sistema
automático de recogida de las rejillas y posicionamiento dentro de su sistema para su
análisis y recolección de datos.
A continuación, se muestra el resumen del total de condiciones probadas. En las

tablas siguientes (Tablas II.6-II12) se muestran las condiciones de preparación de rejillas
para el total de sesiones realizadas durante mi estancia en la Universidad de Oxford. Se
indica el tipo de proteína de fusión, el tipo de rejilla usada, la concentración de proteína,
la condición si fue con o sin aditivos, el tiempo de glow discharging, el tiempo de secado,
la humedad de la cámara del vitrobot, la temperatura dentro de la cámara del vitrobot, la
cantidad de volumen añadida y la fuerza de secado.
Tabla II.6. Condiciones para la primera sesión de Glacios.
Tabla II.7. Condiciones para la segunda sesión de Glacios.
Tabla II.8. Condiciones para la tercera sesión de Glacios.
136
Tabla II.9. Condiciones para la cuarta sesión de Glacios.
Tabla II.10. Condiciones para la quinta sesión de Glacios.
Tabla II.11. Condiciones para la sexta sesión de Glacios.
Tabla II.12. Condiciones para la séptima sesión de Glacios.
7.1.3 ANÁLISIS DE DATOS. DE PARTICLE PICKING A REFINADO 3-D.
Una vez se colocan las rejillas de CryoEM en el microscopio electrónico se

realiza un cribado de las diversas rejillas y se seleccionan aquellas áreas en las que
el hielo se distribuye de la mejor manera y las partículas se observan con la mejor
apariencia, distribución y contraste. Así, se definen mediante un sistema informático
todas las áreas de los agujeros en los mejores cuadrados de las rejillas a partir de las
cuales queremos obtener las micrografías durante la toma de datos que lleva
normalmente toda la noche dependiendo de las áreas seleccionadas dentro de las
rejillas.
137
Para que el procesamiento final tenga éxito, se deben seleccionar imágenes de

CryoEM de alta calidad, con el hielo vitrificado con el espesor correcto,
contaminación de hielo mínima, distribución uniforme de partículas, poco ruido de
fondo y con un contraste de fase suficiente. El contraste de fase se representa como
la nitidez de los patrones de anillo de Thon (Figura II.39) adquiridos de la transformada
de Fourier en el espacio recíproco que también revela la resolución potencial. Los anillos
de Thon deben ser visibles al menos hasta la resolución deseada. Las imágenes de mayor
calidad que cumplen estos requisitos previos se procesaron siguiendo los procedimientos
descritos a continuación.
Imagen II.39 Se muestra el ejemplo de la estimación CTF (B) a través de MotionCor2 (Rohou & Grigorieff,
2015) de Scipion para una de las micrografías obtenidas experimentalmente durante la toma de datos (A).
Se muestran los anillos de Thon del espectro de poder, en este caso, durante la curación manual de las
micrografías obtenidas, sería descartada debido a la alta contaminación de hielo, que está representada por
esas formas más oscuras en forma de gotas que resaltan sobre el fondo de la micrografía (izquierda). Imagen
obtenida a través del software Scipion.
Las mejores micrografías obtenidas para las proteínas de fusión, se obtuvieron por
medio del microscopio electrónico Glacios, con los parámetros: exposición: 39.94 e-
/A2, 35 frames (1.22 s cada uno) y tamaño de píxel 0.96 A/pix. 150k magnificación. Con
un desenfoque aplicado de -2.5 µm. Con un total de aproximadamente 300 películas de
calidad que resultaban entre 10.000-12.000 partículas totales.
Una vez recogidos todos los datos, estos se exportan a un programa de análisis
de CryoEM tales como Scipion, Relion o Cryosparc (de la Rosa-Trevín et al., 2016;
Punjani et al., 2017; Scheres, 2012), donde la primera actividad será analizar todas
las micrografías y seleccionar aquellas donde se vea una distribución adecuada de
partículas y contraste adecuado para poder realizar la selección de partículas. Para
ello, previo a la selección de partículas se tiene que llevar a cabo el alineamiento de
138
los frames así como la estimación de CTF, en esta Tesis Doctoral se realizaron por
medio de los programas MotionCor2 y CTFFIND4 respectivamente (Rohou &
Grigorieff, 2015; Zheng et al., 2017). En este proceso, se seleccionan todas las
partículas que se corresponden con diversas visiones de nuestra proteína o complejo
proteico en diversos ángulos dependiendo de en que posición se haya congelado
cuando se realizó el proceso de vitrificación.
El alineamiento de los frames de cada micrografía es importante porque el proceso

de interacción de los electrones con la muestra siempre causa un movimiento rotacional
y translacional en el espécimen analizado. De esta manera, es habitual descartar los 2
primeros frames donde este efecto es más acusado, así como también los 2 últimos
frames, donde el daño por la radiación del láser es más fuerte (Brilot et al., 2012; Li et
al., 2013).
Por su parte, para entender la función de transferencia de contraste (CTF), que

contiene la información fundamental de cada micrografía, hay que considerar cada
electrón como una onda de electrones que se difracta en sus componentes de Fourier
después de interaccionar con la muestra. Los electrones que difractan tras impactar con
la muestra contendrán información del espécimen. Cada componente tendrá una
frecuencia espacial y una amplitud. Además, las ondas difractas por el espécimen viajan
a diferentes longitudes de trayectoria de las que no impactan con la muestra generando
un cambio de fase adicional. Representando la función de contraste de transferencia de
los electrones en comparación con las frecuencias espaciales, obtendremos el CTF de la
imagen total que se corresponderá a la suma del CTF de cada uno de los electrones. En
términos simples, CTF representa cuanto contraste de cada componente de Fourier
procedente de cada electrón contribuye al espectro final CTF. Esta información
normalmente se representa como un espectro de poder de la imagen, esto es una serie de
anillos Thon concéntricos (Figura II.39), donde los máximos valores representan la
presencia de señal y los ceros en la función de transferencia del CTF indican la ausencia
de señal. Así, el centro del espectro representa la información de la baja resolución
mientras que los bordes describen los detalles de la máxima resolución (Figura II.38)
(Orlova & Saibil, 2011).
139
Posteriormente, para las micrografías seleccionadas (Figura 40.II.A) se realiza

el proceso de selección de partículas. En esta fase se deberán de seleccionar todas las
partículas que estén representando nuestra proteína de interés en sus diversas
orientaciones espaciales (Figura 40.II.B). A continuación, tiene lugar el proceso de
clasificación 2D, donde el sistema recoge y agrupa las partículas en diferentes clases
(Figura 40.II.C). Cada una de estas clases muestra la visión 2D reconstituida con los
detalles de la sección bidimensional de la proteína que estén representando todas las
partículas agrupadas dentro de cada una de estas clases 2D. Si la calidad de los datos
es suficientemente alta, se podrán observar detalles de la estructura secundaria de la
proteína es estas clases 2D. Cuando se obtengan las suficientes clases 2D de calidad,
se puede realizar la reconstrucción tridimensional de la proteína de interés mediante
el proceso de clasificación 3D. Las últimas fases involucran el refinamiento de la
estructura y finalmente, si la resolución atómica lo permite, se podrá realizar el
modelo atómico de la proteína objetivo (Figura II.40 D y E).
Figura II.40. Se muestra un ejemplo de un flujo de trabajo de análisis típico de cryoEM. De izquierda a
derecha, imagen de una micrografía típica donde se observa una buena distribución de partículas, así como
un buen contraste de estas sobre el fondo de la micrografía (A). En segundo lugar, micrografía en la que se
lleva a cabo la selección de partículas (B). A continuación, imagen con la clasificación 2-D donde
observamos las “fotografías 2D” de diversos ángulos de la molécula (C). La siguiente imagen es la
reconstrucción del modelo proteico (D) y por último se muestra el modelo proteico a resolución atómica
de la proteína objetivo (E) (Fan et al., 2019).
En resumen, el flujo de trabajo general para los softwares empleados, Cryosparc,

Relion y Scipion fue el siguiente. En primer lugar se importaban las micrografías
obtenidas con el microscopio correspondiente y se continuaba con la reducción del
tamaño de las micrografías para acelerar el proceso, estimación CTF, alineamiento de las
micrografías (Contrast transfer function) (Mindell & Grigorieff, 2003; Rohou &
Grigorieff, 2015; Zhang, 2016) determinación de las micrografías adecuadas, selección
de partículas, extracción de partículas, clasificación 2D e importación del volumen que
se usará como referencia inicial para los pasos siguientes de refinado.
140
7.1.4 PRINCIPIO BÁSICO DE LA CRYO-EM. TRANSFORMACIÓN DE

FOURIER.
El principio básico para la determinación estructural de la CryoEM consiste en

tomar imágenes por medio del microscopio electrónico, de moléculas biológicas fijadas
en una capa de hielo, obteniendo así proyecciones en todas direcciones de la proteína en
cuestión. Una computadora es entonces empleada para procesar y calcular una gran
cantidad de proyecciones bidimensionales (clases 2D) y reconstruir el modelo estructural
3D. Para poder realizar este proceso, la transformación de Fourier juega un papel muy
importante.
Figura II.41. Conceptos básicos para la determinación estructural por medio de CryoEM (Nogales &
Scheres, 2015).
141
Como se comenta y se explica de forma clara en la Figura II.41, las transformadas

de Fourier juegan un papel fundamental en la determinación de la estructura de las
proteínas por medio de técnicas estructurales como CryoEM. Por medio de este principio,
se explica el mecanismo matemático y físico a partir del cual las proyecciones 2D
generadas por el microscopio electrónico, al hacer incidir un haz de electrones sobre la
muestra, se pueden convertir en un modelo tridimensional final (Figura II.41) (De Rosier
& Klug, 1968).
El teorema de la proyección en secciones (Figura II.41 A), establece que la

proyección 2D de un objeto 3D en el espacio real (columna de la izquierda, Figura II.41)
equivale a tomar una sección central 2D fuera de la transformada de Fourier 3D de ese
objeto. La dirección de la proyección del espacio real (izquierda con líneas punteadas con
flechas rojas) es perpendicular a la sección (derecha, el marco rojo).
En la imagen (Figura II.41 B-E) se muestran diversas proyecciones 2D

experimentales que pueden ser combinadas en reconstrucciones 2D a través de un proceso
iterativo llamado “projection matching”. Para determinar las orientaciones relativas de
todas las proyecciones experimentales, primero se deben calcular las proyecciones de un
objeto 3D en todas las direcciones (Figura II.41 B). Después, se compara cada proyección
experimental con todas las proyecciones de referencia para encontrar el mejor match de
una medida de similitud dada (Figura II.41 C). Esto orienta todas las proyecciones
experimentales en relación con la estructura 3D.
El teorema de proyecciones de secciones entonces implica que las
reconstrucciones 3D pueden ser calculadas posicionando muchas secciones 2D (las
transformadas 2D de Fourier de todas las proyecciones experimentales) en transformadas
3D (Figura II.41 E) mediante el cálculo de las transformadas inversas. Procesos iterativos
concernientes a los procesos entre B-E irán mejorando de forma gradual las orientaciones
y con ello la resolución de la reconstrucción tridimensional final (Nogales & Scheres,
2015).
142
7.2 CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X.
7.2.1 CRIBADOS DE CRISTALIZACIÓN PARA LA FORMACIÓN DE

CRISTALES POR DIFUSIÓN DE VAPOR. SITTING DROP.
Para los ensayos de cristalización realizados en esta Tesis Doctoral se emplearon

placas Greiner de 96 pocillos de Hampton Research y Molecular Dimensions (Sitting
drop, round-bottom plates). El rellenado del reservorio de las placas y la preparación de
las diluciones en los ensayos de optimización se realizó con máquinas de tipo Hydra 96
(Art Robbins instruments).
La técnica de sitting drop es un método muy popular para la cristalización de

macromoléculas, donde la gota de la solución proteica junto con el agente de precipitación
se deposita en un mini-pocillo situado al lado del pocillo donde se introduce el volumen
de la solución de precipitación. El principio de difusión de vapor es muy simple y se basa
en un proceso de equilibrio en el que el vapor de solvente de la gota con la proteína más
diluido difunde hasta el solvente de la solución de precipitación más concentrada. A
medida que la gota de proteína junto con la solución de precipitación pierde parte del
solvente por el proceso del proceso de difusión, tanto la concentración proteica como la
del agente de precipitación aumentan. De esta manera, desplazándose por el diagrama de
fases nos podemos mover hasta el estado de nucleación y formación de cristales (Figura
II.42) (Walter et al., 2005).
Figura II.42. Muestra ejemplificativa del proceso de difusión de vapor en la técnica de sitting drop. Imagen
tomada de la web de Hampton.
143
Algunas de las ventajas de la técnica de sitting drop son que es una técnica barata,
requiere poco tiempo para ejecutarla, resulta adecuada para el empleo de detergentes u
otros reactivos hidrofóbicos y las gotas se pueden posicionar en una posición de sitting
estable. La principal desventaja de esta técnica es que los cristales de proteína a veces se
pueden anclar a la superficie de la placa haciendo difícil separarlo, aunque esto, a su vez
puede ser una ventaja puesto que puede ayudar en la nucleación del cristal.
Los cribados se realizaron por medio de la tecnología de Cartesian PixSys 4200,

añadiendo gotas de 100 nl de precipitante y 100 nl de proteína en cada pocillo en ese
orden. Justo después de tener los cribados preparados se sellaban las placas con láminas
de sellado (Hampton Research). Las placas se dejaban durante varias horas o durante la
noche a 4ºC para evitar condensación y posteriormente se almacenaban en el Rock Imager
182 (Formulatrix). Este es un sistema que almacena las placas y toma imágenes de las
gotas de forma periódica para determinar la presencia de cristales y su evolución en el
tiempo.
La razón de mantener las placas a 4ºC durante la incubación de las placas, se

basaba principalmente en mantener la proteína en un estado lo más estable posible de
modo que su actividad quinasa quede intacta para potenciar los eventos de interacción en
los casos en los que añadía en conjunción con RACK1 y Fascin1. De esta manera la
proteína podía mantener la actividad quinasa en su máxima función.
Posteriormente desde una aplicación bioinformática llamada Xtal de la
universidad de Oxford, se podía acceder y observar los pocillos uno por uno. Desde esta
aplicación se podían realizar anotaciones tales como si la proteína había o no precipitado,
la aparición de potenciales cristales, agujas o cristales de interés para poder llevarlos a
difractar al sincrotrón.
Para discernir si los cristales dudosos se trataban de cristales de proteína o cristales

de sal, se emplearon dos técnicas diferentes. La primera de ellas era observar los cristales
con un filtro de luz polarizada y ver si se producía la birrefringencia de la luz al incidir el
cristal. Por otro lado, también se podía emplear luz UV. Teniendo en cuenta que las
proteínas se pueden hacer claramente visibles porque presentan aminoácidos aromáticos,
que se excitan con esta luz a una longitud de onda de 300-350 nm (Figura II.43 y Figura
II.44).
144
Figura II.43. Observaciones con un filtro de luz polarizada. Se observa en la izquierda un cristal de proteína
muy poco birrefringente. Y a la derecha cristales de sal muy birrefringentes. Imagen tomada de la web de
Hampton.
Figura II.44. Comparativa de cristales de proteína brillando claramente cuando son incididos con luz UV
en la derecha en comparación cuando se observan únicamente con luz visible en la izquierda. Imagen
tomada de la web de Hampton.
Los cristales son ordenaciones regulares tridimensionales de moléculas (Figura

II.45). De forma ideal se describen como organizaciones infinitas en el que los bloques
constructores del cristal (las unidades asimétricas) están organizadas de acuerdo con
simetrías muy bien definidas (pudiendo llegar a formar 230 grupos espaciales) en
unidades celulares que se repiten en las 3 dimensiones por medio de translaciones. Es
importante destacar que las proteínas, así como los ácidos nucleicos no cristalizan en
grupos espaciales con simetría invertidas porque están formados de enantiómeros (L-
aminoácidos y D-azúcares respectivamente), de esta manera se reduce el número de
grupos espaciales hasta 65.
145
Figura II.45. A) Distribución de las proteínas en un cristal. Los cubos negros representan la unit cell del
cristal. Por su parte, la caja roja que se muestra en la zona media de la imagen A, hace referencia a la unidad
asimétrica. B) A nivel tridimensional hay 3 dimensiones (a, b y c) y 3 ángulos interaxiales (α, β y γ) que
definen la unit cell que forman el ladrillo básico de construcción dentro del cristal. Imagen tomada de la
web de Hampton.
Una vez seleccionábamos cristales candidatos a ser difractados en el sincrotrón,

se rescataban de sus pocillos correspondientes con CryoLoops (Crystal Cap-Hampton
Research) de dimensiones concretas que se adaptaban al tamaño de los cristales junto con
una disolución del 25% en glicerol. Justo después de ser montados en los CryoLoops se
congelaban de forma rápida en nitrógeno líquido (-173ºC). Entonces se guardaban en los
revolver de carga en los tanques con nitrógeno líquido, que serían cargados directamente
en el sistema de toma de muestras del sincrotrón donde el sistema, de forma automática,
los iría seleccionando y colocando para su difracción.
Los parámetros para la recolección de datos mediante la difracción de rayos X era

los siguientes. Se describen los parámetros para los datos obtenidos en el sincrotrón de
Oxford (Fascin1) y de Barcelona (Dominio C2 de PKCα).
- Sincrotrón: Diamond Light Source/ALBA

- Beamline: IO3/IO3
- Distancia muestra detector: 250 mm/ 270 mm
146
- Longitud de onda (Å): 1.00/ 0.96

- Oscilación (º): 0.1/0.25º
- Número de imágenes: 3600/2500
El problema de fases fue resuelto empleando reemplazo molecular usando un modelo

homólogo (PDB: 1DFC, para el caso de Fascin1 y PDB: 3GPE, para el caso del dominio
C2 de PKCα) (Evans & McCoy, 2008). El modelo fue refinado por medio del programa
informático CCP4 (Brünger et al., 1998) y el modelo construido con Coot (Emsley &
Cowtan, 2004).
7.2.2 PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X.
Los cristales recogidos de las placas de cribado de cristalización se llevan al

sincrotrón donde son incididos por un haz de electrones. Este choque de los electrones
con los diversos átomos de los aminoácidos de la proteína hace que difracten en todas
direcciones. De esta manera, se genera un patrón de difracción característico y único para
las coordenadas atómicas de dicha proteína que posteriormente será analizado e
interpretado por métodos matemáticos e informáticos. En este proceso, la ley de Bragg
juega un papel fundamental (Figura II.46). Midiendo intensidades y ángulos se puede
traducir el patrón de difracción en una densidad electrónica, que va a tener ciertas
características para unos aminoácidos y otros. Pudiendo así determinar la estructura
tridimensional de la proteína a nivel atómico siempre que la resolución lo permita
(Thomas, 2012).
Así, por técnicas de reemplazo molecular como las se que realizaron en la presente
Tesis Doctoral se puede determinar la distribución atómica en el espacio tridimensional
para cada uno de los aminoácidos de la proteína siempre y cuando la resolución de los
datos obtenidos lo permitiera (Evans & McCoy, 2008).
147
Figura II.46. Ley de Bragg, donde λ es la longitud de onda de los rayos X, d es el espacio entre los planos
de la red cristalina, θ es el ángulo incidente (el ángulo entre el rayo que incide y el plano de difracción) y n
es un número entero haciendo referencia al orden de difracción.
A diferencia de la CryoEM donde las micrografías obtenidas son imágenes del

espacio real conteniendo tanto información de la fase como de la amplitud, en la
cristalografía de rayos X nos vamos a encontrar con el conocido “problema de las fases”
(Millane & Arnal, 2015; Taylor, 2003). La técnica de reemplazo molecular (MR),
empleada en esta presente Tesis Doctoral, es una manera de afrontar el problema de las
fases en la cristalografía de rayos X y se basa en la disposición de un modelo semejante
a la estructura que queremos resolver. De esta manera, se facilita la resolución del
problema de fases cristalográfico proveyendo estimaciones iniciales de la fase de la nueva
estructura a partir de una estructura previamente conocida que puede ser refinada de
manera iterativa (Evans & McCoy, 2008). Así, por ejemplo, en el caso de la PKCα
podemos usar la información estructural homóloga relativa a PKCβ, y en el caso del
dominio C2 de PKCα podemos introducir directamente su propia estructura que ya está
previamente depositada en la base de datos PDB.
Debido a la gran cantidad de estructuras depositadas en las bases de datos, cada

día resulta más fácil encontrar estructuras similares a las proteínas problema que se
estudian y por ello la técnica de MR es la que más se emplea por encima de los métodos
directos (ab initio) y los métodos de reemplazo de isoforma.
148
Figura II.47. Esquema básico del proceso de cristalografía de rayos X. Tras conseguir obtener un cristal de
nuestra proteína de interés, el siguiente paso es incidirlo con un haz de electrones que generan un patrón de
difracción característico que se puede traducir en un mapa de densidad electrónica y este a su vez contiene
la información a partir de cual se puede construir el modelo atómico estructural.
Al igual que hemos explicado en el caso de la CryoEM la transformada de Fourier

juega un papel clave. Con la diferencia de aquí, en la cristalografía de rayos X,
previamente se deben conocer las amplitudes de los rayos X difractados, así como las
fases relativas para poder computar la transformada de Fourier.
7.3 TOMOGRAFÍA POR MEDIO DE CRIOMICROSCOPÍA ELECTRÓNICA.
La CryoET es una técnica muy potente para la visualización 3D y análisis de

biomoléculas en el contexto de estructuras celulares. El uso de esta tecnología permite un
mejor entendimiento de las bases estructurales de los procesos celulares, lo que es
esencial para el conocimiento de las funciones celulares. A diferencia de otras técnicas
biológicas, se trata de una técnica libre de etiquetas en las moléculas que no requiere
fijación química o tinción. En lugar de eso, las células u organizaciones celulares se
preservan en su entorno biológico por medio de vitrificación de la misma manera que se
ha explicado en el apartado de CryoEM (Turk & Baumeister, 2020).
El espécimen es entonces introducido en un microscopio electrónico de

transmisión. Como en otras técnicas tomográficas, las muestras son giradas en diversos
ángulos relativos al haz de electrones (un ejemplo típico podría ser girar la muestra desde
una posición neutra hasta +60º y después hasta -60º con incrementos de 1 a 3º en cada
toma de datos). Esta serie de imágenes tomadas a diversos ángulos, pueden entonces ser
reconstruidas computacionalmente en una visión tridimensional del objeto de interés. A
este proceso se le conoce como reconstrucción tomográfica.
149
El flujo de trabajo típico en CryoEM se explica en la Figura II.48:
Figura II.48. Flujo de trabajo en la Cryo-ET desde preparación de la muestra hasta la adquisición de los
tomogramas. Se parte en primer lugar de las muestras a analizar, que pueden ir desde proteínas purificadas
hasta estructuras celulares más complejas como los filamentos de actina que se estudian en esta presente
Tesis Doctoral. El siguiente paso sería llevar a cabo el proceso de vitrificación de la muestra. Generalmente
el grosor de la muestra determina el método de vitrificación y los subsecuentes pasos de procesamiento. En
nuestro caso, se llevo a cabo la criogenización en rejillas de CryoEM. Finalmente, el espécimen se coloca
en un microscopio electrónico donde se somete a un haz de electrones, que tomando información a diversos
ángulos obtendrá los diversos tomogramas que siguiendo el mismo proceso descrito en el apartado de
CryoEM relativo a las transformadas de Fourier, conseguirá reconstruir el modelo tridimensional de nuestra
muestra problema (Turk & Baumeister, 2020).
Previo a la preparación de las rejillas, se pusieron a punto las condiciones de

mezcla entre Fascin1 y F-actina mediante ensayos de co-sedimentación.
Para este proceso de co-sedimentación, se empleó F-actina procedente de

citoesqueleto (β/γ-actin procedente de plaquetas humanas). Para obtener un complejo
150
estable de Fascin1-F-actina, se empleó F-actina-Fascin1 en una proporción de 1:1, a una

concentración final de F-actina y Fascin1 de 12.5 uM para cada una. Previo al ensayo,
β/γ-F-actina se resuspendió en G-buffer (5 mM HEPES pH 7.4, 0.2 mM CaCl2, 0.2 mM
DTT, 0.2 mM ATP) y fue incubado en hielo durante 30 minutos. Por su parte, la
polimerización se llevó a cabo empleando F-buffer (20 mM HEPES pH 7.4, 100 mM
KCl, 5 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA, 1 mM DTT, 0.2 mM ATP) durante 30 minutos a
temperatura ambiente. Fascin1 (12.5 µM) se añadió a la F-actina polimerizada y la mezcla
se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente, posteriormente se sometió a un proceso
de centrifugación 59000 rpm/ 60 min/10ºC. Para establecer condiciones óptimas de la
formación del complejo entre Fascin1 y F-actina, tanto el sobrenadante como el pellet
fueron analizados por medio de SDS-PAGE, seguido de tinción por medio de Coomassie
brilliant blue (Sigma Aldrich). Para preparar la muestra a congelar y analizar por medio
de CryoEM el pellet fue resuspendido en 50 µl de F-buffer que contenía 0.1% NaN3 e
incubado durante la noche. Al día siguiente las muestras eran procesadas para la
preparación de rejillas de CryoEM.
Para la preparación de las rejillas de CryoET, 3ul del complejo fascin1-F-actina

se añadieron después en rejillas (Cu R1.2/R1.3) sometidas a un proceso de glow
discharging y se dejaron reposar durante 15 segundos. Esta muestra después fue secada
y congelada en etano líquido empleando un vitrobot (95% humedad, 6ºC, fuerza de
secado: 15). Las gradillas se secaron en tiempos de entre 4.5-5 segundos y se almacenaron
en nitrógeno líquido para el cribado posterior.
Los cribados primarios para determinar cuales eran las mejores condiciones y
observar las rejillas se llevaron a cabo con un microscopio electrónico de tipo Talos Artica
(200 kV, Fisher Scientific). Las series tomográficas fueron adquiridas empleando una
dosis simétrica con un esquema de imágenes recolectadas de 0º a -60º, luego de 0º a +60º
con incrementos de ángulo de 3º. La dosis total fue de 109 e−/Å2, y un rango de
desenfoque de entre -2 µm y -4 µm.
Las reconstrucciones tomográficas se llevaron a cabo por medio de IMOD y su

interfaz Etomo (Kremer et al., 1996).
151
CAPÍTULO III. CARACTERIZACIÓN
BIOFÍSICA DE LA INTERACCIÓN
ENTRE PKCα Y PROTEÍNAS DIANA
MEDIANTE THERMAL SHIFT ASSAY.
CAPÍTULO III. CARACTERIZACIÓN BIOFÍSICA DE LA INTERACCIÓN
ENTRE PKCα Y PROTEÍNAS DIANA MEDIANTE THERMAL SHIFT ASSAY.
1 INTRODUCCIÓN.
Uno de los principales ensayos biofísicos que se llevaron a cabo fue el de Thermal
Shift Assay por medio del sistema de UNcle (Unchained Labs). Este sistema no solo mide
estabilidad proteica sometida a un incremento gradual de temperatura por medio de
mediciones de luz UV, sino que además aplica DLS y SLS para medir agregación, tamaño
de poblaciones de partículas y polidispersidad. Estas mediciones, permiten obtener una
enorme cantidad de parámetros a medida que las proteínas son sometidas a un proceso de
desnaturalización por un ascenso escalonado de temperatura. Esta información, ayuda a
entender mejor las propiedades y estabilidad de las proteínas que posteriormente serán
sometidas a análisis estructurales de cristalografía de rayos X y criomicroscopía
electrónica (Bai et al., 2019; Routledge et al., 2009).
Esta técnica, a diferencia del Thermal Shift Assay tradicional, no requiere de

sondas fluorescentes y se basa en la medida de la propia fluorescencia intrínseca de la
proteína a partir de sus aminoácidos aromáticos. Estos aminoácidos se exponen al inicio
del experimento en el entorno apolar de las proteínas en su estado nativo. Posteriormente,
a medida que tiene lugar la rampa de temperatura y la proteína se desnaturaliza, se
exponen al medio los aminoácidos aromáticos que al inicio estaban en el entorno
hidrofóbico. En dicho proceso de ascenso de la temperatura, se combinan mediciones de
luz UV, SLS y DLS, pudiendo así determinar diversos parámetros que definen la
estabilidad, capacidad de agregación o polidispersidad de las proteínas bajo estudio, tales
como la Tm, Tagg266, Tagg473 o índice de polidispersidad entre otros (Huynh & Partch,
2015; Layton & Hellinga, 2010; Mahler et al., 2009).
De este modo, este sistema permite realizar medidas rápidas de las proteínas, en
el que no se requiere de una gran cantidad de proteína total. Una vez depositada la muestra
en su capilar, se puede obtener una numerosa cantidad de información relacionada con la
estabilidad y polidispersidad de las proteínas sometidas a diversas condiciones
(https://www.unchainedlabs.com/uncle/).
155
Estas medidas de estabilidad y polidispersidad son de suma importancia para las

proteínas sometidas a técnicas de biología estructural. Además de que la muestra proteica
sea altamente pura, también son requisitos indispensables que las proteínas presenten alta
estabilidad y una baja polidispersidad (Passmore & Russo, 2016). Por medio del sistema
UNcle, se pueden medir dichos parámetros, variando diversas condiciones hasta
encontrar aquellas en las que nuestras proteínas se comportan de la forma más estable.
2 RESULTADOS.
Se realizaron ensayos de Thermal Shift Assay por medio de la plataforma UNcle para las
siguientes proteínas y combinaciones proteicas:
• PKCα (1 mg/ml). M.W.: 78.96 kDa.

• Fascin1 (1 mg/ml). M.W.: 54.57 kDa.
• PKCα-Fascin1. Se empleó 1 mg/ml de PKCα (12,66 μM) y su cantidad
equimolar de Fascin1.
• PKCα-RACK1. Se añadió al ensayo 1 mg/ml de PKCα y su cantidad equimolar
de RACK1. M.W. para RACK.: 35.6 kDa.
Además, también se analizaron diversas combinaciones de aditivos que se

conocen que tienen una función reguladora en la actividad catalítica y estructural de la
PKCα (Newton, 2018). Las combinaciones probadas fueron las siguientes:
• EGTA.
• CaCl2, éster de forbol P13A y ADP-MgCl2.
• CaCl2 y ADP-MgCl2.
• CaCl2 y éster de forbol P13A.
• CaCl2
Las concentraciones finales empleadas para los aditivos fueron de: EGTA 5 mM,
CaCl2 0.2 mM, ADP 2 mM, MgCl2 5 mM y P13A 5 mM.
156
2.1 PKCα.
Las curvas de las medidas de la fluorescencia intrínseca de la proteína sometida a

una rampa de temperatura concerniente a los ensayos realizados para PKCα, fueron muy
semejantes en todas las condiciones para las diferentes combinaciones de aditivos
añadidos a la proteína, tal y como se muestra en las siguientes tablas e imágenes.
Las curvas de Thermal Shift Assay para PKCα junto con los diversos aditivos
(figura III.1) parten desde aproximadamente 346.5 unidades relativas de BCM (media
baricéntrica, medida en nm) en las que se mide la fluorescencia, hasta bajar
aproximadamente dos unidades relativas de BCM en el transcurso de la rampa de
temperatura de 20ºC a 50ºC. Posteriormente y a partir de los 50ºC, todas las curvas sufren
una subida progresiva hasta alcanzar alrededor de las 348 unidades de BCM cuando se
alcanzan los 90ºC de temperatura.
Figura III.1. Ensayos de Thermal Shift Assay para las diversas condiciones de la proteína PKCα en presencia
de CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol P13A (B, salmón), CaCl2 y ADP-MgCl2 (C, verde), CaCl2 y éster
de forbol P13A (D, marrón) y CaCl2 (E, azul). La condición A, no representada, se trata de PKCα junto con
EGTA, sin la presencia de ningún aditivo. En el eje X se representa la temperatura en ºC y en el eje Y la
medida relativa de fluorescencia en términos de BCM (nm). Figura obtenida por medio del software de
análisis de UNcle.
En las medidas relativas a la temperatura de fusión (Tm, ºC), destaca la condición

A (Tabla III.1), para únicamente PKCα junto con EGTA que actúa como quelante de
157
iones calcio y por lo tanto representaría una condición en ausencia de cualquiera de los
aditivos que se conocen tienen una actividad en la función y estructura de la PKCα. Para
esta condición, la Tm (ºC) desciende drásticamente desde los 53.7ºC de media para todas
las demás condiciones donde se añaden aditivos, hasta los 35.6ºC, habiendo una caída
significativa de 18ºC. Esto indica la importancia del ion calcio en mantener la estabilidad
de la estructura de la quinasa. Para el resto de las condiciones, los valores de Tm, Tagg266
y Tagg473 son prácticamente idénticos (Tabla III.1).
Por otro lado, el resto de los patrones de Thermal Shift Assay para PKCα por sí
sola, se mantienen muy semejantes en las diversas combinaciones de aditivos. Siendo
dentro de los complejos proteicos PKCα-Fascin1, como se comentará a continuación, la
condición con todos los aditivos junto con el complejo PKCα-Fascin1, la que más se
asemeja a estos patrones para PKCα. Dentro del patrón de Thermal Shift Assay para
PKCα, como se ha comentado, todas las curvas se caracterizan por esa bajada en la curva
de BCM en la región comprendida entre 40-50ºC, para luego repuntar hacia arriba de
nuevo.
Tabla III.1. Resumen de los principales parámetros concernientes al Thermal Shift Assay, temperatura de
fusión y temperatura de agregación medidas por medio de SLS a 266 y 473 nm. Para las condiciones de la
proteína PKCα en presencia de EGTA (A, gris), CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol P13A (B, salmón),
CaCl2 y ADP-MgCl2 (C, verde), CaCl2 y éster de forbol P13A (D, marrón) y CaCl2 (E, azul).
En cuanto a la agregación medida por medio de SLS a 266 nm y 473 nm (Figura

III.2 y Figura III.3) durante el proceso de aumento controlado de la temperatura, en
general todas las muestras mostraban un comportamiento de agregación muy semejante,
que aparecía centrado en torno a los 50ºC. Punto en el cual se alcanzaba el máximo valor
de fluorescencia medido en unidades relativas de SLS (counts nm) en el Thermal Shift
Assay. Todas las muestras mostraban un máximo de agregación de en torno 3x105
counts.nm para las medidas de SLS a 266 nm y de aproximadamente 7.5x104 counts.nm
para las muestras analizadas con SLS a 473 nm.
158
Figura III.2. Valores de agregación medidos por SLS a 266 nm para PKCα en presencia de CaCl2, ADP-
MgCl2 y éster de forbol P13A (B, salmón), CaCl2 y ADP-MgCl2 (C, verde), CaCl2 y éster de forbol P13A
(D, marrón) y CaCl2 (E, azul). En el eje X se muestra la temperatura en ºC y en el eje Y datos de SLS a 266
nm (counts nm). Figura obtenida por medio del software de análisis de UNcle.
Figura III.3. Valores de agregación medidos por SLS a 473 nm para PKCα en presencia de CaCl2, ADP-
MgCl2 y éster de forbol P13A (B, salmón), CaCl2 y ADP-MgCl2 (C, verde), CaCl2 y éster de forbol P13A
(D, marrón) y CaCl2 (E, azul). En el eje X se muestra la temperatura en ºC y en el eje Y datos de SLS a 266
nm (counts nm). Figura obtenida por medio del software de análisis de UNcle.
Las mediciones relativas al diámetro hidrodinámico por medio de DLS mostraban

en general, picos anchos para todas las muestras. Además, para casi todas las condiciones
se mostraban varios picos. Los picos principales se centraban en torno a los 100 nm de
diámetro. La existencia de varios picos para algunos de los especímenes y/o la anchura
de estos picos eran indicativo de que la proteína se estaba comportando de manera
polidispersa y agregándose en poblaciones de tamaño diferente (Figura III.4).
159
Figura III.4. Se muestra la intensidad de distribución concerniente al diámetro hidrodinámico medido por
medio del DLS del sistema UNcle relativo a las diversas combinaciones de PKCα con los aditivos. PKCα
en presencia de CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol P13A (B, salmón), CaCl2 y ADP-MgCl2 (C, azul),
CaCl2 y éster de forbol P13A (D, granate) y únicamente CaCl2 (E, gris). En el eje X se representa el diámetro
hidrodinámico, y en el eje Y la amplitud (%). Figura obtenida por medio del software de análisis de UNcle.
De esta manera, las medidas por medio de DLS mostraban muestras polidispersas,
con índices de polidispersidad (PDI) muy por encima del valor teórico definido para la
calificación de monodispersión de < 0.25. Siendo el máximo valor de PDI para las
muestras A (2.584) y E (2.267), que se corresponden con aquellas muestras que contenían
menos aditivos añadidos (A, únicamente EGTA y E, únicamente CaCl2). La anchura de
los picos detectados, como se ha comentado, era muy amplia siendo los valores máximos
para las muestras D (100,23 nm) y E (150,04 nm) y la mínima anchura de pico para la
muestra B (53,84 nm). En general, estos datos muestran mezclas proteicas muy
polidispersas y agregadas. También, las estimaciones del peso molecular mostraban
valores muy altos para la muestra B (296,52 kDa) y valores para el resto de las
condiciones que no se podían determinar debido a la alta agregación presente en la
muestra. El tamaño teórico de la proteína sometida a examen (PKCα) era de 78,96 kDa.
De modo que la medida de la muestra B, 296,52 kDa, podría estar indicando la presencia
de poblaciones de 4 unidades de PKCα (Tabla III.2).
160
Tabla III.2. Principales parámetros de agregación medidos por medio de DLS para las muestras relativas a
las condiciones de la proteína PKCα en presencia de CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol P13A (B,
salmón), CaCl2 y ADP-MgCl2 (C, azul), CaCl2 y éster de forbol P13A (D, marrón) y únicamente CaCl2 (E,
gris). La condición A se trata de PKC junto con EGTA, sin la presencia de ningún aditivo. Datos obtenidos
por medio del software de análisis de UNcle.
2.2. FASCIN1.
Para las muestras analizadas relativas a Fascin1, se pueden observar unos patrones
de Thermal Shift Assay, que son muy semejantes para todas las condiciones, apareciendo
ligeras diferencias para dos grupos de Fascin1 según los aditivos añadidos:
-Grupo 1. Fascin1 + CaCl2 y Fascin1 + CaCl2 + P13A

-Grupo 2. Fascin1 + CaCl2 + P13A + ADP-MgCl2 y Fascin1 + CaCl2 + ADP-
MgCl2.
No obstante, en general, eran patrones prácticamente idénticos que variaban en

apenas 0.5 unidades de BCM (nm).
Estos patrones comenzaban centrados en torno a las 338.5 unidades de BCM,

manteniéndose constante hasta los 50ºC, punto en el que las unidades de BCM
experimentaban un aumento acusado hasta las aproximadamente 347 unidades de BCM.
En este caso, no se observaba un decrecimiento de la curva del Thermal Shift Assay como
se estudió en el caso de PKCα sola a la altura de los 50ºC. Para Fascin1, la curva se
mantenía estable hasta los 50ºC, a partir de donde el proceso de desnaturalización ocurría,
aumentando los valores relativos de BCM (Figura III.5).
161
Figura III.5. Ensayos de Thermal Shift Assay para las diversas las condiciones de la proteína Fascin1 en
presencia de CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol P13A (K, rosa), CaCl2 y ADP-MgCl2 (L, verde oscuro),
CaCl2 y éster de forbol P13A (M, verde claro) y únicamente CaCl2 (N, gris). En el eje X se representa la
temperatura en ºC y en el eje Y la medida relativa de fluorescencia en términos de BCM (nm). Figura
obtenida por medio del software de análisis de UNcle.
Los valores de Tm y Tagg medidos a 266 y 473 nm, mostraban valores muy
semejantes para todas las muestras en las diversas combinaciones de aditivos.
Únicamente las muestras M y N mostraban valores más pequeños (36,46ºC y 42,89ºC
respectivamente) dentro de la componente de agregación medida por SLS a 266 nm en
comparación con las muestras K y L (57,44ºC y 57,74ºC respectivamente) (Tabla III.3).
Tabla III.3. Resumen de los principales parámetros concernientes al Thermal Shift Assay, temperatura de
fusión y temperatura de agregación medidas a 266 y 473 nm. Para las condiciones de la proteína Fascin1
en presencia de Ca2+, ADP/Mg2+ y éster de forbol P13A (K, rosa), CaCl2 y ADP-MgCl2 (L, verde oscuro),
CaCl2 y éster de forbol P13A (M, verde claro) y únicamente CaCl2 (N, gris).
Con respecto a los valores de SLS medidos a 266 y 473 nm durante la rampa de
temperatura (Figuras III.6 y Figura III.7), cabe destacar que en comparación con PKCα y
162
el complejo PKCα-Fascin1 (como veremos a continuación), la agregación máxima tiene

lugar más adelante en la rampa de temperatura, en torno a los 70ºC (a diferencia de los
50ºC observados para las muestras vistas hasta el momento). Siendo los valores de
agregación muy semejantes para todas las muestras en el caso de las medidas de SLS a
473 nm (5x104 counts.nm, para las muestras K y L, y 6x104 counts.nm para las muestras
M y N). En las medidas de SLS a 266 nm se observaba un componente prácticamente
nulo de agregación para las muestras K (CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol P13A) y L
(CaCl2 y ADP-MgCl2) y un máximo de agregación para las muestras N y M de 4x105
counts.nm centrado en torno a los 68ºC.
Figura III.6. Valores de agregación medidos por SLS a 266 nm para las condiciones de la proteína Fascin1
en presencia de CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol P13A (K, rosa), CaCl2 y ADP-MgCl2 (L, verde
oscuro), CaCl2 y éster de forbol P13A (M, verde claro) y únicamente CaCl2 (N, gris). En el eje X se muestra
la temperatura en ºC y en el eje Y datos de SLS a 473 nm (counts.nm). Figura obtenida por medio del
software de análisis de UNcle.
163
Figura III.7. Valores de agregación medidos por SLS a 473 nm para las condiciones de la proteína Fascin1
en presencia de CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol P13A (K, rosa), CaCl2 y ADP-MgCl2 (L, verde
oscuro), CaCl2 y éster de forbol P13A (M, verde claro) y únicamente CaCl2 (N, gris). En el eje X se muestra
la temperatura en ºC y en el eje Y datos de SLS a 473 nm (counts.nm). Figura obtenida por medio del
software de análisis de UNcle.
Con respecto a los valores del diámetro hidrodinámico, se puede observar un

menor componente de agregación en comparación con las muestras estudiadas
previamente para PKCα. En general, se aprecia un pico principal y mayoritario de
diámetro hidrodinámico para cada una de las condiciones medidas, centrado por debajo
de los 10 nm (Figura III.8).
En las medidas de DLS, cabe destacar que para Fascin1, tanto los valores del
índice de polidispersidad como los del diámetro hidrodinámico (nm) eran menores en
comparación con los datos correspondientes a PKCα y al complejo PKCα-Fascin1 (como
se verá a continuación). Para todas las muestras, el diámetro hidrodinámico se
correspondía con valores centrados en torno a 6-7 nm, y las estimaciones de los pesos
eran más cercanas a los valores teóricos de MW para Fascin1 (54,57 kDa) (Tabla III.4).
Las combinaciones de Fascin1 y aditivos para mas muestras L, M y N proporcionaron un
índice de polidispersidad muy bajo, indicando que los aditivos no afectan al estado de
agregación de esta proteína.
164
Imagen III.8. Se muestra la intensidad de distribución del diámetro hidrodinámico medido por medio del
DLS del sistema UNcle para las diversas condiciones de la proteína Fascin1 en presencia de CaCl2, ADP-
MgCl2 y éster de forbol P13A (K, rosa), CaCl2 y ADP-MgCl2 (L, verde oscuro), CaCl2 y éster de forbol
P13A (M, verde claro) y únicamente CaCl2 (N, gris). En el eje X se representa el diámetro hidrodinámico,
y en el eje Y la amplitud (%). Figura obtenida por medio del software de análisis de UNcle.
Tabla III.4. Principales parámetros de agregación medidos por medio de DLS para las muestras relativas a
Fascin1. Para las condiciones de la proteína Fascin1 en presencia de CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol
P13A (K, rosa), CaCl2 y ADP-MgCl2 (L, verde oscuro), CaCl2 y éster de forbol P13A (M, verde claro) y
únicamente CaCl2 (N, gris).
2.3. PKCα-Fascin1.
El complejo PKCα-Fascin1 se sometió también a estudio en combinación con los

diversos tipos de ligandos que se han comentado anteriormente. Se detectaron dos tipos
de comportamiento en el Thermal Shift dependiendo de las combinaciones de aditivos
que se usaron:
• Comportamiento 1, cuando se añadía CaCl2, éster de forbol P13A y ADP-MgCl2

o CaCl2 y ADP-MgCl2 al complejo PKCα-Fascin1.
165
• Comportamiento 2, cuando se añadía CaCl2 o CaCl2 y P13A al complejo proteico

PKCα-Fascin1.
A) Comportamiento 1. En estas condiciones, concretamente en la condición en

la que se añadían los tres aditivos: CaCl2, éster de forbol y ADP-MgCl2 (muestra G, curva
amarilla en figura III.9) se inducía una gran estabilidad en la que apenas se observaba una
transición en el Thermal Shift Assay a lo largo de todo el espectro de temperaturas. Se
generaba una curva casi horizontal (valores de BCM) en el patrón a lo largo de la rampa
de temperatura (20 a 90ºC), como se observa en la figura III.9, con una variación en la
fluorescencia casi inapreciable. Esto, era similar a lo que ocurría cuando se añadía PKCα
por sí sola en presencia de todos los aditivos, pero sin mostrar el decrecimiento en la
fluorescencia característico que se observa para PKCα en torno a 40-50ºC. A
temperaturas superiores, experimentaba un crecimiento del valor de BCM hasta los 90ºC
(en la figura III.9, curva salmón para PKCα sola en presencia de los 3 aditivos).
Por su parte, para la condición en la que se añadía CaCl2 y ADP-MgCl2 (muestra

I, rosa en figura III.9), la primera mitad del patrón del Thermal Shift Assay era muy
semejante al comentado anteriormente para la condición en la que se añadían los 3
aditivos (muestra G). No obstante, a la altura a la que la PKCα sufre un decrecimiento en
el patrón de fluorescencia (50ºC), el complejo PKCα-Fascin1 junto con CaCl2 y ADP-
MgCl2 experimenta una gran inestabilidad, subiendo la medida de fluorescencia relativa
medida en BCM de forma acusada en más de 10 unidades de BCM, desde 345 hasta 356.
Con respecto a los valores de agregación de SLS a 266 nm y 473 nm (Figura III.10
y Figura III.11) medidos durante el Thermal Shift Assay, para las condiciones
concernientes al comportamiento 1 (muestra G, curva verde clara y muestra I curva rosa
en Figura III.10 y III.11), se puede observar claramente que estas condiciones eran las
que mostraban un menor componente de agregación entre todas las condiciones del
complejo PKCα-Fascin1 y en comparación con PKCα por sí sola (curva salmón en las
figuras III.10 y III.11). Siendo concretamente la condición que incluye los 3 aditivos
(muestra G), la condición que menor agregación exhibía.
B) Comportamiento 2. Los Thermal Shift Assay para las mezclas del complejo
proteico PKCα-Fascin1 que contenía CaCl2 (Muestra H, curva azul) o CaCl2 y P13A
166
(muestra J, curva verde) mostraban un máximo de fluorescencia procedente de Trp más

consistente con los residuos localizados en un entorno hidrofóbico. De modo que los
valores de BCM empezaban en valores más bajos y estos iban ascendiendo a medida que
la temperatura aumentaba en el ensayo. El patrón comenzaba en torno a las 341 unidades
de BCM y avanzaba casi de manera horizontal hasta la zona de 50ºC, donde
experimentaba una subida hasta las 347.5 unidades de BCM (Figura III.9).
Por su parte, tal y como se puede ver para las gráficas de SLS a 266 y 473 nm
(Figuras III.10 y III.11), en estas condiciones del comportamiento 2, la tendencia de
agregación es mayor que las condiciones del comportamiento 1, pero claramente más baja
que en comparación con PKCα por sí sola. Más concretamente, es la condición que solo
contiene CaCl2 y éster de forbol (Muestra J, curva verde oscuro en figuras III.10 y III.11),
la condición que muestra la mayor agregación durante la rampa de temperatura. Y, por
tanto, indicando que se trata de la muestra menos estable.
Figura III.9. Thermal shift para las condiciones de los complejos PKCα-Fascin1 en presencia de CaCl2,
ADP-MgCl2, y éster de forbol P13A (G, amarillo), CaCl2 y ADP-MgCl2 (I, rosa), CaCl2 y P13A (J, Verde),
CaCl2 (H, azul) en comparación con PKCα sola en combinación con todos los aditivos CaCl2, ADP-MgCl2,
y éster de forbol P13A (salmón). En el eje X se representa la temperatura en ºC y en el eje Y la medida
relativa de fluorescencia en términos de BCM (nm). Figura obtenida por medio del software de análisis de
UNcle.
167
Tabla III.5. Valores de Tm, Tagg 266 y Tagg 473 (ºC) para las condiciones de los complejos PKCα-Fascin1
en presencia de CaCl2, ADP-MgCl2, y éster de forbol P13A (G, amarillo), CaCl2 y ADP-MgCl2 (I, rosa),
CaCl2 y P13A (J, Verde), CaCl2 (H, azul).
Figura III.10. Valores de agregación medidos por SLS a 266 nm para las condiciones de los complejos
PKCα-Fascin1 en presencia de CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol P13A (G, verde claro), CaCl2 y ADP-
MgCl2 (I, rosa), CaCl2 y é P13A (J, Verde oscuro) y CaCl2 (H, azul). En comparación con PKCα sola en
presencia de todos los aditivos (B, Salmón). En el eje X se muestra la temperatura en ºC y en el eje Y datos
de SLS a 266 nm (counts.nm). Figura obtenida por medio del software de análisis de UNcle.
Figura III.11. Valores de agregación medidos por SLS a 473 nm para las condiciones de los complejos
PKCα-Fascin1 en presencia de CaCl2, ADP-MgCl2, y éster de forbol (G, verde claro), CaCl2 y ADP-MgCl2
(I, rosa), CaCl2 y P13A (J, Verde oscuro), CaCl2 (H, azul). En comparación con PKCα sola en presencia de
todos los aditivos (B, Salmón). En el eje X se muestra la temperatura en ºC y en el eje Y datos de SLS a
473 nm (counts.nm). Figura obtenida por medio del software de análisis de UNcle.
168
Para todos los ensayos realizados, es importante destacar que las proteínas se
añadieron a concentraciones equimolares y que sus coeficientes de extinción molar son
de 75290 y de 67840 M-1 cm-1 para PKCα y Fascin1 respectivamente.
Figura III.12. En la figura se muestran con flechas granates en A) los residuos de Trp expuestos al medio
polar de PKCα y en B) los residuos de Trp en Fascin1, representados en modo de esferas. Los residuos
resaltados en esferas para cada una de las proteínas sin estar señalados con flechas granates son aquellos se
encontrarían escondidos en un entorno hidrofóbico de la proteína. Como se observa en B), la proteína
Fascin1 no presenta residuos triptófanos expuestos hacia la superficie. Figuras representadas por medio del
software PyMOL.
Los valores del diámetro hidrodinámico, al igual que las muestras medidas para
PKCα, de nuevo mostraban picos anchos, de varios componentes y centrados en valores
superiores a los 100 nm. Esto indicaba que en general las muestras se comportaban de
manera polidispersa y con una tendencia a la agregación (Figura III.13).
169
Figura III.13. Representación del diámetro hidrodinámico en eje X en comparación con la amplitud en el
eje Y para las condiciones de los complejos PKCα-Fascin1 en presencia de CaCl2, ADP-MgCl2, y éster de
forbol P13A (G, verde claro), CaCl2 y ADP-MgCl2 (I, rosa), CaCl2 y P13A (J, verde oscuro), CaCl2 (H,
azul). En el eje X se representa el diámetro hidrodinámico, y en el eje Y la amplitud (%). Figura obtenida
por medio del software de análisis de UNcle.
Experimentos de DLS mostraron que todas las muestras del complejo PKCα-
Fascin1 son muy polidispersas (Tabla III.6). Esto es debido a que el índice de
polidispersidad (PDI) teórico para una muestra monodispersa es de menos de 0.25 y para
todos los especímenes se muestran valores superiores. El valor del índice PDI máximo
fue para la muestra I (CaCl2 y ADP-MgCl2, PDI: 3,26) y el mínimo para la muestra H
(Ca2+, PDI: 0,377).
El menor diámetro (Z-ave, nm) asignado fue para las condiciones H, con CaCl2
(41,49 nm) e I junto CaCl2 y ADP-MgCl2 (77,95 nm). En estos dos casos, el MW asignado
para cada una de las condiciones fue de 78,09 y 205,09 kDa respectivamente. Teniendo
en cuenta que el valor teórico del MW para el complejo PKCα-FascinWT es de unos 120
kDa, la muestra H podría estar representando poblaciones de monómeros del complejo
PKCα-FascinWT, mientras que la muestra I, podría representar poblaciones de 2
complejos de PKCα-FascinWT ensamblados.
170
Tabla III.6. Se muestran los principales datos de polidispersidad y tamaños obtenidos a partir del sistema
UNcle medidos por DLS para el complejo PKCα-Fascin1, para las condiciones en presencia de CaCl2,
ADP-MgCl2, y éster de forbol P13A (G, verde claro), CaCl2 y ADP-MgCl2 (I, rosa), CaCl2 y P13A (J,
Verde oscuro), CaCl2 (H, azul).
2.4. PKCα-RACK1.
El complejo PKCα-RACK1, se probó únicamente en presencia de todos los

aditivos: CaCl2, éster de forbol P13A y ADP-MgCl2. La rampa de temperatura fue como
se esperaría para una proteína con residuos Trp localizados en un entorno hidrofóbico y
se producía un aumento de 8 unidades relativas de BCM (transición desde 342 hasta 350
unidades de BCM) (Figura III.15, verde) con una Tm de 59.3ºC. La Tagg a 266 nm fue
de 44.86ºC y la Tagg a 473 nm de 42.23ºC (Tabla III.7).
En estos ensayos y al igual que ocurría para el complejo PKCα-Fascin1 las

proteínas se añadían en concentraciones equimolares y sus coeficientes de extinción
molar son de 75290 y 80440 M-1 cm-1 para PKCα y RACK1 respectivamente.
Figura III.14. En la figura se muestran con flechas granates los residuos de Trp expuestos totalmente al
medio polar de la proteína RACK1, representados en modo de esferas. El resto de los residuos Trp
resaltados en forma de esferas sin estar señalados con flechas granates, son aquellos que se encuentran
escondidos en un entorno hidrofóbico de la proteína.
171
Como ya se ha comentado anteriormente, PKCα presenta 4 residuos de Trp

expuestos en la superficie y RACK1 por su parte, presenta 2 de ellos completamente
expuestos en la superficie (Figura III.14).
En comparación con PKCα por sí sola en presencia de los 3 aditivos (Figura III.15,
curva salmón), el complejo PKCα-RACK1 (Figura III.15, curva verde) presenta un patrón
de Thermal Shift diferente en el que los valores de BCM comienzan en valores más bajos
(5 unidades de BCM por debajo de PKCα). No es a partir del shift de temperatura en el
rango de 50-60ºC cuando las medidas de BCM alcanzan valores prácticamente idénticos
para ambas proteínas (348 unidades de BCM).
Figura III.15. Thermal shift para PKCα/RACK1 en presencia de CaCl2, éster de forbol P13A y ADP-MgCl2
(Verde, F), en comparación con PKCα sola con todos los aditivos (B, salmón). En el eje X se representa la
temperatura en ºC y en el eje Y la medida relativa de fluorescencia en términos de BCM (nm). Figura
obtenida por medio del software de análisis de UNcle.
Tabla III.7. Valores de Tm, Tagg 266 y Tagg 473 (ºC) para la condición del complejo PKCα-RACK1 en
presencia de CaCl2, ADP-MgCl2, y éster de forbol P13A (F, verde).
Con respecto a los patrones de agregación medidos a través de SLS a 266 nm y

473 nm (Figuras III.16 y III.17), se observaron componentes de agregación más bajos
para el complejo PKCα-RACK1 (curva verde) en comparación con PKCα en presencia
de todos los aditivos (curva salmón). Produciéndose la agregación máxima en torno a 66-
70ºC.
172
Figura III.16. Valores de agregación medidos por SLS a 266 nm para la condición del complejo PKCα-
RACK1 en presencia de CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol P13A (F, verde), en comparación con PKCα
sola en presencia de todos los aditivos (B, Salmón). En el eje X se muestra la temperatura en ºC y en el eje
Y datos de SLS a 266 nm (counts nm). Figura obtenida por medio del software de análisis de UNcle.
Figura III.17. Valores de agregación medidos por SLS a 473 nm para la condición del complejo PKCα-
RACK1 en presencia de CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol P13A (F, verde), en comparación con PKCα
sola en presencia de todos los aditivos (B, Salmón). En el eje X se muestra la temperatura en ºC y en el eje
Y datos de SLS a 473 nm (counts nm). Figura obtenida por medio del software de análisis de UNcle.
Las medidas de DLS mostraban un pico de diámetro hidrodinámico muy amplio

de 182,11 nm y un índice de polidispersidad mayor de 0.25 (PDI: 2).
173
Figura III.18. Representación del diámetro hidrodinámico en eje X en comparación con la amplitud en el
eje Y para la condición del complejo PKCα-RACK1 en presencia de CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol
P13A (F, verde), en comparación con PKCα sola junto con CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol P13A. En
el eje X se representa el diámetro hidrodinámico, y en el eje Y la amplitud (%). Figura obtenida por medio
del software de análisis de UNcle.
Tabla III.8. Parámetros de polidispersidad para PKCα/RACK1 en presencia de CaCl2, éster de forbol P13A
y ADP- MgCl2 (Verde, F).
3 DISCUSIÓN.
Los patrones del Thermal Shift para PKCα son prácticamente idénticos en todas
las condiciones y muestran un comportamiento en el que primero tiene lugar una
agregación de la proteína PKCα que hace que se oculten ciertos residuos de Trp de la
superficie (disminución de la fluorescencia medida en BCM), para posteriormente
exponer en superficie más residuos aromáticos en el proceso de desnaturalización
proteica, aumentando la señal de fluorescencia proteica.
Así, para PKCα los valores de BCM comienzan disminuyendo ligeramente desde
los 20ºC, donde muestra los valores de BCM correspondientes a los residuos de Trp que
PKCα expone al medio soluble de forma nativa (346.5 de BCM), hasta los 50ºC, donde
174
PKCα estaría sufriendo un sutil proceso de agregación (345 nm de BCM). Esta ligera
bajada en la fluorescencia, podría explicarse debido a que PKCα estaría interaccionando
con otras unidades proteicas que permitirían ocultar ciertos residuos de Trp y por ello
disminuir los valores de BCM. A partir de los 50ºC, comenzaría un proceso de
desnaturalización en el cual se exponen más residuos Trp del interior hidrofóbico de la
proteína PKCα, subiendo por ello los valores de fluorescencia medidos en términos de
BCM hasta 348 nm cuando se alcanzan los 90ºC.
Referente a los parámetros de estabilidad determinados por medio de ensayos de

SLS a 266 y 473 nm durante el incremento de temperatura, es interesante destacar que,
PKCα por sí sola se comporta de manera más inestable que en comparación con el
complejo PKCα-Fascin1. Asignándole de esta manera, un papel estabilizador al hecho de
formarse el complejo entre ambas proteínas, lo que resulta positivo a la hora de intentar
determinar su estructura tridimensional.
Los patrones de Thermal Shift Assay medidos en términos de BCM (nm) de

Fascin1, indican que la proteína se mantiene de forma homogénea sin agregarse durante
el ascenso escalonado de temperatura desde los 20ºC hasta alcanzar los 50ºC
(manteniéndose valores de BCM constantes de 338.5 nm aproximadamente). Es entonces
cuando el proceso de desnaturalización comienza, mostrándose nuevos residuos de Trp
internos de la proteína y aumentando por ello los valores de BCM, hasta las 347 unidades
cuando se llega a los 90ºC.
Por su parte, para Fascin1, los valores de estabilidad, polidispersidad y agregación

muestran una proteína que se comporta de forma muy estable y homogénea, a diferencia
de lo que ocurre con PKCα.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos para los complejos PKCα-Fascin1,

resulta interesante destacar que se observan dos posibles modelos de desnaturalización
entre PKCα y Fascin1 atendiendo a la combinación de aditivos añadidos
(comportamiento 1 y comportamiento 2 descritos previamente), en los que se podría
explicar los diversos resultados obtenidos por medio de esta técnica. Esto se basa en la
observación de los patrones de Thermal Shift Assay y como para algunas muestras, las
medidas relativas de fluorescencia medidas en BCM se mantienen muy estables y casi
constantes con la rampa de temperatura, mientras que para otras muestras se observa
175
como estos valores de BCM comienzan en valores más bajos y van aumentando con la
subida de la temperatura en comparativa con los patrones de BCM para PKCα por sí sola.
Hay que recordar que los valores de BCM al inicio de la rampa de temperatura se
deben única y exclusivamente a las cadenas laterales de los aminoácidos aromáticos
orientados hacia el medio polar de las proteínas. A medida que la rampa de temperatura
aumenta y, dependiendo de cuan estable se mantenga la proteína, podrá exponer más
aminoácidos aromáticos procedentes del centro hidrofóbico a medida que se extienda su
estructura terciaria en el proceso de desnaturalización proteica. De modo que, las
diferencias observadas en valores de BCM al inicio de la rampa de temperatura se deben
a diferentes grados de exposición de los residuos Trp en la superficie de la proteína de
forma nativa y como pueden estar ocultos por el proceso de interacción entre moléculas,
dependiendo del modelo propuesto.
Todos estos resultados, sugieren que dentro del comportamiento 1 (muestras G e

I), los residuos de Trp de PKCα estarían expuestos hacia afuera en la superficie y Fascin1
podría estar interaccionando con PKCα en un área que hace que evite la agregación de
PKCα. Esta sería una condición dependiente de la presencia de ADP/Mg2+, con una
estabilidad adicional si el éster de forbol está presente. En este modelo, la interacción
entre ambas proteínas estaría dejando expuesto los aminoácidos aromáticos de PKCα al
medio polar, como estarían indicando los valores de partida más altos de BCM (346.5
nm) (Figura III.18). En el caso de la muestra G, el alto grado de estabilidad que muestra
el complejo proteico, haría que en el proceso de desnaturalización proteica los valores de
BCM apenas aumentaran unas pocas unidades de BCM. Respecto a la muestra I (Ca2+ y
ADP/Mg2+), aunque la primera parte del patrón de la rampa de temperatura es semejante
para la condición compañera en la que se añaden los 3 aditivos, a partir de los 50ºC el
proceso de desnaturalización sería tan acusado que las medidas de fluorescencia se
disparan de forma muy acuciante. Esto puede indicar que, de esta manera, probablemente
el complejo se vuelve muy inestable desnaturalizándose por completo y exponiendo más
aminoácidos aromáticos del entorno hidrofóbico en comparación con la condición G en
las que esto no ocurre y los valores relativos de BCM se encuentran de media 7 puntos
por debajo.
176
Con respecto al otro comportamiento 2 (muestras H y J), Fascin1 estaría

interaccionando directamente con la superficie donde PKCα exhibe los residuos de
triptófano. Dado que Fascin1 no tiene residuos de Trp expuestos a nivel superficial, esto
indica que una gran proporción de ambas proteínas deben estar interaccionando de tal
manera que se están ocultando los residuos de Trp expuestos en la superficie de PKCα
(Figura III.18). Esto lo estaría indicando los valores de BCM más bajos de partida
(cercanos a los 340 nm).
Atendiendo a los valores de polidispersidad para el complejo PKCα-Fascin1,

estarían mostrando que podríamos tener agrupaciones proteicas más grandes de lo
esperado y ello podría ser algo positivo a la hora de determinar la estructura del complejo
por medio de Cryo-EM. Esto es debido a que nuestro complejo proteico es bastante
pequeño en términos estructurales y se favorecería de estar formando macrocomplejos
para ser detectados por medio de la técnica CryoEM, donde el tamaño se presenta como
un problema a la hora de la resolución estructural.
Los valores de estabilidad por medio de SLS tanto a 266 nm y 473 nm para el
complejo PKCα-Fascin1, mostraban muestras más estables en comparación con PKCα.
Esto muestra de nuevo que el complejo de PKCα junto con Fascin1 estaría formando
alguna estructura más estable y con menor propensión a la agregación que en
comparación con PKCα por separado. Además, dentro de los dos grupos diferenciados
para PKCα-Fascin1 se observa una mayor estabilidad para el comportamiento 1 en el que
se añade CaCl2, éster de forbol P13A y ADP-MgCl2 (muestra G) y por otra parte CaCl2
y ADP-MgCl2 (muestra I). El segundo comportamiento, muestra menor estabilidad a lo
largo de la rampa de temperatura, cuando se añade CaCl2 (muestra H) o CaCl2 y P13A
(muestra J) al complejo proteico. Siendo la muestra G la que mayor estabilidad presenta
en términos de SLS, otorgando así al éster de forbol un papel fundamental en la
estabilización del complejo proteico.
Resulta interesante comentar también que, aunque la estabilidad durante la rampa

de temperatura sea menor para el comportamiento 2, éste resulta en datos de
polidispersidad más bajos que el comportamiento 1. Asignando a este modelo 2 un
complejo proteico menos polidisperso aunque con una mayor propensión a la agregación
durante la rampa de temperatura (de acuerdo a lo comentado referente a las medidas de
177
SLS). La condición que presenta una menor polidispersidad es la muestra H, donde solo
se añade Ca2+.
Estos resultados nos permiten proponer dos modelos de interacción entre PKCα y
Fascin1 dependiendo de los aditivos disponibles en el medio (Figura III.18).
Figura III.18. En general, los datos procedentes de los complejos proteicos PKCα-Fascin1, pueden generar
dos posibles modelos. A) Modelo A (comportamiento 1), para las condiciones del complejo junto con los
aditivos CaCl2, éster de forbol y ADP-MgCl2 y por otro lado CaCl2 y ADP-MgCl2, donde los residuos Trp
quedarían expuestos en la superficie debido a que el modo de interacción junto con Fascin1 implica que
dicha región está expuesta libremente. B) Modelo B (comportamiento 2), para las condiciones del complejo
con los aditivos CaCl2 y por otra parte CaCl2 junto con el éster de forbol, donde la superficie de PKCα que
expone los Trp estaría, en este modelo, protegida bien por la unión de Fascin1 a esta región o bien porque
la unión con Fascin1 genera una reorganización de la estructura tal que hace que dichos residuos por medio
de mecanismos intermoleculares dejen de estar expuestos hacia la superficie. Imágenes realizadas por
medio del software PyMOL.
Con respecto al complejo PKCα-RACK1, cuando se compara el perfil de BCM

con PKCα por sí sola, los resultados sugieren que PKCα y RACK1 podrían interaccionar
en una manera en la que los residuos Trp se mantienen en un ambiente hidrofóbico
formando un complejo más estable que la proteína PKCα por sí sola, debido a que su Tm
es mayor y el porcentaje de agregación menor.
178
Sin embargo, las medidas de DLS muestran un pico muy amplio de 157.86 nm, y
alta polidispersidad. Esto indica claramente que tenemos diversas poblaciones, de
combinaciones mol:mol del complejo PKCα-RACK1, lo que a priori podría ser ventajoso
siempre que se guardase un orden en la formación de macrocomplejos a la hora de ser
determinados por medio de técnicas estructurales como CryoEM que se benefician de
partir de complejos proteicos de gran tamaño, aumentando así el contraste de partida para
la técnica.
Con respecto a los valores de agregación, en comparación con PKCα por sí sola,
son mucho más bajos para el complejo PKCα-RACK1, indicando de nuevo que los
complejos proteicos aumentan la estabilidad en general en comparación con las proteínas
por sí solas.
179
CAPÍTULO IV. CARACTERIZACIÓN
BIOFÍSICA DE LA INTERACCIÓN
ENTRE PKCα Y PROTEÍNAS DIANA
POR MEDIO DE SPR, MS NATIVA Y
ENSAYOS DE ENTRECRUZAMIENTO.
CAPÍTULO IV. CARACTERIZACIÓN BIOFÍSICA DE LA INTERACCIÓN
ENTRE PKCα Y PROTEÍNAS DIANA POR MEDIO DE SPR, MS NATIVA Y
1 INTRODUCCIÓN.
1.1 Surface Plasmon Resonance (SPR).
Uno de los primeros estudios biofísicos que se llevaron a cabo en el transcurso de

esta Tesis Doctoral fue determinar la naturaleza de unión entre PKCα y Fascin1 por medio
de la técnica SPR (de sus siglas en ingles Surface Plasmon Resonance). Concretamente
esta unión se estudió por medio de la técnica cinética Single Cycle Kinetics (SCK),
descrita con mayor detalle en el apartado de materiales y métodos, en presencia de
diversos ligandos que se conocen son moduladores de la actividad catalítica de PKCα
(Homola, 2003; Pattnaik, 2005).
Para ello, se trabajó con dos construcciones de Fascin1, tanto la versión silvestre
(WT) como el mutante S39D, donde la serina en posición 39 está sustituida por un residuo
aspártico. El residuo S39 de Fascin1, se conoce que es el aminoácido que fosforila PKCα
cuando reconoce su sustrato Fascin1 regulando su capacidad empaquetadora de
filamentos de F-actina en el citoesqueleto (Ono et al., 1997; Yamakita et al., 1996). Este
sitio de fosforilación de Fascin1, además está altamente conservado entre diversas
especies (Kureishy et al., 2002).
El mutante S39D contiene en lugar de la serina 39 un ácido aspártico

fosfomimético que estaría simulando el estado fosforilado de la proteína y, de acuerdo
con la literatura, funcionaría para dar lugar a una unión constitutiva de PKCα a Fascin1.
Estas conclusiones se llevaron a cabo mediante el uso de técnicas de FLIM-FRET en
tiempo real usando células de cáncer de mama MCF-7, donde se marcaba con EGFP
Fascin1 WT y Fascin1S39D, mientras que se marcaba con el tallo Myc a la proteína
PKCα para posteriormente usar anticuerpos anti-Myc conjugados con la sonda
fluorescente Cy3. Así, mediante la medida de transferencia de energía entre EGFP y Cy3,
en células con PKCα estimulada con TPA (tetradecanoil forbol 13-acetato) y sin
estimular, se estudió y comparó la unión de PKCα a Fascin1WT y Fascin1S39D. De esta
forma, se determinó que el mutante Fascin1S39D se une de manera constitutiva a PKCα
(Anilkumar et al., 2003).
183
Podemos encontrar en la bibliografía que la sobreexpresión de los mutantes

fosfomiméticos S39D así como de sus antagonistas S39A (mutantes para los que la
fosforilación no es posible, puesto que el residuo serina está sustituido por una alanina
que no es susceptible de ser fosforilada) resultan en fallos de la función celular normal
relacionada con la matriz extracelular. Estos fallos celulares, aparecen relacionados con
migración celular u organización del citoesqueleto debido a desregulaciones en el
empaquetado de F-actina por parte de Fascin1 (Adams et al., 1999; Kureishy et al., 2002).
Algunas propiedades importantes que se extrajeron a partir de los ensayos de

Thermal Shift Assay por medio de la herramienta UNcle (Unchained labs), y que tuvimos
de referencia para diseñar los ensayos de SPR, fueron los siguientes:
• PKCα empieza a agregarse a partir de 50ºC, independientemente de la

composición y combinación de aditivos añadidos al tampón (CaCl2, éster de
forbol P13A o ADP-MgCl2).
• La estabilidad del complejo PKCα-Fascin1 medida por SLS, es menor cuando
todos los aditivos se añaden de manera conjunta: CaCl2, éster de forbol P13A y
ADP-MgCl2.
• Por su parte, los experimentos de DLS, mediante la medida del diámetro
hidrodinámico e índice de polidispersidad, indican que la polidispersidad es
menor solo en la presencia de CaCl2.
Todo ello sugería, que se debería comenzar añadiendo CaCl2 en primer lugar y
después de analizar los primeros resultados, se podría determinar la unión por medio de
SPR añadiendo el resto de las combinaciones de los aditivos para ver de que manera
modulan la interacción entre PKCα-Fascin1. Se comenzaría usando el mutante de Fascin1
S39D puesto que en la bibliografía resultaba presentar una mayor afinidad por PKCα
según lo explicado anteriormente (Anilkumar et al., 2003).
184
1.2 Espectrometría de masas nativa (MS) y entrecruzamiento químico.
La espectrometría de masas (MS) nativa, no da información molecular y

estructural tan detallada de las muestras a analizar como la cristalografía de rayos X o la
criomicroscopía electrónica. Sin embargo, presenta grandes ventajas sobre las técnicas
tradicionales de biología estructural. Una de ellas es la elevada sensibilidad, que permite
la detección de complejos proteicos expresados de forma endógena en cantidades de
picomoles. Otras ventajas son la velocidad, la selectividad y la habilidad para medir de
manera simultánea diversas especies en una misma mezcla. Estas características hacen de
la espectrometría de masas nativa, un método que requiere únicamente una fracción de
proteína mucho menor de la que se necesita para otras técnicas tales como NMR o
cristalografía de rayos X. Además, es una técnica que de manera rápida ofrece
información sobre la pureza y estequiometría de posibles complejos proteicos en la
muestra bajo estudio (Heck, 2008).
De forma complementaria, la espectrometría de masas nativa acoplada al uso de

entrecruzadores químicos (XL-MS) es una técnica de gran interés que en complemento
con la cristalografía de rayos X o criomicroscopía electrónica puede ser de gran ayuda
para el mapeo de los sitios de interacción entre complejos proteicos. Así, esta técnica es
crucial para aportar información de la arquitectura de complejos proteicos y de la red que
envuelve la interacción entre proteínas, para poder llegar a comprender mejor su función
celular y poder desarrollar dianas terapéuticas. Esto convierte a estas técnicas, en
herramientas fundamentales para cubrir el vacío que suele existir entre los estudios
proteómicos de interactoma proteico y las tecnologías de alta resolución de biología
estructural (Holding, 2015; Liu & Heck, 2015).
En la XL-MS, el uso de los agentes de entrecruzamiento juegan un papel

fundamental. Se tratan de moléculas que típicamente contienen dos grupos reactivos que
permiten la unión covalente entre aminoácidos. Después de la digestión proteolítica de la
muestra proteica que se analiza con enzimas tales como tripsina, los residuos
entrecruzados se identifican por medio de MS. Puesto que los dos residuos aminoacídicos
necesitan estar espacialmente cercanos para que ocurra la ligación, el entrecruzador
impone limitaciones en la separación de los aminoácidos que une. De esta manera, se
185
unen los aminoácidos que se encuentran cercanos entre las proteínas y que son potenciales
candidatos para estar implicados en la interacción en el complejo proteico, o bien uniones
intramoleculares que también ayudarían a entender mejor el plegamiento de las proteínas
por separado y como este puede cambiar una vez interacciona con otras proteínas o
ligandos. Esto resulta fundamental para poder llevar a cabo el análisis estructural y la
identificación de interacciones proteína-proteína (Leitner et al., 2010; Rappsilber, 2011;
Sinz, 2006, 2014; Walzthoeni et al., 2013).
2 RESULTADOS.
2.1. MEDIDA DE LA AFINIDAD ENTRE PKCα-FASCIN1 EN LAS DIVERSAS

COMBINACIONES DE ADITIVOS POR MEDIO DE SPR.
Los ensayos de SPR se llevaron a cabo por medio del instrumento Biacore T200,
empleando la técnica cinética de SCK (Single Cycle Kinetics). El analito, se aplicaba a
las concentraciones de 0,625, 1,25, 2,5, 5 y 10 µM mediante SCK, en presencia de
diversas condiciones que englobaban la adición de una serie de aditivos y que se explican
de manera más desarrollada en el apartado correspondiente de materiales y métodos.
Concretamente, se probaron cuatro condiciones diferentes para cada una de las

combinaciones de PKCα con Fascin1WT y Fascin1S39D:
• Condición 1: CaCl2.
• Condición 2: CaCl2 y éster de forbol P13A.
• Condición 3: CaCl2 y ADP-MgCl2.
• Condición 4: CaCl2, éster de forbol P13A y ADP-MgCl2.
Las concentraciones finales empleadas para los aditivos fueron de: CaCl2 0.2 mM,
ADP 2 mM, MgCl2 5 mM y P13A 5 mM.
En los primeros ensayos realizados de SPR, se empleó Fascin1S39D debido a que

la bibliografía la marcaba como una proteína que se une de forma constitutiva a PKCα
186
(Anilkumar et al., 2003). Además, de acuerdo con los datos obtenidos en la plataforma
UNcle relativos a Thermal Shift Assay y DLS, se empezaría usando la condición de
PKCα, Fascin1 y Ca2+. Posteriormente se testaron diversas combinaciones de PKCα,
FascinS39D/WT junto con los aditivos para estudiar la unión en más detalle.
Los valores de la constante de disociación Kd (nM) que se obtuvieron, para cada

una de las condiciones de aditivos y combinaciones de proteínas se muestran en la tabla
siguiente (Tabla IV.1).
Tabla IV.1. Resumen de los valores de Kd (nM) para todas las condiciones probadas de unión entre PKCα-
Fascin1WT y PKCα-Fascin1S39D. Se muestran los valores de Kd para el modelo cinético que mejor
encajaba de acuerdo con los análisis estadísticos que el software del sistema Biacore llevaba a cabo.
Así, se puede observar en la tabla IV.1, que para el caso de PKCα-Fascin1WT el

valor más pequeño para la Kd (nM) y que por tanto representa una mayor afinidad es de
es de 0,31 nM para la condición 4 (CaCl2, éster de forbol P13A y ADP-MgCl2). Mientras
que el valor más elevado, y por tanto indicando menor afinidad, es de 837 nM para la
condición 1 (CaCl2).
Por otra parte, en el caso de PKCα-Fascin1S39D el valor más pequeño (que indica
una mayor afinidad) de la constante de disociación Kd (nM) se corresponde con 14,8 nM
para la condición 3 (CaCl2 y ADP-MgCl2), mientras que el valor más elevado (que
representa una menor afinidad) se corresponde con 456 nM para la condición 1 (CaCl2).
2.2. DETERMINACIÓN DEL MODELO CINÉTICO DE UNIÓN ENTRE PKCα-

FASCIN1 POR MEDIO DE SPR.
Los datos experimentales finales se ajustaron a los cuatro modelos de unión que
el software de análisis del sistema Biacore propone: unión 1:1, analito bivalente, ligando
187
heterogéneo y reacción en dos pasos. Obteniéndose una serie de datos estadísticos como
el de la Chi2 que ayudan a determinar cual es el estado de unión al que mejor se ajusta
nuestro modelo cinético (Kim, 2017).
Para el caso en el que la Kd mostraba una mayor afinidad, Fascin1WT- PKCα,

condición 4, con todos los aditivos añadidos, podemos observar en la siguiente tabla
(Tabla IV.1) y figura (Figura IV.1), que el modelo al que mejor se ajustaban los datos de
la cinética eran a un modelo de unión en dos estados (Chi2 = 5,76).
Tabla. IV.1 Valores cinéticos para cada uno de los modelos donde podría ajustar nuestro modelo de unión
entre ambas proteínas. Fascin1WT, condición 4. El menor valor de Chi2 se corresponde para el modelo de
unión en dos pasos (5,76), seguido del ligando heterogéneo y analito bivalente (17).
Figura IV.1. Se observa, a modo de ejemplo, como el sistema de Biacore con los datos experimentales
determina el mejor ajuste comparando con los 4 modelos donde se puede ajustar el modo de interacción
entre ambas proteínas. Para el caso de Fascin1WT condición 4, la curva experimental (roja) ajusta de mejor
manera con la línea teórica (negra) para el modelo de unión en dos pasos.
188
Para el resto de las condiciones, se puede observar también a continuación el

resumen de los parámetros cinéticos ajustados a cada uno de los modelos que el sistema
Biacore propone, junto con los valores correspondientes de Chi2.
Tabla IV.2. Valores cinéticos para cada uno de los modelos donde podría ajustar nuestro modelo de unión
ligando heterogéneo (2,36), seguido de la unión en dos pasos (4,34).
entre ambas proteínas. Fascin1S39D, condición 1. El menor valor de Chi2 se corresponde para el modelo
de unión en dos pasos (2,39).
ligando heterogéneo (7,8), seguido de la unión en 2 pasos (19).
189
unión en dos pasos (4).
Figura IV.8. Valores cinéticos para cada uno de los modelos donde podría ajustar nuestro modelo de unión
Dentro de los valores estadísticos en los diversos conjuntos de datos, para los
complejos de PKCα-Fascin1 en las diversas combinaciones de aditivos, se puede observar
que hay una tendencia a ajustar los datos experimentales dentro del modelo de unión de
2-state reaction (modelo de unión en dos pasos). A continuación (Figura IV.2), se ilustra
la fórmula cinética que ejemplifica como tiene lugar esta unión entre un analito y un
ligando.
190
Figura IV.2 Se describe el modo de unión entre dos moléculas por medio del mecanismo enzimático de
reacción en dos pasos que implica un cambio conformacional. Donde A y B estarían representando cada
una de las proteínas, AB la unión primaria entre las dos moléculas y AB* el cambio conformacional que
experimentaría el complejo proteico para que se pueda completar la unión. Así, la única manera de que el
complejo AB* se disocie en sus dos componentes, es pasando previamente por el estado primario AB
cambiando a su estado estructural inicial.
2.3. ESPECTROMETRÍA DE MASAS NATIVA PARA PKCα, FASCIN1 Y EL

COMPLEJO PROTEICO PKCα-FASCIN1.
Otro estudio biofísico que se llevó a cabo fue estudiar por medio de espectrometría
de masas nativa, la interacción entre PKCα y Fascin1.
Se realizó espectrometría de masas nativa para el complejo proteico PKCα-

Fascin1WT. Puesto que a la hora de realizar este experimento ya se habían llevado a cabo
previamente los ensayos de SPR, decidimos emplear la forma silvestre de Fascin1 ya que
presentaba una mayor afinidad en la interacción con la proteína PKCα. El primer paso,
fue disolver las proteínas en solventes no desnaturalizantes para mantener parte de las
proteínas en un estado casi nativo cuaternario en la fase gas. Para todas las condiciones
probadas en MS, el tampón proteico se intercambió por NH4-OAc.
En la realización de la espectrometría de masas nativa, se empleó el instrumento

LC-MS-Orbitrap para determinar la masa intacta de las proteínas por sí solas, así como
en presencia de las condiciones de activación (CaCl2, éster de forbol P13A y ADP-MgCl2)
que se determinaron por medio de SPR que tenían un mejor resultado en la afinidad entre
las proteínas.
En primer lugar, se midió PKCα sola para estudiar la pureza del pico y el patrón
de fosforilación, aspectos claves a considerar para poder continuar con ensayos
estructurales. Esto es debido a que la pureza de la proteína y el hecho de que esté
fosforilada en los lugares clave, se consideran fundamentales a la hora de poder
determinar su estructural tridimensional. Estas condiciones, potencian la actividad
191
catalítica de PKCα y favorecen un estado de unión con su sustrato Fascin1, mejorando

así las posibilidades de determinar la estructura del complejo proteico (Messerschmidt et
al., 2005; Parekh et al., 2000).
Después de ello se probaron las siguientes condiciones:
1. Fascin1WT (5 µM) por si sola, para estudiar si el pico se presentaba de forma

clara y pura, para posteriormente estudiar el complejo PKCα-Fascin1.
2. PKCα y Fascin1WT añadidas de forma separada (5 µM para PKCα y su cantidad
equimolar 1:1 para Fascin1) sin aditivos.
equimolar 1:1 para Fascin1), añadiendo todos los aditivos (CaCl2, éster de forbol
P13A y ADP-MgCl2) que son claves para la activación de PKCα y aumentar la
afinidad con su sustrato. Las concentraciones empleadas fueron de: CaCl2 0.2
mM, ADP 2 mM, MgCl2 5 mM y P13A 5 mM.
equimolar 1:1 para Fascin1) añadiendo todos los aditivos 5 veces diluidos a la
concentración a la que se estaban usando para el resto de los ensayos biofísicos y
de biología estructural. Las concentraciones empleadas fueron de: CaCl2 0.04
mM, ADP 0.4 mM, MgCl2 1 mM y P13A 1 mM.
Se obtuvieron espectros muy limpios y de gran calidad tanto para PKCα y Fascin1
aisladas, condición fundamental para poder seguir con el estudio de estas técnicas donde
una gran pureza es una condición fundamental de partida.
PKCα se mostraba como un monómero centrado en torno al estado de carga +19

(79366 Da). También aparecía una muy pequeña proporción de un fragmento más corto
de la proteína de aproximadamente ~1185 Da de menor tamaño que la forma completa
(78180 Da), que se indica con un asterisco en la Figura IV.3.
El tamaño teórico de la proteína, introduciendo su secuencia de aminoácidos en

la herramienta de Expasy (Swiss Institute Bioinformatics), es de 78963.23 Da. Teniendo
192
en cuenta el peso teórico del grupo fosfato (94,97 Da), si la proteína estuviera fosforilada
en sus 3 sitios claves de fosforilación su tamaño ascendería a 79248 kDa.
De modo que estas dos poblaciones (la mayoritaria de PKCα de 79366 Da y el

un fragmento más corto de 78180 Da) estaría dando información de que el grupo
mayoritario, estaría constituido por PKCα con sus modificaciones postraduccionales, de
3 fosfatos y posiblemente otras modificaciones que sumaran aproximadamente 118 Da.
Mientras que, el segundo grupo de menor tamaño podría tratarse de una población
minoritaria de PKCα sin sus modificaciones postraduccionales, y que, además,
posiblemente estuviera careciendo de alguna región de la proteína de aproximadamente
800 Da.
Fascin1 también se presentaba predominantemente como un monómero, pero con

una proporción significante de dímero, centrados en torno a los estados de carga 15+ y
23+ respectivamente (Figura IV.3).
Combinando las dos proteínas (PKCα y Fascin1) en una proporción 1:1, sin
aditivos, aparecía una pequeña formación del complejo proteico. Sin embargo, este
complejo PKCα-Fascin1WT, se detecta en una cantidad muy pequeña puesto que se
determina a muy baja intensidad y a un nivel semejante al que se detecta el dímero de
Fascin1 en esta misma condición donde se añaden las proteínas por separado en
concentraciones equimolares. El fragmento más corto de PKCα también se observa en
este ensayo donde se añaden las dos proteínas, indicado de nuevo con un asterisco en la
Figura IV.3.
193
Figura IV.3. Se muestran los espectros de arriba hacia abajo para: A) PKCα, donde podemos observar tanto
la versión completa como el fragmento más corto (marcado con asterisco) de la proteína que se detectó. B)
Fascin1, donde se observa tanto el pico del monómero como del dímero. C) La combinación de Fascin1-
PKCα, donde podemos observar los picos para PKCα y el monómero de Fascin1. En la zona inferior se
muestra la región ampliada del sitio donde se puede ver el dímero de Fascin1 o el complejo proteico PKCα-
Fascin1 (D). En eje X se representa la proporción de intensidad de 0 a 100% y en eje Y relación carga masa
(m/z).
Para favorecer el estado de unión entre ambas proteínas, posteriormente se

probaron diversas condiciones con los aditivos añadidos al complejo proteico en distintas
concentraciones.
194
Se muestra a continuación (Figura IV.4), el mejor espectro que se obtuvo cuando

los diversos aditivos se añadían a la mezcla final del complejo proteico 5 veces diluidos
a conforme se venían usando en los diversos ensayos biofísicos y estructurales (fue la
concentración más reducida que se probó para intentar aminorar el ruido de fondo que
introducía la presencia de todos los aditivos en la medida del complejo proteico). En
general, se puede ver que el espectro se vuelve bastante sucio y con mucho ruido, por lo
que es muy difícil sacar ningún tipo de información significativa de la región donde se
esperaría ver la interacción entre ambas proteínas.
Se observan múltiples picos de muy baja intensidad en la región donde se espera

obtener la señal para la unión entre PKCα y Fascin1, lo que impide determinar la
presencia del complejo, que en presencia de aditivos sería esperable que estuviera
representado en mayores concentraciones debido a la mayor afinidad de interacción entre
las dos proteínas que forman el complejo, tal y como se determinó mediante SPR.
El primer set de picos podía ser resuelto parcialmente y se corresponden con los
estados de carga en torno a 12-14+ para Fascin1. No obstante, a relaciones m/z mayores
no fue posible asignar identidad de forma significativa a las señales que se obtienen dentro
de la región donde esperaríamos observar PKCα sola, el dímero de Fascin1 y la unión
entre PKCα y Fascin1.
195
Figura IV.4. Se observa el espectro, en la zona superior, para la condición en la que se añade el complejo
proteico PKCα-Fascin1, junto con la adición de todos los aditivos (CaCl2, éster de forbol y ADP-MgCl2).
En la zona inferior, se compara el espectro para el complejo proteico PKCα-Fascin1 sin la adición de
aditivos. Se ve claramente que la adición de aditivos distorsiona el espectro completamente y hace muy
difícil extraer cualquier tipo de información significante de dicho ensayo.
2.4. ESTUDIO DE LA UNIÓN ENTRE LOS COMPLEJOS PKCα-FASCIN1 y

PKCε-RACK1 MEDIANTE ENSAYOS CON ENTRECRUZADORES.
Con la información obtenida por medio de los ensayos de MS nativa, en los que
se intentó analizar el complejo proteico PKCα-Fascin1 que nos pudiera aportar
información de gran valor acerca de la interacción entre ambas proteínas, se comenzó a
realizar ensayos de entrecruzamiento entre los complejos proteicos PKCα-Fascin1 y
PKCε-RACK1 en nuestro laboratorio, con el fin de poder obtener información de las
regiones y residuos involucrados en la interacción entre ambas proteínas.
Concretamente, se realizaron experimentos de entrecruzamiento empleando el

entrecruzador BS3 (5 mM) para ambos complejos proteicos (Figura IV.5). Se probaron
196
diversas condiciones y combinaciones de aditivos para cada uno de los complejos

proteicos con el fin de estudiar las diferencias en la unión entre ambas proteínas.
Figura IV.5. Estructura tridimensional del agente de entrecruzamiento BS3.
Este entrecruzador BS3, es capaz de interaccionar con las proteínas reaccionando

con los grupos aminos localizados en los residuos de lisina y en los extremos amino
terminal.
De esta manera, se realizaron ensayos de entrecruzamiento químico tal y como se

describe en el apartado correspondiente de materiales y métodos para los complejos
proteicos PKCα-Fascin1 y PKCα-RACK1 en combinación con diversos aditivos (Figura
IV.6 y IV.7).
La zona perteneciente a la región superior de los geles en la figura IV.6 y figura

IV.7, y que aparece enmarcada en rojo, podría corresponderse a los complejos proteicos
formados por uniones inter- e intra-moleculares en los complejos proteicos.
Teniendo en cuenta que el rango de tamaño en el que se encuentran estos

complejos oscila entre 130-200 o más kDa, esto se podría corresponder con la formación
de complejos intermoleculares donde algunos de ellos contengan un híbrido del complejo
PKCα-Fascin1 (Figura IV.6).
197
Figura IV.6. Resultados de los ensayos de entrecruzamiento para el complejo PKCα-Fascin1.
Adicionalmente se procedió a realizar el experimento de entrecruzamiento con

BS3 para el complejo PKCα-RACK1. Considerando que el rango de tamaño en el que se
encuentran estos complejos oscila entre 120-200 o más kDa, esta región del gel podría
contener la información relativa a la de los complejos intermoleculares, donde alguno de
estos complejos podría representar algún híbrido para el complejo proteico PKCα-
RACK1 (Figura IV.7).
198
Figura IV.7. Resultados de los ensayos de entrecruzamiento para el complejo PKCε-RACK1.
3 DISCUSIÓN.
En general, por medio de SPR, se pudo ver que los menores valores de Kd y por
lo tanto mayor afinidad entre las proteínas, se daban para la unión entre PKCα-
Fascin1WT condición 4 (CaCl2, P13A y ADP-MgCl2), PKCα-Fascin1S39D condición 3
(CaCl2 y ADP-MgCl2), PKCα-Fascin1WT condición 3 (CaCl2 y ADP-MgCl2) y PKCα-
Fascin1WT condición 3 (CaCl2 y P13A), en ese orden de mayor a menor afinidad.
Los valores de la constante de disociación mostraron que la mayor afinidad (0.31

nM) se daba para la interacción entre PKCα y Fascin1WT en presencia de todos los
ligandos, condición 4 (CaCl2, P13A y ADP-MgCl2) en comparación con el resto de las
condiciones. Esto indica la importancia que tienen todos los aditivos que se conocen por
la bibliografía que juegan un papel fundamental en la activación de la proteína. Debido a
esta activación por medio de los aditivos, la proteína estaría sometiéndose a un cambio
estructural que haría más fácil el reconocimiento de su sustrato.
199
Sin embargo, de forma llamativa, en el caso de Fascin1S39D, esta presenta su

mayor afinidad por PKCα en la condición 3 (CaCl2 y ADP-MgCl2) en ausencia del éster
de forbol, única condición para el caso de Fascin1S39D, en la que la Kd disminuye hasta
10 órdenes de magnitud en comparación con el resto de las condiciones. Para las demás
condiciones (1, 2 y 4) en el caso de Fascin1S39D, la constante de disociación (Kd)
presenta valores muy semejantes, en el que la afinidad por PKCα ve ampliamente
disminuida en comparación con la condición 3.
Todos estos resultados, exhibían efectos totalmente opuestos a los que mostraron
los investigadores de la publicación comentada anteriormente en el apartado de la
introducción (Anilkumar et al., 2003). Como se ha comentado, estos autores proponían
una unión constitutiva del mutante de Fascin1S39D a PKCα por medio de ensayos de
FLIM-FRET in vivo y, por tanto, cabría esperar una mayor afinidad entre las proteínas
PKCα y Fascin1S39D una vez medida por medio técnicas biofísicas.
Para la mayor afinidad que se produce entre las proteínas PKCα y Fascin1WT
(condición 4), el valor de Kd (0.31 nM) revela que la afinidad de la interacción entre
ambas proteínas resulta muy elevada. Si además tenemos en cuenta los valores de Ka1,
Ka2, Kd1 y Kd2 obtenidos, se puede comprobar que el estado de unión del complejo PKCα-
Fascin1WT estaría muy estabilizado dentro de está condición.
Con los datos relativos al modelo de unión que el sistema de Biacore nos ofrece,
también se pudo determinar que el modelo que mejor encaja con la naturaleza de la unión
entre nuestras dos proteínas se ajustaba al modelo de reacción en dos estados. Este modelo
de unión implica la interacción 1:1 de ambas proteínas con un cambio conformacional
del complejo proteico para darse la unión, siguiendo una cinética de primer orden. Donde
el cambio de conformación se acumula igual en ambas direcciones y donde antes de que
el analito pueda disociarse, debe cambiar al primer estado de unión.
Hay que enfatizar que los cambios conformacionales en ligando o complejos

proteicos normalmente no dan una gran respuesta en los sistemas Biacore. De esta
manera, un buen ajuste de los datos experimentales al modelo de dos estados tiene que
200
tomarse como un indicador para poder estudiar más en detalle y contrastar las propiedades
conformacionales con otras técnicas tales como NMR o espectrometría.
Aunque con los datos obtenidos experimentalmente se decidió asignar el modelo

de reacción en dos estados, para la unión entre PKCα y Fascin1WT/S39D, cabe destacar
que aparecían dos condiciones de las 8 totales probadas donde el modelo de two-state
reaction no era el que presentaba una menor Chi2. De esta forma, para las condiciones de
PKCα-Fascin1WT condición 1 y PKCα-Fascin1WT condición 2, el modelo se ajustaba
mejor para la forma de unión de ligando heterogéneo. Este modelo de ligando
heterogéneo implicaría la interacción de un analito con dos ligandos independientes, algo
que podríamos descartar ya que a nivel bibliográfico y estructural no sería posible una
doble interacción entre una molécula de PKCα y dos de Fascin1.
En general, todo esto nos da información de que la unión entre PKCα y Fascin1
se trata de una unión con alta afinidad y cooperativa en la que probablemente se vean
implicados diferentes dominios de PKCα. Así, en un primer lugar se formaría un primer
intermedio de interacción, donde ambas proteínas se anclarían la una con la otra y
posteriormente tras un cambio conformacional del complejo, se produce la unión
completa para finalizar con la fosforilación del sustrato. De esta forma, probablemente y
atendiendo a la información de la bibliografía, primero tendría lugar la interacción entre
el dominio C1B de la PKCα y Fascin1 (Anilkumar et al., 2003). Después, la proteína
PKCα sufriría un cambio conformacional por el cual el dominio catalítico interaccionaría
con la serina en posición 39 de Fascin1 y así llevar a cabo su fosforilación. Por último y
para poder liberarse de esta unión, PKCα tendría que pasar por el primer intermedio de
interacción (Figura IV.8).
Figura IV.8. Modelo de unión entre Fascin1 y PKCα explicada por medio del método cinético de unión en
dos estados.
201
Con respecto a los ensayos de MS nativa, se determinó de forma clara y muy

limpia los picos para las señales de las proteínas individuales PKCα y Fascin1, así como
también se pudo observar una pequeña cantidad de la formación del complejo PKCα-
Fascin1 por medio de MS nativa para la condición en la que se añade PKCα y Fascin1 en
concentraciones equimolares sin la adición de ningún aditivo.
Aunque se observa la formación del complejo, no se puede descartar que, debido

a las bajas intensidades a las que se detecta el pico, el complejo no se haya formado de
forma inespecífica como parte del proceso de electrospray dentro de la técnica de
espectrometría de masas. Para esclarecer esto, se deberían seguir probando más
condiciones, variando la concentración de proteína y aditivos. Aunque, trabajando en las
condiciones de concentración finales que se probaron, debería haber ayudado a rebajar
las posibilidades de unión no específica y podemos inclinarnos por tanto a establecer que
sí se forma una población minoritaria de complejo proteico en esta técnica de MS nativa.
Por otro lado, también es importante destacar que en la presencia de ambas

proteínas (PKCα y Fascin1), en los primeros experimentos sin la adición de aditivos, el
pico de Fascin1 correspondiente al dímero de esta proteína, se reduce bastante en
intensidad en comparación a cuando se añade Fascin1 de forma independiente. Esto,
podría ser una clara indicación de que realmente la interacción entre PKCα y Fascin1 está
teniendo lugar, y por ese motivo, el dímero de Fascin1 sea menos propenso a formarse en
comparación con la condición en la que solo se añade Fascin1 por sí sola.
La presencia de aditivos no ayudó a sacar más conclusiones debido a que el

espectro aparecía muy desorganizado y difícil de obtener ninguna información. Ante este
problema, la optimización de las condiciones iniciales podría mejorar la resolución del
espectro.
También, es importante destacar que se pudo determinar por diferencias de peso

molecular que la proteína PKCα estaba fosforilada en sus 3 sitios claves, en un porcentaje
muy elevado, siendo así totalmente funcional y pudiendo adoptar una conformación que
le permita fosforilar a su sustrato.
202
El empleo de entrecruzadores nos permitió potenciar y estabilizar los complejos

formados en las distintas condiciones en presencia de aditivos. Los datos preliminares
obtenidos correspondientes a los ensayos de entrecruzamiento, en los que las regiones
superiores del gel podrían ser potenciales candidatos para contener los complejos
proteicos podrían dar información valiosa por medio de XL-MS de las interacciones entre
PKCα y Fascin1, así como entre PKCε y RACK1.
Realizando la técnica de XL-MS con estas proteínas y los entrecruzadores

ayudarían a mapear las regiones de interacción entre ambas proteínas, lo que podría
ayudar a esclarecer la forma en la que los complejos proteicos interaccionan.
203
CAPÍTULO V. DETERMINACIÓN DE
LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL
DE PKCα Y PROTEÍNAS CON LAS
QUE INTERACCIONA POR MEDIO
DE CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X.
CAPÍTULO V. DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL
DE PKCα Y PROTEÍNAS CON LAS QUE INTERACCIONA POR MEDIO DE
CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X.
1 INTRODUCCIÓN.
El entendimiento de como los complejos macromoleculares desempeñan sus

papeles en las células vivas es un tema central en la biología molecular. La biología
estructural tiene como objetivo deducir cómo estos complejos funcionan mediante la
determinación de la organización tridimensional de sus átomos. Se pueden emplear
diversas técnicas para determinar tales estructurales, pero con diferencia, la técnica que
ha sido más exitosa históricamente para este fin ha sido la cristalografía de rayos X
(Thomas, 2012). Teniendo en cuenta que el complejo molecular a determinar pueda
cristalizar, esta técnica puede obtener resolución atómica y no está limitada por el tamaño
de la molécula. Otra técnica estructural ampliamente usada ha sido la resonancia
magnética nuclear (NMR), que puede proveer información única sobre la dinámica e
interacción de complejos moleculares, pero la determinación estructural a nivel atómico
está restringida para pequeñas moléculas con pesos moleculares menores de 50 kDa. Por
su parte, otra técnica más reciente y con un potencial sin parangón que está
revolucionando la biología estructural en las últimas décadas, es la CryoEM, de la que
hablaremos más en detalle en el siguiente capítulo (Bai et al., 2015).
Como se ha descrito en la introducción de este manuscrito, hasta la fecha no existe

ninguna estructura completa para ninguna de las isoenzimas de las PKCs y solo
disponemos de información fragmentada a través de las estructuras de dominios
independientes. La información multidominio más detallada que se ha conseguido hasta
la fecha, es el caso de la PKCβ (Leonard et al., 2011) y aún así, su estructura no se
consiguió determinar a nivel atómico para el conjunto de todos sus dominios. Dado el
carácter de las distintas conformaciones adoptadas por estas enzimas dependiendo de su
estado de activación, existe una gran falta de información con respecto a la disposición
relativa de unos dominios con respecto a otros en cada uno de estos estados. De ahí, la
gran dificultad que todavía existe a la hora de poder diseñar moduladores de la función
específica de cada una de estas isoenzimas (Mochly-Rosen et al., 2012).
Uno de los principales objetivos estructurales con los que se inició esta Tesis
Doctoral, fue determinar la estructura tridimensional de PKCα por si sola, así como de
207
PKCα en combinación con una proteína sustrato (Fascin1) y con una proteína de soporte
estructural (RACK1) por medio de la técnica de cristalografía de rayos X.
Para ello, los cribados de cristalización se diseñaron en presencia de los distintos

ligandos activadores como el CaCl2, éster de forbol P13A o derivados de ATP, con el fin
de homogeneizar la población de distintas posibles conformaciones. Además, el hecho
de poder determinar la estructura de PKCα interaccionando con sus sustratos Fascin1 o
RACK1 podría aportar un valor añadido ya que la información de la interacción entre
ambas proteínas, nunca resuelta a nivel estructural, puede ser de gran interés para el
desarrollo de dianas terapéuticas que sean de gran importancia en el control de
enfermedades como el cáncer (Francis et al., 2019; Palaniyandi et al., 2009).
2 RESULTADOS.
2.1 CRISTALIZACIÓN DE LA PROTEÍNA PKCα Y LOS COMPLEJOS

PROTEICOS PKCα-FASCIN1 Y PKCα-RACK1.
En primer lugar, se realizaron cribados de cristalización para las siguientes

combinaciones de proteínas:
• PKCα sola (78.96 kDa).

• PKCα y Fascin1 (54.57 kDa para Fascin1) añadidas por separado en cantidades
equimolares.
• PKCα y RACK1 (35.6 kDa para RACK1) añadidas por separado en cantidades
equimolares.
De la misma manera, se añadieron diversas combinaciones de aditivos en los

diferentes cribados realizados. Concretamente, se testaron 4 condiciones diferentes:
• Condición 1. Sin aditivos añadidos.

• Condición 2. CaCl2.
208
• Condición 3. CaCl2 y ADP-MgCl2.

• Condición 4. CaCl2, ADP-MgCl2 y P13A.
Las concentraciones finales empleadas fueron de: CaCl2 0.2 mM, ADP 2 mM, MgCl2
5 mM y P13A 5 mM.
Antes de llevar a cabo los diversos cribados de cristalización, se realizó un cálculo

aproximado de la concentración óptima de proteína a emplear en las pruebas de
cristalización por medio de la prueba de pre-cristalización (PCT) (Hampton Research).
Este ensayo PCT, combina 4 soluciones de precipitación basadas en la presencia de Tris
pH 8.5, sulfato de amonio, cloruro de magnesio y PEG 4000
(https://hamptonresearch.com/product-PCT-Pre-Crystallization-Test-10.html).
Estas soluciones de precipitación se añaden junto con la proteína a cristalizar y así

se puede determinar la concentración óptima de partida para los cribados de
cristalización. De esta manera, se puede evitar perder mucha proteína por ensayo y error
antes de observar a lo largo de los cribados un balance entre precipitación y no
precipitación adecuada. Tras incubar las gotas de proteínas siguiendo el protocolo de PCT
y posterior examen del grado de precipitación en los pocillos, se pudo determinar la
concentración optima para comenzar a realizar las pruebas de cristalización (Tabla V.1 y
Tabla V.2).
Figura V.1. Se muestran ejemplos para imágenes de pocillos con los 3 tipos de grados de precipitación
esperados. No precipitado, precipitado débil y precipitado fuerte de izquierda a derecha para el caso de
PKCα sola. Imágenes tomadas de la web de Hampton Research.
209
Para los ensayos de pre-cristalización se emplearon las concentraciones que se

indican en las siguientes tablas (Tablas V.1 y Tabla V.2) para PKCα y su concentración
equimolar para la proteína diana Fascin1 y RACK1.
Tabla V.1. Primer ensayo de PCT empleando 10 mg/ml de PKCα y su concentración equimolar para
Fascin1 y RACK1. Se indica el grado de precipitación observado para cada agente de precipitación (A1,
A2, A3 y A4) para cada una de las proteínas. En la última columna se indica la recomendación del protocolo
de la casa comercial de acuerdo con la combinación de tipos de precipitados que aparecen en cada una de
las condiciones.
(10 mg/ml) A1 A2 B1 B2 Acción

PKCα Precipitado Precipitado Precipitado Clara Diluir entre 50-70%
fuerte débil débil
PKCα-Fascin1 Precipitado Precipitado Clara Precipitado Diluir entre 50-70%
fuerte fuerte débil
PKCα-RACK1 Precipitado Precipitado Precipitado Precipitado Diluir entre 50-70%
débil fuerte débil débil
Tabla V.2. Segundo ensayo de PCT empleando 3.5 mg/ml de PKCα y su concentración equimolar para
Fascin1 y RACK1. Se indica el grado de precipitación observado para cada agente de precipitación (A1,
A2, A3 y A4) para cada una de las proteínas. En la última columna se indica la recomendación del protocolo
de la casa comercial de acuerdo con la combinación de tipos de precipitados que aparecen en cada una de
las condiciones.
(3.5 mg/ml) A1 A2 B1 B2 Acción

PKCα Precipitado Precipitado Precipitado Precipitado Realizar
débil débil débil Fuerte cribados
PKCα-Fascin1 Precipitado Clara Precipitado Clara Realizar
débil débil cribados
PKCα-RACK1 Precipitado Precipitado Precipitado Precipitado Realizar
débil débil débil fuerte cribados
Atendiendo a los resultados obtenidos por medio de la prueba PCT para PKCα y
para PKCα junto con sus proteínas acompañantes RACK1 y Fascin1 (añadidas en
cantidades equimolares) se determinó que la concentración optima de partida era de 3.5
mg/ml (45 μM). La primera referencia que se tiene que tomar para evaluar si la
concentración de las proteínas es adecuada son las soluciones A1 y A2. Si una de estas
dos condiciones resulta en precipitado fuerte, como ocurrió en el primer ensayo PCT
empleando 10 mg/ml de PKCα (126 μM) y su cantidad equimolar de Fascin1 y RACK1,
la concentración tiene que diluirse entre un 50 y 70% para repetir de nuevo el ensayo. Es
210
por ello por lo que la concentración de PKCα se disminuyó hasta 3.5 mg/ml. En esta
nueva concentración al menos una de las condiciones para A1 o A2 resultó en precipitado
débil sin aparecer precipitado fuerte. De este modo, podíamos tomar esta concentración
(3.5 mg/ml; 45 μM de PKCα) como la adecuada para poder realizar los cribados de
cristalización que se realizaron a continuación.
Tabla V.3. Se muestra el resumen de los cribados de cristalización realizados en primer lugar para las
diversas combinaciones de proteínas junto con los diferentes aditivos.
Block 1 Membrane Membrane Index Morpheus PACT Block Proplex PEGRX

Gold2 premier 3
PKCα P P P P P P P P P
PKCα RACK1 + P P P P P P P P
CaCl2, ADP-
MgCl2 y éster de
forbol.
PKCα + Fascin1 P P P P P P P P
+ CaCl2, ADP-
MgCl2 y éster de
forbol.
PKCα + Fascin1 P P P P P P P
+ CaCl2
PKCα + Fascin1 P P P P P P P
+ CaCl2 + ADP-
MgCl2
En primer lugar, se realizaron 9 cribados de cristalización para PKCα sola, sin

aditivos. Los cribados realizados fueron: Block 1, Membrane, Membrane Gold 2, Index,
Morpheus, PACT premier, Block 3, Proplex y PEGRX.
Por otra parte, se realizaron 8 cribados de cristalización para los complejos PKCα-
RACK1 y PKCα-Fascin1, ambos en combinación con los tres aditivos que se conocen
tienen una función en la actividad catalítica de PKCα: CaCl2, éster de forbol P13A y
ADP-MgCl2. Los cribados realizados fueron: Proplex, Morpheus, Membrane, Membrane
Gold 2, PEGRX, Index, Block 3 y PACT premier.
211
Finalmente, también se prepararon 7 cribados (Proplex, Morpheus, Membrane,

Membrane Gold 2, PEGRX, Index y Block 3) para el complejo PKCα-Fascin1. Por una
parte, se prepararon esos 7 cribados de cristalización para el complejo junto con la adición
de Ca2+ y por otra parte el mismo complejo junto con la adición de Ca2+ y ADP/Mg2+.
La primera fase de elección de estos cribados de cristalización se realizó de forma

amplia para cubrir las condiciones más repetidas de las estructuras depositadas en el PDB
que ya han sido resueltas por medio de cristalografía de rayos X y que, además, por sus
características se adecuaban al tipo de proteínas con el que estábamos trabajando. Es
importante tener en cuenta que existen algunos cribados de cristalización que se muestran
más idóneos para determinados tipos de proteínas con propiedades fisicoquímicas
específicas. Sin embargo, debido al componente molecular desconocido con el que
siempre contamos a la hora de plantear estos objetivos de determinación de estructura
3D, los expertos siempre recomiendan probar el mayor número de condiciones posibles
que estén a nuestro alcance.
Se usaron los siguientes cribados de cristalización:
1. En primer lugar, se comenzó usando los cribados de cristalización Membrane y

Membrane Gold 2 (Molecular dimensions). Estos cribados englobaban las condiciones
de cristalización más repetidas dentro de las proteínas eucariotas y procariotas formadas
predominantemente por hélices alfa y que son proteínas de membrana tales como
transportadores y canales de membrana, determinadas y resueltas estructuralmente por
medio de cristalografía de rayos X hasta el momento. Concretamente, se cubren las
condiciones para 130 proteínas de membrana cristalizadas y depositadas en el Protein
Data Bank (PDB) en el caso de MemGold y 121 proteínas de membrana cristalizadas y
depositadas en el PDB, en el caso de MemGold2. Cubriendo en los 96 pocillos diversas
concentraciones de sales, pHs (4.0-10.0) y concentración de PEG (de pequeño MW)
(Newstead et al., 2008).
Nuestra proteína, presenta cierto carácter hidrofóbico y, aunque per se no es una

proteína de membrana, es una molécula que contiene dominios de unión con la membrana
212
y además también tiene una composición importante de alfa hélice en su estructura. Por
ello, estos cribados de la serie Membrane suponían una buena condición de partida.
2. Debido a que estábamos trabajando con complejos proteicos (PKCα-Fascin1 y

PKCα-RACK1) se empleó el cribado Proplex (Molecular Dimensions). Este cribado
reúne una serie de condiciones para complejos proteicos resueltos y depositados en la
base de datos de complejos proteicos cristalizados (PCCD). En este caso, las condiciones
de los precipitantes tienen dos características que los hacen idóneos para este propósito.
Por una parte, son capaces de mantener las interacciones proteína-proteína de forma
estable y, por otra parte, reducen la solubilidad del complejo. Reúnen para dicho propósito
una serie de características como el empleo de PEG de medio y alto peso molecular, bajas
concentraciones de PEG, pocos precipitantes orgánicos, ácidos orgánicos neutralizados y
un rango de pH de 4.5 a 8.5. En general, son condiciones que se ha demostrado que son
idóneas para la obtención de cristales de complejos proteicos (Dafforn, 2007; Radaev et
al., 2006).
3. El cribado Morpheus (Molecular Dimensions), se basa en el empleo de ligandos

que se han usado de forma exitosa en la formación de cristales en alrededor de 33000
estructuras depositadas en el PDB. Se trata de una selección de 49 ligandos de bajo peso
molecular que pueden promover la formación inicial del cristal y la estabilidad de la
estructura cristalina. Estos ligandos reúnen una serie de característica comunes: son
pequeños (el más grande es HEPES 238.3 g/mol y el más pequeño es el ion litio 6.94
g/mol), estables, comunes, baratos, fáciles de obtener y cada uno de ellos está relacionado
con al menos 5 estructuras no relacionadas depositadas en el PDB. A su vez, también lo
hace ideal para proteínas de membrana puesto que muchas de las condiciones contienen
PEG y bajo contenido en sal (Gorrec, 2009).
Estas características del cribado Morpheus, lo hacen un cribado de cristalización

idóneo para emplear independientemente de la naturaleza de la proteína que se quiera
cristalizar ya que la presencia de ligandos en muchas ocasiones es clave para marcar la
diferencia entre la aparición o no aparición de cristales.
213
4. El cribado PEGRx (Hampton Research), engloba 3 tipos de polímeros de diverso

MW y a diversas concentraciones. Concretamente contiene polietilenglicoles,
polietilenglicol monoetil éteres y jefaminas en un amplio rango de MW (200-20000 Da)
en un ambiente de baja fuerza iónica y con agentes tamponadores que abarcan un rango
de pHs de 3.5 a 9.0. Puesto que el PEG se ha demostrado que es un polímero de gran
interés para la resolución de estructuras de proteínas de membrana, para la PKCα que
como se ha comentado presenta un carácter hidrofóbico es muy conveniente probar este
tipo de cribados de cristalización (McPherson, 1990).
Este tipo de pruebas de cristalización son consideradas como cribados primarios,

es decir, son cribados cuyo objetivo principal no busca la aparición inmediata de cristales
para difractar directamente, si no que es un tipo de cribado que suele emplearse como una
suerte de ensayo piloto para determinar cuales son las condiciones ideales de partida para
seguir optimizando los hits potenciales. En estos casos, no se etiqueta la proteína dentro
de un grupo y se introduce un sesgo por parte del investigador probando un rango
concreto, sino que se somete la proteína a un cribado de un amplio rango de diversas
características como en el caso del cribado PEGRx: pH, tipos de polímeros y MW de
estos. Además, la característica del polímero PEG y polímeros relacionados se saben que
tienen un papel muy importante para la formación de cristales de proteínas de carácter
hidrofóbico como es el caso de la PKCα y por esto se convierten en idóneos para probar
con nuestros complejos proteicos de interés (Newstead et al., 2008).
El cribado PEGRx, también puede funcionar como un sistema de búsqueda

secundario, este es un sistema que sigue al primario y busca profundizar y optimizar las
condiciones previamente probadas. En este caso, por ejemplo, después de usar el cribado
Index (del que se habla a continuación) y tener cristales o potenciales cristales dentro de
condiciones semejantes a las que están dentro del sistema PEGRx, se puede pasar a
emplear el cribado PEGRx como sistema de búsqueda secundario, ya que amplía las
condiciones dentro del propio cribado Index.
5. El cribado Index (Hampton Research) se emplea para péptidos, proteínas, ácidos

nucleicos y pequeñas moléculas solubles en agua. De nuevo y al igual que el cribado de
cristalización PEGRx se presenta como un cribado primario para determinar cuales son
214
las condiciones más adecuadas que se pueden tomar de partida para optimizar la aparición
de cristales mediante la observación de los pocillos y ver que tipo de precipitación,
microcristales o agrupaciones de agujas cristalinas se generan (Dauter & Dauter, 2001;
McPherson, 2001). Al ser un cribado primario combina una amplia cantidad de
condiciones a lo largo de sus 96 pocillos, variando características como:
-Sales (tales como sulfato de amonio o cloruro potásico) vs pH.

-En algunos pocillos contiene ácidos orgánicos, como malonato de sodio o
Tacsimato.
-Condiciones de alta concentración de sal con polímeros pequeños.
-Condiciones de alta concentración de polímeros con baja concentración de sal.
-Baja fuerza iónica (usando polímeros como PEG, 2-metil-2,4-pentanodiol y
pentaeritritol) vs rango de pH.
-PEG y sales vs pH.
-PEG y sal.
Como cribado primario, por ejemplo, si se observaran cristales o potenciales hits

en las regiones donde se trabaja con sales, se podría pasar a emplear el cribado secundario
SaltRx, más especializado en sus 96 pocillos en diversos tipos y concentraciones de sales.
6. Los cribados de cristalización Block1 y Block3 (Hampton Research), son cribados

de cristalización primarios formados por, en el caso de Block 1 a partir de una
combinación de condiciones de cristalización albergadas en el Hampton Crystal Screen
y Hampton Screen 2, y en el caso de Block3 por la combinación de los cribados: Hampton
PEG/ion Screen, Hampton PEG6k Screen y Hampton Ammonium Sulphate Screen.
7. El cribado PACT premier (Molecular Dimensions), se trata de otro cribado de

cristalización primario basado en el uso de cationes y aniones, usando PEG como
precipitante (Newman et al., 2005). Los 96 pocillos se distribuyen de la siguiente manera:
-24 pocillos, se hace un barrido de pH (4-9) vs PEG.
-24 pocillos, se hace un barrido de 7 cationes vs PEG 6000, a 4 pHs diferentes: 5,
6, 7 y 8.
215
-48 pocillos, se realiza un barrido de 11 aniones vs PEG 3350, a 3 pH diferentes:

6.5, 7.5 y 8.5.
En estos primeros cribados de cristalización realizados, entre las 72 y 96 horas,

después de incubar las placas a 4ºC en el Rock Imager 182 (Formulatrix), se observaron
en algunas placas algunos cristales que empezaban a presentar un buen aspecto en cuanto
a su morfología para ser objeto de análisis por medio del sincrotrón. A continuación, se
resumen algunos de los eventos más interesantes encontrados en 3 condiciones diferentes
en las horas siguientes a la elaboración de los cribados de cristalización con las diferentes
combinaciones de proteínas y aditivos probados.
Figura V.2. Agrupaciones de agujas cristalinas típicas observables en los cribados que contenían el
complejo PKCα-RACK1 (Condición CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol). A las 72-96 horas de
observación detenían su crecimiento. Estas agrupaciones de agujas presentaban un rango de tamaño de
entre 125-500 μm.
216
Figura V.3. Cristales típicos observables en las placas que contenían el complejo PKCα-Fascin1 (Condición
CaCl2). A las 96 horas de observación detenían su crecimiento. Estos cristales presentaban un rango de
tamaño de entre 150-700 μm.
Figura V.4. Cristales típicos observables en las placas que contenían el complejo PKCα-Fascin1 (Condición
CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol). A las 96 horas de observación detenían su crecimiento. Estos cristales
presentaban un rango de tamaño de entre 225-430 μm.
217
Figura V.5. Cristal observado en uno de los cribados que contenían el complejo PKCα-Fascin1 (Condición
CaCl2 y ADP-MgCl2). A las 96 horas de observación detenían su crecimiento. Estos cristales presentaban
un rango de tamaño de entre 200-400 μm.
Como pudo verse en las primeras observaciones de las placas de cristalización

(Figuras V.2-V.5), en las primeras horas de incubación, para las condiciones de PKCα-
Fascin1 aparecieron una gran cantidad de cristales con la forma característica de vara
(Rod-shaped), que serían habituales a partir de entonces. Sin embargo, para el caso de
PKCα junto con RACK1 no aparecieron cristales y sí un gran número de agrupaciones
de agujas cristalinas, que podrían representar potenciales condiciones candidatas a ser
optimizadas para intentar obtener cristales en los cribados de optimización posteriores.
Las placas de cristalización se dejaron en periodo de incubación y observación

durante varias semanas más, antes de llevar a cabo la elección de los cristales que serían
objeto de análisis en el sincrotrón Diamond (Light Source IO3, Oxford).
Los cristales llevados al sincrotrón procedían de las placas, pocillos, proteínas y

condiciones de precipitación que se muestran en la siguiente tabla (Tabla V.4).
218
Tabla V.4. Información relativa a las condiciones de cristalización de los cristales tomados para difracción
en el sincrotrón.
Proteína/Complejo [Co] Condición ID Placa Pocillo Cribado/ Agente precipitante

(mg/ml)
PKCα-Fascin1 3.5 CaCl2 251363 E9 Morpheus. 0.12 M Ethylene
glycols 0.1 M Buffer System 3
8.5 30 % v/v Precipitant Mix 1.
PKCα-Fascin1 3.5 CaCl2 251363 H4 Morpheus. 0.1M de mezcla de

aminácidos (Glu, Ala, Gly, Lys,
Ser) 0.1 M Buffer System 1
(Imidazol/MES) pH 6.5, 37.5 %
(v/v) Precipitant Mix 4.
PKCα-Fascin1 3.5 CaCl2 251349 H4 MemGold2. 0.1M Tris, pH 8.4,
32% PEG 550 MME
PKCα-Fascin1 3.5 CaCl2 251332 H3 PEGRx. 10% v/v PEG 200, 0.1
M BIS-TRIS propano pH 9,
18% w/v PEG 8000.
PKCα-Fascin1 3.5 CaCl2 251370 D1 Proplex. Cloruro de sodio 0.2

M, Na-HEPES 0.1M pH 7.5
25% v/w PEG 4000
PKCα-Fascin1 3.5 CaCl2 y ADP- 251400 A11 Proplex. Na-HEPES 0.1 M pH
MgCl2 7.5, 25% v/w PEG 2000 MME
PKCα-Fascin1 3.5 CaCl2, ADP- 251462 H11 Index. Tiocianato de potasio
MgCl2 y éster 0.1 M, 30% v/w PEG 2000
de forbol MME
PKCα-Fascin1 3.5 CaCl2, ADP- 251462 H12 Index. Bromuro de potasio 0.15
MgCl2 y éster M, 30% v/w PEG 2000 MME
de forbol
219
Figura V.6. Listado de imágenes de todos los cristales que se tomaron en la primera tanda de difracción en
el sincrotrón Diamond (Light Source, Oxford). Ordenados de izquierda a derecha y de arriba abajo. 251363
E9 y H4, 251349 H4, 251332 H3, 251370 D1, 251400 A11 y 251462 H11 y H12. Como se ha comentado
anteriormente, prácticamente todos presentan la peculiaridad de tener forma de vara con un tamaño de entre
170 μm para el más pequeño y 700 μm para el más grande.
Referente a la morfología de los cristales mostrados en la Figura VI.6, cada uno

presentaba propiedades tridimensionales correctas y tamaños adecuados. Los bordes de
los cristales estaban bien definidos con caras cristalinas lisas, que también son indicativos
de un orden cristalino correcto. Por lo tanto, cada uno de estos cristales se sometieron a
experimentos de difracción sin realizar optimización previa.
2.2. COLECCIÓN DE DATOS DE CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X PARA LA

PROTEÍNA PKCα Y LOS COMPLEJOS PROTEICOS PKCα-FASCIN1 Y PKCα-
RACK1 Y DETERMINACIÓN ESTRUCTURAL.
A continuación, se muestra el resumen de los parámetros de difracción de los

cristales que se difractaron en el sincrotrón Diamond (Light Source, Oxford). En la
siguiente tabla se indica el número de 6 dígitos del código de barras identificador de la
placa del cribado (ejemplo para el primer cristal: 251363) y posición alfanumérica del
pocillo donde se seleccionó el cristal (ejemplo para el primero: E9, cada una de las filas
de la placa de 96 pocillos se nombra alfabéticamente desde la A hasta la H, cada una de
las columnas del 1 al 12). También aparecen anotaciones de la resolución del cristal,
grupo espacial al que pertenecen y dimensiones de la unit cell. Además, aparecen
220
anotaciones de la posición que ocupan en el revólver que se introduce en el detector del

sincrotrón, así como de la solución de congelación empleada para congelar los cristales
antes de almacenarlos para la difracción. Todos estos datos deben indicarse en la hoja de
registro para que todo el proceso quede anotado de una manera eficiente.
Tabla V.5. Resumen de la hoja de registro donde se incluye la información relativa a los cristales de cada
uno de los pocillos de cada cribado que se tomaron para analizarlos con el sincrotrón. N.A. se correspondía
con cristales de sal.
ID del Proteína- Resolución Posición Agente Grupo espacial y

cribado Complejo (Å) revólver crioprotector dimensiones de la unit
cell.
251363-E9 PKCα- N.A. 1 20% glicerol N.A.
Fascin1
251349-H4 PKCα- 2.1 4 20% glicerol C2. 163 x 70 x 115 Å,
Fascin1 90/132/90º.
251332-H3 PKCα- 3.4 7 20% glicerol P2. 121.8 x 70x 123.6 Å,
Fascin1 90/90.19/90º.
251370-D1 PKCα- 2.06 8 20% glicerol C2. 163 x 70 x 115 Å,
Fascin1 90/132/90º.
251370-C5 PKCα- N.A. 10 20% glicerol N.A.
Fascin1
251400-A11 PKCα- 2.08 12 20% glicerol C2. 163 x 70 x 115 Å,
Fascin1 90/132/90º.
251462-H12 PKCα- N.A. 13 20% glicerol N.A.
Fascin1
251462-H11 PKCα- 1.99 15 20% glicerol C2. 163 x 70 x 115 Å,
Fascin1 90/132/90º.
Todos los cristales seleccionados y difractados pertenecían a cribados de

cristalización en los que se añadía PKCα y Fascin1, y tenían en común la forma de vara
en todos ellos y terminaban de crecer a las 96 horas. De esta manera, en principio cabía
esperar que estos cristales se correspondieran con Fascin1, el complejo PKCα-Fascin1 o
bien PKCα por sí sola. Por su parte, después de incubar durante más semanas las placas
del complejo PKCα-RACK1, seguían observándose únicamente los conjuntos de agujas
221
cristalinas candidatas a procesos de optimización, pero sin presencia de ningún cristal

potencial candidato para poder difractar en el sincrotrón.
Así, era importante tener de referencia las condiciones de cristalización, grupo

espacial y dimensiones de la unit cell de los cristales de las proteínas con las que
trabajábamos que ya estaban resueltas a nivel estructural (Fascin1, PDB: 4GOY y
RACK1, PDB: 4AOW esta última no necesaria, puesto que no había cristales
seleccionados para difractar en los cribados de cristalización probados hasta el momento
en las condiciones que incluían PKCα y RACK1). Además, también tuvimos de
referencia proteínas relacionadas con PKCα ya cristalizadas (PKCβ, PDB: 3PFQ) antes
de analizarlas con softwares de resolución de estructura por medio del reemplazo
molecular.
Tabla V.6. Condiciones de cristalización, dimensiones de la unit cell y grupo espacial de los cristales
procedentes de las estructuras ya resultas para PKCβ, RACK1 y Fascin1.
Proteína Condiciones de cristalización Dimensiones de la unit cell (Å) Grupo espacial

PKCβ 1%-4% (w/v) PEG 8000, 100 a = b =114.27, c = 170.84 P3221
mM Tris, pH 8.5
RACK1 100 mM CHES pH 9.5, 20% a = b = 134.3, c = 135.2 P41212
(w/v) PEG 8000.
Fascin1 20% PEG 4000, 0.1 M Hepes, a = 165.43, b = 71.69, c = 116.92 C2
pH 7.5 y 1mM DTT.
Como puede observarse en la hoja de registro (Tabla V.5), la mayoría de los

cristales difractaron a una resolución de ~2 Å, en el grupo espacial C2, con dimensiones
para la unit cell: 163 x 70 x 115 Å, 90/132/90 grados. Por su parte, los cristales del pocillo
H3 del cribado 251332 difractaron a una resolución de 3.4 Å, grupo espacial P2, con
dimensiones para la unit cell: 121.8 x 70.0 x 123.6 Å, 90/90.19/90 grados.
Comparando los resultados de difracción (Tabla V.5) con la tabla mostrada

anteriormente (Tabla V.6), y teniendo en cuenta que la mayoría de nuestros cristales
problema difractaron a ~2 Å, en el grupo espacial C2, 163 x 70 x 115 Å, 90/132/90 grados,
puede observarse en la tabla V.6 que este grupo espacial, simetría y dimensiones de la
unit cell se corresponden para la proteína Fascin1. De modo que, atendiendo a la
222
información de la tabla, los resultados parecían indicar que todos estos cristales con esas
dimensiones de la unit cell no parecían ser ni PKCα sola ni el complejo PKCα-Fascin1,
y podrían corresponderse solamente a Fascin1 puesto que los parámetros identificativos
del cristal obtenido, eran muy parecidos a los de la publicación donde se resolvió su
estructura por primera vez (Sedeh et al., 2010).
Posteriormente, se realizó la determinación de la estructura del cristal por medio

de la técnica de reemplazo molecular (empleando como referencia la estructura del PDB
1DFC). Estos resultados determinaron que estos cristales se correspondían con Fascin1.
Aunque la estructura de Fascin1 se encuentra resuelta desde 2010 (Sedeh et al., 2010), se
procedió a realizar su determinación estructural ya que las condiciones de cristalización
se habían producido en presencia de PKCα y esto podía haber ocasionado ligeros cambios
estructurales. El problema de las fases (Taylor, 2003), se resolvió por medio de reemplazo
molecular (Evans & McCoy, 2008), se realizaron varios ciclos de refinado del Rigid Body
con el software REFMAC5 (Murshudov et al., 1997) a través del programa informático
CCP4 (Brünger et al., 1998) y el modelo fue reconstruido manualmente por medio del
software de visualización gráfica Coot (V. B. Chen et al., 2010; Emsley & Cowtan, 2004;
Emsley et al., 2010). El modelo fue compuesto basado en la secuencia de aminoácidos
conocida para Fascin 1 (Uniprot Q16658, Fascin1, Homo Sapiens).
La estructura se resolvió a una resolución de 2.1 Å donde los mapas de densidad

electrónica mostraron una densidad bien definida dentro del modelo propuesto y refinado
(Figura V.7.). Esto indicaba que no existían posibles modificaciones en la estructura de
Fascin1 ocasionadas por medio de la presencia de PKCα en el medio de cristalización.
Por su parte, todos los datos estadísticos tanto de la recogida de datos como del proceso
de refinamiento están resumidos en la tabla V.7.
223
Figura V.7. Se observa una imagen del mapa de densidad electrónica correspondiente a Fascin 1. Se ven
las dos unidades de Fascin1 características de la unidad primaria del cristal. El dominio F2 del lóbulo 1 de
la unidad 2 de Fascin1 es la que se encuentra con la densidad electrónica superpuesta sobre el modelo
construido. La densidad electrónica calculada encajaba a la perfección con las cadenas laterales del modelo
Fascin1, una vez completado el refinado de la estructura, indicando el éxito en el cálculo de la fase de la
estructura cristalina. Confirmando así que la proteína del cristal se corresponde con Fascin1 y no se
observaba presencia o influencia de PKCα. En la zona de la izquierda se observa la unidad asimétrica que
forman los paquetes de 2 unidades de la proteína Fascin1 característicos en el cristal. Imagen procedente
del software Coot.
224
Figura V.8. A) Estructura de Fascin1 determinada por medio de remplazo molecular. Como se comenta
anteriormente, la unidad básica cristalina consta de dos unidades de Fascin1 enfrentadas. B) Cada unidad
de Fascin1 está formada por dos lóbulos, constituido cada uno por 2 dominios. Representación en modo
cartoon. Se corresponde con el mismo modelo propuesto en 2010 (Sedeh et al., 2010). Imágenes realizadas
con PyMOL.
225
Tabla V.7. Datos y estadísticas para la recogida de datos y refinado de Fascin1.

Fascin1
Grupo espacial C2
Parámetros de celda (Å/º) 163 x 70 x 115 Å, 90/132/90 º
Número de reflexiones totales 252421
Número de reflexiones únicas 73985
Rango de resolución (Å) 2-19
Resolución (Å) 2.1
Completeness (%) 94.2
Redundancia 4
Rmerge (%) 0.12
I/σ(I) 15
Rwork 0.195
Rfree 0.227
rms deviations
Longitud de los enlaces (Å) 0.009
Ángulos de los enlaces (Å) 1.4
Número de moléculas solubles 5432
B-factor
Proteína 97
Ramachadran plot:
Favoured % 95
Allowed % 4
Outliers % 1
Los valores de R (Rwork y Rfree) son la medida de la calidad del modelo atómico
obtenido de los datos cristalográficos (Kleywegt & Jones, 1997). Cuando se resuelve la
estructura de una proteína, el investigador en primer lugar construye un modelo atómico
y entonces se calcula un patrón de difracción simulado basado en ese modelo. Los valores
de R (Rwork y Rfree) miden como de bien el patrón de difracción simulado encaja con el
patrón de difracción observado experimentalmente. Aunque el valor teórico para encajar
perfectamente es de 0, valores típicos de un modelo correcto se encuentran en torno a 0.2.
Como se observa en la tabla anterior V.7, nuestro modelo se puede considerar
correctamente propuesto y refinado (Rwork: 0.195 y Rfree 0.227).
226
Con respecto al otro cristal que presentaba parámetros diferentes referente a la

unit cell y perteneciente al grupo espacial P2 (que observando en la tabla no se
corresponde ni con Fascin1 ni con PKCβ), cabía la posibilidad de que se tratara de la
proteína PKCα que, aunque es muy semejante en estructura con PKCβ (mirar en tabla
V.6, grupo espacial P3221), podría estar adoptando una conformación y simetría
diferente, o bien podría tratarse del complejo PKCα-Fascin1 alojado en ese grupo espacial
P2.
Después de realizar la técnica de reemplazo molecular con la información

estructural correspondiente a PKCβ (PDB 3PFQ) y ver que no daba resultado positivo,
finalmente se probó de nuevo con la información estructural de Fascin1 como modelo
(PDB: 1DFC) para realizar el reemplazo molecular resolviendo así el problema de las
fases y se determinó que se trataba de una conformación y empaquetamiento de Fascin1
no depositado actualmente en las bases de datos estructurales, conformado por 4
moléculas de Fascin1 dentro de la unidad básica cristalina. Las estructuras depositadas
hasta la fecha están formadas todas ellas por 2 moléculas de Fascin1 y no de 4 unidades,
de ahí esa diferencia que se observó en el grupo espacial. El hecho de haber determinado
la estructura de forma diferente a las que se encuentran depositadas en el PDB podría
indicar que la propia PKCα podría haber ocasionado este tipo de reorganización
estructural de Fascin1. Aún queda por estudiar esta estructura más en detalle en
colaboración con el departamento de biología estructural STRUBI de la universidad de
Oxford, que por causa de la pandemia del COVID-19 ha sufrido un enorme retraso.
2.3. ESTABILIDAD COLOIDAL Y ESTUDIO DE POSIBLES POTENCIALES

CONDICIONES PARA OPTIMIZAR.
Después de este primer testeo con todos los cribados de cristalización probados e
incubados en el sistema de almacenamiento y toma de imágenes, Rock Imager 182
(Formulatrix) durante varios meses, se llevó a cabo una estrategia basada en la estabilidad
coloidal y propensión a la agregación. Esto se basaba en la observación de que hay
condiciones de precipitantes en los cuales los complejos proteicos se comportan de
manera muy estable después de la incubación durante numerosos meses a 4ºC. Llevamos
227
a cabo una clasificación primaria, contando el número de eventos de no precipitación en

cada uno de los cribados de cristalización de 96 pocillos a diversos pHs. Para normalizar,
el número de eventos contados se divide por el total del número de eventos en cada uno
de los pHs para cada uno de los cribados de cristalización.
La idea era usar esta información para seleccionar determinadas mezclas donde
los complejos proteicos parecían comportase de manera estable y mediante el uso de la
herramienta UNcle y parámetros de estabilidad proteica tales como Kd y B22 poder
diseñar potenciales experimentos que pudiesen resultar en la formación de cristales. Todo
esto, ayudaría a predecir si dichas condiciones son las más favorables para la asociación
proteica.
Figura V.9. Imagen en la que se representa pH vs eventos normalizados de no precipitación. Las barras de
diversos colores muestran los eventos registrados en los diversos cribados de cristalización realizados hasta
la fecha de realización de la gráfica.
Se puede observar que las condiciones donde aparecían mayor número de eventos
de no precipitación y por ello las condiciones más estables donde podíamos movernos en
el diagrama de fases para intentar cambiar desde la fase de no precipitación a la zona
metaestable y de nucleación, eran las condiciones de pH 7.5 del cribado PEGRx y la
condición de pH 8.5 del cribado Index.
228
Aunque finalmente no se realizó la medida de parámetros de estabilidad (Kd y

B22) por medio del sistema UNcle (Unchained labs), estas condiciones fueron tomadas
en cuenta a la hora de realizar la optimización de los cribados que se describen en
siguiente apartado.
2.4. OPTIMIZACIÓN DE CONDICIONES PARA LA CRISTALIZACIÓN DE LA

PROTEÍNA PKCα Y LOS COMPLEJOS PROTEICOS PKCα-FASCIN1 Y PKCα-
RACK1.
Para la anterior serie de cristalización, no solo nos centramos en seleccionar los

mejores cristales que fueron objeto de difracción en el sincrotrón y posterior análisis
estructural, sino que también se hizo una revisión de todos los cribados de cristalización
realizados y se observaron potenciales condiciones que tras su optimización pudieran ser
candidatas a la generación de cristales. Esto viene de la observación de determinados
patrones de precipitación, agrupaciones de agujas cristalinas y microcristales en
determinados pocillos que podrían indicar que la condición está cercana a la nucleación
para la formación del cristal final. Esto, junto con el análisis de estabilidad coloidal nos
ayudarían a diseñar los ensayos de optimización.
El evento de cristalización y la lógica que se busca mediante la optimización de

condiciones se puede explicar de la mejor manera por medio del diagrama de fases. Estos
diagramas describen el comportamiento de una mezcla de proteína y precipitantes a
diversas concentraciones (Cudney et al., 1994). De esta manera, a bajas concentraciones
de proteína y agente precipitante, las gotas permanecerán claras sin precipitación
(condición 1 en la figura V.10). Conforme la concentración de ambos componentes
aumenta durante el proceso de difusión de vapor, se pasa de la fase metaestable a la fase
de nucleación, donde pequeños cristales pueden formarse (condición 2 en la figura V.10).
A medida que los cristales crecen, siguen empleando la proteína de la gota y de esta
manera disminuyendo la concentración de proteína en el medio y de nuevo pasando a la
zona metaestable, donde no se nuclearán nuevos cristales, pero los pequeños cristales ya
existentes crecen para hacerse más grandes (condición 3 en la figura V.10). Si las
concentraciones de proteína y precipitante son muy altas, se genera precipitado de forma
229
inmediata sin la aparición de cristales (condición 4 en la figura V.10) (Asherie, 2004;

Rupp, 2015; Saridakis et al., 1994).
Figura V.10. Diagrama de cristalización. Se observan las diversas condiciones que se pueden dar en la gota
de cristalización con la proteína y la solución de precipitación: zona de precipitación (4), nucleación (2),
clara (metaestable) (3) y clara. (1), atendiendo a la relación de la concentración entre la proteína y el agente
precipitante. Imagen tomada de la web de Hampton (https://hamptonresearch.com/).
De esta manera, el proceso de optimización se basa en buscar cuales son las

condiciones en las que, partiendo de microcristales, agrupaciones de agujas cristalinas o
patrones de precipitación que podrían ser candidatas para obtener cristales, variar las
concentraciones, proporciones de proteína, concentración del agente de cristalización o
pH del sistema tamponador para titular el diagrama de fases, de forma que se pueda llegar
a la fase de nucleación y formación del cristal deseado.
El principio básico por medio de difusión de vapor (Forsythe et al., 2002), explica
la formación de los cristales en un ensayo de cristalización tal como se ha ilustrado en el
apartado correspondientes del capítulo de materiales y métodos.
Con toda la información obtenida a partir de todos los cribados de cristalización

realizados en el primer bloque de cribados de cristalización y análisis de estabilidad
coloidal, el siguiente objetivo fue, usar todos los datos disponibles para intentar optimizar
las condiciones candidatas a poder generar cristales. Por otra parte, también se realizaron
230
nuevos cribados no realizados hasta el momento, para así intentar abarcar el máximo
numero de condiciones posibles.
Todas las condiciones (cristales, microcristales, agrupaciones de agujas cristalinas

o precipitado adecuado para el proceso de optimización) procedentes de la primera serie
de cristalización y que se muestran en las siguientes figuras (Figura V.11-V.13) podrían
estar sujetas a procesos de optimización. Esto quiere decir que se puede variar la
concentración de proteína, la concentración de precipitante o rangos de pHs de los agentes
tamponadores para hacer diversas titulaciones de esas condiciones y parámetros para
intentar obtener la aparición de eventos de cristalización. Así, podríamos intentar
acercarnos a la zona de nucleación desde la zona metaestable o de precipitación
dependiendo de la condición de optimización de partida y, de esa manera, conseguir que
se formen los cristales de las proteínas.
Figura V.11. Ejemplo de condiciones candidatas a ser optimizadas para poder obtener cristales para PKCα-
Fascin1 (CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol). Se observan microcristales en las condiciones MemGold2-
G5 y PACT premier-G5. Así como precipitados potenciales de formar nuevos cristales para el resto de las
condiciones.
231
Fascin1 (CaCl2, ADP-MgCl2 y éster de forbol). Microcristales en Proplex-D5, Proplex A11, Proplex-D10
y MemGold1 F6. Así como precipitados candidatos a optimización en Proplex-E9, Proplex-F1 y
MemGold1-H2.
232
Fascin1 junto con CaCl2 y ADP-MgCl2. Se observan cristales crecidos a velocidad de crecimiento y
morfología distinta a la observada en los cristales ya difractados para Fascin1 en Morpheus-H12
representados en Block3-G6 y Block3-G5. Microscristales en Proplex-A10, MemGold F6, MemGold F12
y PEGRx B8 así como precipitados potenciales a ser optimizados en Morpheus-D1, Morpheus-E5 y
MemGold H3.
El contenido de proteína en los pocillos de optimización donde se observaban

cristales o microcristales candidatos a optimización, para descartar la opción de que se
trataran de cristales de sal, se confirmó mediante luz UV o luz polarizada.
233
Tabla V.8. Resumen de las condiciones de optimización realizadas. Se indican las proteínas involucradas,
condición, naturaleza de precipitantes y procedencia de cribados originales, así como el tipo de
optimización llevado a cabo. P:S relación proteína/reservorio.
PROTEÍNAS CONDICIÓN PRECIPITANTE TIPO DE OPTIMIZACIÓN
PKCα + CaCl2, ADP-MgCl2 A11 Proplex: 0.1 M Na- 3 filas. Variaciones de

Fascin1 y el éster de forbol. HEPES pH 7.5, 25% concentración 3%. En cada fila
w/v, PEG 2000 MME proporción P:S: 1:1, 2:1 y 1:2
PKCα + CaCl2, ADP-MgCl2 E5 Proplex: 0.1 M Tris 3 filas. Variaciones de
Fascin1 y el éster de forbol. pH 8, 8% w/v PEG concentración 3%. En cada fila
8000. proporción P:S: 1:1, 2:1 y 1:2
PKCα + CaCl2, ADP-MgCl2 G5 MemGold2: 0.1 M 3 filas. Variaciones de

Fascin1 y el éster de forbol. MES, pH 6.2, 11% w/v concentración 3%. En cada fila
PEG 20000. proporción P:S: 1:1, 2:1 y 1:2
PKCα + CaCl2, ADP-MgCl2 C11 MemGold2: 0.1 M 3 filas. Variaciones de
RACK1 y el éster de forbol. sulfato de amonio, 0.1 M concentración 3%. En cada fila
Hepes pH 8.5, 23% PEG proporción P:S: 1:1, 2:1 y 1:2
3350.
PKCα + CaCl2, ADP-MgCl2 Condición H1 3 filas. Variaciones de

RACK1 y el éster de forbol. MemGold2: 0.05 M Tris, concentración 3%. En cada fila
pH 8.7, 28% PEG 400. proporción P:S: 1:1, 2:1 y 1:2
PKCα + CaCl2, ADP-MgCl2 Block3: 0.1 M HEPES, 3 filas. Variaciones de

RACK1 y el éster de forbol. pH 7, 5% w/v, PEG concentración 3%. En cada fila
6000 proporción P:S: 1:1, 2:1 y 1:2
PKCα + CaCl2, ADP-MgCl2 C11 MemGold2: 0.1 M Placa de 96 pocillos + additives
RACK1 y el éster de forbol. sulfato de amonio, 0.1 M block 3.
Hepes pH 8.5, 23% PEG
3350.
PKCα + CaCl2, ADP-MgCl2 Condición H1 Placa de 96 pocillos + additives

RACK1 y el éster de forbol. MemGold2: 0.05 M Tris, block 3.
pH 8.7, 28% PEG 400.
PKCα + CaCl2, ADP-MgCl2 Tris pH (6-10), PEG 500 Placa de 96 pocillos. Gradiente
RACK1 y el éster de forbol. (25-40%). vertical pH 6-10. Gradiente
horizontal PEG 500 25-40%.
234
PKCα + CaCl2, ADP-MgCl2 Tris pH (6-10), PEG Placa de 96 pocillos. Gradiente

RACK1 y el éster de forbol. 6000 (5-15%). vertical pH 6-10. Gradiente
horizontal PEG 6000 5-15%.
PKCα + CaCl2, ADP-MgCl2 A11 Proplex: 0.1 M Na- S. Bullet y S. Bullet Bio
Fascin1 y el éster de forbol. HEPES pH 7.5, 25% w/v,
PEG 2000 MME
PKCα + CaCl2, ADP-MgCl2 C11 MemGold2: 0.1 M S. Bullet y S. Bullet Bio
RACK1 y el éster de forbol. sulfato de amonio, 0.1 M
Hepes pH 8.5, 23% PEG
3350.
PKCα + CaCl2, ADP-MgCl2 C11 MemGold2: 0.1 M S. Bullet y S. Bullet Bio
RACK1 y el éster de forbol sulfato de amonio, 0.1 M
+ Sulfato de Hepes pH 8.5, 23% PEG
amonio 30mM 3350.
PKCα + CaCl2, ADP-MgCl2 Tris pH 7-10 vs Placa de 96 pocillos. Gradiente
Fascin1 y el éster de forbol PEG3350 15-30% + vertical pH 7-10. Gradiente
+ Sulfato de sulfato de amonio 0.1 M horizontal PEG 500 15-30%.
amonio 30mM
PKCα + CaCl2, ADP-MgCl2 25% PEG 2000 MME y 3 filas. Variaciones de
Fascin1 y el éster de forbol 0.1 M HEPES pH 7.5 concentración 2%. En cada fila
+ Sulfato de proporción P:S: 1:1, 2:1 y 1:2
amonio 30mM
De esta manera se comenzó la optimización de las condiciones procedentes de los

pocillos A11 y E5 del cribado Proplex así como las condiciones del pocillo G5 del cribado
Membrane Gold 2, con la combinación de proteínas de PKCα y Fascin1 junto con todos
los aditivos añadidos (CaCl2, éster de forbol y ADP-MgCl2).
- Condición A11 Proplex: 0.1M Na-HEPES pH 7.5, 25% w/v, PEG 2000 MME.
- Condición E5 Proplex: 0.1M Tris pH 8, 8% w/v PEG 8000.
- Condición G5 MemGold2: 0.1M MES, pH 6.2, 11% w/v PEG 20000.
En este proceso de optimización, se varió la concentración del precipitante en cada

una de las condiciones A11, E5 y G5, (Na-HEPES/PEG 2000, Tris/PEG8000 y
MES/PEG20000) del 100% al 67% de su concentración inicial (0.1 M/25%, 0.1M/8% y
0.1 M/11%) en incrementos de 3% en 3% en cada fila de 12 pocillos de una placa de 96
235
pocillos. También se varió la relación proteína/reservorio en 3 filas, cada una de las filas
con la siguiente proporción: 1:1, 2:1 y 1:2 (proteína/precipitante). En todos los casos, al
complejo proteico se le añadía todos los aditivos: CaCl2, éster de forbol y ADP-MgCl2,
que se saben tienen una función en la activación de PKCα y potencian su unión con
Fascin1.
Por otra parte, también se realizó la optimización para diversas condiciones

procedentes de los complejos PKCα-RACK1. Como se ha comentado anteriormente, a
diferencia de los cribados de cristalización de PKCα-Fascin1, en los cribados de
cristalización realizados para PKCα-RACK1 no apareció ningún cristal, pero sí diversas
condiciones donde surgían agrupaciones de agujas cristalinas que podían presentarse
como candidatas a formar posibles cristales que pudieran albergar PKCα o el complejo
PKCα-RACK1. De esta forma, se empezó con la optimización de la condición procedente
de los pocillos C11 y H1 del cribado de cristalización MemGold2, así como las
condiciones de los pocillos E4 del cribado de cristalización Block3 donde se observaban
estas formaciones características de agujas.
- Condición C11 MemGold2: 0.1 M sulfato de amonio, 0.1 M Hepes pH 8.5, 23%
PEG 3350.
- Condición H1 MemGold2: 0.05 M Tris, pH 8.7, 28% PEG 400.
- Condición E4 Block3: 0.1 M HEPES, pH 7, 5% w/v, PEG 6000.
De nuevo, se varió la concentración del precipitante de cada una de las

condiciones C11, H1 y E4 (sulfato de amonio/HEPES/PEG, Tris/PEG y HEPES/PEG)
del 100 al 67% de sus concentraciones iniciales (0.1 M/0.1 M/23%, 0.05 M/28% y 0.1
M/5%) en incrementos de 3% en 3%, y variando también la ratio proteína/reservorio en
3 filas de una placa de 96 pocillos para las siguientes relaciones: 1:2, 2:1 y 1:2
(proteína/precipitante). Para todas las condiciones de optimización comentadas también
se añadían todos los aditivos: CaCl2, éster de forbol y ADP-MgCl2.
Además, se probaron las condiciones C11 y H1 de MemGold2, así como la

condición de E4 de Block3 cada una repetida en placas de 96 pocillos a la que a cada
pocillo se le añadían aditivos de diversa naturaleza, empleado el cribado comercial de
236
Hampton denominado Additives Block 3. Para todas las condiciones se añadían también
todos los aditivos: CaCl2, éster de forbol y ADP-MgCl2.
También se probaron, para el caso del complejo PKCα-RACK1 placas de 96

pocillos con un gradiente vertical de Tris pH de 6.0 a 10.0 y un gradiente horizontal de
PEG. En una placa PEG 500 del 25% al 40% y en una segunda placa PEG 6000 del 5%
al 15%. De nuevo, se añadían todos los aditivos: CaCl2, éster de forbol y ADP-MgCl2.
Alrededor de dichas condiciones de PEG y pH se observaban la aparición de agrupaciones
de agujas, de ahí, moverse en dichas condiciones con el objetivo de transformar las
agrupaciones de agujas en cristales óptimos para difracción.
Asimismo, se realizaron los cribados de cristalización de aditivos S. Bullet y S.

Bullet Bio para los dos complejos de PKCα-Fascin1 y PKCα-RACK1, así como para el
complejo PKCα-RACK1 junto con sulfato de amonio (30 mM). Estos cribados de
cristalización de Hampton Research se basan en la adición de aditivos pequeños que se
conocen son útiles para estabilizar uniones intermoleculares, puentes de hidrógeno,
interacciones hidrofóbicas y electroestáticas que pueden promover la estabilización y
formación de cristales proteicos (McPherson & Cudney, 2006).
Igualmente, se llevó a cabo un gradiente vertical de Tris pH (de 7 a 10) vs

gradiente horizontal de % PEG3350 (de 15 a 30%) + 0.1 M sulfato de amonio para la
placa de 96 pocillos entera. Por otro lado, también se llevó a cabo un gradiente escalonado
en incrementos de 2% en 2%, empleando las condiciones: 25% PEG 2000 MME y 0.1M
HEPES pH 7.5. Ambas condiciones de optimización con PKCα-Fascin1WT junto con
todos los aditivos: CaCl2, éster de forbol y ADP-MgCl2.
Por otra parte, también se realizaron nuevos cribados de cristalización,

concretamente para los complejos PKCα-Fascin1 y PKCα-RACK1 (empleando 3.5
mg/ml de PKCα y su concentración equimolar de RACK1 y Fascin1). Los cribados de
cristalización que se llevaron a cabo fueron: SaltRx, Block 4N, PE, PGA, MG, Block2 e
Index. Para los cribados de cristalización Block 2 e Index además de los dos complejos
237
proteicos se probó por otra parte el complejo PKCα-RACK1 al que se añadía 30 mM de

sulfato de amonio.
Tabla V.9. Resumen de nuevos cribados de cristalización realizados para los complejos proteicos PKCα-
Fascin1 y PKCα-RACK1.
Complejo Proteico SaltRx Block 4N PE PGA MG Block2 Index
PKCα-Fascin1 P P P P P P P
PKCα-RACK1 P P P P P P P
PKCα-RACK1 + 30 P P
mM sulfato de amonio
1. SaltRx, es un cribado primario/secundario como se ha comentado anteriormente.

Como su propio nombre indica, es un cribado que se basa únicamente en el empleo de
sales de diversa índole como agentes primarios de precipitación. Esto es fundamental
puesto que, atendiendo a la literatura, en un 35% de las proteínas cristalizadas, las sales
se encuentran como los principales agentes de cristalización (McPherson, 2001).
2. Block 4N y Block 2, de nuevo se trataban de cribados de cristalización primarios.

En el caso de Block 4N, sus condiciones provienen del cribado Natrix (Hampton
Research). Para Block 2, se trataban de una combinación de condiciones procedentes de
los cribados de cristalización: Emerald Wizard1 y Emerald Wizard2 (Molecular
Dimensions).
3. PE, cribado primario (Hampton Research), basado en el pentaeritritiol como

agente precipitante principal, junto con tampones y sales de diversa índole (Gulick et al.,
2002).
4. PGA (Molecular Dimensions), se trata de un cribado comercial relativamente

nuevo basado en el empleo de un nuevo polímero, el polímero acido gamma glutámico.
Se propone ideal para proteínas globulares y proteínas de membrana, y como una
revolución al usarlo en vez de PEG, pudiendo así abrir nuevas áreas en los espacios de
cristalización. Sin embargo, presenta el inconveniente de que estos polímeros son más
difíciles de sintetizar y por ello más caros (Hu et al., 2008).
238
Tras dejar reposar las placas en el Rock Imager 182 (Formulatrix) a 4ºC durante
varios meses, se analizaron los nuevos cristales formados. Aunque algunos de ellos
presentaban formas poco comunes, debido a que los cribados de cristalización de aditivos
podían ser propensos a generar diversos cristales de sales y no de proteínas, decidimos
no descartar ninguna posibilidad puesto que al observarlos con luz polarizada y luz UV
en muchos de ellos no quedaba totalmente claro que fueran cristales de proteína o de sal.
A continuación, se muestra un resumen de todos los cristales que se tomaron para

difractar (Tabla V.10). Se indican los complejos proteicos y condiciones de aditivos,
cribados de cristalización y pocillos de los que proceden. También se muestra si estos
cristales proceden de algún proceso de optimización descritos anteriormente.
Tabla V.10. Resumen de los cristales tomados para difracción. P/R: relación proteína reservorio.
Proteína/Complejo Condición Placa Pocillo Optimización y/o agente precipitante del
cribado.
PKCα-RACK1 CaCl2, ADP- 251899 F1 Optimización: MemGold2 C11
MgCl2 y el éster Precipitante: 0.1 M sulfato de amonio, 0.1 M
de forbol. HEPES pH 8.5, 33% PEG 3350 (1:2 P/R).
PKCα-RACK1 CaCl2, ADP- 251899 F6 Optimización: MemGold2 C11

MgCl2 y el éster Precipitante: 0.085 M sulfato de amonio,
de forbol. 0.085 HEPES pH 8.5, 28.05% PEG 3350
(1:2 P/R).
PKCα-RACK1 CaCl2, ADP- 251905 A1 Optimización: pH (6-10) y vertical PEG 500

MgCl2 y el éster (25-40%)
de forbol. Precipitante: TRIS pH 6, PEG 500 25%.
PKCα-Fascin1 CaCl2, ADP- 251868 E5 Optimización: C11 MemGold + Additive
MgCl2 y el éster Block 3.
de forbol. Precipitante: 0.1 M sulfato de amonio, 0.1 M
Hepes pH 8.5, 23% PEG 3350 +
Dinucleótido nicotinamida adenina.
PKCα-Fascin1 CaCl2, ADP- 251868 F5 Optimización: C11 MemGold + Additive
MgCl2 y el éster Block 3.
de forbol.
239
Precipitante: 0.1 M sulfato de amonio, 0.1 M

Hepes pH 8.5, 23% PEG 3350 + D(+)-
sucrosa.
PKCα-RACK1 CaCl2, ADP- 251615 G12 PE
MgCl2 y el éster Precipitante: 100 mM TRIS pH 8.5, 45%
de forbol. w/v PEE 797
PKCα-RACK1 CaCl2, ADP- 251615 H12 PE
MgCl2 y el éster Precipitante: 400 mM cloruro de potasio,
de forbol. 100 mM Tris pH 8.5, 45% w/v PEE 797
PKC-RACK1 CaCl2, ADP- 251769 H1 SaltRX
MgCl2 y el éster Precipitante: 0.6 M Tartrato de potasio
de forbol. sódico, 0.1 M Bis-Tris propano pH 7.
PKCα-RACK1 CaCl2, ADP- 251660 C5 C11 de memgold2 + Silver Bullet
de forbol. Hepes pH 8.5, 33% PEG 3350
+ 0.01 M L-Alanyl-L-alanine
PKCα-RACK1 CaCl2, ADP- 251653 D1 Memgold + sulfato de amonio 30 mM

MgCl2 y el éster Precipitante:
de forbol.
PKCα-RACK1 CaCl2, ADP- 251677 C12 C11 de MemGold2 + Silver Bullet Bio
de forbol. Hepes pH 8.5, 33% PEG 3350
+ 0.008 M Uridina.
PKCα-Fascin1 CaCl2, ADP- 251684 G10 Block 2

MgCl2 y el éster Precipitante: 0.1M imidazol pH 8, 10% w/v
de forbol. PEG 8000.
240
Figura V.14. Se muestran los cristales difractados en el sincrotrón de izquierda a derecha y de arriba abajo.
251899 F6 y F1. 251905-A1. 251868-E5 y F5. 251615-G12 y H12. 251769-H1. 251660-C5. 251653-D1
251677-C12. 251684-G10. Estos cristales presentaban tamaños de entre 130 y 235 μm. En general todos
aparecían entorno a las 96 horas y detenían su crecimiento a los 10 días desde que se preparaba el cribado
de cristalización.
Teniendo en cuenta la morfología de los cristales mostrados en la Figura V.14,

algunos de ellos (251905-A1, 251615-H12 y 251769-H1) presentaban propiedades
tridimensionales correctas y tamaños adecuados para la difracción. Los bordes de los
cristales estaban bien definidos con caras cristalinas lisas, que también son indicativos de
un orden cristalino correcto. No obstante, el resto de los cristales presentaban propiedades
cristalinas que se alejaban más de un orden cristalino correcto y podían indicar que se
trataban de cristales de sal, sin embargo, la observación con luz polarizada y luz UV no
dejaba clara su naturaleza y esto determinó que se tomaran para su análisis mediante
difracción de rayos X en el sincrotrón (Diamond, Light Source, Oxford)
241
2.5. COLECCIÓN DE DATOS DE CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X PARA LOS

CRISTALES OBTENIDOS EN LAS CONDICIONES DE OPTIMIZACIÓN.
Tabla V.11. Resumen de la hoja de registro para la segunda tanda de cristales que se llevaron a difractar al
sincrotrón.
ID del Resolución Posición Agente crioprotector Grupo espacial y dimensiones
cribado (Å) revólver de la unit cell.
251899-F6 N.A. 1 Glicerol 20% N.A.

251899-F1 N.A. 2 Glicerol 20% N.A.
251905-A1 N.A. 3 Glicerol 20% N.A.
251868-F5 2.88 4 Glicerol 20% C2. 164.97x71.32x115.63 Å,
90/132/90º.
251868-E5 N.A. 5 Glicerol 20% N.A.
251615-G12 N.A. 6 Glicerol 20% N.A.
251615-H12 N.A. 8 Glicerol 20% N.A.
251769-H1 N.A. 10 Glicerol 20% N.A.
251660-C5 N.A. 11 Glicerol 20% N.A.
251653-D1 N.A. 12 Glicerol 20% N.A.
251677-C12 N.A. 13 Glicerol 20% N.A.
251684-G1 N.A. 15 Glicerol 20% N.A.
Desafortunadamente, de todos los cristales recogidos después de los numerosos

procesos de optimización y seleccionados como candidatos a ser difractados en el
sincrotrón Diamond (Light Source, Oxford), solamente uno de ellos resultó ser un cristal
de proteína.
Este cristal (Figura V.16), difractó a una resolución de 2.88 Å, grupo espacial C2,
164.97x 71.32 x 115.63 Å. Correspondiéndose con las dimensiones de la unit cell propia
de los cristales de Fascin1. En este caso y por la experiencia previa no se realizó el
reemplazamiento molecular y se le asignó directamente la identidad de Fascin1.
242
Figura V.15. Único cristal de proteína en los nuevos cribados de cristalización, tras la optimización y que
resultó ser un cristal de proteína. Asombrosamente, y a pesar de distar bastante en la morfología típica de
vara que esta proteína adopta al cristalizar, su naturaleza se correspondía con Fascin1.
2.6 CRISTALIZACIÓN DE PKCƐ, PKCζ Y LAS CONSTRUCCIONES UNIDAS

COVALENTEMENTE.
Posteriormente, se probaron diversos cribados de cristalización para las siguientes

combinaciones de proteínas nuevas que no se habían probado hasta el momento y que se
habían generado con vistas a la CryoEM, como se comentará más en detalle en el
siguiente capítulo, pero también se les dio una oportunidad por medio de esta técnica de
cristalografía de rayos X:
- Proteína de fusión A: construcción covalentemente unida NT-Fascin1WT-PKCα

-CT.
- Proteína de fusión D: construcción covalentemente unida NT-Fascin1S39A-
PKCα -CT.
- Proteína de fusión E: construcción covalentemente unida NT- PKCα-
Fascin1S39A-CT.
- Proteína de fusión H: construcción covalentemente unida NT- PKCα-Fascin1WT-
CT.
- PKCƐ.
- PKCζ.
- PKCα junto con el dominio C2 de PKCα.
243
Por medio de técnicas biofísicas y estructurales, tras haber añadido las proteínas
PKCα y Fascin1 por separado, se determinó que la unión entre estas proteínas se producía
de forma fuerte, pero de manera muy transitoria y limitada por la dilución de la proteína
en el medio donde se encontraba. De esta manera, se realizó la estrategia de generar las
proteínas unidas covalentemente por un conector, para intentar estabilizar el complejo y
aumentar así las posibilidades de interacción entre ambas proteínas al tener limitada la
difusión.
Por su parte, también era interesante probar las isoenzimas PKCƐ (perteneciente a
la familia de las PKCs nuevas) y PKCζ (perteneciente a la familia de las PKCs atípicas),
para las que, al igual que PKCα (perteneciente a la familia de las PKCs clásicas), no existe
información estructural 3D en su conformación completa y que se consiguieron expresar
y purificar con un alto grado de pureza.
Por otro lado, el dominio C2 de PKCα junto con la proteína PKCα, se añadió
porque este dominio C2 podría actuar como un módulo similar al efecto que producen los
nanobodies, interaccionando con la propia proteína PKCα y favoreciendo la formación
de un empaquetamiento más simétrico que ayudara a la formación de cristales.
En primer lugar, se realizó el ensayo de PCT (Tabla V.12) para determinar cuales
eran las concentraciones adecuadas para realizar los cribados. Estas concentraciones
resultaron similares a las descritas con anterioridad (3.5 mg/ml, 44 µM), a excepción del
complejo PKCƐ-RACK1 que resultó en una concentración de partida adecuada de 4.5
mg/ml para PKCƐ (53,7 μM) y su cantidad equimolar para RACK1.
244
Tabla V.12. Ensayo de PCT empleando 3.5 mg/ml de PKCζ, PKCƐ, PKCα-Fascin1-C2 y proteínas de fusión
A, D, E y H, así como 4 mg/ml de complejo PKCƐ-RACK1. Se indica el grado de precipitación observado
dentro de cada agente de precipitación para cada una de las proteínas y la acción a realizar siguiendo las
indicaciones del protocolo de Hampton para el ensayo de PCT.
Proteína/Concentración A1 A2 B1 B2 Acción
PKCζ 3.5 mg/ml Precipitado Precipitado Precipitado Precipitado Realizar
débil débil débil Fuerte cribados
PKCƐ 3.5 mg/ml Precipitado Clara Precipitado Clara Realizar
débil débil cribados
Complejo PKCƐ- Precipitado Precipitado Precipitado Precipitado Realizar
RACK1 4.5 mg/ml débil débil débil fuerte cribados
PKCα-Fascin1-C2 3.5 Precipitado Clara Precipitado Precipitado Realizar
mg/ml débil débil Fuerte cribados
Proteínas de fusión 3.5 Precipitado Precipitado Precipitado Precipitado Realizar
mg/ml débil débil débil Fuerte cribados
A continuación, en las tablas siguientes (V.13-V.20), se muestran todos los

cribados de cristalización realizados para las proteínas citadas anteriormente. Se indica la
concentración de proteína empleada, si se añadieron aditivos (CaCl2, éster de forbol y
ADP-MgCl2). El volumen final de gota formado por proteína (P) y reservorio (R). Si se
diluyó o no el reservorio y a qué concentración. La aparición de cristales en el cribado y
en caso afirmativo confirmación de si se trata de cristal de proteína o sal por medio de
técnicas de luz UV o luz polarizada.
Tabla V.13. Conjunto de ensayos de cristalización realizados para PKCζ.
245
Tabla V.14. Conjunto de ensayos de cristalización realizados para PKCε.
Tabla V.15. Conjunto de ensayos de cristalización realizados para la proteína de fusión A.
Tabla V.16. Conjunto de ensayos de cristalización realizados para la proteína de fusión H.
Tabla V.17. Conjunto de ensayos de cristalización realizados para la combinación PKCε -RACK1.
Tabla V.18. Conjunto de ensayos de cristalización realizados para la combinación de PKCα, Fascin1 y el
dominio C2 de PKCα como posible nanobody.
Tabla V.19. Conjunto de ensayos de cristalización realizados para la proteína de fusión D.
246
Tabla V.20. Conjunto de ensayos de cristalización realizados para la combinación PKCα + Dominio C2 de
PKCα.
Se pudo observar que para PKCζ, PKCε, proteína de fusión A y proteína de fusión
H (tablas V.13-15), después de haber empezado a trabajar con la concentración que nos
indicó adecuada la prueba PCT, decidimos introducir un cambio subiendo las
concentraciones de proteína de 3.5 mg/ml a 8 mg/ml. Por contrapartida, se diluyó la
concentración del reservorio a la mitad, en un intento de movernos a través del diagrama
de fases de cristalización e intentar alcanzar a la zona de nucleación que llevara a la zona
metaestable para la formación de cristales.
Desafortunadamente, no se formaron cristales de proteína para ninguna de las

condiciones realizadas después de observar los cristales a las semanas de incubación.
2.7. COLECCIÓN DE DATOS DE CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X.
En última instancia, también se realizó una recopilación y repaso de todos los

cristales que aparecieron en las placas almacenadas en el Rock Imager 182 (Formulatrix)
desde que se inició la colaboración con el departamento STRUBI de la Universidad de
Oxford. Estos procedían de la primera, segunda y tercera tanda de cristalización. Se
seleccionaron cristales que presentaban una morfología diferente a los que ya se habían
seleccionado previamente con resultados negativos.
Concretamente, se recogieron cristales de los siguientes cribados de cristalización,

pocillos y condiciones descritos en la siguiente tabla.
247
Tabla V.21. Resumen de cristales seleccionados para su difracción en el sincrotrón Diamond (Light Source,
Oxford).
Proteína/Complejo Condición Placa Pocillo Cribado y agente precipitante

PKC-Fascin1 CaCl2 251332 B11 PEGRx, 0.1 M MES monohidrato
pH 6, 20% w/v, polietilen glicol
monometil éter 2000.
PKC-Fascin1 CaCl2 251325 D8 Index, 0.1M HEPES pH 7.5, 25%

w/v PEG 3350.
PKCα-RACK1 N.A. 251691 D8 Block2, 0.2 M Ca (OAc)2, 0.1 M

acetato, pH 5.8, 30% v/v PEG 400.
PKC-Fascin1 CaCl2, ADP- 251462 D7 Index. 0.1 M BIS-TRIS pH 6.5, 25%
MgCl2 y P13A w/v PEG 3350.
PKCα-RACK1 N.A. 251653 D6 MG, 0.2 M cloruro de calcio, 0.1 M

MES, pH 6.5, 26% v/v PEG 350
MME.
Figura V.16. Resumen del último conjunto de cristales llevados al sincrotrón Diamond (Light Source,
Oxford). En orden de izquierda a derecha y de arriba abajo: 251332-B1, 251325-D8, 251691-D8, 251462-
D7 and 251653-D6. Se puede observar que se escogieron cristales con morfología totalmente diferente a
los seleccionados previamente. Estos cristales presentaban tamaños de entre 150 y 200 μm. En general, la
aparición de dichos cristales se daba después de 2-3 semanas y completaban su crecimiento en un lapso
comprendido entre 72-96 horas.
248
Observando la morfología de los cristales mostrados en la Figura V.16, todos ellos

presentan propiedades tridimensionales y tamaños adecuados. Los bordes de los cristales
estaban bien definidos con caras cristalinas lisas, que como se ha indicado anteriormente,
son indicativos de un orden cristalino correcto. De esta manera, todos estos cristales
fueron sometidos a difracción. Es importante destacar que, cristales con dichas
morfologías no habían sido difractados hasta el momento y sus patrones de crecimiento
eran diferentes a los de los cristales previamente analizados en el sincrotrón Diamond
(Light Source, Oxford).
Tabla V.22. Hoja de registro de los cristales llevados al sincrotrón Diamond (Light Source, Oxford).
ID del Resolución (Å) Posición Agente crioprotector. Grupo espacial y
cribado revólver dimensiones de la unit cell.
251332-B11 ¡Baja resolución! 1 Glicerol 20% P2. 177x75x308. 90 99 90º.
251325-D8 3 2 Glicerol 20% C2. 162x70x114. 90 132
90º.
251691-D8 N.A. 3 Glicerol 20% N.A.
251462-D7 N.A. 4 Glicerol 20% N.A.
251653-D6 N.A. 5 Glicerol 20% N.A.
Lamentablemente, todos los cristales resultaron contener en su estructura

unidades de Fascin1 o cristales de composición salina. No obstante, hubo un cristal que
resultó ser un cristal de proteína que no difractó a una resolución suficientemente buena
como para poder determinar su estructura por reemplazo molecular. De este modo, solo
se pudo determinar su grupo espacial, que era P2, a diferencia de Fascin1 (C2), y las
dimensiones de la unit cell eran de 177x75x308 Å y 90/99/90º que diferirían también de
las dimensiones de la unit cell de Fascin1: 162x70x114 Å, 90/132/90º.
De esta manera, se realizó se realizó la técnica de tinción de plata, empleando

controles positivos para las proteínas purificadas PKCα y Fascin1, así como también se
incluyeron cristales de Fascin1 como control, procedentes de pocillos donde se sabía que
se alojaban dichos cristales. Sorprendentemente, para todas las calles en el gel de tinción
de plata se pudo ver señal para todas las proteínas, tanto los controles positivos de las
proteínas purificadas como la proteína Fascin1 rescatada de cristales del pocillo del
cribado. Sin embargo, para la última calle del gel, correspondiente al cristal de dudosa
249
naturaleza y que difractó a una resolución no adecuada, no apareció ninguna señal, de

modo que no se pudo confirmar que proteína constituía dicho cristal.
Figura V.17. Gel para la tinción de plata. Empezando por la izquierda, escalera de peso molecular, los dos
controles para las proteínas purificadas Fascin1 (a concentración 1 y ½), 2 controles para PKCα purificada
(a concentraciones 1 y ½). A continuación, cristal dudoso para el que estábamos interesados determinar su
naturaleza proteica por medio de esta técnica (calle encuadrada en rojo). Y, por último, un control de
Fascin1 procedente de un cristal a partir de uno de los pocillos donde ya se tomó un cristal con la misma
morfología, se difractó y se determinó que eran cristales de Fascin1.
Se intentó optimizar las condiciones para el cribado de PEGRX de donde provenía

el cristal de naturaleza desconocida. Las propiedades del precipitante eran: PEGRx, 0.1
M MES monohidrato pH 6, 20% w/v, polietilen glicol monometil éter 2000. Para la
optimización, siguiendo la estrategia previamente realizada, se varió la concentración del
precipitante del 100% al 67% de su concentración inicial (0.1 M/20%,) en incrementos
de 3% en 3% en cada fila de 12 pocillos de una placa de 96 pocillos. También se varió la
relación proteína/reservorio en 3 filas, cada una de las filas con la siguiente proporción:
1:1, 2:1 y 1:2 (proteína/precipitante). En todos los casos, al complejo proteico se le añadía
todos los aditivos: CaCl2, éster de forbol y ADP-MgCl2, conocidos como activadores de
la función de PKCα.
250
Desafortunadamente, no pudimos obtener ningún cristal después del proceso de

optimización para intentar difractar de nuevo y obtener mejores resultados. Queda
pendiente continuar estar colaboración con el departamento STRUBI de la universidad
de Oxford una vez que pasen las contingencias debidas a la pandemia de COVID-19.
3 DISCUSIÓN.
Se han realizado una gran cantidad de cribados de cristalización para el conjunto

de proteínas de la familia de las PKCs con las que hemos trabajado. Las primeras etapas
del proceso concluyeron de forma muy satisfactoria y se ha conseguido purificar con alto
grado de pureza las proteínas PKCα, PKCε y PKCζ, así como para las proteínas de fusión
entre PKCα y Fascin1 en sus diferentes modalidades. Además, se han explorado diversas
condiciones que a lo largo de la Tesis determinaron que aumentan la afinidad entre dichas
proteínas. Finalmente, no se ha conseguido obtener ningún cristal que resultase contener
las proteínas de interés de la familia de las PKCs para las cuales, hasta la fecha no hay
información completa.
El hecho de intentar cristalizar estas proteínas en su conformación completa es un

enorme reto que se lleva intentando llevar a cabo durante décadas en multitud de grupos
de investigación alrededor del mundo. En la actualidad, nadie ha conseguido resolver la
estructura de ninguna de estas proteínas a nivel atómico para todos sus dominios en su
conformación completa.
Los primeros elementos que parecen dificultar este proyecto se basan en la enorme
asimetría que presentan las proteínas PKCs, así como su condición multidominio que las
convierten en proteínas altamente flexibles. Estas únicas dos condiciones ya hacen
bastante difícil la misión de conseguir cristales para estas proteínas, situación limitante a
la hora de poder obtener la información estructural por medio de esta técnica.
Durante nuestro propósito por determinar su estructura, intentamos resolver

dichos problemas mediante diversas técnicas, tales como emplear proteínas que
interaccionan con ellas, bien como sustrato (Fascin1) o bien como soporte estructural
251
(RACK1) y que pudieran mejorar la simetría de la proteína por sí sola, así como darle
rigidez mediante la formación del complejo proteico. Por otra parte, añadir diversos
ligandos que a lo largo de la literatura se han demostrado que poseen una función
reguladora del control de la actividad de las PKCs, desplazando el equilibrio hacia una
conformación catalíticamente activa. En el caso de las PKCs con sus proteínas diana, se
pensó que podría mover el equilibrio hacia una conformación activa homogénea donde
estas proteínas quinasas reconocen su sustrato.
De la misma manera, tras observar y estudiar los cribados de cristalización

realizados, también se realizaron multitud de ensayos de optimización de las condiciones
de cristalización para aquellos potenciales hits. Aún así, ninguna de estas estrategias
generó resultados prometedores.
Durante el proceso de escritura de la presente Tesis Doctoral, la compañía Deep

Mind de Google lanzó la herramienta denominada AlphaFold que se presenta como una
enorme revolución dispuesta a poder predecir la estructura de cualquier proteína
procedente de cualquier organismo. Hasta el momento, se han publicado más de 350.000
estructuras, incluyendo 20.000 proteínas procedentes de Homo Sapiens, así como las de
otros 20 organismos diferentes (Jumper et al., 2021).
A continuación, se muestra la predicción estructural que la herramienta realiza

para las proteínas PKCα, PKCζ y PKCε con las que se trabajaron en esta Tesis Doctoral
(Figura V.19).
En primer lugar, con el fin de poder establecer una comparación con las
predicciones de AlphaFold, se muestra de nuevo, para tener de referencia, la información
estructural disponible para la PKCβ (PDB 3PFQ) (Leonard et al., 2011). Hasta la fecha,
este es el miembro de la familia de las PKCs para el que más cerca se ha estado de
determinar su estructura en su conformación completa (Figura V.18).
252
Figura V.18. Se muestra la estructura proteica de la proteína PKCβ (PDF: 3PFQ). Se consiguió determinar
a nivel atómico los dominios C2 (cian), C1B (azul oscuro) y catalítico (naranja) (Leonard et al., 2011).
Imagen obtenida por medio de PyMOL.
Figura V.19. Se observa las predicciones que el sistema AlphaFold realiza para A) PKCα, B PKCε) y C)
PKCζ. Los colores de la estructura representan la confianza en la predicción del modelo por parte del
algoritmo. Azul oscuro y azul claro indican alta confianza. Amarillo y rojo indican de baja a muy baja
confianza respectivamente. Predicción obtenida por medio del algoritmo Alpha Fold protein data base
(https://alphafold.ebi.ac.uk/).
253
Hay que subrayar que, aunque esta herramienta supone una enorme revolución
para la ciencia en su intento de obtener la máxima información estructural posible de las
diversas proteínas en cuestión de minutos frente a los meses e incluso años requeridos
para algunas proteínas por medio de cristalografía de rayos X o CryoEM, aún presenta
grandes limitaciones. Así, por ejemplo, para las proteínas PKCα, PKCζ y PKCε para las
que no existe la estructura en su conformación completa resuelta para ninguna de sus
proteínas relacionadas dentro de la familia de las PKCs, AlphaFold encuentra más difícil
determinar de qué manera se disponen entre ellos los diversos dominios que constituyen
estas proteínas.
Así, se puede observar en las predicciones estructurales de AlphaFold (Figura

V.19), que en general ofrece valores bastante elevados de confianza a la hora de predecir
la conformación de los módulos independientes: dominios C1A, C1B, C2 y dominio
quinasa (representados por gamas azules que se traducen en una gran confianza por parte
del sistema a la hora de elaborar la predicción del modelo). Esto se debe a que, para todos
estos dominios independientes, como se ha comentado en la introducción hay
información disponible para diversos miembros de la familia de las PKCs lo que explica
el alto grado de confianza al proponer la predicción tomándolos como modelo.
Ahora, para las regiones que conectan unos dominios con otros, la confianza de la
predicción es de baja (representado en color amarillo en el modelo) a muy baja
(representada en color rojo en la predicción). Esto pone de manifiesto que sin al menos
una estructura molde al completo de cada miembro de la familia de las PKCs, este
algoritmo de predicción no es capaz de pronosticar como se ensambla la estructura
multidominio al completo de novo sin haber tenido en su base de datos ninguna
conformación estructural semejante hasta la fecha.
Se puede concluir que, aunque los dominios independientes de las PKCs presentan
un alto grado de confianza por parte de AlphaFold, al apenas tener validez predictiva los
loops que unen unos módulos proteicos con otros, no se puede tomar el modelo conjunto
de las PKCs multidominio que ofrece AlphaFold como válido para ninguna de las
proteínas PKCs. De ahí, la importancia de continuar con las técnicas tradicionales de
biología estructural tales como la cristalografía de rayos X, o la técnica más moderna
254
CryoEM que podrían dar una visión más biológica de la manera en la que verdaderamente
se ensamblan los diversos dominios para estas quinasas. Una vez que el sistema dispusiera
de un molde para cada una de las subfamilias de las PKCs (por ejemplo: PKC clásicas:
PKCα, PKC nuevas: PKCζ y PKC atípicas: PKCε), podría ser más certero a la hora de
ser capaz de predecir la estructura multidominio del resto de los miembros que componen
cada una de dichas subfamilias.
También es interesante destacar que el sistema AlphaFold, aunque con un valor

muy bajo de confianza, debido a la baja puntuación que se le asigna a los lazos de
conexión entre los dominios, propone un modelo de plegamiento más en consonancia con
la predicción que establecía el grupo de investigación de Antal (Antal, Callender, et al.,
2015) a partir de la reinterpretación de la información cristalina que ofrecieron el grupo
de Leonard (Leonard et al., 2011). En estos modelos de AlphaFold, al igual que lo que
propone Antal y colaboradores, los dominios C2 de PKCα, PKCζ y PKCε estarían más
cercanos al dominio catalítico. Atendiendo a la bibliografía, dicho modelo concordaría
con un modelo más relevante desde un punto de vista biológico, como se ha comentado
en la introducción de la Tesis (Banci et al., 2002; Conrad et al., 1994; Corbalán-García et
al., 2003; Edwards & Newton, 1997a, 1997b; Feng et al., 2000; Kheifets & Mochly-
Rosen, 2007).
Por otro lado, la herramienta aún está por desarrollarse a la hora de poder realizar
modelado molecular y docking, así que de momento no se puede explorar y predecir de
manera precisa de que manera pueden interactuar con otras proteínas (PKCα-Fascin1 y
PKCα-RACK1). También sería complicado explorar las diferencias estructurales que la
presencia de diversos ligandos pudiera tener en la estructura de la proteína estudiada. De
esta manera, no sería fácil estudiar a nivel estructural los diversos estados intermedios de
activación que sí se podrían determinar de forma experimental por ejemplo por medio de
técnicas de biología estructural como la CryoEM.
Por todo ello, aunque estas herramientas bioinformáticas suponen una revolución
para la ciencia en general, se debe seguir insistiendo en conseguir las estructuras de estas
proteínas por métodos experimentales como la cristalografía de rayos X y CryoEM.
255
Debido a los resultados obtenidos y la imposibilidad de conseguir unas

condiciones de cristalización que pudieran capturar el complejo PKCα-Fascin1 o PKCα
sola, se exploró el uso de la CryoEM como metodología para determinar la estructura 3D
de estos complejos. Esta técnica permite sobrepasar la necesidad de formar cristales
ordenados de la proteína de interés, aunque presenta otros retos adicionales para nuestras
proteínas objetivo, no menos desafiantes y que se describirán en el siguiente capítulo.
256
CAPÍTULO VI. DETERMINACIÓN DE LA
ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DEL
COMPLEJO PKCα-FASCIN1 POR MEDIO
DE CRIOMICROSCOPÍA ELECTRÓNICA.
CAPÍTULO VI. DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL
DEL COMPLEJO PKCα-FASCIN1 POR MEDIO DE CRIOMICROSCOPÍA
ELECTRÓNICA.
1 INTRODUCCIÓN.
Aunque históricamente, con diferencia, la cristalografía de rayos X ha sido la

técnica más exitosa a la hora de la determinación estructural con resolución atómica de
complejos proteicos por medio de técnicas de biología estructural, en los últimos años la
criomicroscopía electrónica (CryoEM) está revolucionando este campo. Siendo por ello
los galardonados en 2017 del premio nobel de bioquímica; Jacques Dubochet, Joachim
Franch y Richard Henderson por el desarrollo de la CryoEM para la determinación a alta
resolución de la estructura de biomoléculas en disolución (Shen, 2018).
Este método presenta una serie de ventajas con respecto a las técnicas
tradicionales. Una de las principales ventajas que presenta la CryoEM con respecto a la
cristalografía de rayos X o NMR, es requerir de una cantidad de proteína mucho menor
(0.1 mg puede ser más que suficiente para determinar la estructura de una proteína). Por
otro lado, impone menos restricciones en lo que se refiere a la pureza de la preparación,
y además, no requiere determinar unas condiciones óptimas de cristalización que, en
numerosas ocasiones se plantean como un cuello de botella dependiendo del tipo de
proteína a cristalizar (Bai et al., 2015). Por otro lado, permite la determinación estructural
de proteínas que debido a su tamaño, heterogeneidad conformacional o variabilidad de la
composición no sería de otra manera posible (Herzik et al., 2019).
La microscopía electrónica ha avanzado a pasos agigantados desde el desarrollo

de los primeros microscopios electrónicos y las primeras imágenes obtenidas de
bacteriófagos por los hermanos Ruska en la primera mitad del siglo XX. Sin embargo, no
fue hasta los años 70 cuando se inició el desarrollo de la técnica de CryoEM, hasta llegar
a principios del siglo XXI cuando se comenzaron a obtener grandes logros con esta
técnica. Ha sido a partir de estos últimos años, cuando la atención científica global se ha
dirigido hacia este método ya que se han obtenido una gran cantidad de estructuras
proteicas con resoluciones casi atómicas (< 4 Å) y atómicas (Cheng et al., 2015).
En la presente Tesis nos encontramos con el reto de intentar obtener la estructura

tridimensional de una quinasa PKCα de gran importancia médica en conjunción con una
259
ELECTRÓNICA.
de las proteínas que fosforila; Fascin1. Concretamente, nuestro complejo proteico PKCα-
Fascin1 presenta un tamaño de aproximadamente 134 kDa.
Durante mucho tiempo se pensó que la CryoEM no era una técnica viable para la
determinación estructural de proteínas o complejos proteicos de menos de 200 kDa. Esto
es debido a los problemas intrínsecos que presenta la técnica relativos a intentar
maximizar la ratio señal ruido, a la vez que se disminuye el daño del espécimen embebido
en hielo ocasionado por radiación para pequeñas partículas, que además presentan un bajo
contraste. Esto hace que, para proteínas de bajo peso molecular, sea más difícil de detectar
características en forma reconocibles en su estructura que ayuden a facilitar el
alineamiento de imagen inicial a baja resolución. Además, sin simetría, las pequeñas
proteínas requieren condiciones optimas tales como la obtención de preparaciones
altamente homogéneas, una conformación proteica rígida y una distribución aleatoria de
partículas en una capa fina de hielo, condiciones que son difíciles de alcanzar para la
mayoría de las muestras. Sin embargo, la determinación estructural de pequeñas proteínas
tiene una gran importancia puesto que la mayoría de las proteínas presentes en los seres
vivos tienen un tamaño inferior a 100 kDa y aproximadamente el 50% son más pequeñas
de 50 kDa, incluyendo muchas proteínas de membrana y proteínas con una gran
importancia médica (Wu & Rapoport, 2021).
No obstante, en 2016 el grupo de investigación de Merk fue el primero en superar

este límite de los 200 kDa, presentando las estructuras por medio de CryoEM de la lactato
deshidrogenasa (140 kDa) y de la isocitrato deshidrogenasa (90 kDa) a una resolución de
2.8 Å y 3.8 Å respectivamente (Merk et al., 2016).
Desde entonces, este límite en tamaño se ha reducido y ha sido en estos últimos

años cuando se han obtenido muchas más estructuras de proteínas de pequeño tamaño (<
200 kDa) a alta resolución (< 4 Å). Siendo la estructura biológica más pequeña obtenida
hasta el momento el riboswitch de ADN S-adenosilmetionina IV de un tamaño de
aproximadamente 40 kDa a una resolución de 3.7 Å sin la ayuda del empleo de ninguna
proteína de andamiaje. Esto se encuentra justo en el mismo límite que se teorizó años
atrás que podía ser alcanzable por medio de esta técnica (Henderson, 1995; Zhang et al.,
2019).
260
ELECTRÓNICA.
En la bibliografía, hasta la fecha actual solo hay 21 proteínas de un tamaño igual

o inferior al del complejo PKCα-Fascin1 (135 kDa), depositadas en la base de datos
EMDB (electron-microscopy data bank) determinadas con una resolución atómica o casi
atómica (< 4 Å). Esto representaría menos del 1% de todas las proteínas depositadas en
esta base de datos de CryoEM (Figura VI.1) (Wu & Lander, 2020).
Figura VI.1. Se muestran entradas de la base de datos de CryoEM (EMDB) de proteínas y complejos
proteicos con tamaños inferiores a los 200 kDa y resueltos a una resolución menor a los 4 Å distribuidos
en la gráfica según su peso molecular (kDa, eje X) y resolución (Å, eje Y). Los puntos naranjas y azules
indican proteínas determinadas por medio de microscopios electrónicos de 300 keV y 200 keV
respectivamente (Wu & Lander, 2020).
Relacionado con la serina/treonina quinasa PKCα de la que tenemos como

objetivo determinar la estructura en esta Tesis Doctoral, algunos de los ejemplos más
recientes que podemos encontrar en la literatura de quinasas determinadas
estructuralmente por medio de CryoEM son la serina/treonina quinasa mTOR o diana de
rapamicina en mamíferos de un tamaño de 287 kDa y con un papel central en el
crecimiento celular (Kim & Guan, 2019). Esta proteína se determinó formando un
macrocomplejo molecular junto con la proteína regulatoria asociada a mTOR a una
261
ELECTRÓNICA.
resolución atómica de 3.67 Å (Wälchli et al., 2021). También la serina/treonina quinasa

ATM (350 kDa) se ha determinado recientemente a alta resolución por medio de CryoEM
para su dominio catalítico (2.78 Å). Para el resto de la proteína, se ha reconstruido el
modelo molecular con la información disponible. La quinasa ATM es una proteína muy
importante en la reparación de roturas de ADN y con gran importancia en la terapia contra
el cáncer (Stakyte et al., 2021).
Como puede observarse en estos ejemplos, se tratan de proteínas de mayor tamaño

a nuestras PKCs y determinadas en complejos macromoleculares que muestran una
elevada simetría y baja capacidad de adoptar diversas conformaciones. Sin embargo,
hasta la fecha ningún miembro de la familia de las PKCs se ha conseguido determinar a
nivel tridimensional por sí sola o en complejo con otras proteínas accesorias con las que
interacciona por medio de este método.
2 RESULTADOS.
2.1 CRIOMICROSCOPÍA ELECTRÓNICA Y RECOLECCIÓN DE DATOS

PARA LA PROTEÍNA PKCα JUNTO CON RACK1 Y FASCIN1.
En este primer set de rejillas de CryoEM preparadas, se añadieron mezclas de la

proteína PKCα junto con las proteínas con las que interacciona: Fascin1 o RACK1. Por
otro lado, también se testaron estas proteínas que interaccionan con PKCα expresadas de
forma recombinante con tallo de GST. Este tallo que añade un total de 26.9 kDa al total
del peso molecular, permite de esta manera incrementar el tamaño de los complejos
proteicos, que por sí solos tienen un diámetro de aproximadamente 100 Å. Al aumentar
el tamaño del complejo a detectar por medio de CryoEM, se hace más fácil obtener
información estructural al respecto mediante el aumento del contraste. De esta manera,
no estaríamos trabajando en el mismo límite de resolución de la técnica, que hacía nuestro
proyecto más desafiante.
262
ELECTRÓNICA.
Para ello, se probaron las siguientes combinaciones de proteínas, a las

proporciones equimolares que se indican:
-PKCα -Fascin1. Proporción 2:1. (Complejo, 133.53 kDa).

-PKCα-GSTFascin1. Proporción 2:1. (Complejo, 160.43 kDa).
-PKCα-GSTRACK1. Proporción 2:1. (Complejo 141.46 kDa).
Los pesos moleculares eran de 78.96 kDa para PKCα, 62.5 kDa para GSTRACK1,
54.57 kDa para Fascin1 y 81.47 kDa para GSTFascin1.
En estos ensayos de CryoEM, PKCα se añadió a 1 mg/ml (12.66 μM) y 4 mg/ml

(50.65 μM), y Fascin1 o RACK1 a la proporción equimolar en la que se indica para cada
una de las combinaciones proteicas. Los resultados obtenidos en las rejillas de CryoEM,
se muestran en la figura VI.2.
Como se puede ver en la figura VI.2, se observa cierta tendencia a la agregación

proteica. Concretamente esto ocurre de forma muy acusada para la condición que
involucra a PKCα y GSTRACK1, 4 mg/ml (Figura V1.2 D). En la figura VI.2 C, (PKCα
y GSTRACK1 1 mg/ml) se observa un campo casi completamente claro sin presencia de
proteína, esto es debido a que la agregación acusada deja la proteína en otras regiones de
la rejilla agregada, quedando el resto de los huecos en la rejilla completamente libres de
proteína. Por otro lado, en comparación con las condiciones C y D de la figura VI.2, se
puede ver en el caso de los apartados A (PKCα-Fascin1 1 mg/ml) y B (PKCα-Fascin1 4
mg/ml) una menor tendencia a la formación de agregados proteicos. En estas rejillas, en
las que se añaden PKCα y Fascin1 de forma separada, se produce una distribución más
homogénea de la proteína y con una menor tendencia a la agregación. Por ello, sería sobre
dichas rejillas (condición A, Figura VI.2) donde se llevaría a cabo la recolección de datos
y estudio de clasificación 2D.
263
ELECTRÓNICA.
Figura VI.2. Se muestran imágenes de las micrografías para los primeros testeos de las rejillas de cryoEM
analizadas por medio del microscopio Tecnai Polara 12 (120 kV). A) PKCα-Fascin1 (1 mg/ml). B) PKCα-
GSTFascin1 (4 mg/ml). C) PKCα-GSTRACK1 (1 mg/ml). D) PKCα-GSTRACK1 (4 mg/ml). Para la
preparación de las muestras se usaron rejillas C-flats, 5’’ blotting time, -25 blot force, 4ºC y 80% humedad.
Para tener un mejor entendimiento de la naturaleza del complejo proteico en las

gradillas, se tomó una colección de aproximadamente 150 micrografías correspondientes
a PKCα-Fascin1 (1mg/ml), para analizarlas por medio de clasificación 2D. Para estas
mejores rejillas de PKCα-Fascin1, se realizó un análisis primario de selección de
partículas (aproximadamente 11000 partículas totales) y clasificación 2D, empleando el
software Scipion. Se realizó la selección de partículas por medio de Xmipp3, el
alineamiento de las micrografías por medio de MotionCor2 para generar micrografías de
alta calidad y la estimación de CTF con CTFFIND4 (de la Rosa-Trevín et al., 2016; Li et
al., 2013; Mindell & Grigorieff, 2003).
264
ELECTRÓNICA.
Los datos de clasificación 2D, concernientes a la rejilla seleccionada para el

procesado de datos, se muestran en la figura VI.3. Es interesante destacar que, para ciertas
clasificaciones 2D como las mostradas en las micrografías de la Figura VI.2 B,
presentaban una semejanza en tamaño y morfología con el modelo que proponíamos de
interacción entre PKCα-Fascin1 (Figura VI.3) según los resultados obtenidos de los
experimentos de caracterización biofísica mediante Thermal Shift Assays, SLS y DLS
(Capítulo 3). Sin embargo, no eran mayoritarias las clasificaciones 2D en las que parecía
mostrarse el modelo de interacción que proponíamos entre PKCα y Fascin1, dando la
impresión de que se estaban produciendo pocos eventos de interacción entre ambas
proteínas en estas condiciones experimentales.
Figura VI.3. A) Se muestra un ejemplo del estado de la rejilla de CryoEM (PKCα-Fascin1 2:1) donde se
aprecia la distribución de partículas, en general de forma homogénea, aunque con una tendencia a la
agregación en determinadas regiones, posiblemente debido a la alta concentración a la que se añadió la
proteína. B) Se observan algunas de las clasificaciones 2D que se obtuvieron después de la selección de
partículas, muy semejantes en forma y tamaño (80 Å) con el modelo de interacción preliminar entre PKCa
y Fascin1 (Scipion). C) Se muestra el modelo de interacción entre PKCa y Fascin1 que proponíamos. En
este modelo, el dominio catalítico de PKCa estaría interaccionando con Fascin1. Cat, dominio catalítico
de PKCα, C1-C2, dominios C1 y C2 de PKCα. Los parámetros de la recolección de datos para la muestran
fueron: exposición: 53 e-/A2, 35 frames (0.4 s cada uno) y tamaño de píxel 1.35 A/pix. La muestra de la
rejilla se constituía de PKCα y Fascin1 añadidas de manera equimolar (1 mg/ml para PKCα). Además, se
añadían los aditivos CaCl2 (0.2 mM), ADP (2 mM), MgCl2 (5 mM) y el éster de forbol (0.2 mM). Tecnai
Polara 12 120K. 100.000 magnificación.
265
ELECTRÓNICA.
2.2 ESTUDIOS DE ESTABILIDAD Y POLIDISPERSIDAD DE LAS PROTEÍNAS

UNIDAS COVALENTEMENTE PKCa Y FASCIN1 POR MEDIO DE
FLUORESCENCIA, DLS Y SLS EMPLEANDO LA PLATAFORMA UNcle.
Como se ha comentado en el capítulo anterior y se describe de manera más

detallada en el apartado correspondiente dentro del capítulo de materiales y métodos, se
diseñaron las proteínas de fusión de manera específica para la CryoEM, debido a que las
proteínas añadidas por separado Fascin1 y PKCα no parecían mostrar un alto número de
eventos de interacción cuando se observaban en las primeras gradillas de CryoEM
analizadas (Figura VI.2).
De esta manera, mediante la unión a través de un conector, se permitía inclinar el

equilibrio a la aparición de más sucesos de unión entre ambas moléculas y de esta manera
sería mucho más probable captar la interacción del complejo proteico por medio de esta
técnica y poder así estudiar la interacción entre ambas proteínas a nivel estructural.
Aunque por medio de SPR se determinó que la afinidad entre ambas proteínas era
mayor cuando se empleaba la versión WT de Fascin1, se pensó que el empleo del mutante
S39D podría ser interesante estudiarlo, por si por medio de esta vía podíamos captar
posibles estados intermedios de interacción entre ambas proteínas.
De esta forma, se diseñaron y emplearon las siguientes proteínas de fusión:

MW para proteínas de Fusión: (135.158 kDa).
Puesto que la agregación parecía ser un problema en los primeros ensayos de

CryoEM realizados, añadiendo por separado PKCα y las proteínas con las que
interacciona (Fascin1 o RACK1), se llevó a cabo el análisis de estabilidad y
266
ELECTRÓNICA.
polidispersidad de estas nuevas construcciones por medio de la plataforma UNcle (que

reúne medidas de fluorescencia por medio de UV, SLS y DLS a la misma vez que se
aplica una rampa de temperatura) (Minton, 2007; Shiba et al., 2010; Stetefeld et al., 2016).
Además, se trabajó con dos condiciones diferentes para las proteínas mencionadas
arriba:
• Condición 1, para las proteínas en el tampón madre donde habían sido purificadas
originalmente, sin la adición de ningún aditivo.
• Condición 2, para las proteínas en su tampón original de purificación en presencia
de los aditivos que modulan la estructura y función de PKCα (CaCl2, ADP-MgCl2,
y éster de forbol P13A).
Esta última condición, se basa en las evidencias de que por medio de SPR, como
se ha comentado en apartados anteriores, cuando se añaden todos los aditivos
mencionados se potencia la capacidad de unión entre Fascin1WT y PKCα. Además, estos
aditivos están demostrados en la bibliografía que son capaces de promover una
conformación activa de PKCα, favoreciendo una forma catalíticamente activa de la
proteína (Newton, 2018), y que podría desencadenar una mejor respuesta a la hora de
reconocer y unirse a su sustrato, Fascin1. Las concentraciones finales de aditivos
empleadas fueron de: CaCl2 0.2 mM, ADP 2 mM, MgCl2 5mM y P13A 5mM.
En primer lugar, se muestran los datos concernientes a los ensayos de medidas de

fluorescencia y SLS a medida que se aplica un incremento de temperatura (Tabla VI.1).
Haciendo uso de medidas de la propia fluorescencia intrínseca de las proteínas a través
de sus aminoácidos aromáticos, se mide por medio de luz UV la estabilidad proteica en
el proceso completo de desnaturalización de la proteína. Estos parámetros nos dan
información de la estabilidad de nuestra proteína. Una mayor estabilidad de la proteína
nos informa del entorno favorable para preparar nuestro espécimen de cara a las técnicas
estructurales.
267
ELECTRÓNICA.
Tabla VI.1. Se muestran los datos del Thermal shift assay para todas las muestras en las dos condiciones
comentadas, con y sin aditivos. Numero de adquisiciones: 6, tiempo de adquisición (s): 5, temperatura de
inicio (ºC): 20. Incubación (s): 180. Incremento de ºC/min: 1, tiempo de mantenimiento en placa (s): 30,
temperatura final (ºC): 70. Tm: temperatura de fusión. Tagg: temperatura de agregación.
SIN CON
ADITIVOS ADITIVOS
Tagg 266 nm Tagg 473 nm Tagg 266 nm Tagg 473 nm
Muestra Tm (ºC) Tm (ºC)
(ºC) (ºC) (ºC) (ºC)
Fusion A 41.4 43.11 47.29 41.4 38.88 42.99
Fusion D 45.9 38.1 44.03 45.9 38.36 39.83
Fusion E 46.9 37.37 35.98 46.9 40.59 43.64
Fusion H 43.8 37.29 42.03 43.8 39.98 40.88
En el caso de la condición 1, sin la adición de aditivos, los valores se mantienen

en el caso de la Tm, (temperatura de fusión, medida en ºC), en un rango comprendido
entre 41.4ºC para la proteína de fusión A y 46.9ºC para la proteína de fusión E. En el caso
de la Tagg 266 (temperatura de agregación medida a absorbancia 266 nm en ºC) se sitúa
en un rango comprendido entre 37.29ºC para la proteína de fusión H y 43.11ºC para la
proteína de fusión A. En el caso de la Tagg 473 (temperatura de agregación medida a
absorbancia 473 en ºC) se mantiene en un rango entre 35.98ºC para la proteína de fusión
E y 47.29ºC para la proteína de fusión A.
Por otro lado, en el caso de la condición 2, con la adición de aditivos, los valores
se mantienen en el caso de la Tm, (temperatura de fusión, medida en ºC), en un rango
comprendido entre 41.4ºC para la proteína de fusión A y 46.9ºC para la proteína de fusión
E. En el caso de la Tagg 266 (temperatura de agregación medida a absorbancia 266 nm
en ºC) se sitúa en un rango comprendido entre 38.36ºC para la proteína de fusión D y
40.59ºC para la proteína de fusión E. En el caso de la Tagg 473 (temperatura de
agregación medida a absorbancia 473 en ºC) se mantiene en un rango entre 39.83 para la
proteína de fusión D y 42.99ºC para la proteína de fusión A.
Con respecto a la parte más importante para el desarrollo de técnicas de biología

estructural que nos ofrece el sistema UNcle, esta plataforma además funciona aplicando
mediciones de SLS y DLS determinando agregación y tamaño de diámetro hidrodinámico
de poblaciones de proteína. Se hizo uso de un parámetro denominado PDI (índice de
268
ELECTRÓNICA.
polidispersidad), que indica cuan de homogénea o heterogénea se comporta una muestra

proteica y nos informa de si nuestra proteína se comporta de manera no polidispersa, y
por ello siendo apta para los ensayos estructurales.
En la tabla VI.2 se puede observar como los valores de PDI oscilan, en el caso de
la condición 1 sin aditivos, entre 0.547 (mínimo) para la proteína de fusión A y 0.759
(máximo) para la proteína de fusión D. Con respecto a los valores de este parámetro para
la condición 2, adicionando todos los aditivos, estos valores se comprenden entre 0.6
(mínimo) para la proteína de fusión H y 2.369 (máximo) para la proteína de fusión A.
Tabla VI.2 Índice de polidispersidad (PDI), para todas las muestras proteicas medidas. Numero de
adquisiciones: 6, tiempo de adquisición (s): 5, temperatura de inicio (ºC): 20. Incubación (s): 180.
Incremento de ºC/min: 1, tiempo de mantenimiento en placa (s): 30, temperatura final (ºC): 70.
SIN CON
ADITIVOS ADITIVOS
Muestra PDI PDI
Fusion A 0.547 2.369
Fusion D 0.759 2.637
Fusion E 0.74 0.627
Fusion H 0.634 0.6
En general, estos resultados indican que los índices de polidispersidad son

elevados en todas las condiciones y que en el caso de no presencia de aditivos las
proteínas de fusión A y H serían las que se comportarían de manera más homogénea. En
presencia de aditivos, presentaría menor polidispersidad las construcciones E y H.
2.3 TINCIÓN NEGATIVA CON MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA PARA LAS

MUESTRAS DE PKC UNIDAS COVALENTEMENTE A FASCIN1 POR MEDIO
DE CONECTORES.
Aunque los datos de polidispersidad determinados por medio de la plataforma

UNcle no resultaron ser los más idóneos y ninguno de ellos era menor de 0.2, se realizaron
ensayos de tinción negativa de estas muestras por medio de microscopía electrónica. Esta
269
ELECTRÓNICA.
técnica se propone idónea para evaluar el comportamiento de la muestra previo a realizar

CryoEM.
En primer lugar, se tomó la proteína de fusión D, NT-Fascin1S39A-PKCα-CT.

Después de optimizar todo el proceso de tinción negativa y probar diversas
concentraciones para asegurarnos que trabajábamos en un rango de concentración óptimo
para poder estudiar el comportamiento de la proteína (0.01-0.03 mg/ml), se pudo observar
que en ciertas regiones de las rejillas preparadas para la tinción negativa existía una
distribución de partículas bastante homogénea sin zonas de proteínas precipitadas o
grandes agregados, lo que indicaba un comportamiento no polidisperso de nuestra
proteína en la rejilla (Figura VI.3).
De la misma manera, también se pudieron reproducir áreas de la misma calidad

en cuanto a distribución y comportamiento proteico para la proteína de fusión A NT-
Fascin1WT-PKCα-CT, usando también una concentración de proteína muy semejante a
la empleada en el caso de la proteína de fusión D (Figura VI.4).
Para asegurarnos que el proyecto de CryoEM avanzaba en la dirección adecuada,

antes de realizar la preparación de rejillas de CryoEM, decidimos llevar a cabo un ensayo
piloto de análisis por medio de clasificación 2D sobre las áreas que tenían buen aspecto
en cuanto a la distribución de partículas proteicas para las rejillas de tinción negativa,
concernientes a la proteína de fusión D (Figura VI.4, A).
270
ELECTRÓNICA.
Figura VI.4. A) En la zona superior: rejillas de tinción negativa para la proteína de fusión D, 0.017 mg/ml,
67kx. B) En la zona inferior: rejillas de tinción negativa para la proteína de fusión A, 0.019 mg/ml, 67kx.
Los parámetros para la recolección de datos para las proteínas de fusión D y A fueron: exposición: 53 e-
/A2, 35 frames (0.4 s para cada uno) y tamaño de píxel 1.35 A/pix. Tecnai Polara 12 (120 kV).
Concretamente, se tomaron las rejillas de la proteína de fusión D para hacer

adquisición de datos y clasificación 2D (Figura IV.5). Para ello, se llevó a cabo una
colección de aproximadamente 100 micrografías. En el primer set de resultados para esta
clasificación 2D, se pudieron ver algunas clasificaciones que se asemejaban y ajustaban
en tamaño y forma con un potencial modelo de interacción entre la PKCα y Fascin1. Estos
análisis informáticos se realizaron por medio del software de CryoEM llamado Scipion
que engloba diversas herramientas para el procesamiento de datos en la CryoEM (de la
Rosa-Trevín et al., 2016). Se empleó Xmipp3 para el proceso de selección de partículas
271
ELECTRÓNICA.
(de un conjunto de 100 micrografía, se seleccionaron un total de 5000 partículas totales),

MotionCor2 para el alineamiento de las micrografías obtenidas (Li et al., 2013) y
CTFFIND4 para la estimación de la función de transferencia de contraste (CTF) (Rohou
& Grigorieff, 2015).
Los resultados, como se observan en la Figura VI.5, mostraron clasificaciones 2D

que presentaban una morfología semejante a un posible modelo de unión del complejo
proteico (PKCα-Fascin1), aunque los niveles de resolución en estos momentos del estudio
eran muy bajos.
Figura VI.5. A) En la zona superior izquierda, región de unas de las rejillas de tinción negativa para la
proteína de fusión D analizadas para clasificación 2D con el software Scipion. B) En la zona superior
derecha se observan algunas de las clasificaciones 2D obtenidas después de la adquisición de datos y la
selección de partículas. Se enmarcan en rojo dos clasificaciones que se corresponderían con distintas
visiones del modelo de unión entre PKCα y Fascin1 propuesto. C) y D) En la zona inferior, se puede
determinar que algunas de estas clasificaciones desde distintas perspectivas, se parecen en forma con el
modelo propuesto de unión entre PKCα y Fascin1.
Posteriormente, se seleccionaron de este primer análisis de clasificación 2D, las

clasificaciones que mejor encajaban con nuestro modelo de unión entre la quinasa y su
sustrato Fascin1. Usando estas clasificaciones seleccionadas como molde, se tomaron de
referencia para refinar el proceso y realizar una segunda clasificación 2D. En este nuevo
272
ELECTRÓNICA.
análisis, pudimos detectar más clasificaciones que se adaptaban al posible modelo de

interacción entre las dos proteínas (Figura VI.6).
Figura VI.6. Segunda clasificación 2D, usando como modelo las mejores clasificaciones 2D a partir de la
primera clasificación 2D. Algunas de las clasificaciones que mejor se asemejan a nuestro modelo de unión
entre las proteínas PKCα y Fascin1 se encuadran en rojo.
De este segundo proceso de clasificación 2D, resultaron numerosas

clasificaciones que, de nuevo, encajaban en morfología dentro del modelo de unión entre
las dos moléculas (Figura VI.7).
273
ELECTRÓNICA.
Figura VI.7. Similitudes entre las clasificaciones 2D procedentes de las rejillas de tinción negativa y el
modelo estructural de unión entre PKCα y Fascin1 (I). Cat. Dominio catalítico de PKCα. C1-C2, dominios
C1 y C2 de PKCα.
2.4 ANÁLISIS POR MEDIO DE CRIOMICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE LAS

CONSTRUCCIONES DE PKCα-FASCIN1 UNIDAS COVALENTEMENTE POR
MEDIO DE CONECTORES.
Después de estos resultados tan prometedores concernientes a la tinción negativa

y el primer análisis 2D, nos decidimos a preparar rejillas de CryoEM para poder
observarlas y hacer cribados abarcando diversas condiciones en el microscopio de mayor
resolución Glacios (Thermo Fisher Scientific, 200 kV). Para este fin, las muestras se
diluyeron a entorno a concentraciones de 0.1-0.05 mg/ml con la intención de asegurar
una correcta distribución de partículas a lo largo de las rejillas en el proceso de
criogenización en etano líquido.
Concretamente, empezamos a optimizar las condiciones para la proteína de fusión

D, para la condición 1 (sin añadir ningún aditivo). Después de diversos intentos
optimizando el tipo de rejillas a utilizar, la concentración adecuada de proteína y los
parámetros en el Vitrobot (Tecnai, FI) (tiempo de glow discharging, tiempo de blotting,
274
ELECTRÓNICA.
la humedad de la cámara del vitrobot, la temperatura dentro de la cámara del vitrobot, la

cantidad de volumen añadida y la fuerza de blot), pudimos comenzar a observar áreas
adecuadas en cuanto a la distribución de partículas y espesor de hielo en la rejilla (Figura
VI.8), en las que pudimos realizar colección de datos en el microscopio electrónico de
alta resolución Glacios (Thermo Fisher Scientific, 200 kV).
Figura VI.8. Imágenes del aspecto de las gradillas de cryoEM para las preparaciones de la proteína de
fusión D. Los parámetros para la colección de datos para la proteína de fusión A fueron: exposición: 39.94
e-/A2, 35 frames (1.22 s cada uno) y tamaño de píxel 0.96 A/pix. Glacios 200 kV. 150k magnificación.
Sin embargo, después de procesar las películas tomadas en el microscopio Glacios

(Thermo Scientific, 200 kV), por medio del programa Scipion, en el primer set de
clasificación 2D (Figura VI.9) no pudimos detectar clasificaciones 2D que, a diferencia
de lo que si observamos en el primer análisis de datos a partir de las rejillas de CryoEM
(Figura VI.3) y las pruebas anteriormente descritas de tinción negativa (Figura VI.7),
presentaran el modelo de unión que proponíamos constituido por tres esferas. Este
modelo de 3 esferas presentaba un diámetro de aproximadamente 75 Å, cada una de las
esferas con un diámetro de en torno 30 Å cada una.
275
ELECTRÓNICA.
Tabla VI.3. Parámetros de recolección de datos de CryoEM para el set de datos correspondiente a la
proteína de fusión D.
Colección de datos
Microscopio Glacios (FEI)
Cámara K2 summint (Gatan)
Voltaje (KeV) 200 kV
Rango de desenfoque (um) -2.5 a -4
Magnificación 150.000x
Tamaño de píxel (Å/pixel) 0.96
Relación de dosis e-/pixel/s 5.4
Películas 300
Frames por película 35
Tiempo total de exposición (Sec) 1.22
Dosis total acumulada (e-/Å) 50
Partículas después de la selección de partículas 45000
Partículas que contribuían a la reconstrucción final. 30000
Sharpening B-factor Å2 -150
Resolución final Å N.A. (< 50 Å)
Figura VI.9. Clasificación 2D, para la primera rejilla de CryoEM en la que obtuvimos una distribución de
partículas adecuada y una buena capa de hielo con el espesor óptimo, para la proteína de fusión D. Scipion.
Mediante la mejora en la optimización de la selección de partículas en Scipion

previa a la clasificación 2D, con el mismo set de datos correspondientes a la proteína de
fusión D sin la adición de aditivos, se empezaron a observar mejoras en las clasificaciones
276
ELECTRÓNICA.
2D que se asemejaban al modelo propuesto de interacción entre Fascin1 y PKCα (Figura

VI.10).
Para conseguir este progreso, se llevó a cabo una optimización en el proceso de

selección de partículas de Scipion por medio de la herramienta Xmipp3 (Martínez et al.,
2020). De este modo, por procesos iterativos se sometió al algoritmo a un proceso de
aprendizaje de manera manual para recoger las partículas más adecuadas que pensábamos
se asociaban a diferentes clasificaciones de nuestro modelo de interacción. Una de estas
decisiones para enseñar al algoritmo a seleccionar las partículas más adecuadas, fue, por
una parte, ser más restrictivo con la libertad que se le daba al algoritmo para seleccionar
partículas. En este aspecto, si el algoritmo detecta residuos de hielo por ejemplo o de oro
u otro de los materiales de los que se componen las rejillas, los puede considerar como
partículas y esta información sería incorporada al análisis añadiendo ruido al ensayo final,
dificultando el procesado de datos. De este modo, por el proceso de aprendizaje, se
conseguía que el sistema de selección de partículas fuera más fino y de mejor calidad a
la hora de elegir y considerar lo que de verdad representaba una partícula correspondiente
a nuestro complejo proteico sus diversas conformaciones y perspectivas posibles según
como se posicionara en la capa de hielo previo al proceso de criogenización.
Por otro lado, en el primer análisis de datos, se le enseñó a la herramienta Xmipp3

de búsqueda de partículas de Scipion a buscar partículas constituidas en su mayoría
únicamente por 3 esferas, que de acuerdo con nuestro modelo deberían de corresponderse
a 1) los dominios catalíticos de PKCα, 2) los dominios C1 y C2 de PKCα juntos y 3) por
otra parte la proteína sustrato Fascin1 (Figura VI.11 A). En este segundo análisis, además
también se seleccionaron dentro del aprendizaje de selección de partículas por medio de
Xmipp3, las partículas formadas por dos esferas. Esto es debido a que también tendría
sentido un modelo en el que el dominio catalítico de PKCα y Fascin1 están
interaccionando (dos esferas de aproximadamente 30 Å cada una) y los dominios C1 y
C2 en algunas ocasiones pueden verse como una tercera esfera en el caso en el que se
encuentre en un estado más cerrado y organizado. No obstante, en el caso en el que estos
dominios se encuentren abiertos y separados el uno del otro sin interaccionar, no sería
posible detectarlos por medio de CryoEM como una tercera esfera correspondiente a la
unión de dichos dominios por su pequeño tamaño (Figura VI.11 B).
277
ELECTRÓNICA.
De esta manera y tras introducir esas modificaciones en el proceso de búsqueda

de Xmipp3 de Scipion, se comenzaron a observar ambos modelos de 3 y 2 esferas en las
nuevas clasificaciones 2D (Figura VI.10). Estos modelos además añadían una nueva
connotación, y era que, en el caso de las clasificaciones donde aparecían 3 esferas, el
modelo de interacción parecía sugerir una conformación más cerrada de interacción entre
las dos proteínas (Figura VI.11 A), mientras que en el caso donde solo se veían 2 esferas,
la separación entre éstas, daba a indicar un modelo más abierto de no interacción entre
PKCα y Fascin1 o bien un estado intermedio de interacción entre ambas proteínas (Figura
VI.11 C).
En estos procesados de datos disponíamos de aproximadamente 150 micrografías

de calidad en las que disponíamos de aproximadamente 45.000 partículas totales. Los
datos, fueron recogidos por medio del microscopio de alta resolución Glacios (Thermo
Scientific, 200 kV) como se ha comentado anteriormente (Tabla VI.3).
Figura VI.10. Se muestran algunas de las nuevas clasificaciones 2D después de optimizar el proceso de
selección de partículas por parte del paquete Xmipp3 de Scipion. Se muestran encuadradas en rojo y azul
ambos modelos explicados. Encuadrado en rojo: modelo de tres esferas que estaría representando un
modelo más cerrado de interacción. Y encuadrado en azul: modelo de dos esferas, estaría representando un
modelo más abierto de no interacción. Scipion.
278
ELECTRÓNICA.
Figura VI.11. Se muestran 3 posibles interpretaciones de las reorganizaciones de los dominios principales
(esferas) que componen nuestras proteínas a través de CryoEM en las clasificaciones 2D. A) Se pueden
observar 3 esferas interaccionando y definidas para Fascin1, los dominios C2-C1 y el dominio catalítico de
PKCα. B) Se pueden ver 2 esferas interaccionando de Fascin1 y el dominio catalítico de PKCα. C) Se
observan dos esferas no interaccionando para Fascin1 y el dominio catalítico de PKCα, que quedan
suficientemente cerca debido a que ambas proteínas están unidas de forma covalente por medio de un
conector. Rodeado en rojo se resaltan los dominios u organización de dominios que debido a su tamaño
permiten ser detectados por medio de CryoEM.
El hecho de observar estos dos modelos de una estructura abierta y cerrada, podían
deberse además al factor de que en primer lugar se empleó la condición 1 en ausencia de
aditivos. Por este motivo, nuestra proteína podría ser más propensa a adoptar una
conformación catalíticamente no activa y por ende se daban menos casos de uniones con
Fascin1. Debido a esto, posteriormente nos centramos en la preparación de muestras para
la condición 2, en la que estaban presentes todos los aditivos y podían hacer que nuestra
proteína adoptara una conformación catalíticamente más activa que promoviera la
interacción con Fascin1.
279
ELECTRÓNICA.
Posteriormente, se realizó un análisis de los datos por medio de otros softwares

especializados en CryoEM para comparar los resultados y determinar si se obtenían
clasificaciones 2D parecidas o si se podría mejorar la calidad de éstas con herramientas
diferentes. Para de esta manera, poner a punto y dejar definido el mejor flujo de trabajo
para aplicar una vez obtuviéramos más colecciones de datos.
En primer lugar, se usó Cryosparc con el mismo set de datos de la proteína de

fusión D explicado y analizado hasta el momento. Particularmente, en esta ocasión se
empleó el Blob Picker de Cryosparc (Punjani et al., 2017). Esto se trata de un
seleccionador de partículas totalmente automático. El usuario solo tiene que marcar un
umbral de detección de lo que se considera partícula por parte del software, y éste, sin
que el investigador realice un proceso de aprendizaje por parte del algoritmo para detectar
lo que es una partícula, lo detecta por sí solo. De esta manera, no se sesga la capacidad
de detectar partículas desde una visión más subjetiva de la idea que el investigador pueda
tener de lo que considere puede ser el aspecto de una partícula que represente su modelo.
Por el contrario, con este enfoque, se deja al software actuar desde un punto de vista
totalmente imparcial para detectar partículas de diversa índole, abriendo la puerta a
posibles nuevos modelos de interacción que de otra manera y sesgados por la visión del
investigador serían más difíciles de detectar. Por su parte, posterior a la selección de
partículas se emplearon los mismos paquetes descritos para Scipion, CTFFIND4 y
MotionCor2 para el alineamiento de las micrografías de las películas recogidas y la
estimación de CTF, previo a la clasificación 2D.
El primer set de clasificación 2D a través del Blob Picker de Cryosparc se muestra

en la Figura VI.12. Se observa que la primera clase situada en la zona de la izquierda, que
además se corresponde con la clase con mayor número de partículas recolectadas, es una
clase que se asemeja mucho a las clasificaciones encontradas por medio de Scipion y que
se corresponden al modelo de 3 esferas. Por otra parte, por ejemplo, las clasificaciones 4
y 5 (empezando a contar desde la izquierda) podrían corresponderse a las mismas
clasificaciones que veíamos en Scipion correspondientes al modelo de 2 esferas.
280
ELECTRÓNICA.
Figura VI.12. Se muestran algunas de las clasificaciones 2D, tras el primer análisis realizado por medio de
Cryosparc y su Blob Picker.
Posteriormente, y usando las clasificaciones que mejor representaban nuestros

modelos de 2 y 3 esferas, las usamos como modelo para realizar un nuevo análisis 2D por
medio de Cryosparc, que se muestra en la Figura VI.13.
Figura VI.13. Algunas de las clasificaciones 2D que se obtuvieron en la segunda clasificación 2D,
empleando las mejores clasificaciones del primer análisis como modelo.
De nuevo, podemos observar que las clasificaciones con más partículas

representadas se corresponderían al modelo de 2 esferas en la primera clase en la esquina
superior izquierda, y justo a continuación se observa el modelo de 3 esferas en la segunda
clase con más partículas seleccionadas por el Blob Picker de Cryosparc (Figura VI.12).
Posteriormente, además también se trabajó con el software de CryoEM Relion

(Scheres, 2012) con el mismo set de datos correspondiente a la proteína de fusión D sin
la adición de aditivos, que hasta el momento, había sido la recolección de datos de mejor
calidad. En primer lugar, con todo lo aprendido hasta el momento, se tomó un set de
micrografías tomadas por medio del microscopio de alta resolución Glacios 200 kV
(Thermo Scientific) y se procedió a la selección manual de partículas una por una, de todo
aquello que se consideraba que podía representar a nuestro complejo proteico desde todas
las perspectivas posibles. Se empleó la herramienta de selección manual de partículas de
Relion.
281
ELECTRÓNICA.
Concretamente, y a modo de ensayo piloto preliminar, esto se realizó para 10

micrografías después de ser sometidas a alineamiento por MotionCor2 y posterior
estimación de CTF por CTFFIND4. Para un total de aproximadamente 3000 partículas
seleccionadas, se procesaron esos datos y se realizó clasificación 2D donde se
consiguieron los mejores resultados de clasificación 2D obtenidos hasta el momento. Las
clasificaciones se observaban mucho más definidas en un fondo negro, indicativo de que
la calidad de las clasificaciones 2D comenzaba a aumentar significativamente. Sin
embargo, todavía se presentaba difícil observar características propias de las proteínas en
dichas esferas blancas que representaban cada clase, lo que indicaba que aun quedaba por
mejorar nuestras clasificaciones 2D para poder llegar a la resolución estructural a nivel
atómico (Figura VI.14).
Figura VI.14. A) Clasificación 2D después de hacer la selección de partículas manual en 10 micrografías

del total de datos recolectados con el uso del microscopio Glacios, por medio del software Relion. Las
clasificaciones que no están encuadradas en rojo se pueden considerar clasificaciones 2D adecuadas donde
podemos seguir viendo nuestro modelo de 2 y 3 esferas correspondientes al modelo putativo de interacción
y de no interacción entre PKCα-Fascin1. B) También se muestra un ejemplo de una micrografía en la que
se seleccionaron de forma manual las partículas rodeadas en círculos verdes por medio del programa
Xmipp3 de Scipion.
Para intentar mejorar el proceso de clasificación 2D, se siguió usando el software

Relion con la herramienta de selección de partículas Cryolo (Wagner et al., 2019). Esto
dio lugar a un mejor resultado aún en comparativa con el selector de partículas Xmipp3
de Scipion, el Blob Picker de Cryosparc, y la selección manual de partículas en Relion
descritos anteriormente.
282
ELECTRÓNICA.
De esta manera, con Cryolo, lo que se hizo fue someter a Relion a un proceso de
aprendizaje por el cual éste era capaz de seleccionar partículas de la misma manera en la
que nosotros mismos seleccionamos las partículas de forma manual anteriormente en las
10 micrografías del ensayo piloto por medio de Relion.
Tomando de referencia como nosotros seleccionamos las partículas en esas 10

micrografías de forma manual, a través de Cryolo, Relion aprendió nuestra forma de
elegir partículas. A continuación, se realizó el análisis 2D tomando el total de todas las
micrografías recolectadas (unas 150 micrografías que resultaban en aproximadamente
45000 partículas totales) y no solamente 10 de prueba. En este nuevo procesamiento, se
obtuvieron clases 2D que incluso para algunas eran de mejor calidad en comparación con
los análisis realizados anteriormente. Además, se empezaron a observar ciertos detalles
en las clases que empezaban a aparecer más definidas en un fondo negro, lo que indicaba
un perfeccionamiento en la calidad de la resolución percibida (Figura VI.15).
En algunas de estas clasificaciones, como se comenta, se empiezan a observar en

algunas de las esferas de nuestro modelo de unión entre las proteínas detalles más finos,
tales como una suerte de túnel interno en una de las esferas de nuestro modelo de
interacción (Figura VI.15). Así, en algunas de las esferas que conforman nuestro modelo
de interacción, se observa una zona central carente de densidad electrónica, que estaría
representando una reorganización de uno de los dominios de la PKCα o de la propia
Fascin1, donde en el centro no habría densidad proteica.
283
ELECTRÓNICA.
FigurA VI.15. A) Se muestran algunas de las clasificaciones 2D que se obtuvieron con Relion después de
usar todo el set de micrografías correspondiente con la proteína de fusión D, condición 1 (sin aditivos). En
este caso, se hizo uso del seleccionador de partículas Cryolo y de la información de la que disponíamos de
la anterior clasificación 2D. B) Detalle ampliado para dos de las clasificaciones 2D donde se observa dentro
de una de las esferas una zona de anillo, donde en el interior de las esferas encuadradas en naranja se indica
con una flecha roja la zona carente de densidad electrónica que estaría representando un túnel interno en
alguna de las esferas.
Aunque la calidad de la clasificación 2D aún distaba bastante de acercarse a la

perfección para poder aproximarnos a la resolución atómica y apreciar detalles de la
estructura secundaria de la proteína, se continuó con el análisis de CryoEM por medio de
la realización del modelo inicial y de la clasificación 3D, para tener una idea grosso modo
de como se mostraba nuestro modelo a nivel tridimensional.
De las 25 clasificaciones 2D obtenidas, nos quedamos con 9 clasificaciones 2D

que contenían un total de 3100 partículas. Con todas ellas, se realizó una clasificación 3D
con 5 clasificaciones 3D diferentes, quedándonos con una de ellas que englobaba 1900
partículas. Con estas partículas se llevó a cabo un refinamiento del modelo 3D del
complejo. A continuación, se muestra la reconstrucción preliminar a baja resolución
atómica (> 50 Å) del complejo proteico (Figura VI.16).
284
ELECTRÓNICA.
Figura VI.16. A) En la zona superior, se representa el modelo inicial para la proteína de fusión D desde dos
perspectivas diferentes. Se muestra también una imagen de una clase 2D que representa este modelo inicial
indicándose el diámetro máximo del modelo, 72.67 Å. B) En la zona central se representa desde dos
perspectivas diferentes la mejor de las clasificaciones 3D obtenidas del total de 5 que se obtuvieron en el
proceso. C) En la parte inferior: modelo final refinado de la mejor clase 3D. Proceso realizado por medio
de Relion.
Por otra parte, también se empezaron a preparar nuevas rejillas para la proteína de
fusión A, para la condición 2 en presencia de todos los aditivos (CaCl2, ADP-MgCl2, y
éster de forbol) (Figura VI.17). Estas condiciones permitirían a las PKCs adoptar una
conformación más apropiada para interaccionar con su sustrato Fascin1 y poder
fosforilarlo.
285
ELECTRÓNICA.
Figura VI.17. Ejemplos de rejillas de CryoEM para la proteína de fusión A (condición 2) recolectadas con
el microscopio Glacios. Parámetros de recolección de datos para la proteína de fusión A fueron: exposición:
39.94 e-/A2, 35 frames (1.22 s each) y tamaño de píxel 0.96 A/pix. 150.000x magnificación.
Sin embargo, durante las nuevas tomas de datos con el microscopio electrónico
Glacios (Thermo Scientific, 200 kV), nos encontramos con algunos problemas que
dificultaron la obtención de rejillas con el espesor de hielo perfecto y que hicieron difícil
la reproducción de las condiciones de hielo que se han mostrado en el caso de la proteína
de fusión D anteriormente.
Así, uno de los mayores problemas a los que nos enfrentamos a la hora de obtener
preparaciones de rejillas de calidad, fue la aparición de un patrón de hielo con forma de
iceberg, como puede observarse en las siguientes imágenes (Figuras VI.18 y VI.19). Hay
que recordar que para poder observar y tomar datos e imágenes de calidad de nuestras
286
ELECTRÓNICA.
partículas proteicas, que permitan un análisis de datos óptimo, es fundamental que la capa
de hielo sea lo más fina posible y ajustada al tamaño de nuestro complejo proteico. Esta
condición, se favorece cuando se forma un gradiente de hielo a lo largo de la rejilla que
facilita definir regiones de agujeros de las rejillas donde el espesor del hielo es
ligeramente superior al tamaño de nuestra proteína de interés (Passmore & Russo, 2016).
Figura VI.18. Visión de varios cuadrantes de las rejillas, donde se puede observar en algunos de ellos esos
parches oscuros en el centro del cuadrante (indicado con flechas naranjas), que indica una distribución de
hielo anómala en forma iceberg, que dificulta y a veces imposibilita una recolección de datos de calidad.
Figura VI.19. Visión ampliada de dos cuadrantes de las rejillas, donde se puede observar con mayor claridad
los agujeros de la rejilla. A) Se puede ver como casi no hay gradiente de hielo. Este, pasa de estar
relativamente espeso en el centro del cuadrante a prácticamente seco en la zona de los bordes. B) En algunas
ocasiones podíamos observar un pseudo-gradiente poco natural desde el centro más espeso hasta los bordes
más fino, pero eran áreas tan pequeñas y con un gradiente tan poco fino que hacía muy difícil definir áreas
adecuadas para recolectar datos. Las áreas de hielo descritas se encuentran delimitadas por un perímetro
delimitado en azul.
287
ELECTRÓNICA.
Sin embargo, por algún motivo, nos encontramos con la aparición de patrones de
hielo muy heterogéneos o patrones de hielo en forma de iceberg en el que en el centro de
los cuadrados de la rejilla aparecía una superficie de hielo muy grueso y de este espesor
de hielo pasaba a estar prácticamente seca sin ninguna capa de hielo fino y sin apenas
ningún gradiente que pudiera albergar nuestra proteína en las condiciones más ideales
para llevar a cabo la recolección de datos.
Por otra parte, el hecho de no obtener un patrón de hielo adecuado a lo largo de la

rejilla hacía que en algunas regiones donde el hielo podía tener un espesor cercano a las
condiciones ideales aparecieran proteínas precipitadas, desnaturalizadas o agregadas
debido a que éstas se depositaban en la interfase aire-hielo.
Todo esto, a la hora de realizar la recolección de datos hacía muy difícil definir
que áreas de hielo eran las más idóneas donde se localizarían las partículas para iniciar el
análisis a partir de la selección de partícula y clasificación 2D. Esto se traducía, en un
número total muy reducido de partículas de partida para comenzar el análisis de CryoEM.
Teniendo en cuenta que se trabajaba con un complejo proteico muy pequeño, asimétrico
y en el que muy posiblemente se estaban adoptando varias conformaciones, era una
condición sine qua non el hecho de comenzar el análisis con el mayor número de
partículas posibles que ayudaran a la determinación de la estructura tridimensional del
complejo PKCα-Fascin1.
A pesar de las dificultades encontradas a lo largo de la preparación del espécimen

y de la recolección de datos, se pudo realizar el procesado de datos para un total 5
condiciones diferentes que, aunque no fueron tan exitosas como la primera, que es la que
se describe con detalle en este capítulo, arrojaron información interesante a nivel
estructural cuando se estudiaban las clasificaciones 2D para cada una de las condiciones
analizadas (Figura VI.20).
288
ELECTRÓNICA.
Figura VI.20. Se representan todos los análisis de clases 2D para: A. Proteína de fusión D, condición 1.
Todo el proceso de análisis de esta muestra se ha descrito en detalle en la elaboración de este capítulo. Para
el resto de las clases 2D (B, C, D y E) debido a la baja calidad de los datos obtenidos mediante la recolección
de micrografías, no se pudo realizar análisis más allá de la clasificación 2D. B. Proteína de fusión D,
condición 1. C. Proteína de fusión A, condición 2. D. Proteína de fusión A, condición 2. E. PKCα por sí
sola, condición 2.
Condición 1: no se añadían aditivos. Condición 2: todos los aditivos añadidos para potenciar la unión entre
las dos proteínas (ADP-MgCl2, CaCl2 y éster de forbol). Para todas las clases 2D mostradas en cada
conjunto de datos se tomaron 10 micrografías de las que se seleccionaban las partículas (aproximadamente
300) manualmente y se realizaba la clasificación 2D tal y como se ha descrito anteriormente por medio de
Cryolo y Scipion.
3 DISCUSIÓN.
En el primer acercamiento a la técnica de CryoEM, sin apenas preparación previa,

empleando las proteínas PKCα, RACK1 y Fascin1 añadidas por separado, se pudo llevar
a cabo un ensayo de clasificación 2D. Esta clasificación 2D se realizó sobre rejillas de
CryoEM con las proteínas PKCα y Fascin1 añadidas por separado en cantidades
equimolares, que eran dentro de todas las combinaciones preparadas las que daban una
mejor preparación de rejillas.
289
ELECTRÓNICA.
Aunque las clases 2D obtenidas en general eran de baja calidad, para algunas de
estas clases se pudieron establecer semejanzas con el modelo de interacción que
propusimos entre PKCα y Fascin1. Teniendo en cuenta que no había habido ninguna
preparación previa ni puesta a punto de ninguno de los parámetros, estos resultados,
aunque aún lejos de ser perfectos nos abrieron la puerta a poder analizar de una forma
más detallada y sistemática esta interacción a través de la CryoEM.
También se pudo concluir, observando la figura VI.2 que una concentración de 1

mg/ml y 4 mg/ml para las mejores condiciones A) y B) de PKCα y Fascin1 añadidas en
cantidades 2:1 mol a mol (2 de PKCα y 1 de Fascin1), aportan una correcta distribución
de partículas y una menor agregación en comparación con el complejo PKCα-RACK1.
Sin embargo, una menor concentración proteica podría reducir las formaciones de
agrupaciones proteicas que aparecían distribuidas de forma homogénea por la gradilla y
que ayudarían de esta manera a obtener una colección de datos de mejor calidad.
Relativo al estudio de la estabilidad y polidispersidad de las muestras a ser

analizadas por medio de CryoEM, como puede verse en la Tabla VI.1, los valores para
los diversos parámetros medidos por medio de Thermal Shift Assay son muy parecidos
para las condiciones con y sin aditivos añadidos. Lo que significa que la condición 2
(aditivos añadidos), no tiene un efecto crítico en el comportamiento de la estabilidad de
las proteínas sometidas a un proceso de desnaturalización por temperatura.
Observando la tabla VI.2 y teniendo en cuenta que los valores teóricos que indican
que una muestra es monodispersa equivalen a un índice de polidispersidad PDI inferior a
0.25, se puede determinar en la tabla que ninguna de nuestra proteína de partida se
presenta como una muestra monodispersa ideal para someterse a las técnicas
estructurales. Esto se debe a que en todas las muestras el índice PDI oscila en un rango
comprendido entre 0.547 y 2.4, y en ninguno de los casos se mantiene inferior a 0.25.
Por otra parte, se puede ver que algunas de las muestras se comportan de manera
más homogénea y menos polidispersa para las condiciones sin añadir ningún aditivo. De
cualquier manera, esta condición con la adición de aditivos no se descartó para ninguna
de las proteínas de fusión, debido a las implicaciones fisiológicas y cambios estructurales
290
ELECTRÓNICA.
de gran interés que tienen las para las proteínas PKCs. Además, de haberse demostrado
por medio de SPR durante el desarrollo de la Tesis, que es la condición donde más se
potencia la unión entre PKCα y Fascin1.
Todo esto sugería que la muestra debía ser modificada para poder someterse al
proceso de CryoEM. Esto se podía realizar añadiendo diversos aditivos, cambiando las
propiedades del tampón de purificación o modificando las concentraciones de los aditivos
ya presentes en el tampón mediante el uso de filtros de diálisis específicos, hasta dar con
una condición en el que la muestra se comportara de la manera más monodispersa posible
para potenciar las posibilidades de que esta técnica estructural tuviera éxito.
Después de los desalentadores resultados tras medir la estabilidad y

polidispersidad de nuestra proteína por medio del sistema UNcle, siguiendo las
indicaciones de profesionales en la materia, realizamos la técnica de tinción negativa
antes de mejorar las condiciones del tampón que contenía nuestra proteína para poder
seguir realizando ensayos de estabilidad proteica y polidispersidad por medio de la
plataforma UNcle. En este proceso, se tendrían que haber probado multitud de variantes
hasta determinar las condiciones que hicieran que nuestra proteína fuera lo menos
polidispersa posible y así aumentar las posibilidades de éxito en la CryoEM. Ello habría
supuesto una gran pérdida de muestra proteica y tiempo de optimización.
Como se ha comentado, los resultados concernientes a la tinción negativa fueron

bastante prometedores en cuanto a que, en el primer procesamiento de datos, las primeras
clases 2D estudiadas se asemejaban mucho en tamaño y forma a nuestro modelo de unión
entre las dos proteínas. Además, la distribución de partículas homogénea en las gradillas
nos daba información de que la polidispersidad no iba a ser un problema para llevar
nuestra proteína al objetivo final de CyoEM, a diferencia de lo que indicaban los datos de
polidispersidad a través de la herramienta UNcle.
De esta manera, se desarrolló un método para preparar rejillas de CryoEM en el

cual pudiéramos determinar la estructura del complejo PKCα-Fascin1.
291
ELECTRÓNICA.
Observando la figura VI.20, podemos sacar conclusiones bastante interesantes.

Antes de continuar es importante aclarar que las clases 2D, para cada una de las
clasificaciones 2D que se muestran en la figura anterior, están ordenadas por
representación de número de partículas perteneciente a cada clasificación. Desde la clase
con más partículas recolectadas en el recuadro de la esquina superior izquierda y, a
continuación, desplazándonos de izquierda a derecha y hacia abajo, vamos viendo menor
representación de partículas pertenecientes a cada una de las clasificaciones hasta
terminar en la clasificación de la esquina inferior derecha con menor representación de
partículas.
Como ya hemos comentado anteriormente, fijándonos en el apartado A de la

figura VI.20, tenemos la proteína de fusión D, condición 1 sin aditivos. En este caso,
podemos observar tanto el modelo de 2 como de 3 esferas distribuido entre las clases con
más partículas representadas. El modelo de dos esferas, estarían indicando una
conformación abierta, no catalíticamente activa en el que quizás se corresponda con un
intermedio de interacción entre PKCα y Fascin1. Mientras que también se observa el
modelo de 3 esferas, donde la proteína quinasa estaría adoptando una conformación
catalíticamente activa y por ello más propensa a unirse al sustrato al que fosforila.
En el apartado B (Figura VI.20) tenemos de nuevo la proteína de fusión D,

condición 1. De nuevo, se pueden observar entre las clases, tanto el modelo de dos esferas
como de tres esferas.
Por su parte, en el apartado C (Figura VI.20), se representan las clases para la

proteína de fusión A. En este caso sí se añadían todos los aditivos (ADP-MgCl2, CaCl2 y
éster de forbol) para intentar conseguir un estado activo de la proteína que favorezca la
unión de la quinasa a su sustrato. En este apartado C, si nos fijamos en las clases de la
primera fila (con mayor número de partículas representadas), podemos ver que hay
diferencias significativas con respecto a las clasificaciones 2D de los apartados A y B. En
esta condición, podemos ver que efectivamente se favorece la aparición de lo que parecen
3 esferas desde diversas perspectivas en las 4 primeras clases de la primera fila. Esto
estaría validando nuestra hipótesis de que la adición de todos los aditivos favorece la
292
ELECTRÓNICA.
aparición de una conformación cerrada de la proteína en la que estarían representadas las

3 esferas en las clasificaciones 2D.
Sin embargo, si observamos el apartado D (Figura VI.20), que al igual que el

apartado C se trata de la proteína de fusión A, condición 2 (todos los aditivos añadidos),
los resultados difieren bastante a lo que se esperaría obtener. Sin embargo, cabe destacar
que en este caso la recolección de datos fue de muy baja calidad en cuanto a que el espesor
de hielo no era tan bueno como en análisis correspondiente al apartado C y en las
micrografías recogidas durante la recolección de datos aparecían muchas regiones de
proteína desnaturalizada o agregada. Esto hizo, en general, que la calidad de las partículas
de partida dejara mucho que desear y por ello como se puede observar en la primera fila
de clasificaciones 2D, no podemos detectar apenas modelos de 2 y 3 esferas como los ya
mencionados en los apartados A, B y C. De modo que la hipótesis, a falta de poder realizar
más replicados, de que la adición de todos aditivos desplaza el equilibrio a la aparición
de más modelos de interacción de 3 esferas todavía queda como válida. Pudiendo en
cierto modo, y por la naturaleza de la recolección de datos, llegar a descartar este análisis
a la espera de poder repetirlo en un futuro.
Por último, si analizamos el apartado E (Figura VI.20), se prepararon rejillas

control añadiendo únicamente la proteína PKCα junto con todos los aditivos. Se puede
observar que en la primera fila de las clasificaciones 2D con más partículas representadas
solo aparecen modelos de 2 esferas en todos los casos. Esto estaría apoyando la teoría de
que PKCα aparece en las partículas como dos esferas, una perteneciente al dominio
catalítico y la otra correspondiéndose con los dominios C1 y C2. También podemos ver
que hay clases 2D con una sola esfera que bien podría deberse al hecho de que, los
dominios C1 y C2 no se organizan y solo se detecta el dominio catalítico como una única
esfera, o bien que, estén presentes las dos esferas, pero por la perspectiva en la que se
observan las clases 2D estén alienadas ambas esferas y por ello solo se vea una única
esfera.
En la siguiente figura VI.21, se muestra una interpretación del modelo 3D

obtenido que, aunque lejos de dar información atómica por el momento, ofrece
293
ELECTRÓNICA.
información tridimensional de gran interés relativa al modelo de interacción entre PKCα

y Fascin1.
Figura VI.21. Interpretación del modelo de interacción a partir del modelo tridimensional obtenido. A)
Fascin1 podría estar organizándose de tal manera que se podría formar un túnel en la zona central de su
estructura (representado con el círculo rojo en la figura) mediante la organización de sus lóbulos 1
(dominios F1 y F2) junto con el lóbulo 2 (dominios F3 y F4). De ahí, observar en las clases 2D esa forma
de anillo. B) En las clases 2D, se observa una de las esferas con forma de anillo con reducida densidad
electrónica central, que podría corresponderse con la molécula de Fascin1 (indicada con la flecha naranja).
Por otra parte, una de las otras dos esferas se correspondería con el dominio catalítico (Cat.) y la otra con
los dominios C1-C2 de la PKCα. C) En el modelo tridimensional, se observa una esfera de interacción con
una zona central con una menor densidad electrónica que se podría corresponder con Fascin1 (indicada con
la flecha naranja), mientras que la esfera más voluminosa de la izquierda se podría corresponder con el
dominio catalítico de PKCα y la densidad de la zona superior podría representar los dominios C1 y C2 de
PKCα, que debido a su flexibilidad y por ende una organización más laxa, no estarían tan definidos dentro
de una tercera esfera de interacción en el modelo 3D. D) Se muestra el modelo tridimensional propuesto de
unión entre PKCα y Fascin1 que podría encajar con la información obtenida de las clases 2D y del modelo
3D propuesto. En la estructura de Fascin1, se marca con un círculo naranja la región que podría estar
formando el túnel interno carente de densidad electrónica y que definiría esa forma de anillo.
Aunque los datos preliminares fueron muy prometedores por el hecho de que
nuestras clases 2D e incluso el modelo 3D preliminar, entreveían el modelo de unión entre
las proteínas propuestas, hay varios aspectos que tienen que ser perfeccionados para poder
seguir con el proyecto e intentar dilucidar la estructura tridimensional a resolución
atómica de la PKCα.
El principal escollo que hay resolver es la preparación de rejillas. Se tiene que

intentar reproducir las condiciones iniciales en las que conseguíamos una distribución de
294
ELECTRÓNICA.
hielo con el gradiente perfecto. Esto ayudaría a definir múltiples áreas de recolección de
datos que faciliten la disposición de un gran número de partículas iniciales con la calidad
idónea para empezar con el material de partida más propicio. Esto, es una condición
fundamental puesto que no hay que olvidar que, nuestro complejo proteico es altamente
asimétrico y además puede estar formando varios estados intermedios de interacción con
su sustrato. Lo que se traduce en la necesidad de un enorme número de partículas
correspondientes a cada clasificación 2D que represente cada posible orientación de
nuestro complejo proteico asimétrico y con sus varios intermedios de interacción posibles
a lo largo de los 360º en el espacio. De esta forma, el análisis final conseguiría ensamblar
todas las piezas en el puzle que compone nuestra estructura del complejo proteico entre
PKCα y Fascin1 de la forma más precisa posible
Aunque nuestro complejo proteico es muy probable que esté adoptando diversas
conformaciones, esto no debería ser un problema a la ahora de determinar su estructura
siempre y cuando se recojan las suficientes micrografías que tengan un número lo
suficientemente representativo de partículas que representen cada una de las posibles
conformaciones. De hecho, este tipo de reconstrucciones ya se han realizado previamente
en diversos ejemplos en la bibliografía (Lee et al., 2019).
No hay que olvidar tampoco que nuestro complejo proteico de 130 kDa se puede
considerar una proteína bastante pequeña. Hasta la fecha, aunque hay ejemplos en la
bibliografía de proteínas de menor peso molecular (< 50 kDa) para las que se han resuelto
sus estructuras a nivel atómico, realmente solo se han resuelto menos de 20 estructuras
para proteínas con un peso molecular inferior a 100 kDa. Esto supone un gran reto y a la
misma vez añade aún mayor valor añadido a la resolución de nuestro complejo proteico
que debido a su importancia fisiológica supondría un hito estructural y un gran avance
para la ciencia y la propia técnica de la CryoEM (Fan et al., 2019; Liu et al., 2019; Wu &
Lander, 2020; Zhang et al., 2019).
El uso del Volta Phase Plate (VPP) podría ser una mejora para tener en cuenta,
puesto que en la bibliografía se ha visto su efectividad en la determinación estructural de
proteínas de pequeño tamaño (Khoshouei et al., 2017; Khoshouei et al., 2016). El uso del
VPP tiene un papel fundamental en la mejora de la calidad de la imagen. Puede introducir
295
ELECTRÓNICA.
un cambio de fase extra a la función de transferencia de contraste (CTF) de la lente

objetivo. Así, aumentando la señal de baja frecuencia de los objetos de fase débil como
en este caso las proteínas pequeñas congeladas y facilitando la observación de estos
objetos de fase débil con una mejora muy importante en el contraste. Debido a ello, el
VPP introduce una mejoría importante en la CryoEM para pequeñas moléculas
favoreciendo la determinación de su estructura (Danev & Baumeister, 2016; Danev et al.,
2014; Herzik et al., 2019).
Otro enfoque que se podría implementar para la determinación de la estructura de

las proteínas de fusión tal como ya se ha comentado en el apartado de XL-MS, es el
empleo de entrecruzadores, como BS3. En este caso, no para posteriormente digerir la
proteína en péptidos y someterlos a MS para estudiar las uniones entre las proteínas, pero
sí para añadirlo a la mezcla proteica previa a la preparación de las rejillas de CryoEM de
modo que se pueda fijar y estabilizar esa unión que parece tan transitoria entre ambas
proteínas PKCα y Fascin1 (Chen et al., 2018; Ser et al., 2019).
Tampoco hay que olvidar que en la literatura se encuentran diversos ejemplos que
demuestran que la base de oro de las rejillas mejoran sobremanera la estabilidad de la
muestra y el movimiento de la misma inducido por el haz de electrones (Russo &
Passmore, 2014). Así como también, se ha visto que la recubierta de las rejillas con una
nanocapa de grafeno mejora notablemente la calidad de la señal obtenida, concretamente
en el caso del empleo de proteínas pequeñas como en nuestro caso (Han et al., 2020). De
modo que, es importante fijarnos en estos detalles relacionados con el tipo de rejillas
empleadas para futuras preparaciones.
Por otra parte, también se podría intentar fusionar nuestra quinasa de interés a otra
proteína que se demuestre por técnicas biofísicas que presenta una gran afinidad por las
PKCs y a ser posible que fuese una proteína más grande, de modo que, una vez formado
el complejo, superara con creces el tamaño que nuestras proteínas de fusión presentan
(130 kDa). El empleo de grandes proteínas de estructura conocida usadas como andamiaje
para la determinación de proteínas pequeñas que se han expresado fusionadas a ellas, ya
se ha empleado con éxito en la literatura para proteína más pequeñas de 50 kDa (Chiu et
al., 2021; Liu et al., 2019; Wu & Rapoport, 2021; Yeates et al., 2020).
296
CAPÍTULO VII. ESTUDIO DE LA UNIÓN
ENTRE FASCIN1 Y F-ACTINA POR MEDIO
DE TOMOGRAFÍA CRIOELECTRÓNICA
(CRYO-ET).
CAPÍTULO VII. ESTUDIO DE LA UNIÓN ENTRE FASCIN1 Y F-ACTINA POR
MEDIO DE TOMOGRAFÍA CRIOELECTRÓNICA (CRYO-ET).
1 INTRODUCCIÓN.
Como se ha comentado en la introducción, Fascin1 es una proteína con un papel

fundamental en el funcionamiento del citoesqueleto. Éste tiene un papel muy importante
en las células en un gran numero de procesos celulares como migración, endocitosis y
división. En todos ellos, las células usan proteínas accesorias tales como Fascin1 para
regular la dinámica espacio-temporal de polimerización de los filamentos de F-actina y
microtúbulos y así controlar la función celular adecuada (Jayo & Parsons, 2010; Lamb &
Tootle, 2020).
Todavía queda por entender el mecanismo completo de interacción entre F-actina

y Fascin1. Se sabe que existen dos regiones importantes de Fascin1 situadas en N-
terminal y C-terminal de la proteína y que facilitan la eficacia de entrelazamiento entre
los filamentos adyacentes de F-actina. Estos entrecruzamientos por parte de Fascin1
producen, a partir de filamentos flexibles de F-actina, unidades rígidas y ordenadas de
estos filamentos que se encuentran en las fibras de estrés y filopodios, entre otras
estructuras (Adams, 2004; Ono et al., 1997; Tilney et al., 1998).
Por medio de técnicas bioquímicas y estructurales se han podido determinar los

sitios principales de interacción entre Fascin1 y F-actina (Yang et al., 2013). Estos sitios
de interacción son los siguientes (Figura VII.1):
-Sitio 1 de interacción. Está formado por residuos pertenecientes al dominio 1 y

al dominio 4 de Fascin1 (los aminoácidos K22, K43, R398 juegan un papel muy
importante).
-Sitio 2 de interacción. Está constituido por aminoácidos localizados en el

dominio 1 y dominio 2 de Fascin1 (los residuos K150, R151, K313 tienen
funciones fundamentales)
299
-Sitio 3 de interacción. Con menor importancia en la unión y que está formado

por residuos ubicados en el dominio 3 de Fascin1 (los residuos R271, K353, K358
tienen una función importante en este sitio 3).
Figura VII.1. Se muestra en la representación tridimensional de la proteína Fascin1, los 3 sitios de unión a
F-actina. Algunos de los aminoácidos demostrados como fundamentales e implicados en cada sitio de unión
se representan a modo de esferas rojas para el sitio de unión a F-actina 1 (K22, K43 y R398), esferas
magentas para el sitio de unión a F-actina 2 (K150, R151 y K313) y esferas cian para el sitio de unión 3
(R271, K353 y K358). PDB (1DFC). Imagen realizada por medio del software PyMOL.
La tomografía por medio de criomicroscopía electrónica (CryoET) se presenta

como una herramienta fundamental para poder determinar la estructura tridimensional de
macroestructuras biológicas tales como los filamentos de F-actina, en este caso en
conjunción con la proteína Fascin1 (Turk & Baumeister, 2020).
La actina aparece de forma despolimerizada en forma de monómeros globulares

(G-actina) y polimerizada en forma de filamentos (F-actina). Los filamentos de F-actina
300
son polímeros polares que forman una doble hélice con un giro a derechas y dos extremos
que son dinámicamente diferentes denominados extremo barbed (+), que es el extremo
por el que crece y se alargan los filamentos, y, por otro lado, extremo pointed (-) que
funciona como el extremo de nucleación o inicio. En este proceso de elongación la G-
actina es activada por unión a ATP y una vez que se produce la polimerización tiene lugar
la hidrólisis del ATP, mientras que el ADP permanece fuertemente unido. Este proceso
es asistido por diversas proteínas tales como el complejo ARP-2 y ARP-3. La dinámica
de polimerización es mucho más rápida en el extremo barbed (+) que se conoce también
como el extremo de crecimiento rápido. Debido a que el proceso de polimerización es
exotérmico, esto puede proveer la energía necesaria para que una célula avance en su
medio. Las principales formas de distribución de unos filamentos de actina con respecto
a otros descritas en la bibliografía son: paralela, antiparalela y formando una organización
entrecruzada de estos filamentos. En cada uno de estos modos de disposición intervienen
diversas proteínas que permiten dicha disposición de F-actina (Blanchoin et al., 2014;
Carlsson, 2010).
Como en este caso los filamentos de F-actina solapan unos con otros en paquetes
distribuidos tridimensionalmente, la única manera de poder determinar la estructura 3D
de estas moléculas a nivel atómico, es por medio de CryoET. Mediante tomografía, se
pueden recoger tomogramas en diferentes planos del espacio tridimensional a diferencia
de la CryoEM. Esto convierte a la CryoET en una técnica muy empleada para estudiar la
estructura de complejos celulares en células completas criogenizadas (Wan & Briggs,
2016).
La biología estructural, de forma tradicional ha resuelto la estructura de diversos

complejos celulares de una manera reduccionista en la que componentes celulares
moleculares son fraccionados y estudiados por separado, antes de ponerlos en un contexto
más complejo. Ahora, con la técnica de CryoET, se pueden estudiar de forma directa
macrocomplejos celulares tales como los filamentos de actina (Turk & Baumeister,
2020).
301
Este trabajo se realizó en colaboración con el profesor Dr. Juha Huiskonen y la

persona colaboradora de su laboratorio, el Dr. Selvaraj Muniyandi. Ambos pertenecientes
a la Universidad de Helsinki, instituto Life science HiLIFE.
2 RESULTADOS.
2.1 FASCIN1-S39D CON ACTIVIDAD NO NUCLEADORA COMO CANDIDATA

A INTERACCIONAR CON LOS FILAMENTOS DE F-ACTINA PARA
ESTUDIAR EL MODELO DE UNIÓN ENTRE F-ACTINA Y FASCIN1.
La unión de Fascin1WT a los filamentos de F-actina genera un entrecruzamiento

que forma grandes haces tridimensionales de fibras de F-actina que dificultan en gran
medida el estudio de las interacciones moleculares entre ambas moléculas a nivel atómico
(Figura VII.2) (Jansen et al., 2011). Para llevar a cabo el estudio estructural de la unión
Fascin1-F-actina, es necesario decorar los filamentos de F-actina con unidades de Fascin1
que se unan de forma discreta y no generen grandes haces tridimensionales de F-actina.
Pensamos que inhibiendo uno de los dos sitios principales de unión de filamentos
de F-actina en Fascin1, podríamos obtener dicho efecto basándonos en los resultados
previos obtenidos por el grupo de Jansen y colaboradores (Jansen et al., 2011). De esta
forma, se generaría un entrecruzamiento menos potente como el que se muestra en la
Figura VII.2, que proporcionaría haces de fibras de F-actina menos gruesos y ordenados
que permitirían aplicar las técnicas de CryoET para así determinar el mecanismo
molecular de la interacción entre estas dos moléculas.
302
Figura VII.2. Micrografía de CryoEM para F-actina junto con Fascin1WT. Se pueden observar paquetes de
F-actina muy densos que dificultarían el estudio estructural de la unión de Fascin1 a F-actina. En la zona
de la izquierda se muestra una región con baja amplificación y en la zona de la derecha a gran amplificación,
las flechas blancas están indicando unidades de Fascin1 (Jansen et al., 2011).
En primer lugar, generamos el mutante Fascin1-S39D, una sustitución

fosfomimética que simula la fosforilación del residuo S39 por la proteína PKCα
(Yamakita et al., 1996), con el objetivo de bloquear la interacción del sitio 1 y dejar
intactas las interacciones del sitio 2 y el sitio 3 con F-actina.
Las imágenes de CryoET mostraron filamentos de F-actina extendidos y

distribuyéndose de forma individual. No se observaron haces de F-actina organizados en
paquetes (Figura VII.3).
Figura VII.3. Primera imagen recolectada por medio de CryoET mediante el empleo del mutante de
Fascin1-S39D. Se observa una gran cantidad de ruido de fondo, que se podría atribuir a las moléculas de
Fascin1 libres que no se unen a los filamentos de F-actina. Los filamentos de F-actina se observan muy
claramente. 200 kV TEI Talos Artica TEM.
303
Posteriormente, se llevó a cabo la selección de filamentos por medio del software

Scipion (de la Rosa-Trevín et al., 2016) y se realizó después el análisis de las
clasificaciones 2D obtenidas. Para ello, se tomaron un total de 100 micrografías con
aproximadamente 9000 filamentos seleccionados para el análisis. Después de procesar
las micrografías por medio de MotionCor2 y CTFFIND4, se realizó la clasificación 2D.
En todas las clasificaciones que nos ofreció el procesado de datos por medio de Scipion
daba la impresión de que se obtenían unidades de F-actina desnudas sin las decoraciones
de Fascin1 que esperaríamos ver si estuvieran interaccionando con los filamentos a través
de únicamente los sitios de unión 2 y 3. Las clasificaciones 2D, eran clases de alta calidad
puesto que se observaban los filamentos de F-actina en un fondo totalmente negro y en
estos filamentos se podían ver detalles de la estructura secundaria de los filamentos de F-
actina (Figura VII.4).
Figura VII.4. Análisis 2D de las diversas clasificaciones que se obtuvieron en el procesado de filamentos
seleccionados para el mutante de Fascin1-S39D. Scipion.
De las 25 clasificaciones 2D obtenidas, nos quedamos con las 20 primeras,

representadas en la Figura VII.4, que contenían un total de 8000 partículas. Con todas
304
ellas, se realizó una clasificación 3D generando 3 clases 3D diferentes, seleccionando de

ellas la que contenía 5000 partículas totales. Con estas partículas pertenecientes a la mejor
clasificación 3D, se llevó a cabo un refinamiento del modelo 3D del complejo. A
continuación, se muestra la reconstrucción preliminar del modelo (7 Å), en el que los
filamentos de actina no aparecían decorados con unidades de Fascin1 (Figura VII.5).
Puesto que quedaba claro que Fascin1 no se encontraba unida en la estructura, no se
realizó mayor refinado ni procesamiento del modelo más que el modelo 3D primario que
se muestra en la Figura VII.5.
Cabe destacar que los métodos para el procesamiento de datos, se llevaron a cabo
de una manera muy semejante a los que se realizaron para la publicación en la que se
determinó la estructura de F-actina junto con tropomiosina, tal y como se describen en el
apartado de materiales y métodos (von der Ecken et al., 2015).
Figura VII.5. Modelo 3D para un filamento de F-actina a una resolución de 7 Å. No se encontraron

unidades de Fascin1 unidas a los filamentos. Refinamiento realizado por medio de Scipion.
Es importante señalar que todavía cabía la posibilidad de que la unión fuera tan
baja a causa de la baja afinidad que presentaría el mutante S39D que, debido a ello, las
moléculas de Fascin1 decorando la F-actina no se observara en las clasificaciones 2D
305
puesto que estas clases representan un promedio del comportamiento global de todas las
imágenes recogidas.
Asumiendo esta última hipótesis, todavía podría obtenerse información de la

interacción entre ambas moléculas llevando a cabo una clasificación más focalizada,
intentando dividir los monómeros de F-actina que contienen Fascin1 unida de los que no
la presentan unida. Sin embargo, después de llevar a cabo esta estrategia, no se encontró
ninguna molécula de Fascin1 unida a F-actina.
2.2 OTROS MUTANTES DE FASCIN1 CON ACTIVIDAD NO NUCLEADORA

COMO CANDIDATOS A DECORAR LOS FILAMENTOS DE F-ACTINA PARA
ESTUDIAR EL MODELO DE UNIÓN ENTRE F-ACTINA Y FASCIN1.
Debido a que con el mutante de Fascin1 S39D no se consiguió obtener la unión

de Fascin1 a F-actina que se deseaba, se probaron otros mutantes intentando determinar
esta interacción basándonos en el trabajo publicado por el grupo de Jansen y
colaboradores (Jansen et al., 2011).
Para ello se generaron los siguientes mutantes:
- Mutante A (sitio 2), con los siguientes residuos mutados: K150E, R151E y K313E
(Figura VII.6).
- Mutante B (sitio 3), con los siguientes residuos mutados: R271E, K353E y K358E
(Figura VII.7).
306
Figura VII.6. Micrografía de CryoEM para F-actina junto Fascin1 Mutante A (sitio de unión a F-actina 2,
no activo). Se pueden observar paquetes de F-actina menos densos que en el caso de Fascin1WT, en el cual,
sería más sencillo el estudio del modelo de unión entre ambas moléculas por medio de CryoET. En la zona
de la izquierda se muestra una región a baja amplificación y en la zona de la derecha a gran amplificación.
Las flechas blancas indican unidades de Fascin1 (Jansen et al., 2011).
Figura VII.7. Micrografía de CryoEM para F-actina junto Fascin1 Mutante B (sitio de unión a F-actina 3,
no activo). Se pueden observar al igual que nuestro caso experimental para Fascin1S39D que no se forman
paquetes de F-actina y solo se encuentran filamentos individuales a lo largo de la preparación. En este caso,
se observan moléculas de Fascin1 unidas a F-actina que podrían facilitar el estudio de la estructura. En la
zona de la izquierda, se muestra una región a baja amplificación y en la zona de la derecha a gran
amplificación. Las flechas blancas indican la presencia de Fascin1 unida a los filamentos de F-actina
(Jansen et al., 2011).
El mutante A de Fascin1 (K150E, R151E y K313E), presentaba residuos mutados

localizados en el sitio de unión 2 a F-actina, mientras que el mutante B de Fascin1
(R271E, K353E y K358E) presentaba residuos mutados y localizados en el sitio de unión
3 a F-actina. Ambas mutaciones, afectarían a la capacidad de formar entrelazamientos
con los filamentos de F-actina, siendo posibles candidatas para decorar los filamentos de
F-actina de tal manera que permitieran estudiar el mecanismo molecular de esta unión.
307
Desafortunadamente, para el mutante B (R271E, K353E y K358E) fue imposible

conseguir purificar la proteína después de cambiar diversos parámetros en el protocolo
de purificación. Esto se debía a que se perdía la totalidad de la proteína que llegaba a la
separación por medio de cromatografía de exclusión molecular. Sin embargo, sí se
consiguió purificar cantidad suficiente del mutante A de Fascin1 (K150E, R151E y
K313E) para poder formar complejos junto con F-actina.
Esta vez y a diferencia del caso anterior, el residuo de Fascin1 S39 estaría
exhibiendo la actividad empaquetadora y de entrecruzamiento de Fascin1 con F-actina.
En contrapartida, sería el sitio 2 de unión a F-actina del mutante A de Fascin1 (K150E,
R151E y K313E) el que estaría afectado en la actividad nucleadora de filamentos de F-
actina. Esto podía ser suficiente para que el nuevo modelo de interacción permitiera la
unión de Fascin1 a F-actina con una afinidad intermedia que ocasionara un
empaquetamiento de menor número de filamentos, permitiendo así el estudio estructural
mediante CryoET.
Figura VII.8. A) Filamentos de F-actina cuando se observan por medio de cryoEM sin la adición de Fascin1.
B) Cuando se añadía el mutante A de Fascin1 (K150E, R151E y K313E), se ven filamentos de F-actina
organizados de tal manera que indican que Fascin1 está ejerciendo su función nucleadora de forma parcial.
Esto es debido a que los filamentos no se empaquetan de forma tan densa como ocurre con Fascin1WT.
200 kV TEI Talos Artica TEM.
De nuevo, se llevaron a cabo preparaciones en rejillas de CryoEM para estudiarlas

por medio de CryoET. En este caso, con el mutante A de Fascin1 (K150E, R151E y
K313E), se observaron organizaciones de filamentos de F-actina dispuestos de forma
308
estructurada (Figura VII.8B), pero no de forma tan acusadamente empaquetada como

ocurría con la versión silvestre de Fascin1 (Figura VII.2) (Jansen et al., 2011).
Un ejemplo de la distribución en el espacio tridimensional de los filamentos de F-

actina junto con el mutante A de Fascin1 (K150E, R151E y K313E) se muestra en la
Figura VII.9.
Figura VII.9. Se puede ver el plano 3D, desde dos perspectivas diferentes, la reconstrucción de los
filamentos de F-actina con el mutante A de Fascin1 (K150E, R151E y K313E) unida una vez obtenida la
información procedente de diversos ángulos por medio del proceso de tomografía. Los filamentos de actina
se observan organizados tanto de forma paralela como de manera perpendicular entre ellos.
Para las micrografías correspondientes a los filamentos de F-actina ordenados

junto con el mutante A de Fascin1 (K150E, R151E y K313E) (Figura VII.8 B), se realizó
un análisis más en detalle por medio de Scipion (de la Rosa-Trevín et al., 2016). De esta
manera, en primer lugar se realizó la selección de los filamentos de F-actina candidatos a
estar decorados por moléculas de Fascin1 por medio de la herramienta de Scipion Xmipp3
(Figura VII.10).
309
Figura VII.10. Se observa el siguiente paso en el procesado de datos después de obtener las imágenes de
CryoET. Se seleccionan filamentos de una forma extrapolable a como se escogen las partículas tal y como
se comentó anteriormente en el apartado correspondiente de CryoEM. Scipion.
Sin embargo, tras realizar la clasificación 2D con Scipion, no se detectaba Fascin1

con la suficiente calidad unida a los filamentos de F-actina para poder discernirla dentro
de las clases 2D (Figura VII.11). De esta manera, se prepararon nuevas rejillas para su
análisis por medio de CryoET.
Figura VII.11. Se observan las primeras clasificaciones 2D obtenidas después de analizar los datos
obtenidos, a partir de 100 micrografías, que contenían aproximadamente 9000 filamentos seleccionados
para análisis. Scipion.
310
Tras preparar nuevas rejillas con las mismas condiciones y realizar pruebas de
tomografía, seleccionamos regiones mejores en cuanto a la naturaleza del hielo en las
rejillas de CryoET. En estos tomogramas procedentes de la nueva adquisición de datos,
las unidades de Fascin1 eran ahora claramente visibles, tal y como se muestran en las
siguientes micrografías en las que se podían ver por primera vez densidades de Fascin1
interactuando con los filamentos de F-actina (Figura VII.12). Los datos relativos a la
recolección de los filamentos se muestran en la Tabla VII.1.
Figura VII.12. Nuevos tomogramas correspondientes a las muestras de F-actina junto con el mutante A de
Fascin1 (K150E, R151E y K313E) donde se puede observar de manera más clara las densidades de Fascin1
interconectando los filamentos de F-actina. Algunos ejemplos de las densidades de Fascin1 apreciadas para
las micrografías mostradas, se marcan con flechas blancas. 200 kV TEI Talos Artica TEM.
El proyecto, actualmente se encuentra en esta fase, en la que se requiere poner a

punto un protocolo adecuado de procesado de datos (sub-tomogram averaging de los
segmentos de filamentos). Además, debido a estos datos preliminares tan prometedores,
311
en la siguiente fase de procesamiento, se tiene que coleccionar datos con microscopios

más avanzados como Titan Krios (300 kV) usando detectores Gatan K3 junto con
BioQuantum o Falcon 4 junto con Selectris.
Tabla VII.1. Datos relativos a la colección de datos y estadísticas de los filamentos.

Colección de datos
Magnificación 120kx
Rango de desenfoque (µm) 0.8-2.6
Voltaje (kV) 200
Microscopio Talos Artica FEI
Cámara Falcon 3
Tiempo de grabación por frame 0.085-0.5
Número de frames 7
- 2
Dosis de electrones (e Å ) 16
Tamaño de píxel (Å) 0.98
Estadísticas de las partículas
Filamentos 9000
Box size (px) 256
Boxing distance (px) 20
Rise (Å) 27.5
Azimuthal roation (º) 166.4
3 DISCUSIÓN.
Los primeros ensayos llevados a cabo con el mutante de Fascin1 S39D, mostraron
fibras de F-actina sin Fascin1 unida. Esto indica que la inhibición del sitio 1 de Fascin1 a
F-actina por medio de la fosforilación del residuo S39 por PKCa, desactiva por completo
el sitio 1 de Fascin1, dejando solo el sitio de unión 2. Además, este sitio de unión 2, no
es suficiente por sí solo para promover la unión con fuerza de Fascin1 a F-actina, como
se puso de manifiesto al no observarse unida Fascin1 a los filamentos de F-actina en las
micrografías obtenidas experimentalmente (Figura VII.3). Indicando así, un papel crítico
del sitio de unión 1 de Fascin1 a F-actina.
De esta manera la fosforilación de la serina 39 o la sustitución de la serina 39 por

un residuo aspártico, que estaría emulando un estado fosfomimético, inhibe la actividad
de unión y empaquetamiento de F-actina en el sitio 1, dejando únicamente el sitio 2 de
312
unión activo. De la misma forma, cabe destacar que en la bibliografía está descrito que
se obtendría el mismo resultado empleando Fascin1-WT junto con el inhibidor
macroketona. Este inhibidor se une de manera específica al sitio 1 de interacción de
Fascin1. También existe otro inhibidor, denominado G2, que de la misma forma
interacciona con el área que rodea el residuo S39 localizado en el sitio de unión 1,
causando el mismo efecto. Estos fármacos se han probado eficaces tanto en cultivos
celulares in vitro como con animales modelo para ser capaces de bloquear la migración,
la invasión y metástasis de células tumorales de diversa índole (L. Chen et al., 2010; Han
et al., 2016; Huang et al., 2015; Zhao et al., 2021). Estudios estructurales por medio de
cristalografía de rayos X, muestran que cambios conformacionales en el caso del fármaco
G2 son el causante de que Fascin1 pierda su capacidad empaquetadora (Huang et al.,
2018; Wang et al., 2020).
Como ya se ha comentado anteriormente, en la bibliografía está descrito que la

fosforilación de la serina S39 por medio de PKCα causa una disminución en la función
nucleadora de Fascin1. Esto tendría sentido pues al inhibir una de las dos regiones
fundamentales de unión de Fascin1 con F-actina (región 1 de unión), su capacidad de
interaccionar con los filamentos de F-actina se vería reducida (sólo quedaría el sitio 2
activo) y por ello perdiendo capacidad de formar paquetes de F-actina (Anilkumar et al.,
2003).
Posteriormente, tras probar el mutante A (K150E, R151E y K313E) que presenta

mutaciones en el sitio 2 de Fascin1 de unión a F-actina, se observaron paquetes de F-
actina discretos (Figura VII.8) y no tan acumulados como ocurre cuando se emplea
Fascin1-WT (Figura VII.2). A diferencia del mutante S39D afectando al sitio de unión 1,
en este caso sí se producía una unión de Fascin1 a F-actina, observado por medio de
CryoET. No obstante, el hecho de no presentar el sitio de unión 2 activo por medio de las
mutaciones, hacía que su capacidad nucleadora disminuyera considerablemente en
comparación con Fascin1-WT junto con los filamentos de F-actina (Figura VII.12). Hasta
la fecha no hay ejemplos en la bibliografía de fármacos con un método de actuación
mediante su unión selectiva a este sitio de 2 de unión de Fascin1 a F-actina.
313
Esto, por tanto, indicaba que Fascin1 estaba uniéndose y organizando los
filamentos de F-actina de manera discreta para poder ser estudiados estructuralmente a
través de Cryo-ET (Figura VII.8). En general, se puede decir que la unión de Fascin1-
WT a F-actina se está produciendo debido a que se encuentran paquetes ordenados de F-
actina, así como se observa dicha unión en las clasificaciones 2D, pero la calidad de la
colección de datos no es suficientemente buena para detectar la interacción entre ambas
proteínas a nivel atómico.
Por otro lado, se llevó a cabo una predicción bioinformática de los posibles
modelos estructurales de unión entre Fascin1-WT (PDB: 3LLP) junto con los filamentos
de F-actina (PDB: 5OOE). El refinamiento y la minimización de la energía de los
complejos se realizó por medio del software ClusPro, mediante ejecuciones secuenciales
(Kozakov et al., 2017).
Dentro de los posibles modelos de interacción de Fascin1-WT junto con F-actin

obtenido por medio de ClusPro, el más importante que se determinó fue el modo de unión
paralelo (Figura VII.13). Además, excepcionalmente hemos encontrado otras
disposiciones como la perpendicular (Figura VII.16) y anti-paralela (Figura VII.17) que
podrían formarse en menor medida.
Figura VII.13. Modelo de unión paralelo entre Fascin1WT y F-actina. Modelo obtenido por medio de
ClusPro. Imagen realizada por medio de PyMOL.
314
Estos modos de disposición de los filamentos de actina han sido estudiados en la

bibliografía en presencia de diversas proteínas accesorias. Sin embargo, el papel exacto
de Fascin1 en los modelos en los que participa aún queda por esclarecerse y hasta la fecha
solo se le ha encontrado una función en la interacción con F-actina formando
disposiciones paralelas y perpendiculares (Blanchoin et al., 2014; Elkhatib et al., 2014;
Hartwig et al., 1980; Hashimoto et al., 2011).
La predicción del modelo de interacción paralelo (Figura VII.13) parece encajar

con el modo de unión entre el mutante A de Fascin1 (K150E, R151E y K313E) y F-actina
que se observa en las micrografías obtenidas experimentalmente (Figura VII.12).
Este modelo de unión paralelo es el más descrito en la bibliografía para Fascin1,

con un papel fundamental en la formación, mantenimiento y estabilidad de filopodios
(Elkhatib et al., 2014).
Si se analiza en detalle la forma en la que interacciona el mutante A de Fascin1

(K150E, R151E y K313E) y F-actina, obtenido experimentalmente por medio de Cryo-
ET, se puede ver como las unidades de Fascin1 se unen a F-actina, pero no de forma
paralela y alineada en el plano. Esta unión de las moléculas de Fascin1 a los filamentos
de F-actina guardan cierto ángulo en la unión entre las unidades de esta proteína
empaquetadora, siendo muy similar al patrón de unión observado en el modelo obtenido
por medio de ClusPro (Figura VII.14).
315
Figura VII.14. Modelo de interacción paralelo entre Fascin1WT (azul) y F-actina (verde y amarillo) (A)
junto con una micrografía de CryoET donde se observa como el mutante A de Fascin1 (K150E, R151E y
K313E) se une a los filamentos de F-actina de la misma manera que se predice por medio de ClusPro (B).
Las flechas azules indican la disposición de las moléculas de Fascin1 entre los filamentos de F-actina (B).
En la zona superior de la micrografía, se enmarca en naranja la región donde se detecta la densidad
correspondiente a las moléculas de Fascin1 interaccionando con F-actina. Estas unidades se van observando
de manera repetida a lo largo de las fibras de F-actina (B).
Es importante señalar que, en comparación con los principales residuos

propuestos por el grupo de Yang y colaboradores (Yang et al., 2013), en el modelo
paralelo obtenido mediante el uso de ClusPro (Figura VII.14), solo los aminoácidos R68,
E81, R82 y E83 para el sitio de unión 1 (Figura VII.15.A), el residuo S328 para el sitio
de unión 2 (Figura VII.15.B) y los aminoácidos R271 y K358 para el sitio de unión 3
(Figura VII.15.C) muestran una orientación y proximidad adecuadas para poder
interactuar con la superficie de F-actina. De todos esos residuos, R271 y K358 para el
sitio de unión 3, son los únicos con evidencia en la bibliografía de tener un efecto en la
actividad nucleadora de F-actina cuando el grupo de Yang realizó mutagénesis dirigida
(Yang et al., 2013). Estos resultados siguen siendo compatibles en el sentido de que la
mutagénesis de algunos aminoácidos, aunque no estableciendo contactos directos entre
las superficies de ambas moléculas, podría afectar a la interacción Fascin1-F-actina de
forma indirecta.
316
Figura VII.15. Se muestran los residuos en el modelo obtenido por ClusPro que están dispuestos en una
orientación y proximidad para que la interacción con la F-actina sea posible. A) Para el sitio de unión 1, los
residuos de Fascin1 R68, E81, R82 y E83 pueden interactuar con los residuos de F-actina E224 y N225. B)
Para el sitio de unión 2, sólo el aminoácido S328 de Fascin1 es capaz de interactuar con E100 en F-actina.
C) Finalmente, para el sitio de unión 3 los aminoácidos R271 y K358 pertenecientes a Fascin1 pueden
interactuar con Y143 y D25 respectivamente en la F-actina.
La distribución perpendicular (Figura VII.16) obtenida en ClusPro también se

observó experimentalmente tal y como puede verse en los haces de F-actina que se
entrecruzan dentro del espacio tridimensional ilustrado en la figura VII.9. Se describen
diversos ejemplos en la bibliografía donde se encuentran estas disposiciones de F-actina
con Fascin1 como proteína accesoria (Blanchoin et al., 2014; Hartwig et al., 1980)
317
Figura VII.16. Modelo de unión perpendicular entre Fascin1WT y F-actina. Modelo obtenido por medio de
Aunque el modelo de unión anti-paralelo se haya descrito en la bibliografía

apoyado por diversas proteínas accesorias (Blanchoin et al., 2014), en nuestros datos
experimentales no tuvimos evidencia de observarlo y hasta la fecha no se ha asociado
Fascin1 con este tipo de distribución.
Figura VII.17. Modelo de unión anti-paralelo entre Fascin1WT y F-actina. Modelo obtenido por medio de
318
CAPÍTULO VIII. RESCATE Y
REPOSICIONAMIENTO DE FÁRMACOS
QUE SE UNEN AL BOLSILLO DE UNIÓN
A PIP2 EN EL DOMINIO C2 DE PKCα.
CAPÍTULO VIII. RESCATE Y REPOSICIONAMIENTO DE FÁRMACOS QUE SE
UNEN AL BOLSILLO DE UNIÓN A PIP2 EN EL DOMINIO C2 DE PKCα.
1.- INTRODUCCIÓN.
Uno de los principales problemas a los que nos enfrentamos hoy en día en la
terapia de enfermedades relacionadas con las PKCs, tales como el cáncer de mama, es el
hecho de no disponer de fármacos eficaces contra las diversas dianas terapéuticas
localizadas en las isoenzimas de la familia de las PKCs. Como se ha comentado en la
introducción, uno de los mayores inconvenientes que existen en el desarrollo de fármacos
contra este tipo de quinasas, es la falta de especificidad que hace que muchos de los
compuestos químicos desarrollados hasta el momento no sean totalmente específicos en
su actuación contra determinadas isoenzimas de estas proteínas que guardan un alto grado
de homología de secuencia entre todas ellas (Carter & Kane, 2004; Hofmann, 2004; Irie
et al., 2005; Kazanietz, 2005; Mochly-Rosen et al., 2012).
Una estrategia que se propone en este capítulo para intentar buscar compuestos
químicos específicos de PKCs, es el reposicionamiento de fármacos junto con el diseño
bioinformático específico del compuesto rescatado, haciendo uso de la información
estructural disponible de este y/o de su diana (Ashburn & Thor, 2004; Xue et al., 2018).
Así, una vez rescatado un compuesto ya existente que se determine por medio de métodos
biofísicos y/o celulares que es capaz de unirse a una determinada región de una isoenzima
concreta de las PKCs, junto con la información estructural disponible hasta el momento
en el PDB de su región diana, se podría modificar y diseñar el fármaco de tal manera que
su especificidad fuera lo más alta posible.
El reposicionamiento y rescate de compuestos con una actividad farmacológica,

se está proponiendo como un método eficaz para intentar buscar fármacos que sean
capaces de reconocer determinadas dianas. Esta estrategia de reposicionamiento ha estado
avanzando mucho en los últimos años y, en estos tiempos de la pandemia de COVID-19,
ha recobrado aún más fuerza en la búsqueda de compuestos químicos eficaces en la lucha
contra el virus de forma paralela en la que se desarrollan vacunas de diversa índole
(Benavides-Cordoba, 2020; Serafin et al., 2020).
321
El rescate de fármacos consiste en el estudio de compuestos químicos que ya han
sido aprobados o bien que se han quedado sin llegar a una fase final, en algún punto
intermedio de los ensayos clínicos para el tratamiento de diversas enfermedades y que se
investigan si pudieran ser adecuados para el tratamiento de otras alteraciones. Para ello,
se hace uso de grandes librerías y diversas bases de datos que contienen multitud de
compuestos que han sido probados por farmacéuticas y grupos de investigación en todo
el mundo y que en su mayoría no han resultado positivas para su objetivo principal, pero
pueden resultar útiles a la hora de buscar una diana terapéutica diferente (Pushpakom et
al., 2019; Xue et al., 2018).
Este enfoque del reposicionamiento de fármacos es efectivo por diversos factores.

El principal de los motivos es que un único compuesto es capaz de interaccionar con
diversas dianas, que por ello pueden encontrarse en diversos tipos de proteínas diferentes.
Otro motivo es, que dianas asociadas con una enfermedad o proceso biológico, son a su
vez muy a menudo relevantes para un gran número de procesos biológicos diferentes.
Además, muchos de estos fármacos ya se han mostrado seguros en ensayos preclínicos
con animales modelo e incluso con humanos. De esta manera, si alguno de estos
compuestos resultase positivo para su nueva diana, se ahorrarían pasos importantes en los
ensayos clínicos y de seguridad, reduciendo todo el coste económico que ello conlleva.
Tiempo que se podría dedicar de forma exclusiva al diseño bioinformático del fármaco
para hacerlo más eficaz y específico en su mecanismo de unión a su diana (Pushpakom
et al., 2019).
El reposicionamiento se puede realizar principalmente de dos maneras diferentes.

Una es teniendo un compuesto, buscar un nuevo sitio diana que sea capaz de reconocer.
El otro enfoque, al contrario, es teniendo una diana conocida, buscar un nuevo fármaco
que la reconozca de forma eficaz (Pushpakom et al., 2019).
En este apartado, nos vamos a enfocar en el rescate y reposicionamiento de

fármacos que tengan como diana el bolsillo de unión a fosfoinosítidos del dominio C2 de
la proteína PKCα. Dicho dominio se conoce que media un papel fundamental en la
activación de las PKCs por medio de su unión a la membrana donde el fosfoinosítido
PIP2, fosfolípido aniónico fosfatidilserina (PS) e iones calcio juegan un papel clave para
322
favorecer una conformación catalíticamente activa, unirse a membrana y realizar sus
funciones aguas abajo por medio de la fosforilación de diversos sustratos (Figura VIII.1)
(Corbalán-García et al., 2003; Verdaguer et al., 1999).
Figura VIII.1. Estructura tridimensional del dominio C2 de PKCα. Se muestra el bolsillo de unión a PIP2,
una región rica en residuos lisina (LRR), donde se encuentran 3 lisinas muy conservadas (K197, K209 y
K211, sus cadenas laterales están representadas en azul oscuro) localizados en las láminas β3 y β4 del
dominio C2. Sobre el bolsillo está representada la cabeza de fosfato de la molécula PIP2 (molécula
representada en verde, naranja y rojo). Este bolsillo, se mantiene candidato a ser el sitio de unión a los
fármacos que intentamos reposicionar. Las 3 esferas amarillas en el extremo de la derecha representan 3
iones calcio, localizados en la zona de unión a calcio (CBR), en los lazos CBR1 y CBR3 que interconectan
las láminas beta de la estructura en uno de los extremos del dominio. Estos iones calcio están coordinados
por 5 residuos aspárticos (D187, D193, D246, D248 y D254, representadas sus cadenas laterales en cian)
muy conservados y que juegan también un papel fundamental para unirse a la membrana coordinando
fosfolípidos tales como PS. Junto con el sitio de unión a PIP2, esta región de unión a calcio participa de
forma colaborativa en la unión a la membrana (Corbalán-García et al., 2003; Verdaguer et al., 1999).
Estructura realizada por medio del software PyMOL.
2. RESULTADOS.
2.1 BÚSQUEDA DE FÁRMACOS POR MEDIO DE BASES DE DATOS DE

INTERACCCIÓN FÁRMACO-PROTEÍNA (MTiOpenScreen: iPPI-Lib y Diverse-
Lib).
Para la búsqueda de fármacos que reconocieran el sitio de unión que nos

interesaba, se emplearon las bases de datos iPPI-Lib y Diverse-Lib pertenecientes a
MTiOpenScreen. Esta es una base de datos curada manualmente de forma activa por
323
científicos, que recoge datos fisicoquímicos y farmacológicos de un gran número de
moduladores de interacción proteína-proteína (PPI) y sus dianas hasta la fecha (Labbé et
al., 2016; Labbé et al., 2015; Torchet et al., 2021).
En primer lugar, para llevar a cabo nuestra búsqueda de fármacos, se introdujo en

la base de datos el sitio diana que propusimos, que fue el bolsillo de unión a
fosfoinosítidos del dominio C2 de la PKCα (Figura VIII.1). La base de datos lanzaba una
serie de resultados ordenados con una puntuación (energy) diferente. Así, los primeros
resultados que aparecen en la lista serían los fármacos que por su estructura y propiedades
fisicoquímicas son candidatos para ocupar de mejor manera el bolsillo de unión a PIP2
del dominio C2 de la PKCα.
Tras introducir en la base de datos MTiOpenScreen la región de la proteína sobre

la cual nos interesaba buscar fármacos que fueran potenciales candidatos para
interaccionar con nuestra región problema, esta devolvía una extensa lista, de tal manera
como se muestra en el ejemplo de la tabla VIII.1.
Tabla VIII.1. Se muestra a modo de ejemplo una zona de la lista de resultados, en el caso de la base de
datos iPPI-Lib, de potenciales fármacos que se obtenían tras introducir el dominio proteico diana (bolsillo
de unión a PIP2 del dominio C2 de la PKCα) sobre el que se buscaban posibles compuestos que lo
reconocieran de manera específica. Acompañando cada búsqueda, aparece una fila con una serie de
parámetros importantes relativos a cada fármaco.
En la primera columna de la Tabla VIII.1, aparece el código del compuesto que

introducido en la base de datos PubChem (National Center for Biotechnology
Information), nos ayuda a identificarlo y obtener toda la información disponible relativa
a sus propiedades, estructura, posibles casas comerciales que lo ofrecen para su
adquisición y la información relativa a los ensayos clínicos en los que se ha probado. En
esta primera columna, también se nos indicaba si estos fármacos se trataban de
compuestos intermedio o aceptados. Para los compuestos intermedios, en la mayoría de
los casos apenas habían entrado en los procesos de ensayos clínicos por lo que sería más
difícil encontrar esos fármacos en alguna casa comercial a no ser que se trataran de
324
compuestos químicos de uso común. Mientras que los fármacos aceptados, son
compuestos que bien habían sido aprobados para el tratamiento de alguna enfermedad, o
en la mayoría de los casos compuestos que, aunque no habían pasado a fase final clínica,
habían avanzado hasta algún ensayo preclínico antes de haber sido descartados por su
falta de efectividad en los experimentos en los que se probaron.
Otros parámetros importantes para los fármacos candidatos a interaccionar con

nuestro dominio C2 y que también aparecen en la tabla VIII.1, son:
- Energy, se trata de la puntuación en la que se ordenan los fármacos en la lista, e

indica cómo de energéticamente favorable sería la unión que se puede generar
entre el modulador y la proteína. En una escala de -10 (mejor modelo de unión
entre el compuesto y la proteína) hasta 0 (peor unión entre el fármaco y su diana).
- nRot, indica el número de uniones químicas en la estructura del fármaco que

pueden rotar.
- La librería de donde proceden estos fármacos (iPPI-lib).
- HBA, numero de puentes de hidrógenos aceptores.
- HBD, número de puentes de hidrógenos dadores.
- LogP que es un indicador del carácter hidrofóbico de la muestra. A mayor valor,

esto indica que la muestra presenta mayor carácter hidrofóbico.
- El peso molecular del fármaco (MW).
- TPSA, indica el área de la superficie polar topológica.
El siguiente paso, fue analizar los fármacos aceptados uno por uno, intentando
seleccionar los fármacos que se situaban en las primeras posiciones de la lista, que serían
los más propensos a reconocer la diana proteica propuesta. Así, se analizaron cual de ellos
325
podían estar disponibles en casas comerciales de tal modo que pudiéramos tener acceso
a su adquisición para poder llevar a cabo los diversos experimentos que posteriormente
se describen en este capítulo.
En el cribado realizado de fármacos candidatos a unirse al sitio del PIP2 del

dominio C2 de PKCα, se seleccionaron y adquirieron en diversas casas comerciales los
compuestos químicos que se muestran en la tabla VIII.2.
Tabla VIII.2. Conjunto de fármacos seleccionados que se pudieron adquirir en diversas casas comerciales.
Aparecen ordenados desde el más probable a reconocer su diana hasta el que obtenía una menor puntuación
en la base de datos. aún así, se procuró que todos los fármacos seleccionados tuvieran puntuaciones
relativamente altas en cuanto a la posibilidad de reconocer su diana en el dominio proteico. Los fármacos
α1 y α2 procedían de la base de datos Diverse-lib, mientras que los fármacos de α3 a α13 pertenecían a la
base de datos iPPI-lib, ambas pertenecientes al conglomerado de MTiOpenScreen (Labbé et al., 2015).
En la siguiente figura, y haciendo uso de Pubchem se muestra la estructura

química para todos los fármacos mostrados en la tabla anterior (Figura VIII.2).
326
Figura VIII.2. Estructura química de todos los fármacos seleccionadas como candidatos a unirse al bolsillo
de unión a PIP2 del dominio C2 de la PKCα, seleccionadas a partir de las bases de datos Diverse-lib (α1 y
α2) e iPPI-lib (α3 a α13).
A nivel estructural, se puede observar que, todos los fármacos desde el fármaco
α1 hasta el fármaco α13 presentan un fuerte componente constituido por anillos
aromáticos. Desde un punto de vista estructural de unión al dominio, podría tener sentido
esta naturaleza de los fármacos ya que en bolsillo de unión a PIP2 también se encuentran
diversos residuos aromáticos cercanos (Y195, W245 y F255). Sobre estos residuos
aromáticos se podrían apilar los grupos aromáticos pertenecientes a los fármacos, como
se muestra en la Figura VIII.3.
327
Figura VIII.3. Se observan aminoácidos aromáticos, localizados cerca del bolsillo de unión a PIP2 del
dominio C2 de PKCα sobre los que sería posible apilar algunos de los grupos aromáticos característicos de
los fármacos seleccionados. Se marcan las cadenas laterales en azul para tirosina 195, rojo para triptófano
245 y magenta para fenilalanina 255. Estructura realizada por medio del software PyMOL.
2.2 DETERMINACIÓN DE LA UNIÓN DEL DOMINIO C2 DE PKCα A LA

MEMBRANA POR MEDIO DE ENSAYOS BIOFÍSICOS Y ENSAYOS
CELULARES.
El principal objetivo fue determinar por medio de algún método biofísico o celular
si los fármacos eran capaces de interaccionar con el bolsillo del PIP2 y si ello tenía algún
efecto en la unión del dominio C2 de PKCα a la membrana lipídica. Para ello, se
realizaron ensayos de FRET, sedimentación lipídica, perfusión acoplada a microscopía
confocal y cristalografía de rayos X.
2.2.1. ENSAYOS DE FRET PARA ESTUDIAR LA UNIÓN DE FÁRMACOS AL

DOMINIO C2 DE PKCα.
El primer ensayo biofísico que se realizó para determinar si estos fármacos podían
tener una función mediante la unión al bolsillo de PIP2 del dominio C2 e impedir la unión
del dominio a la membrana, fueron experimentos de transferencia de energía de
resonancia de fluorescencia (FRET).
328
En estos ensayos de FRET se elaboraron vesículas donde se incorporaba el
fosfolípido fluorescente DHPE Forte Blue (1,2-Dihexadecanoil-sn-Glycero-3-
Fosfoetanolamina). Las vesículas tenían una composición lipídica adecuada para que
interaccionaran con el dominio C2 de la PKCα. Concretamente, estaban constituidas por
POPC, POPS, PIP2 y DHPE en una proporción 68:25:5:2. De esta manera, se cuantificaría
la transferencia de energía entre los propios triptófanos de la proteína y el fosfolípido
fluorescente DHPE.
Estos ensayos de FRET eran posibles debido a que se diseñaron para que los
espectros de emisión y excitación del triptófano y el DHPE solaparan tal como se describe
en los materiales y métodos de forma gráfica.
De esta manera, para los ensayos control en las cubetas de cuarzo de medida de
fluorescencia, en ausencia de vesículas que contienen el DHPE, si se excita la proteína
por sí sola a 280 nm (excitación de los aminoácidos aromáticos), el pico de emisión de
fluorescencia de los triptófanos a 355 nm era máximo. Sin embargo, a medida que se
añaden concentraciones crecientes de vesículas lipídicas con DHPE, se producía una
mayor unión de la proteína a la membrana, produciéndose por ello el acercamiento de los
triptófanos de la proteína al DHPE de las vesículas. Así, el pico de emisión de los
triptófanos a 355 nm iría disminuyendo progresivamente con la adición creciente de
vesículas con DHPE, ya que esa energía de emisión de los Trp se estaría donando al
DHPE que se excitaría a 356 nm y ahora, iría aumentando el pico de emisión del DHPE
a 456 nm de forma progresiva con la adición de las concentraciones crecientes de lípidos
con DHPE.
En resumen, a concentraciones crecientes de lípido, el pico de emisión del

triptófano iría en disminución, y en contra, el pico de excitación del DHPE en aumento
de forma progresiva.
En este ensayo, concretamente, nos fijaríamos y tomaríamos de referencia la

energía de emisión de los Trp. Así, se compararía el comportamiento de la emisión de los
Trp del ensayo control (con proteína y las vesículas añadidas secuencialmente a
concentraciones crecientes y sin ningún fármaco), en comparación con los ensayos donde
329
la proteína se incubaba primero con los diversos fármacos a diferentes concentraciones y
posteriormente se adicionaban las mismas concentraciones crecientes de vesículas con
DHPE que en el control. De esta manera, se podía ver si estos fármacos estaban
interaccionando con el bolsillo del PIP2 del dominio C2, impidiendo por ello la
interacción de la proteína con la membrana y por ende observar patrones diferentes de
emisión de los Trp.
Se comenzó usando en primer lugar los fármacos a concentraciones fisiológicas

de entre 1 y 5 µM de incubación con la proteína, para posteriormente comparar con el
ensayo control sin fármaco añadido. Si no se observaban diferencias significativas en el
espectro de emisión de los Trp en comparación con el control, lo que significaba que a
dichas concentraciones no se produciría una unión del fármaco al bolsillo de PIP2 que
estuviera impidiendo su unión a las vesículas con el DHPE, se pasaría a emplear
concentraciones suprafisiológicas de los fármacos de entre 50-500 µM.
Para todos los ensayos de FRET descritos a continuación y como se explica en el

apartado de materiales y métodos, se elaboraron curvas de hipérboles de saturación
añadiendo concentraciones crecientes de lípidos y tomando de referencia las medias de
emisión de los Trp.
En la siguiente figura (Figura VIII.4), se muestra una curva control (verde) para
la medida de la transferencia de energía, en la que se añaden las concentraciones
crecientes de vesículas con DHPE a la cubeta de cuarzo con la proteína, sin incubar
previamente la proteína con ningún fármaco. Por otra parte, también se muestra la curva
problema (granate) que representa la media de los ensayos de FRET realizados con el
fármaco α1 a 5 µM.
Si se comparan los patrones de emisión de fluorescencia para el control y la

incubación el fármaco, no se observan variaciones significativas con respecto a la curva
control (Figura VIII.4).
330
Figura VIII.4. La capacidad de unión de la proteína a los lípidos se evaluó por medio de experimentos de
FRET proteína-membrana. En este caso se presenta la hipérbole de saturación cuando se incubó la proteína
con el fármaco α1 (granate) a 5µM junto con curva control (verde). En el eje X se representa la
concentración de lípido (nm) y en el eje Y las unidades de FRET medidas a 340 nm (u.a.). Hipérbole
control, Kd: 1,628 ± 0,33, Emax: 0,755. Hipérbole problema: Kd: 1,269 ± 0,35, Emax: 0,65. Figura realizada
con GraphPad Prism9.
Como se ha comentado anteriormente, para algunos fármacos se probaron

concentraciones suprafisiológicas. Así se pasaba del rango de 1-10 µM, a concentraciones
de entre 50 µM y 500 µM. Sin embargo, debido a la naturaleza aromática de los fármacos,
estas concentraciones tan altas alteraban el patrón de fluorescencia de tal manera que no
se podían extraer conclusiones significativas de si dichas concentraciones estaban
causando alguna alteración en el patrón de emisión de los Trp en comparación con el
control.
Para el fármaco α1, se realizó un ensayo de FRET a altas concentraciones de éste

(500 µM) donde, aunque parecía observarse cierto efecto de unión del fármaco a la
proteína (Figura VIII.6), no se podían obtener conclusiones significativas debido a la
alteración que se producía en el patrón de fluorescencia (Figura VIII.5).
331
Figura VIII.5. Se observa una comparación entre A) patrón del espectro de emisión de los triptófanos en la
zona de los 355 nm para cada curva control a cada una de las concentraciones de lípido empleadas. B)
Patrón alterado tras la incubación con el fármaco α1 a 500 µM a la misma concentración de vesículas
añadidas que en el ensayo control.
332
con el fármaco α1 (granate) a 500 µM junto con curva control (verde). En el eje X se representa la
control, Kd: 1,628 ± 0,33, Emax: 0,755. Hipérbole problema: Kd: 8,185 ± 6,529, Emax: 1,468. Figura
realizada con GraphPad Prism9.
Para el caso del fármaco α2, los espectros de fluorescencia eran difíciles de
analizar a partir de 25 µM (Figura VIII.7). A esta concentración del fármaco, se
consiguieron determinar diversas medidas (Figura VIII.8). En estos replicados la propia
variabilidad del proceso (observada en las barras de error) y el hecho de que a esta
concentración los espectros comenzaban a estar alterados (Figura VIII.7), indicaban que
en estas condiciones tampoco se podían determinar conclusiones significativas de si los
fármacos estaban ocasionando alguna alteración en el espectro de fluorescencia en
comparación con el control por medio de estos ensayos de FRET.
333
Patrón alterado tras la incubación con el fármaco α2 a 25 µM, a la misma concentración de vesículas
añadidas que en el ensayo control.
334
con el fármaco α2 (granate) a 25 µM, junto con curva control (verde). En el eje X se representa la
control, Kd: 1,628 ± 0,33, Emax: 0,755. Hipérbole problema: Kd: 1,783 ± 2,139, Emax: 0,539. Figura
También se realizaron ensayos de FRET proteína-membrana para el fármaco α3

(Figura VIII.10). En estos ensayos, las medidas de fluorescencia, de nuevo, se veían
fuertemente alteradas incluso a bajas concentraciones empleadas del fármaco (5 µM)
(Figura VIII.9).
335
Patrón alterado tras la incubación con el fármaco α3 a 5 µM, a la misma concentración de vesículas añadidas
que en el ensayo control.
336
control, Kd: 1,628 ± 0,33, Emax: 0,755. Hipérbole problema: Kd: 0,7642 ± 0,9 , Emax: 0,37. Figura
El hecho de haber obtenido patrones de fluorescencia altamente alterados tras

incubar la proteína con el compuesto α3, aunque se pueda decir por la comparación en
una primera observación, de la curva control (verde) y problema (granate) de la Figura
VIII.10 que hay un efecto significativo de unión del compuesto a su diana, no se puede
sacar ninguna conclusión significativa por lo ya explicado anteriormente (Figura VIII.9).
También se realizaron ensayos de FRET con el fin de medir la unión de la proteína

a membrana para del fármaco α4. Se pudieron tomar medidas adecuadas hasta los 10 µM
de concentración. A partir de dicha concentración, se observaban alteraciones en los
patrones de fluorescencia de la misma manera a lo ya mostrado anteriormente en las
Figuras VIII.5, VIII.7 y VIII.9.
En el caso de los ensayos de FRET para el compuesto α4 incubándolo con la

proteína a 10 µM, como se observa en la Figura VIII.11, las curvas control y problema
prácticamente solapan, indicando un efecto nulo del compuesto químico para impedir la
interacción del dominio C2 con la membrana.
337
También se realizaron ensayos de transferencia de energía para los fármacos α5,

α6, α7, α8 y α9. Pero en todos los casos, nos enfrentábamos a los mismos problemas ya
comentados en los ejemplos anteriores, a bajas concentraciones no se observaban efectos
de los fármacos y a concentraciones suprafisiológicas no se podían extraer conclusiones
al respecto. A continuación, se muestran dos ejemplos más de ensayos de FRET
realizados para los compuestos α6 (25 µM) y α7 (25 µM) (Figuras VIII.12 y VIII.13
respectivamente).
338
FRET proteína-membrana. En este caso se presenta la hipérbole de saturación, cuando se incubó la proteína
En estos dos ejemplos anteriores (Figura VIII.12 y Figura VIII.13), se muestran

medidas de FRET tras incubar los fármacos α6 y α7 a una concentración de 25 µM con
339
la proteína. En comparativa con los controles, se puede ver que no existen diferencias
significativas en las hipérboles de saturación que indiquen un efecto del fármaco
interfiriendo en la unión del dominio C2 a la membrana. Cuando se probaban
concentraciones más elevadas, nos enfrentábamos a los problemas de alteración de los
patrones de fluorescencia ya citados debido a la naturaleza química de los fármacos
empleados.
Puesto que, por esta técnica a concentraciones bajas de los compuestos químicos
no detectábamos indicios de que la unión del fármaco al bolsillo del PIP2 estuviera
bloqueando su unión a las vesículas con DHPE y a concentraciones más altas la propia
naturaleza del fármaco impedía sacar conclusiones de los ensayos, decidimos cambiar la
estrategia y llevar a cabo otro tipo de ensayos bioquímicos.
2.2.2. ENSAYOS DE SEDIMENTACIÓN LIPÍDICA PARA ESTUDIAR LA

UNIÓN DE FÁRMACOS AL DOMINIO C2 DE PKCα.
El siguiente tipo de medida realizada para intentar determinar si los fármacos

seleccionados podían estar uniéndose al bolsillo de unión a PIP2 y por ende bloqueando
la unión del dominio a la membrana, fueron ensayos de sedimentación lipídica. El
principio básico de este experimento de sedimentación consiste en mezclar los lípidos,
proteínas y/o ciertos aditivos, someter la muestra a un proceso de centrifugación, separar
el sobrenadante (S) del pellet (P) y estudiar la composición de cada uno de ellos por medio
de SDS-PAGE y tinción por Coomassie brilliant blue (Sigma Aldrich). Aquí, la
naturaleza química de los compuestos rescatados, a diferencia de lo que estaba ocurriendo
con los ensayos de FRET, no generaría ningún tipo de interferencia con la medida.
En estos experimentos, se prepararon vesículas lipídicas con la naturaleza lipídica

adecuada para unir el dominio C2 de PKCα. Estas vesículas tenían una composición de
POPC, POPS y PIP2 en una proporción 70:25:5.
Cuando se mezclan estas vesículas lipídicas (1 mM) con la proteína en suspensión

(1 µM) y CaCl2 (2.5 mM), se incuban y se someten posteriormente a un proceso de
340
centrifugación. En este proceso las vesículas sedimentan en el fondo del tubo de
centrifugación arrastrando consigo al pellet la totalidad del dominio C2 de PKCα, debido
a la interacción que se produce entre la proteína y la membrana en presencia del CaCl2
(Figura VIII.14.A). Cuando el dominio C2 de PKCα se encuentra por sí solo, con CaCl2,
pero sin presencia de vesículas, la proteína soluble se quedaría en su totalidad en
suspensión en el sobrenadante tras el proceso de sedimentación por centrifugación
(Figura VIII.14.B).
En estos experimentos, la adición de calcio es clave porque conforme hemos

comentado anteriormente el dominio C2 presenta la región CBR, en la que la
coordinación de 2 o 3 iones calcio es fundamental para su unión al lípido PS y actuando
en colaboración con la región LRC del dominio para unirse a la membrana (Figura
VIII.1).
En la figura VIII.14, además se muestra un tercer experimento control. Este es

para la proteína, con las vesículas, pero sin añadir CaCl2 y además añadiendo EGTA. El
EGTA es un agente quelante que secuestra el calcio libre del tampón y lo hace no
disponible para la proteína. En este control con la proteína, las vesículas, sin añadir CaCl2
y además añadiendo EGTA (1 mM), podemos ver como no toda la proteína se va al pellet,
si no que aproximadamente el 50% de la misma permanece en suspensión, indicando que
ambas regiones CBR y LRC del dominio C2 colaboran para unirse a la membrana. Esto
es debido a que el dominio C2 presenta dos sitios que actúan de forma cooperativa para
unirse a las membranas; el bolsillo de unión a PIP2 (LRC) y por otra parte la región del
calcio (CBR) en la que como su nombre indica este ion juega un papel fundamental en la
unión a la membrana. Cuando no hay calcio disponible, se inhabilita este segundo sitio
de unión a membrana y por ello la unión a la membrana se produce, pero de manera
parcial, ya que solo estaría funcionando de forma adecuada el sitio de unión al PIP2 que
no es suficiente para producir la unión de la proteína a la membrana en su totalidad.
341
Figura VIII.14. Controles realizados para los ensayos de sedimentación. En la calle 1 aparece el marcador
de peso molecular, descrito a la izquierda del gel. A) Controles para proteína y lípido en las calles 2 y 3, en
el que la totalidad de la proteína se une al lípido y por tanto aparece en el precipitado (P) después de someter
a la muestra a un proceso de centrifugación. B) Control para proteína sola sin lípido, en las calles 4 y 5.
Tras la centrifugación, la totalidad de la proteína permanece en suspensión en el sobrenadante (S). C)
Control para proteína y EGTA, en las calles 6 y 7. El EGTA secuestra el calcio disponible en el tampón
inhabilitando el sitio del calcio, haciendo que solo se produzca una unión parcial a las vesículas que están
representadas en el pellet (P). El resto de proteína no unida aparece en el sobrenadante (S). S: sobrenadante.
P: precipitado.
En los casos problema en los que se incuban los fármacos con el dominio C2 de
PKCα, se esperaría ver algo semejante a lo descrito anteriormente cuando se adiciona
EGTA. En este caso, se esperaría que los fármacos bloquearan el sitio de unión a PIP2
inhabilitándolo en su actuación cooperativa junto con el sitio de unión CBR. Así, sólo
quedaría disponible para el dominio C2 el sitio de unión a calcio, de modo que, si
esperamos un bloqueo total del sitio de unión a PIP2, se produciría una unión parcial a la
membrana en comparación con el ensayo control, apareciendo parte de la proteína en el
sobrenadante y otra fracción en el precipitado.
En los primeros ensayos realizados para las incubaciones de los dominios C2 de

PKCα con todos los fármacos (α1- α13), se probaron concentraciones de 50 µM para cada
uno de los productos. Estas concentraciones se consideran más que suficientes para que
si los compuestos son capaces de interaccionar con el bolsillo del PIP2, puedan bloquear
la unión de la proteína a las vesículas.
342
Una vez realizados los ensayos de sedimentación para la totalidad de los
experimentos, toda la proteína se quedaba al 100% en el precipitado (Figura VIII.15).
Figura VIII.15. Primera fase de ensayos de precipitación, en los que se incubó 50 µM de cada fármaco (α1
a α13) con el dominio C2 de PKCα antes de realizar la sedimentación lipídica. Para todos los ensayos
realizados de esta manera, tras la sedimentación lipídica, la totalidad de la proteína aparecía en el
precipitado indicando que toda la proteína se unía a las vesículas. S: sobrenadante. P: precipitado.
El siguiente paso después de estos resultados, tras estar usando la versión silvestre
del dominio C2 de la proteína, fue usar un mutante del mismo dominio para el sitio CBR
de unión a calcio y analizar si de esta manera se podían observar diferencias. En este
mutante, los residuos D246 y D248 están sustituidos por alaninas, haciendo el sitio de
unión a calcio no funcional. Esta era una manera de, emulando la condición descrita
anteriormente empleando EGTA (Figura VIII.14), reproducir de nuevo los ensayos de
sedimentación lipídica.
343
De esta manera, partiendo de la hipótesis de que la unión del fármaco fuera parcial,
o no de forma perfecta al bolsillo de unión al PIP2, quizás, como el sitio del calcio estaba
totalmente operativo, permitía la unión completa a la membrana por medio de la
cooperación junto con el sitio del PIP2 (que estaría funcionando de manera parcial,
asumiendo una unión imperfecta del fármaco) como se había observado en los ensayos
anteriores (Figura VIII.15). Pero en este caso, en el que se probaría el mutante del calcio
para el dominio C2 (D246A, D248A), si bloqueábamos por completo la capacidad de
unión a la membrana del sitio del calcio, en el caso en el que la unión del fármaco se
produjera de manera parcial o no bloqueando totalmente el sitio del PIP2, quizás ahora sí
se podría llegar a ver si se produjera algún efecto en la capacidad de interacción con la
membrana del dominio C2, en comparación con un control de únicamente el mutante de
la región CBR (D246A, D248A) y sin incubar con ningún fármaco.
En los ensayos de sedimentación lipídica, empleando el mutante del calcio

(D246A, D248A), en una primera observación, si comparamos las dos primeras calles
correspondientes al control con la proteína sin incubar con ningún fármaco (que genera
el mismo efecto que el control anteriormente explicado en el que se adicionaba EGTA),
con el resto de las calles para las incubaciones con las distintas drogas (100 µM), parecía
no observarse diferencias significativas (Figura VIII.16).
344
Figura VIII.16. Ensayos de sedimentación en los que se incubó 100 µM de cada fármaco (α1 a α13) con la
proteína antes de realizar la sedimentación lipídica con la versión mutante del dominio C2
(D246A/D248A). El primer par de calles, después del marcador de peso molecular, se corresponde al
control solo con DMSO (los fármacos estaban disueltos con una proporción de DMSO) en concentración
igual a la que se aplicaba en los fármacos. El resto de las calles, se refieren a cada uno de los eventos de
Sobrenadante (S) y Precipitado (P) para todos los fármacos incubados con las proteínas, después del
proceso de sedimentación (α1 a α13). S: sobrenadante. P: precipitado.
En estos ensayos de sedimentación realizados con la versión mutante de la

proteína para la región CBR (D246A, D248A), los fármacos se añadieron al doble de
concentración (100 µM) a la que se empleó en los ensayos anteriormente descritos con la
proteína silvestre (50 µM).
El siguiente paso, fue cuantificar por medio de densitometría, con el paquete de

procesamiento de imagen Fiji del programa ImageJ-NIH (Schneider et al., 2012), en los
345
geles las calles de sobrenadante y precipitación para todas las tres réplicas realizadas. De
esta manera, se determinó la proporción de proteína que se unía a la membrana en
comparación con el control. En general, no se observaron diferencias significativas para
ninguna de las drogas en comparación con la capacidad de unión a la membrana del
ensayo control en que no se incubaba con ninguna de las drogas (Figura VIII.17).
Figura VIII.17. A) Se representa en % la proporción de proteína unida a la membrana tras realizar el ensayo
de sedimentación lipídica empleando el mutante del calcio (D246A, D248A) para cada uno de los fármacos
en comparación con el control que no se incubaba con ningún compuesto. Se realizó el análisis de geles
por densitometría empleando la herramienta Fiji (ImageJ). Representación realizada por medio del
programa Prism9 Graph Pad. B) Tabla con el resumen de todos los fármacos probados.
346
2.2.3. ENSAYOS DE CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X PARA ESTUDIAR LA
UNIÓN DE FÁRMACOS AL DOMINIO C2 DE PKCα.
Puesto que el fármaco α1 era el primer compuesto en la lista que ofrecía la base
de datos Diverse-Lib y por ello podría resultar en el más probable a unirse al dominio C2
de PKCα, en paralelo a los ensayos biofísicos y de microscopía confocal (que se describen
a continuación), con los que intentábamos determinar el efecto de los fármacos en la
capacidad de unión del dominio C2 de PKCα a la membrana, comenzamos a realizar
ensayos de cristalización. Estos experimentos se comenzaron a realizar con el fármaco
α1 que según las predicciones de la librería de interacción proteína-proteína sería el que
más probabilidades tendría para unirse al bolsillo de unión a PIP2.
Antes de realizar los ensayos de cristalización, la proteína se incubaba a 4ºC

durante la noche junto con 2.5 mM de CaCl2. Al día siguiente, se realizaría el montaje de
las placas de cristalización. Después de obtener cristales reproduciendo las condiciones
de las últimas publicaciones donde el grupo de investigación en el que he desarrollado la
tesis consiguió cristalizar dicho dominio (20% PEG 8000 y fosfato de potasio 50 mM,
pH 6.5) (Verdaguer et al., 1999), se procedió a la cristalización de éste junto con el
fármaco α1 tal y como se describe en la Figura VIII.18.
347
Figura VIII.18. Reproducción de las condiciones de cristalización óptimas para la obtención de cristales
del dominio C2 de PKCα. En primer lugar, se llevó a cabo un barrido de PEG a 10, 15, 20 y 25% junto con
fosfato de potasio 50 mM, pH 6.5, para los cuales se obtuvieron cristales únicamente en las condiciones de
20% de PEG (pocillo 3 en la figura), tal y como resultaron en la publicación que teníamos de referencia
(Verdaguer et al., 1999). Posteriormente, se reprodujo en varios pocillos la misma condición con PEG 20%
y resultaron cristales del dominio C2 de PKCα para todos los pocillos.
Tras tener definidas y puestas a punto las condiciones de cristalización que

generaban los mejores cristales, se enviaron las proteínas junto con sus condiciones de
cristalización y el fármaco α1 al grupo de investigación de la Dra. Nuria Verdaguer, en
el IBMB y las muestras se analizaron en el sincrotrón ALBA (Alba Synchrotron Light
Facility) de Barcelona.
En primer lugar, se comenzó realizando los complejos de la proteína junto con el

fármaco y se incubaron ON a 4ºC con 2.5 mM de CaCl2. Primero se empezó usando una
proporción equimolar 1:2 proteína/fármaco (100 nl de proteína junto con la droga y 100
nl del precipitante) para concentraciones de proteína de 12 mg/ml (667 µM para el
348
dominio C2 y 1.33 mM para el fármaco) y 8 mg/ml (444 µM para el dominio C2 y 888uM
para el compuesto químico). Sin embargo, tras obtener cristales, difractarlos y no tener
densidades electrónicas en la región donde se esperaba que se generase la unión del
fármaco se cambió la estrategia.
Así, después se generaron gotas de cristalización (100 nl de proteína junto con la

droga y 100 nl del precipitante), manteniendo el máximo de concentración de proteína
posible teniendo en cuenta que se añadió 5 mM del fármaco α1 y el CaCl2. Así en las
placas de cristalización quedaba el fármaco α1 a 5 mM, y el dominio C2 de PKCα a 10.47
mg/ml. En estas condiciones y como se observa en la figura VIII.19 aparecieron cristales.
Figura VIII.19. Varios cristales del dominio C2 de PKCα (10.47 mg/ml) junto con fármaco α1 (5 mM)
obtenidos y recogidos para difractar en el sincrotrón ALBA (Alba Synchrotron Light Facility, Barcelona).
Varios de estos últimos cristales en los que se añadían 5 mM de fármaco,

resultaron positivos para contener una densidad electrónica en la región del bolsillo del
PIP2 donde se esperaría localizar el fármaco α1.
Posteriormente, se realizó la determinación de la estructura del cristal. El

problemas de las fases (Taylor, 2003), se resolvió por medio de reemplazo molecular
(Evans & McCoy, 2008) empleando como referencia la estructura PDB: 3GPE para el
propio dominio C2 de PKCα. Se realizaron varios ciclos de refinado del Rigid Body con
el software REFMAC5 (Murshudov et al., 1997) a través del programa informático CCP4
(Brünger et al., 1998) y el modelo fue reconstruido manualmente por medio del software
de visualización gráfica Coot (V. B. Chen et al., 2010; Emsley & Cowtan, 2004; Emsley
et al., 2010). El modelo fue compuesto basado en la secuencia de aminoácidos conocida
para PKCα (Uniprot P17252, PKCα, Homo Sapiens).
349
La estructura se resolvió a una resolución de 2.4 Å donde los mapas de densidad
electrónica mostraron una densidad bien definida dentro del modelo propuesto y refinado
(Figura VIII.20). Todos los datos estadísticos, tanto de la recogida de datos como del
proceso de refinamiento están resumidos en la tabla VIII.3.
Tabla VIII.3. Datos y estadísticas para la recogida de datos y refinado del dominio C2 de PKCα junto con
el fármaco α1.
Dominio C2 de PKCα + fármaco α1

Grupo espacial P3221
Dimensiones de celda (Å) a = b = 58.81, c = 91.68
Número de reflexiones totales 18650
Número de reflexiones únicas 6790
Rango de resolución (Å) 2-17
Resolución (Å) 2.4
Completeness (%) 99.3
Redundancia 5
Rmerge (%) 4.8
I/σ(I) 12
Rwork 0.22
Rfree 0.23
rms deviations
Longitud de los enlaces (Å) 0.007
Ángulos de los enlaces (Å) 1.09
Número de moléculas solubles 7431
Ramachadran plot:
Favoured % 97
Allowed % 6
Outliers % 2
Los valores de R (Rwork y Rfree) que miden la calidad del modelo atómico obtenido
de los datos cristalográficos (Kleywegt & Jones, 1997), fueron de Rwork: 0.22 y Rfree 0.23.
Como se ha explicado previamente, valores en torno a 0.2 (tal como los que se obtienen),
indican que el patrón de difracción simulado teórico encaja con el patrón de difracción
observado experimentalmente y que nuestro modelo se considera propuesto y refinado de
forma adecuada.
350
Figura VIII.20. Se muestra la estructura refinada del dominio C2 de PKCα desde dos perspectivas
diferentes, resuelta por medio de reemplazo molecular. Las esferas amarillas localizadas en los loops de la
región CBR se corresponden con tres iones de calcio. Mientras que la molécula multicolor localizada en la
zona superior del bolsillo de unión a PIP2 se corresponde con el fármaco α1. Imagen realizada por medio
de PyMOL.
Figura VIII.21. Se observa una imagen del mapa de densidad electrónica correspondiente al dominio C2 de
PKCα. Se indica dentro del círculo rojo, en la zona de unión del PIP2, una gran densidad electrónica, que
no se corresponde a ninguna de las cadenas laterales de la proteína principal (representada con las cadenas
laterales naranjas), ni tampoco a la unidad proteica asimétrica en el cristal (representada con las cadenas
laterales violetas en la zona superior). De modo que se tenía que relacionar con la densidad correspondiente
al fármaco α1. La densidad electrónica calculada para el resto de la estructura encajaba a la perfección con
las cadenas laterales del modelo del dominio C2 de PKCα una vez completado el refinado de la estructura,
indicando el éxito en el cálculo de la fase de la estructura cristalina. Imagen obtenida por medio del software
Coot.
351
Sin embargo, la densidad electrónica que se observaba no era del todo clara y
completa (Figura VIII.21), lo indicaba una baja ocupancia del fármaco y además que este
presentaba una gran flexibilidad.
Figura VIII.22. Estructura del fármaco α1 en su conformación “extendida. Esta conformación tan abierta
no se podía adaptar a la densidad electrónica mostrada en la imagen anterior, de modo que se tuvo que
variar la torsión del fármaco para poder ajustarla en su sitio dentro de la densidad electrónica que aparecía.
Para ello, previamente, se introdujo la información correspondiente a la estructura del compuesto químico
en el software Coot. Así, se pudo modificar la estructura del fármaco respetando las propiedades
fisicoquímicas de su estructura recabadas en los diccionarios previamente introducidos en el software.
Imagen obtenida por medio del software Coot.
Después de adaptar la estructura de la droga a la densidad electrónica

correspondiente, se llevaron a cabo nuevos ciclos de refinados por medio de Rigid Body
con el software REFMAC5 (Murshudov et al., 1997) a través del programa informático
CCP4 (Brünger et al., 1998) y la estructura del fármaco en su densidad electrónica
correspondiente, fue reconstruida manualmente por medio del software de visualización
gráfica Coot (V. B. Chen et al., 2010; Emsley & Cowtan, 2004; Emsley et al., 2010),
hasta que el compuesto químico se adaptaba a la conformación más idónea dentro de la
densidad del bolsillo de unión a PIP2.
En las siguientes imágenes (Figura VIII.23 y Figura VIII.24), se muestran dos

perspectivas diferentes donde se encaja el fármaco α1 en la densidad electrónica que le
corresponde, después de realizar los últimos procesos de refinado.
352
Figura VIII.23. Se observa en la figura la estructura del fármaco α1 dentro del círculo rojo, de la forma en
que interpretamos podría ajustarse en la densidad electrónica obtenida experimentalmente y respetando la
propia estructura del compuesto. La zona mostrada se corresponde con el bolsillo de unión a PIP2 del
dominio C2 de PKCα. Imagen obtenida por medio del software Coot (I).
Figura VIII.24. Se observa en la figura, desde otra perspectiva diferente a la mostrada anteriormente, la
estructura del fármaco α1 dentro del círculo rojo, de la forma en que interpretamos podría ajustarse en la
densidad electrónica obtenida experimentalmente y respetando la propia estructura del fármaco. La zona
mostrada se corresponde con el bolsillo de unión a PIP2 del dominio C2 de PKCα. Imagen obtenida por
medio del software Coot.
353
De acuerdo con lo previsto y comentado al inicio del apartado (Figura VIII.3), uno
de los posibles anillos aromáticos para funcionar de pilar sobre el que se apilara alguno
de los anillos aromáticos de los fármacos, podría ejercer dicha función en nuestro modelo
final tal y como se muestra en la siguiente figura VIII.25.
Figura VIII.25. Como se predijo, uno de los anillos aromáticos de la propia proteína localizados cercanos
al bolsillo de unión a PIP2, candidatos a ayudar a orientar los propios anillos aromáticos del fármaco, se
presentaba de tal manera que podía apilar un anillo aromático del fármaco. Concretamente se trata del
residuo W245 del dominio C2. Imagen obtenida por medio del software Coot.
2.3. ESTUDIO DEL EFECTO DE FÁRMACOS A TRAVÉS DE LA

OBSERVACIÓN DE DESPLAZAMIENTO A MEMBRANA DE PKCα POR
MEDIO DE ENSAYOS DE PERFUSIÓN ACOPLADOS A MICROSCOPÍA
CONFOCAL.
De forma paralela a los ensayos biofísicos, también se realizaron ensayos de

perfusión mediante microscopía confocal para estudiar el desplazamiento de PKCα a
membrana en presencia de diversos fármacos.
354
Para estos ensayos, se empleó la línea celular de cáncer de mama MCF-7
transfectadas con PKCα-EGFP. En estas líneas celulares, la estimulación con las
concentraciones adecuadas de ionomicina (2 µM) y DiC8 (dioctanoil-sn-glicerol) (50
µg/ml) conllevan la situación de la PKCα a la membrana. Como esta proteína está
marcada con EGFP, se puede estudiar este desplazamiento a la membrana de la proteína
en las células MCF-7 incubadas con diversos tipos de fármacos en comparación con la
condición en la que no se incubaba con ningún fármaco. Así, se puede observar si hay
diferencias en el comportamiento de movimiento de PKCα a la membrana en dichas
condiciones.
En situación de reposo, la proteína PKCα-EGFP se encontraría distribuida de

forma homogénea por del citosol y cuando se realiza la estimulación con ionomicina y
DiC8 se puede ver como se desplaza hasta la membrana (Bolsover et al., 2003). Mediante
estudios de time lapse con el paquete de procesamiento de imagen Fiji del programa
ImageJ-NIH (Schneider et al., 2012), se puede cuantificar la cantidad de proteína que se
une a la membrana (método de line profile) y determinar si existen efectos de los fármacos
en dicha unión.
De esta manera, mediante la incorporación de un sistema externo de perfusión al

microscopio confocal, se hacía pasar un micro fluido por medio de una placa de perfusión
en la que teníamos fijadas células MFC-7 de cáncer de mama transfectadas con PKCα-
EGFP. Este sistema de perfusión nos permitía inyectar a tiempos y flujos controlados (0.1
ml/min) los distintos activadores sobre las células fijadas en las placas de perfusión. De
esta forma, se conseguía una estimulación sincronizada en cada uno de los ensayos a la
misma vez que se grababan vídeos por medio del microscopio confocal del efecto de
desplazamiento de PKCα-EGFP a la membrana.
Dichas células en la placa de perfusión se habrían incubado previamente entre 1.5

y 5 horas con diversos fármacos. Se comenzó estudiando los fármacos α1 y α2, a diversos
tiempos (1.5, 2 y 5 horas) y diversas concentraciones de los inhibidores (2-10 µM).
355
A continuación, se muestra un ejemplo para el desplazamiento de PKCα-EGFP a
membrana para un control y para el fármaco α1 y α2 a máxima concentración (10 µM) y
máximo tiempo de incubación estudiado (5 horas) (Figuras VIII.26, VIII.27 y VIII.28).
En las siguientes imágenes, en una observación directa, no se aprecian diferencias
significativas en el modo de interacción de PKCα-EGFP con la membrana plasmática.
Figura VIII.26. Imágenes de microscopía confocal de células MCF-7. Control con DMSO. Incubación con
la concentración de DMSO en la que estaban disueltos los fármacos durante 5 horas. Izquierda, antes de
estimular. Derecha, después de estimular con ionomicia (2 µM) y DiC8 (50 µg/ml).
Figura VIII.27. Imágenes de microscopía confocal de células MCF-7. Fármaco α1 incubado 5 horas a 10
uM. Izquierda, antes de estimular. Derecha, después de estimular con ionomicia (2 µM) y DiC8 (50 µg/ml).
356
Figura VIII.28. Imágenes de microscopía confocal de células MCF-7. Fármaco α2 incubado 5 horas a 10
uM. Izquierda antes de estimular. Derecha después de estimular con ionomicia (2 µM) y DiC8 (50 µg/ml).
Los estudios de time-lapse analizados mediante line profile se muestran en la

Figura VIII.29, donde se observa que no hay diferencias significativas en cuanto al
porcentaje de PKCα-EGFP localizada en la membrana plasmática en presencia y ausencia
de fármacos α1 y α2 comparando con el control.
357
Figura VIII. 29. Se muestra la proporción de la proteína PKCα unida a membrana para las células MCF-7
incubadas con los fármacos α1 y α2 en comparación con un control en el que no se realizaba la incubación
de las células con ningún fármaco. A) Imágenes de microscopía confocal de las células MCF-7, para cada
una de las condiciones control, α1 y α2, después de la estimulación con Dic8 e ionomicina. B) El gráfico
superior, muestra la distribución del porcentaje de PKCα para las células control y las células incubadas
con los compuestos α1 y α2 localizado en la membrana plasmática de cada célula. El gráfico inferior,
muestra la diferencia media de cada condición frente al control que representan las células que no fueron
incubadas con ningún fármaco. Figura realizada con el programa Stimation Stats
(https://www.estimationstats.com/#/).
358
3. DISCUSIÓN.
Después de realizar los ensayos biofísicos de FRET pudimos observar que a

concentraciones fisiológicas de los fármacos (1-10 µM) no se observaban diferencias en
las transferencias de energía proteína-membrana. Esto se traduce en un efecto nulo de la
droga en la capacidad de impedir la unión del dominio proteico a la proteína y por tanto
daba indicación de que no se producía la unión del fármaco al bolsillo del PIP2. Cuando
se probaron concentraciones mayores de los fármacos (25 µM-500 µM), a estas
concentraciones la naturaleza aromática de los fármacos interfería con los espectros de
fluorescencia medidos, de modo que no se podían extraer conclusiones significativas de
si estos compuestos probados a dichas concentraciones estaban uniéndose al dominio C2
de la quinasa y con ello impidiendo su unión a la membrana.
En segundo lugar, se probaron los ensayos de sedimentación lipídica empleando

tanto la versión silvestre como la versión mutante para la región de unión a calcio del
dominio C2 de PKCα (D246A, D248A). En los primeros ensayos realizados para las
incubaciones de la versión silvestre del dominio C2 de PKCα con todos los fármacos (α1-
α13), una vez realizados los ensayos de sedimentación, el total de la proteína se localizaba
al 100% en el precipitado. Esto indicaba que toda la proteína se estaba uniendo a las
vesículas sin problemas y el fármaco no estaba impidiendo la unión de la proteína a la
membrana (Figura VIII.15). En el caso de los ensayos realizados con el mutante de calcio
del dominio C2 (D246A, D248A), tampoco se observaron diferencias significativas en
comparación con el control, indicando de nuevo que las drogas no impedían la unión del
dominio C2 de PKCα a la membrana mediante la unión y bloqueo de la región de
interacción con PIP2 (Figura VIII.16 y VIII.17).
De forma sorprendente, cuando analizamos los primeros cristales del dominio C2

de PKCα por medio de cristalografía de rayos X junto con el fármaco α1, sí se observó
una densidad electrónica localizada en el sitio del bolsillo de unión del PIP2 que se
correspondía con el fármaco α1 después de realizar el procesamiento de datos y refinado
de la estructura, sin embargo, se determinó una baja ocupancia (Figura VIII.21).
359
La baja ocupancia era un parámetro no muy alentador ya que podría indicar que,
la propia elevada concentración del fármaco con la que se incubó la proteína era tal que
por pura concentración y puesto que la base de datos ofrece resultados de potenciales
fármacos que se adaptan en el bolsillo, aunque no haya gran afinidad, estuviera ocupando
su lugar en el puzle molecular porque era una pieza que encajaba a la perfección en su
diana cuando las unidades cristalinas de la proteína se forman.
Por otra parte, otra explicación también podría ser que sí se estuviera produciendo
la unión a su bolsillo, pero con una muy baja afinidad y de ahí la baja ocupancia.
La última alternativa, podía ser que, sí se estuviera uniendo de manera constitutiva

y con una afinidad suficientemente elevada, pero todavía no teníamos las condiciones de
cristalización puestas a punto para potenciar la ocupancia completa. De esta manera, esta
unión no estaría bloqueando al dominio de poder unirse en su totalidad a la membrana,
de ahí el no ver efectos de unión a lípidos en los ensayos biofísicos de FRET y
sedimentación lipídica, y por otro lado sí observar el fármaco unido por medio de esta
técnica al bolsillo del PIP2.
Considerando dicha opción, cabe la posibilidad de que, aunque la unión entre el

bolsillo del PIP2 a la membrana tenga lugar sin problemas a pesar de que el fármaco ocupe
su lugar en el bolsillo del PIP2, dicha unión del fármaco produzca alteraciones a nivel
molecular y de estructura en el plegamiento correcto y de activación de la proteína en su
conformación catalíticamente activa. Así, una vez que la proteína junto con el fármaco se
una la membrana, esto pudiera tener consecuencias en la cascada aguas abajo en su
capacidad de fosforilar diversos sustratos.
Por ello, actualmente nos encontramos en una fase de diseño de ensayos in vivo
con líneas celulares de cáncer de mama MCF-7 y MDA-MB-231, para determinar si los
fármacos pudiesen estar interfiriendo en algún proceso aguas abajo en el modo de
actuación de las PKCs, ensayos que están en proceso de refinado y puesta a punto.
Por último, en los ensayos realizados de perfusión acoplados a microscopía

confocal con células de cáncer de mama MCF-7, no se detectaron diferencias
360
significativas en el desplazamiento de la proteína a la membrana cuando las células se
incubaban con los fármacos rescatados y posteriormente se estimulaban con ionomicina
y DiC8. Esto indica que, si estos fármacos son capaces de interaccionar con el dominio
C2, no están afectando a la capacidad de interacción de la PKCα con la membrana
plasmática. Quedaría por demostrar si alguno de los fármacos tendría algún efecto en la
capacidad de acceso del enzima a sus respectivos sustratos y en la consecuente
señalización aguas abajo.
Otro de los siguientes objetivos futuros, puesto que determinamos la unión del
fármaco α1 al bolsillo del PIP2 mediante cristalografía de rayos X con una baja ocupancia,
es realizar la mejora virtual y modelado molecular del compuesto α1 para potenciar su
capacidad de unión a la diana de la quinasa estudiada. Ya que las condiciones de
cristalización están puestas a punto, una vez realizada la mejora virtual conociendo la
estructura de la proteína y del fármaco, se podría emplear la misma cristalografía de rayos
X para realizar un cribado y determinar que posibles compuestos candidatos mejoran la
unión al bolsillo del PIP2 (Maveyraud & Mourey, 2020; Śledź & Caflisch, 2018).
El fármaco α1 es una imidazolina, se trata de un derivado de la 2-fenil-2-

imidazolina. Por su naturaleza aromática policíclica es capaz de interaccionar con el
material genético (Wei & Guo, 2009). Además, estos compuestos, las imidazolinas, han
sido ampliamente estudiadas pues son importantes ligandos de los receptores
adrenérgicos α2, una clase de receptores asociados a proteína G. Debido a su importancia
fisiológica, los receptores de imidazolinas se presentan como importantes dianas
terapéuticas (Bousquet et al., 2020; Head & Mayorov, 2006; Lowry & Brown, 2014;
Tyagi et al., 2007).
Se han realizado innumerables ensayos biológicos con el compuesto α1

(PubChem CID: 135401389) tal como puede observarse en el apartado de ensayos
biológicos de la web de PubChem
(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/135401389#section=BioAssay-Results).
Sin embargo, para todos los ensayos realizados se ha mostrado inefectivo o no se han
podido extraer conclusiones significativas que le den un papel como fármaco efectivo.
Así, por ejemplo, se ha empleado para detectar pequeñas moléculas inhibidoras de Ras y
361
de GTPasas relacionadas con Ras (PubChem AID: 757), inhibidores de la lisin-
metiltransferasa G9a (PubChem AID: 504332), para la búsqueda de pequeñas moléculas
que impidan la proliferación y generen la apoptosis en células SW480 de cáncer de colon
(PubChem AID: 624297) o para determinar pequeñas moléculas que se unan a receptores
G acoplados a receptores de tipo clase B1 (PubChem AID: 624418).
362
CAPÍTULO IX. DISCUSIÓN
GENERAL Y CONCLUSIONES.
CAPÍTULO IX. DISCUSIÓN GENERAL Y CONCLUSIONES.
DISCUSIÓN FINAL.
La resolución de la estructura tridimensional por medio de cristalografía de rayos

X en su conformación completa para alguna de las isoformas de la familia de las PKCs,
se mantiene aún como un enorme reto que numerosos grupos de investigación llevan
intentado realizar durante más de tres décadas. Esto se debe a las dificultades que entrañan
las propiedades intrínsecas de esta proteína tales como su asimetría y su gran flexibilidad,
al tratarse de una proteína multidominio. Estas características, dificultan sobremanera el
ajustar unidades repetidas dentro de cristales que puedan ayudar a su resolución
estructural por medio de la técnica de cristalografía de rayos X (Leonard et al., 2011).
Esto se puso de manifiesto durante el transcurso de la Tesis donde después de probar un
enorme número de condiciones con proteínas PKCs, proteínas sustrato y ligandos
diversos, no se consiguió obtener ningún cristal que incluyera alguna de las PKCs por sí
solas o en compañía con algunas de las proteínas con las que interacciona (Fascin1 y
RACK1).
Por otra parte, la técnica de biología estructural CryoEM es una herramienta con
un potencial enorme que no hace más que avanzar año tras año. Aunque hoy en día existen
proteínas de menos de 100 kDa que se han resuelto a resolución atómica o casi atómica
(< 4 Å) (Fan et al., 2019; Liu et al., 2019; Zhang et al., 2019), son proteínas que no adoptan
diversas conformaciones y son unidades mucho más simétricas que nuestro complejo
proteico PKCα-Fascin1, de tan solo 135 kDa. Eso, sumado a la poca simetría que presenta
el complejo proteico y la posibilidad de adoptar varias conformaciones, hace que aún se
encuentre en el límite de resolución de la técnica (Peplow, 2020).
Además, experimentalmente también se plantearon dificultades a la hora de

reproducir buenas condiciones de capa de hielo al realizar las rejillas de CryoEM
(condición considerada fundamental para asegurar una adecuada calidad en la toma de
datos) (Glaeser et al., 2016). Esta condición, hacía muy difícil obtener una gran cantidad
de micrografías de gran calidad, que se traduce en disponer miles de partículas de partida
que se correspondan a cada una de sus secciones bidimensionales en cada uno de los
posibles estados de conformación del complejo proteico. De esta forma, la dificultad para
determinar su estructura por medio de esta técnica se multiplica aún mas.
365
No hay que olvidar, sin embargo, que, a pesar de los escollos a superar, este reto
suma más valor añadido a la empresa planteada en la presente Tesis Doctoral. Esto es
debido a que se ha logrado estar cerca de poder haber determinado una estructura que se
sitúa en el mismo límite de la resolución actual de la técnica y que además habría aportado
información de incalculable valor relativo a la estructura de la proteína y de sus posibles
intermedios de activación. Con todas las repercusiones que ello tendría debido a su
implicación en innumerables enfermedades que afectan a la humanidad tales como
cáncer.
Hasta la fecha, la estructura más cercana a una conformación completa para

alguna de las proteínas que conforman la familia de las PKCs se corresponde para
PKCβII. Sin embargo, surgen controversias en cuanto a cuál es la conformación que
realmente adopta la proteína de acuerdo con la información que se puede extraer de la
simetría de las partículas dentro del cristal. Según lo propuesto en la publicación inicial
(Leonard et al., 2011), la proteína se encuentra en una conformación muy abierta y se
podría decir que poco natural desde un punto de vista fisiológico donde las proteínas
tienden a adoptar conformaciones energéticamente más favorables. Además, tal y como
se ha comentado en la introducción, esta estructura, estrictamente no se puede considerar
una estructura de la proteína en su conformación completa. Esto se debe a que hay
dominios estructurales sin una densidad atómica suficientemente clara para obtener
información atómica de ellas. De esta manera, aun siendo la proteína PKC de la que más
información estructural se tiene, deja abiertas muchas dudas estructurales que aún quedan
por esclarecerse.
En este punto, como también se ha comentado en la introducción, frente a la

publicación de Leonard y colaboradores, surgió otra posible interpretación de la
información estructural contenida en el cristal. Esta se trataba de una conformación más
cerrada y a nivel celular podría tener una mayor significancia biológica (Antal, Callender,
et al., 2015). Esta conformación cerrada, a pesar de las actuales limitaciones que
actualmente presentan los algoritmos de predicción, también la proponía el algoritmo de
predicción AlphaFold (Figura V.19).
366
Aquí, ante esta controversia a cerca de cual es la estructura que la proteína estaría
adoptando realmente en su medio biológico, la técnica CryoEM podría jugar un papel
más certero que la información disponible actualmente basada en experimentos de
cristalografía de rayos X y predicción estructurales por medio de algoritmos informáticos.
Esto se debe a que las condiciones de criogenización en el propio tampón donde se
comporta de forma estable la proteína darían una imagen totalmente fisiológica de PKCα
en su estado nativo. Esto se trata de una gran diferencia en comparación con la
cristalografía de rayos X donde, para analizar estructuralmente una proteína, ésta tiene
que cristalizar previamente. En el proceso de cristalización la proteína puede adoptar
alguna conformación o plegamiento que no sea natural desde un punto de vista
fisiológico. Así, en algunas ocasiones no se podría ver como se encuentra plegada la
proteína de forma natural en su entorno fisiológico ya sea por sí sola o en interacción con
alguna de sus proteínas compañeras, y solo podría estar adoptando dicha conformación
por ser la mejor manera en la que se puede ajustar en unidades simétricas dentro de la
unidad cristalina (Shoemaker & Ando, 2018).
Por medio de las técnicas de cristalografía de rayos X desarrolladas en esta Tesis

Doctoral, después de probar multitud de tipo de cribados, combinaciones de proteínas y
de aditivos que se saben tienen una activación en las proteínas PKCs, así como de diversas
estrategias de optimización de potenciales condiciones que pudieran dar como resultado
cristales, no conseguimos obtener ningún cristal que tuviera alguna de las proteínas PKCs
por separado o bien en complejo con alguna de sus proteínas compañeras.
Por otro lado, por medio de la técnica de CryoEM, a pesar de las circunstancias
que hacen nuestro proyecto de criomicroscopía electrónica un reto de enorme magnitud
para la técnica y que supondría un hito en el avance de la técnica en el caso de la
resolución de la estructura a una resolución atómica o casi atómica, se consiguió llegar a
unas condiciones muy cercanas a las ideales para conseguir dicho objetivo. El único paso
limitante, fue el hecho de encontrarnos con la dificultad de obtener un patrón de hielo lo
suficientemente bueno para favorecer una recolección de datos que nos pudiera asegurar
una enorme cantidad de partículas que pudieran representar clasificaciones 2D para todas
las posibles conformaciones en las diversas proyecciones posibles de nuestra muestra y
367
así conseguir una recolección de datos y procesado lo suficientemente bueno para

acercarnos al modelo atómico de la muestra.
Actualmente, el proyecto sigue adelante con el empleo de algunos enfoques

diferentes para asegurar que se obtengan macro complejos proteicos de mayor tamaño
molecular que faciliten y aumenten el contraste haciendo más fácil el análisis de datos.
También se están empleando otros enfoques para conseguir que nuestro complejo
proteico de 135 kDa se encuentre en un estado cerrado de interacción y no se muestren
diversos estados de no unión y de unión intermedia que puedan facilitar la resolución
final de la estructura.
La determinación estructural de PKCα sería fundamental para el desarrollo de

fármacos que como se ha comentado, hoy en día presentan el gran inconveniente de su
falta de especificidad de isoforma. Además, la determinación estructural de PKCα junto
con sus proteínas compañeras Fascin1 o RACK1 también sería de gran importancia, para
entender a nivel estructural como tiene lugar la unión entre estas proteínas. En diversos
tipos de enfermedades, desarrollar fármacos que tuvieran como diana las regiones de
interacción entre estas proteínas podrían ser de gran ayuda.
De acuerdo con la información bioquímica y estructural disponible hasta la fecha,

junto con la información estructural recabada en esta Tesis Doctoral se propone un
modelo de activación para PKCα (Figura IX.1). Este modelo, estaría más en línea con el
que se ha comentado en la introducción del grupo de investigación de Antal y
colaboradores (Antal, Callender, et al., 2015), tomando además como referencia las
anotaciones estructurales del grupo de investigación de Corbalán-García y colaboradores
(Corbalán-García & Gómez-Fernández, 2014) y que se podría adaptar al conjunto de las
proteínas del grupo de las PKCs clásicas dentro de la cual se encuentra PKCα.
En este modelo, se partiría de una conformación cerrada en la que el dominio C2

estaría interaccionando con el dominio catalítico. Una vez la proteína PKC se encuentra
fosforilada y en un entorno propicio de activación, puede dirigirse a la membrana en
presencia de las señales adecuadas tales como Ca2+ y determinados lípidos de membrana.
En estas condiciones, el dominio C2 podría separarse del conjunto proteico activo cerrado
368
y llevar a cabo su unión primaria a la membrana por medio del dominio C2 separándolo
así del dominio catalítico de la PKC (Newton, 2018).
La primera unión tendría lugar a través del sitio de unión a calcio del dominio C2
por medio de la interacción con el fosfolípido aniónico PS en una unión coordinada con
iones Ca2+. Esta primera interacción se trataría de una unión más débil que terminaría de
completarse de forma más fuerte una vez el dominio C2 se ancla a la membrana por medio
de su bolsillo de unión a fosfoinosítidos mediante el reconocimiento de PIP2 de
membrana. Esta segunda unión del dominio C2 a la membrana, por medio de este segundo
sitio de reconocimiento a lípidos haría un efecto palanca en el resto de la estructura
liberando los dominios C1A y C1B de esta estructura cerrada y haciéndolos más
accesibles para el reconocimiento del DAG de membrana. Tras la unión de los dominios
C1 a la membrana, se llevaría a cabo un nuevo cambio conformacional en el que la región
NFD se liberaría. Así, se favorecería que el residuo de Phe629 clave del sitio NFD ocupe
su poción activa en la región catalítica en su unión al anillo de adenina del ATP y
permitiría que la región catalítica se encontrara en óptimas condiciones para realizar su
función de fosforilación sobre los sustratos cercanos (Antal, Callender, et al., 2015;
Corbalán-García & Gómez-Fernández, 2014).
Una vez la proteína PKC se encuentra anclada a la membrana por medio de sus
dominios C2, C1A y C1B, la quinasa estaría en una conformación totalmente activada
para poder llevar a cabo sus diversas funciones (Newton, 2018).
De la misma manera, también se podrían plantear dos modelos de activación que

no implicarían la unión completa de los dominios C2, C1A y C1B a sus lípidos
correspondientes de membrana y que variaría según los activadores presentes en el
entorno. Por un lado, si en el medio hay presente Ca2+, PS y PIP2 se produciría la unión
del dominio C2 de la PKC a la membrana y esto podría ocasionar su activación completa
sin necesidad de la unión de los dominios C1 a DAG. Esto es debido a que el propio
dominio C2 puede ejercer una fuerza de palanca al unirse a la membrana por dos puntos
(sitio del calcio y sitio de unión a PIP2) que pudiera resultar en un cambio conformacional
del resto de la estructura que facilitara la liberación de la región NFD y la separación del
369
dominio C2 del dominio catalítico (Figura IX.2) (Antal, Callender, et al., 2015; Corbalán-
García & Gómez-Fernández, 2014).
Por otra parte, si solo hubiese presente DAG en la membrana, la unión de PKC a
la membrana solo podría tener lugar a través de los dominios C1A y C1B que
ocasionarían de nuevo una liberación de la región NFD, que normalmente se encuentra
abrazada por el dominio C1B. Permitiendo así, ocupar su lugar catalíticamente activo, así
como la separación del dominio C2 del dominio quinasa (Figura IX.1) (Antal, Callender,
et al., 2015; Corbalán-García & Gómez-Fernández, 2014; Kazanietz & Lemmon, 2011).
Figura IX.1. Se muestra el modelo de activación general de las cPKCs como PKCα. Los módulos de la
PKC se representan en colores: dominio C2 (verde), dominio C1B (azul), dominio C1A (naranja), dominio
NFD (amarillo) y dominio catalítico (azul celeste y rojo). En su activación por lípidos y por Ca2+, la proteína
PKC se desplaza a la membrana donde por medio de su dominio C2 se ancla a la membrana a través de PS
y PIP2, mientras que su dominio C1A se une a la membrana por medio de DAG. Una vez en la membrana,
la proteína PKCα puede interaccionar a través de su dominio C2 con sus proteínas de anclaje RACK1 que
juegan un papel fundamental en la colocación de las diversas isoformas en microdominios determinados
para su activación o bien fosforilar sus diversos ligandos tales como Fascin1 mediante su interacción a
través del dominio C1B. Modelo adaptado de la investigación realizada por el grupo de Corbalán-García y
colaboradores en 2014 (Corbalán-García & Gómez-Fernández, 2014).
370
Figura IX.2. Se representa el dominio C2 de PKCα unido a la membrana usando los códigos PDB 1DSY
(izquierda) y 3GPE (derecha). Los dos grupos cabeza de PS y PIP2 lideran la unión del dominio a la
membrana. Se puede observar que en presencia de PIP2 el ángulo de la proteína con respecto a la membrana
cambia. Este cambio conformacional podría ser clave en la modificación de la estructura global de la
proteína en las proteínas que contienen dominios C2 (Corbalán-García & Gómez-Fernández, 2014).
Con respecto al desarrollo de fármacos eficaces contra las diversas isoenzimas de

las PKCs aún queda un gran camino por recorrer. La falta de especificidad de mantiene
como el principal problema a la hora de encontrar fármacos eficaces que sean totalmente
específicos de isoforma (Mochly-Rosen et al., 2012).
Además, la complejidad en el modo de actuación en las PKCs de las que, aunque

actualmente hay una gran cantidad de información disponible, no se conoce con claridad
muchos de los papeles de estas quinasas en los procesos fisiológicos donde participan, es
otro problema que hay que resolver en cuanto al desarrollo farmacológico (Newton, 2001,
2003).
El estudio estructural de estas proteínas en conjunción con diversos de sus

ligandos y proteínas compañeras, se proponen clave para poder obtener la máxima
información estructural que ayude a encontrar diferencias claves en determinados
dominios de su estructura que puedan actuar como dianas terapéuticas. Junto con el
diseño dirigido, se podrían reposicionar fármacos que sean capaces de reconocer sitios
muy específicos de isoforma y resolver así el gran problema con el que no encontramos
hoy en día (Carter & Kane, 2004; Hofmann, 2004; Irie et al., 2005; Kazanietz, 2005;
Mochly-Rosen et al., 2012).
371
A nivel de estructura cabe destacar la región V5 en la zona carboxilo terminal,

que como se ha comentado en la introducción, es la región más específica de secuencia
para cada una de las diversas isoenzimas. Sin embargo, de nuevo subyace el problema de
que al ser una estructura puramente flexible dificulta su estudio estructural y hasta la
fecha, aunque se ha predicho su estructura, no se ha resuelto por medio de ninguna
herramienta de biología estructural para estudiar si presenta algún motivo estructural que
pudiese ser reconocido de forma específica por algún fármaco (Yang & Igumenova,
2013). Debido a este problema, en esta Tesis nos hemos centrado en encontrar fármacos
para el bolsillo de unión a PIP2 del dominio C2 de las cPKCs, de los cuales existen
información estructural para alguna de las isoenzimas de estas quinasas. Aunque por
medio de cristalografía de rayos X en esta Tesis Doctoral se ha determinado la unión de
uno de los fármacos en estudio al bolsillo del PIP2 del dominio C2, por medio de métodos
biofísicos y celulares no se determinó que esta unión perjudicara a la unión del dominio
a la membrana.
Teniendo en cuenta que el cáncer se encuentra entre una de las enfermedades que
más muertes causan en el mundo cada año, la determinación estructural que ayudara a
poder diseñar fármacos que se unieran de manera específica a isoformas sería un enorme
avance de gran calado científico (Cooke et al., 2017).
372
CONCLUSIONES.
Las principales conclusiones que se extraen de esta Tesis Doctoral son las siguientes:
1. Estudios de Thermal Shift Assay para el complejo PKCα-Fascin1 revelan dos

patrones de desnaturalización diferentes que se ajustan a modelos distintos
(Modelo 1 y Modelo 2) según la combinación de aditivos estudiada. Modelo 1
para las condiciones 1 y 2 (condición 1: CaCl2, éste de forbol y ADP-MgCl2 y
condición 2: CaCl2 y ADP-MgCl2). Modelo 2 para las condiciones 3 y 4
(condición 3: CaCl2 y condición 4: CaCl2 y éster de forbol.
2. La estabilidad medida durante el ascenso de temperatura por medio de SLS para

el complejo PKCα-Fascin1, era mayor para el Modelo 1 del complejo PKCα-
Fascin1. A su vez, la estabilidad de los complejos proteicos PKCα-Fascin1, era
mayor que para PKCα en presencia de CaCl2, éster de forbol y ADP-MgCl2.
3. Estudios de polidispersidad por medio de DLS, asignaban al Modelo 2 un

complejo proteico menos polidisperso. La condición que presentaba una menor
polidispersidad se correspondía con la muestra donde solo se añade CaCl2.
4. El Modelo 1, representaría una forma de interacción del complejo donde Fascin1

estaría uniéndose con PKCα en una región diferente a donde la quinasa expone
los residuos Trp al medio soluble. Mientras que en el Modelo 2, Fascin1 estaría
interaccionando con la superficie de PKCα que expone los aminoácidos Trp.
5. La afinidad medida por medio de SPR entre PKCα y Fascin1, se mostró mayor
para la versión WT de Fascin1 en comparación con la versión mutante de Fascin1
S39D, siendo máxima para la condición en la que estaban presentes todos los
aditivos: CaCl2, éster de forbol P13A y ADP-MgCl2.
6. Estudios biofísicos por medio de SPR, muestran que el modelo cinético que mejor
encaja para la unión entre PKCα-Fascin1 es el modelo de unión en dos pasos. Esto
involucra que para que la unión se complete, antes, tiene que producirse un
cambio conformacional.
373
7. Los ensayos de MS nativa para las proteínas añadidas por separado PKCα y
Fascin1, mostraron una señal de baja intensidad que podía corresponderse con el
complejo PKCα-Fascin1.
8. Ensayos preliminares de entrecruzamiento con BS3, mostraron que la formación

de complejos proteicos como resultado de la interacción entre PKCα-Fascin1 y
PKCα-RACK1 eran posibles. Esto abre la puerta a estudiar como interaccionan
las dos proteínas por medio de XL-MS.
9. Después de realizar multitud de cribados de cristalización, en combinación con

diversas proteínas y ligandos. Así como tras realizar diversas estrategias de
optimización para las condiciones que se presentaban potenciales a generar
cristales, no se consiguió la obtención de ningún cristal para ninguna de las
proteínas PKCs probadas por sí solas o en combinación con proteína con las que
interacciona.
10. Las condiciones de CryoEM realizadas durante la Tesis se quedaron cerca de la

determinación estructural de PKCα en complejo con Fascin1. Sin embargo, se
requiere de una colección de datos de mayor calidad para poder avanzar con el
proyecto.
11. Por medio de CryoET, se determinó que el mutante de Fascin1 S39D, que presenta
mutaciones en el sitio 1 de unión a F-actina, resultaba en la ausencia de la
formación de paquetes de F-actina. Únicamente aparecían filamentos de F-actina
individuales que no presentaban Fascin1 unida. Esto indica, que la región mutada
es crítica en la unión a F-actina y el sitio 2 por sí solo no es capaz de compensar
esta disfunción.
12. El mutante A de Fascin1 (K150E, R151E y K313E) que presenta mutaciones en

el sitio 2 de unión a F-actina, resultó en datos preliminares de CryoET muy
interesantes, donde la decoración de filamentos de F-actina con unidades de
374
Fascin1 de forma discreta están cerca de dar información atómica del modelo de
unión entre ambas moléculas.
13. Del conjunto de fármacos rescatados en la presente Tesis Doctoral, por medio de
cristalografía de rayos X, el fármaco α1 se vio que se unía de forma específica al
bolsillo de unión a PIP2 que planteamos como diana terapéutica.
375
REFERENCIAS
REFERENCIAS
Acevedo-Duncan, M., Patel, R., Whelan, S., & Bicaku, E. (2002). Human glioma PKC-iota
and PKC-betaII phosphorylate cyclin-dependent kinase activating kinase during
the cell cycle. Cell Prolif, 35(1), 23-36. https://doi.org/10.1046/j.1365-
2184.2002.00220.x
Adams, D. R., Ron, D., & Kiely, P. A. (2011). RACK1, A multifaceted scaffolding protein:
Structure and function. Cell Commun Signal, 9, 22.
https://doi.org/10.1186/1478-811X-9-22
Adams, J. C. (2004). Roles of fascin in cell adhesion and motility. Curr Opin Cell Biol,
16(5), 590-596. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2004.07.009
Adams, J. C., Clelland, J. D., Collett, G. D., Matsumura, F., Yamashiro, S., & Zhang, L.
(1999). Cell-matrix adhesions differentially regulate fascin phosphorylation.
Mol Biol Cell, 10(12), 4177-4190. https://doi.org/10.1091/mbc.10.12.4177
Aeder, S. E., Martin, P. M., Soh, J. W., & Hussaini, I. M. (2004). PKC-eta mediates
glioblastoma cell proliferation through the Akt and mTOR signaling pathways.
Oncogene, 23(56), 9062-9069. https://doi.org/10.1038/sj.onc.1208093
Alkon, D. L. (1989). Memory storage and neural systems. Sci Am, 261(1), 42-50.
https://doi.org/10.1038/scientificamerican0789-42
Alkon, D. L., Sun, M. K., & Nelson, T. J. (2007). PKC signaling deficits: a mechanistic
hypothesis for the origins of Alzheimer's disease. Trends Pharmacol Sci, 28(2),
51-60. https://doi.org/10.1016/j.tips.2006.12.002
Amendola, V., Pilot, R., Frasconi, M., Maragò, O. M., & Iatì, M. A. (2017). Surface
plasmon resonance in gold nanoparticles: a review. J Phys Condens Matter,
29(20), 203002. https://doi.org/10.1088/1361-648X/aa60f3
Anantharam, V., Kitazawa, M., Wagner, J., Kaul, S., & Kanthasamy, A. G. (2002).
Caspase-3-dependent proteolytic cleavage of protein kinase Cdelta is essential
for oxidative stress-mediated dopaminergic cell death after exposure to
methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl. J Neurosci, 22(5), 1738-1751.
Anilkumar, N., Parsons, M., Monk, R., Ng, T., & Adams, J. C. (2003). Interaction of fascin
and protein kinase Calpha: a novel intersection in cell adhesion and motility.
EMBO J, 22(20), 5390-5402. https://doi.org/10.1093/emboj/cdg521
Antal, C. E., Callender, J. A., Kornev, A. P., Taylor, S. S., & Newton, A. C. (2015).
Intramolecular C2 Domain-Mediated Autoinhibition of Protein Kinase C βII. Cell
Rep, 12(8), 1252-1260. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2015.07.039
Antal, C. E., Hudson, A. M., Kang, E., Zanca, C., Wirth, C., Stephenson, N. L., . . .
Newton, A. C. (2015). Cancer-associated protein kinase C mutations reveal
kinase's role as tumor suppressor. Cell, 160(3), 489-502.
https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.01.001
Ashburn, T. T., & Thor, K. B. (2004). Drug repositioning: identifying and developing new
uses for existing drugs. Nat Rev Drug Discov, 3(8), 673-683.
https://doi.org/10.1038/nrd1468
Ashendel, C. L. (1985). The phorbol ester receptor: a phospholipid-regulated protein
kinase. Biochim Biophys Acta, 822(2), 219-242. https://doi.org/10.1016/0304-
4157(85)90009-7
Asherie, N. (2004). Protein crystallization and phase diagrams. Methods, 34(3), 266-
272. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2004.03.028
378
REFERENCIAS
Ashton, A. W., Watanabe, G., Albanese, C., Harrington, E. O., Ware, J. A., & Pestell, R.
G. (1999). Protein kinase Cdelta inhibition of S-phase transition in capillary
endothelial cells involves the cyclin-dependent kinase inhibitor p27(Kip1). J Biol
Chem, 274(30), 20805-20811. https://doi.org/10.1074/jbc.274.30.20805
Bae, K. M., Wang, H., Jiang, G., Chen, M. G., Lu, L., & Xiao, L. (2007). Protein kinase C
epsilon is overexpressed in primary human non-small cell lung cancers and
functionally required for proliferation of non-small cell lung cancer cells in a
p21/Cip1-dependent manner. Cancer Res, 67(13), 6053-6063.
https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-06-4037
Bai, N., Roder, H., Dickson, A., & Karanicolas, J. (2019). Isothermal Analysis of
ThermoFluor Data can readily provide Quantitative Binding Affinities. Sci Rep,
9(1), 2650. https://doi.org/10.1038/s41598-018-37072-x
Bai, X. C., McMullan, G., & Scheres, S. H. (2015). How cryo-EM is revolutionizing
structural biology. Trends Biochem Sci, 40(1), 49-57.
https://doi.org/10.1016/j.tibs.2014.10.005
Banci, L., Cavallaro, G., Kheifets, V., & Mochly-Rosen, D. (2002). Molecular dynamics
characterization of the C2 domain of protein kinase Cbeta. J Biol Chem,
277(15), 12988-12997. https://doi.org/10.1074/jbc.M106875200
Belin, R. J., Sumandea, M. P., Allen, E. J., Schoenfelt, K., Wang, H., Solaro, R. J., & de
Tombe, P. P. (2007). Augmented protein kinase C-alpha-induced myofilament
protein phosphorylation contributes to myofilament dysfunction in
experimental congestive heart failure. Circ Res, 101(2), 195-204.
https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.107.148288
Bell, R. M., & Burns, D. J. (1991). Lipid activation of protein kinase C. J Biol Chem,
266(8), 4661-4664.
Benavides-Cordoba, V. (2020). Drug Repositioning for COVID-19. Colomb Med (Cali),
51(2), e4279. https://doi.org/10.25100/cm.v51i2.4279
Bharti, A., Kraeft, S. K., Gounder, M., Pandey, P., Jin, S., Yuan, Z. M., . . . Kharbanda, S.
(1998). Inactivation of DNA-dependent protein kinase by protein kinase Cdelta:
implications for apoptosis. Mol Cell Biol, 18(11), 6719-6728.
https://doi.org/10.1128/mcb.18.11.6719
Blanchoin, L., Boujemaa-Paterski, R., Sykes, C., & Plastino, J. (2014). Actin dynamics,
architecture, and mechanics in cell motility. Physiol Rev, 94(1), 235-263.
https://doi.org/10.1152/physrev.00018.2013
Blass, M., Kronfeld, I., Kazimirsky, G., Blumberg, P. M., & Brodie, C. (2002). Tyrosine
phosphorylation of protein kinase Cdelta is essential for its apoptotic effect in
response to etoposide. Mol Cell Biol, 22(1), 182-195.
https://doi.org/10.1128/mcb.22.1.182-195.2002
Bolsover, S. R., Gomez-Fernandez, J. C., & Corbalan-Garcia, S. (2003). Role of the
Ca2+/phosphatidylserine binding region of the C2 domain in the translocation
of protein kinase Calpha to the plasma membrane. J Biol Chem, 278(12), 10282-
10290. https://doi.org/10.1074/jbc.M212145200
Bousquet, P., Hudson, A., García-Sevilla, J. A., & Li, J. X. (2020). Imidazoline Receptor
System: The Past, the Present, and the Future. Pharmacol Rev, 72(1), 50-79.
https://doi.org/10.1124/pr.118.016311
Bowling, N., Walsh, R. A., Song, G., Estridge, T., Sandusky, G. E., Fouts, R. L., . . . Vlahos,
C. J. (1999). Increased protein kinase C activity and expression of Ca2+-sensitive
379
REFERENCIAS
isoforms in the failing human heart. Circulation, 99(3), 384-391.

https://doi.org/10.1161/01.cir.99.3.384
Boyde, A., Petran, M., & Hadravsky, M. (1983). Tandem scanning reflected light
microscopy of internal features in whole bone and tooth samples. J Microsc,
132(Pt 1), 1-7. https://doi.org/10.1111/j.1365-2818.1983.tb04703.x
Braz, J. C., Gregory, K., Pathak, A., Zhao, W., Sahin, B., Klevitsky, R., . . . Molkentin, J. D.
(2004). PKC-alpha regulates cardiac contractility and propensity toward heart
failure. Nat Med, 10(3), 248-254. https://doi.org/10.1038/nm1000
BRENNER, S., & HORNE, R. W. (1959). A negative staining method for high resolution
electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta, 34, 103-110.
https://doi.org/10.1016/0006-3002(59)90237-9
Bright, R., & Mochly-Rosen, D. (2005). The role of protein kinase C in cerebral ischemic
and reperfusion injury. Stroke, 36(12), 2781-2790.
https://doi.org/10.1161/01.STR.0000189996.71237.f7
Brilot, A. F., Chen, J. Z., Cheng, A., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., . . . Grigorieff, N.
(2012). Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film. J
Struct Biol, 177(3), 630-637. https://doi.org/10.1016/j.jsb.2012.02.003
Brünger, A. T., Adams, P. D., Clore, G. M., DeLano, W. L., Gros, P., Grosse-Kunstleve, R.
W., . . . Warren, G. L. (1998). Crystallography & NMR system: A new software
suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallogr D Biol
Crystallogr, 54(Pt 5), 905-921. https://doi.org/10.1107/s0907444998003254
Burguillos, M. A., Deierborg, T., Kavanagh, E., Persson, A., Hajji, N., Garcia-Quintanilla,
A., . . . Joseph, B. (2011). Caspase signalling controls microglia activation and
neurotoxicity. Nature, 472(7343), 319-324.
https://doi.org/10.1038/nature09788
Cabodi, S., Calautti, E., Talora, C., Kuroki, T., Stein, P. L., & Dotto, G. P. (2000). A PKC-
eta/Fyn-dependent pathway leading to keratinocyte growth arrest and
differentiation. Mol Cell, 6(5), 1121-1129. https://doi.org/10.1016/s1097-
2765(00)00110-6
Cacace, A. M., Guadagno, S. N., Krauss, R. S., Fabbro, D., & Weinstein, I. B. (1993). The
epsilon isoform of protein kinase C is an oncogene when overexpressed in rat
fibroblasts. Oncogene, 8(8), 2095-2104.
Carlsson, A. E. (2010). Actin dynamics: from nanoscale to microscale. Annu Rev
Biophys, 39, 91-110. https://doi.org/10.1146/annurev.biophys.093008.131207
Carter, C. A., & Kane, C. J. (2004). Therapeutic potential of natural compounds that
regulate the activity of protein kinase C. Curr Med Chem, 11(21), 2883-2902.
https://doi.org/10.2174/0929867043364090
Castagna, M., Takai, Y., Kaibuchi, K., Sano, K., Kikkawa, U., & Nishizuka, Y. (1982).
Direct activation of calcium-activated, phospholipid-dependent protein kinase
by tumor-promoting phorbol esters. J Biol Chem, 257(13), 7847-7851.
Chaffer, C. L., & Weinberg, R. A. (2011). A perspective on cancer cell metastasis.
Science, 331(6024), 1559-1564. https://doi.org/10.1126/science.1203543
Chen, L., Yang, S., Jakoncic, J., Zhang, J. J., & Huang, X. Y. (2010). Migrastatin analogues
target fascin to block tumour metastasis. Nature, 464(7291), 1062-1066.
https://doi.org/10.1038/nature08978
Chen, V. B., Arendall, W. B., Headd, J. J., Keedy, D. A., Immormino, R. M., Kapral, G. J., .
. . Richardson, D. C. (2010). MolProbity: all-atom structure validation for
380
REFERENCIAS
macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66(Pt 1),

12-21. https://doi.org/10.1107/S0907444909042073
Chen, X., Liu, M., Tian, Y., Li, J., Qi, Y., Zhao, D., . . . Xu, Y. (2018). Cryo-EM structure of
human mTOR complex 2. Cell Res, 28(5), 518-528.
https://doi.org/10.1038/s41422-018-0029-3
Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., & Walz, T. (2015). A primer to single-particle
cryo-electron microscopy. Cell, 161(3), 438-449.
Chiu, Y. H., Ko, K. T., Yang, T. J., Wu, K. P., Ho, M. R., Draczkowski, P., & Hsu, S. D.
(2021). Direct Visualization of a 26 kDa Protein by Cryo-Electron Microscopy
Aided by a Small Scaffold Protein. Biochemistry, 60(14), 1075-1079.
https://doi.org/10.1021/acs.biochem.0c00961
Chou, M. M., Hou, W., Johnson, J., Graham, L. K., Lee, M. H., Chen, C. S., . . . Toker, A.
(1998). Regulation of protein kinase C zeta by PI 3-kinase and PDK-1. Curr Biol,
8(19), 1069-1077. https://doi.org/10.1016/s0960-9822(98)70444-0
Chou, Y. C., Chou, C. C., Chen, Y. K., Tsai, S., Hsieh, F. M., Liu, H. J., & Hseu, T. H. (1999).
Structure and genomic organization of porcine RACK1 gene. Biochim Biophys
Acta, 1489(2-3), 315-322. https://doi.org/10.1016/s0167-4781(99)00213-4
Churchill, E., Budas, G., Vallentin, A., Koyanagi, T., & Mochly-Rosen, D. (2008). PKC
isozymes in chronic cardiac disease: possible therapeutic targets? Annu Rev
Pharmacol Toxicol, 48, 569-599.
https://doi.org/10.1146/annurev.pharmtox.48.121806.154902
Ciccarone, V. C., Polayes, D. A., & Luckow, V. A. (1998). Generation of Recombinant
Baculovirus DNA in E.coli Using a Baculovirus Shuttle Vector. Methods Mol
Med, 13, 213-235. https://doi.org/10.1385/0-89603-485-2:213
Clark, J. A., Black, A. R., Leontieva, O. V., Frey, M. R., Pysz, M. A., Kunneva, L., . . . Black,
J. D. (2004). Involvement of the ERK signaling cascade in protein kinase C-
mediated cell cycle arrest in intestinal epithelial cells. J Biol Chem, 279(10),
9233-9247. https://doi.org/10.1074/jbc.M312268200
Conrad, R., Keranen, L. M., Ellington, A. D., & Newton, A. C. (1994). Isozyme-specific
inhibition of protein kinase C by RNA aptamers. J Biol Chem, 269(51), 32051-
32054.
Cooke, M., Magimaidas, A., Casado-Medrano, V., & Kazanietz, M. G. (2017). Protein
kinase C in cancer: The top five unanswered questions. Mol Carcinog, 56(6),
1531-1542. https://doi.org/10.1002/mc.22617
Corbalán-García, S., García-García, J., Rodríguez-Alfaro, J. A., & Gómez-Fernández, J. C.
(2003). A new phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate-binding site located in the
C2 domain of protein kinase Calpha. J Biol Chem, 278(7), 4972-4980.
https://doi.org/10.1074/jbc.M209385200
Corbalán-García, S., Guerrero-Valero, M., Marín-Vicente, C., & Gómez-Fernández, J. C.
(2007). The C2 domains of classical/conventional PKCs are specific
PtdIns(4,5)P(2)-sensing domains. Biochem Soc Trans, 35(Pt 5), 1046-1048.
https://doi.org/10.1042/BST0351046
Corbalán-García, S., & Gómez-Fernández, J. C. (2006). Protein kinase C regulatory
domains: the art of decoding many different signals in membranes. Biochim
Biophys Acta, 1761(7), 633-654. https://doi.org/10.1016/j.bbalip.2006.04.015
381
REFERENCIAS
Corbalán-García, S., & Gómez-Fernández, J. C. (2014). Classical protein kinases C are

regulated by concerted interaction with lipids: the importance of
phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Biophys Rev, 6(1), 3-14.
https://doi.org/10.1007/s12551-013-0125-z
Cross, T., Griffiths, G., Deacon, E., Sallis, R., Gough, M., Watters, D., & Lord, J. M.
(2000). PKC-delta is an apoptotic lamin kinase. Oncogene, 19(19), 2331-2337.
https://doi.org/10.1038/sj.onc.1203555
Csukai, M., Chen, C. H., De Matteis, M. A., & Mochly-Rosen, D. (1997). The coatomer
protein beta'-COP, a selective binding protein (RACK) for protein kinase
Cepsilon. J Biol Chem, 272(46), 29200-29206.
https://doi.org/10.1074/jbc.272.46.29200
Csukai, M., & Mochly-Rosen, D. (1999). Pharmacologic modulation of protein kinase C
isozymes: the role of RACKs and subcellular localisation. Pharmacol Res, 39(4),
253-259. https://doi.org/10.1006/phrs.1998.0418
Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., & McPherson, A. (1994). Screening
and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr
D Biol Crystallogr, 50(Pt 4), 414-423.
https://doi.org/10.1107/S0907444994002660
Cutler, R. E., Maizels, E. T., Brooks, E. J., Mizuno, K., Ohno, S., & Hunzicker-Dunn, M.
(1993). Regulation of delta protein kinase C during rat ovarian differentiation.
Biochim Biophys Acta, 1179(3), 260-270. https://doi.org/10.1016/0167-
4889(93)90081-y
Dafforn, T. R. (2007). So how do you know you have a macromolecular complex? Acta
Crystallogr D Biol Crystallogr, 63(Pt 1), 17-25.
https://doi.org/10.1107/S0907444906047044
Danev, R., & Baumeister, W. (2016). Cryo-EM single particle analysis with the Volta
phase plate. Elife, 5. https://doi.org/10.7554/eLife.13046
Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., & Baumeister, W. (2014). Volta
potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron
microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A, 111(44), 15635-15640.
https://doi.org/10.1073/pnas.1418377111
Das Evcimen, N., & King, G. L. (2007). The role of protein kinase C activation and the
vascular complications of diabetes. Pharmacol Res, 55(6), 498-510.
https://doi.org/10.1016/j.phrs.2007.04.016
Das, J., & Rahman, G. M. (2014). C1 domains: structure and ligand-binding properties.
Chem Rev, 114(24), 12108-12131. https://doi.org/10.1021/cr300481j
Datta, R., Kojima, H., Yoshida, K., & Kufe, D. (1997). Caspase-3-mediated cleavage of
protein kinase C theta in induction of apoptosis. J Biol Chem, 272(33), 20317-
20320. https://doi.org/10.1074/jbc.272.33.20317
Dauter, Z., & Dauter, M. (2001). Entering a new phase: using solvent halide ions in
protein structure determination. Structure, 9(2), R21-26.
https://doi.org/10.1016/s0969-2126(01)00565-2
De Carlo, S., & Harris, J. R. (2011). Negative staining and cryo-negative staining of
macromolecules and viruses for TEM. Micron, 42(2), 117-131.
https://doi.org/10.1016/j.micron.2010.06.003
de la Rosa-Trevín, J. M., Quintana, A., Del Cano, L., Zaldívar, A., Foche, I., Gutiérrez, J., .
. . Carazo, J. M. (2016). Scipion: A software framework toward integration,
382
REFERENCIAS
reproducibility and validation in 3D electron microscopy. J Struct Biol, 195(1),

93-99. https://doi.org/10.1016/j.jsb.2016.04.010
De Rosier, D. J., & Klug, A. (1968). Reconstruction of three dimensional structures from
electron micrographs. Nature, 217(5124), 130-134.
https://doi.org/10.1038/217130a0
Del Castillo, I. C., Fedor-Chaiken, M., Song, J. C., Starlinger, V., Yoo, J., Matlin, K. S., &
Matthews, J. B. (2005). Dynamic regulation of Na(+)-K(+)-2Cl(-) cotransporter
surface expression by PKC-{epsilon} in Cl(-)--secretory epithelia. Am J Physiol
Cell Physiol, 289(5), C1332-1342. https://doi.org/10.1152/ajpcell.00580.2004
Dempsey, E. C., Cool, C. D., & Littler, C. M. (2007). Lung disease and PKCs. Pharmacol
Res, 55(6), 545-559. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2007.04.010
Denning, M. F. (2004). Epidermal keratinocytes: regulation of multiple cell phenotypes
by multiple protein kinase C isoforms. Int J Biochem Cell Biol, 36(7), 1141-1146.
https://doi.org/10.1016/j.biocel.2003.12.004
Denzel, A., Hare, K. J., Zhang, C., Shokat, K., Jenkinson, E. J., Anderson, G., & Hayday, A.
(2003). Cutting edge: a chemical genetic system for the analysis of kinases
regulating T cell development. J Immunol, 171(2), 519-523.
https://doi.org/10.4049/jimmunol.171.2.519
Detjen, K. M., Brembeck, F. H., Welzel, M., Kaiser, A., Haller, H., Wiedenmann, B., &
Rosewicz, S. (2000). Activation of protein kinase Calpha inhibits growth of
pancreatic cancer cells via p21(cip)-mediated G(1) arrest. J Cell Sci, 113 ( Pt 17),
3025-3035.
DeVries-Seimon, T. A., Ohm, A. M., Humphries, M. J., & Reyland, M. E. (2007).
Induction of apoptosis is driven by nuclear retention of protein kinase C delta. J
Biol Chem, 282(31), 22307-22314. https://doi.org/10.1074/jbc.M703661200
Dicker, P., & Rozengurt, E. (1978). Stimulation of DNA synthesis by tumour promoter
and pure mitogenic factors. Nature, 276(5689), 723-726.
https://doi.org/10.1038/276723a0
Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., &
Schultz, P. (1988). Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Q Rev
Biophys, 21(2), 129-228. https://doi.org/10.1017/s0033583500004297
Duff, D., & Long, A. (2017). Roles for RACK1 in cancer cell migration and invasion. Cell
Signal, 35, 250-255. https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2017.03.005
Duh, F. M., Latif, F., Weng, Y., Geil, L., Modi, W., Stackhouse, T., . . . Lerman, M. I.
(1994). cDNA cloning and expression of the human homolog of the sea urchin
fascin and Drosophila singed genes which encodes an actin-bundling protein.
DNA Cell Biol, 13(8), 821-827. https://doi.org/10.1089/dna.1994.13.821
Edwards, A. S., & Newton, A. C. (1997a). Phosphorylation at conserved carboxyl-
terminal hydrophobic motif regulates the catalytic and regulatory domains of
protein kinase C. J Biol Chem, 272(29), 18382-18390.
https://doi.org/10.1074/jbc.272.29.18382
Edwards, A. S., & Newton, A. C. (1997b). Regulation of protein kinase C betaII by its C2
domain. Biochemistry, 36(50), 15615-15623.
https://doi.org/10.1021/bi9718752
Efimova, T., Deucher, A., Kuroki, T., Ohba, M., & Eckert, R. L. (2002). Novel protein
kinase C isoforms regulate human keratinocyte differentiation by activating a
p38 delta mitogen-activated protein kinase cascade that targets
383
REFERENCIAS
CCAAT/enhancer-binding protein alpha. J Biol Chem, 277(35), 31753-31760.

Elkhatib, N., Neu, M. B., Zensen, C., Schmoller, K. M., Louvard, D., Bausch, A. R., . . .
Vignjevic, D. M. (2014). Fascin plays a role in stress fiber organization and focal
adhesion disassembly. Curr Biol, 24(13), 1492-1499.
https://doi.org/10.1016/j.cub.2014.05.023
Elliott, A. D. (2020). Confocal Microscopy: Principles and Modern Practices. Curr Protoc
Cytom, 92(1), e68. https://doi.org/10.1002/cpcy.68
Emoto, Y., Manome, Y., Meinhardt, G., Kisaki, H., Kharbanda, S., Robertson, M., . . .
Weichselbaum, R. (1995). Proteolytic activation of protein kinase C delta by an
ICE-like protease in apoptotic cells. EMBO J, 14(24), 6148-6156.
Emsley, P., & Cowtan, K. (2004). Coot: model-building tools for molecular graphics.
Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 60(Pt 12 Pt 1), 2126-2132.
https://doi.org/10.1107/S0907444904019158
Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., & Cowtan, K. (2010). Features and development
of Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66(Pt 4), 486-501.
https://doi.org/10.1107/S0907444910007493
Etienne-Manneville, S., & Hall, A. (2001). Integrin-mediated activation of Cdc42
controls cell polarity in migrating astrocytes through PKCzeta. Cell, 106(4), 489-
498. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(01)00471-8
Evans, P., & McCoy, A. (2008). An introduction to molecular replacement. Acta
https://doi.org/10.1107/S0907444907051554
Facchinetti, V., Ouyang, W., Wei, H., Soto, N., Lazorchak, A., Gould, C., . . . Jacinto, E.
(2008). The mammalian target of rapamycin complex 2 controls folding and
stability of Akt and protein kinase C. EMBO J, 27(14), 1932-1943.
https://doi.org/10.1038/emboj.2008.120
Faix, J., & Rottner, K. (2006). The making of filopodia. Curr Opin Cell Biol, 18(1), 18-25.
https://doi.org/10.1016/j.ceb.2005.11.002
Fan, X., Wang, J., Zhang, X., Yang, Z., Zhang, J. C., Zhao, L., . . . Wang, H. W. (2019).
Single particle cryo-EM reconstruction of 52 kDa streptavidin at 3.2 Angstrom
resolution. Nat Commun, 10(1), 2386. https://doi.org/10.1038/s41467-019-
10368-w
Farhadi, A., Keshavarzian, A., Ranjbaran, Z., Fields, J. Z., & Banan, A. (2006). The role of
protein kinase C isoforms in modulating injury and repair of the intestinal
barrier. J Pharmacol Exp Ther, 316(1), 1-7.
https://doi.org/10.1124/jpet.105.085449
Feng, X., Becker, K. P., Stribling, S. D., Peters, K. G., & Hannun, Y. A. (2000). Regulation
of receptor-mediated protein kinase C membrane trafficking by
autophosphorylation. J Biol Chem, 275(22), 17024-17034.
https://doi.org/10.1074/jbc.275.22.17024
Ferreira, J. C., Boer, B. N., Grinberg, M., Brum, P. C., & Mochly-Rosen, D. (2012).
Protein quality control disruption by PKCβII in heart failure; rescue by the
selective PKCβII inhibitor, βIIV5-3. PLoS One, 7(3), e33175.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0033175
Ferreira, J. C., Koyanagi, T., Palaniyandi, S. S., Fajardo, G., Churchill, E. N., Budas, G., . . .
Mochly-Rosen, D. (2011). Pharmacological inhibition of βIIPKC is
384
REFERENCIAS
cardioprotective in late-stage hypertrophy. J Mol Cell Cardiol, 51(6), 980-987.

https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2011.08.025
Fields, A. P., & Murray, N. R. (2008). Protein kinase C isozymes as therapeutic targets
for treatment of human cancers. Adv Enzyme Regul, 48, 166-178.
https://doi.org/10.1016/j.advenzreg.2007.11.014
Fima, E., Shtutman, M., Libros, P., Missel, A., Shahaf, G., Kahana, G., & Livneh, E.
(2001). PKCeta enhances cell cycle progression, the expression of G1 cyclins
and p21 in MCF-7 cells. Oncogene, 20(46), 6794-6804.
Flynn, P., Mellor, H., Palmer, R., Panayotou, G., & Parker, P. J. (1998). Multiple
interactions of PRK1 with RhoA. Functional assignment of the Hr1 repeat motif.
J Biol Chem, 273(5), 2698-2705. https://doi.org/10.1074/jbc.273.5.2698
Forsythe, E. L., Maxwell, D. L., & Pusey, M. (2002). Vapor diffusion, nucleation rates
and the reservoir to crystallization volume ratio. Acta Crystallogr D Biol
Crystallogr, 58(Pt 10 Pt 1), 1601-1605.
https://doi.org/10.1107/s0907444902014208
Francis, S., Croft, D., Schüttelkopf, A. W., Parry, C., Pugliese, A., Cameron, K., . . .
Bower, J. (2019). Structure-based design, synthesis and biological evaluation of
a novel series of isoquinolone and pyrazolo[4,3-c]pyridine inhibitors of fascin 1
as potential anti-metastatic agents. Bioorg Med Chem Lett, 29(8), 1023-1029.
https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2019.01.035
Frey, M. R., Clark, J. A., Leontieva, O., Uronis, J. M., Black, A. R., & Black, J. D. (2000).
Protein kinase C signaling mediates a program of cell cycle withdrawal in the
intestinal epithelium. J Cell Biol, 151(4), 763-778.
https://doi.org/10.1083/jcb.151.4.763
Frey, M. R., Saxon, M. L., Zhao, X., Rollins, A., Evans, S. S., & Black, J. D. (1997). Protein
kinase C isozyme-mediated cell cycle arrest involves induction of
p21(waf1/cip1) and p27(kip1) and hypophosphorylation of the retinoblastoma
protein in intestinal epithelial cells. J Biol Chem, 272(14), 9424-9435.
https://doi.org/10.1074/jbc.272.14.9424
Frutos, S., Moscat, J., & Diaz-Meco, M. T. (1999). Cleavage of zetaPKC but not
lambda/iotaPKC by caspase-3 during UV-induced apoptosis. J Biol Chem,
274(16), 10765-10770. https://doi.org/10.1074/jbc.274.16.10765
Fukumoto, S., Nishizawa, Y., Hosoi, M., Koyama, H., Yamakawa, K., Ohno, S., & Morii,
H. (1997). Protein kinase C delta inhibits the proliferation of vascular smooth
muscle cells by suppressing G1 cyclin expression. J Biol Chem, 272(21), 13816-
13822. https://doi.org/10.1074/jbc.272.21.13816
García-García, J., Gómez-Fernández, J. C., & Corbalán-García, S. (2001). Structural
characterization of the C2 domain of novel protein kinase Cepsilon. Eur J
Biochem, 268(4), 1107-1117. https://doi.org/10.1046/j.1432-
1327.2001.2680041107.x
Garrido, J. L., Godoy, J. A., Alvarez, A., Bronfman, M., & Inestrosa, N. C. (2002). Protein
kinase C inhibits amyloid beta peptide neurotoxicity by acting on members of
the Wnt pathway. FASEB J, 16(14), 1982-1984. https://doi.org/10.1096/fj.02-
0327fje
Gaul, C., Njardarson, J. T., Shan, D., Dorn, D. C., Wu, K. D., Tong, W. P., . . . Danishefsky,
S. J. (2004). The migrastatin family: discovery of potent cell migration inhibitors
385
REFERENCIAS
by chemical synthesis. J Am Chem Soc, 126(36), 11326-11337.

https://doi.org/10.1021/ja048779q
Gavrielides, M. V., Frijhoff, A. F., Conti, C. J., & Kazanietz, M. G. (2004). Protein kinase C
and prostate carcinogenesis: targeting the cell cycle and apoptotic
mechanisms. Curr Drug Targets, 5(5), 431-443.
https://doi.org/10.2174/1389450043345380
Ghayur, T., Hugunin, M., Talanian, R. V., Ratnofsky, S., Quinlan, C., Emoto, Y., . . . Kufe,
D. (1996). Proteolytic activation of protein kinase C delta by an ICE/CED 3-like
protease induces characteristics of apoptosis. J Exp Med, 184(6), 2399-2404.
https://doi.org/10.1084/jem.184.6.2399
Ghosh, P. M., Bedolla, R., Mikhailova, M., & Kreisberg, J. I. (2002). RhoA-dependent
murine prostate cancer cell proliferation and apoptosis: role of protein kinase
Czeta. Cancer Res, 62(9), 2630-2636.
Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., & Smith, H. O.
(2009). Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.
Nat Methods, 6(5), 343-345. https://doi.org/10.1038/nmeth.1318
Glaeser, R. M., Han, B. G., Csencsits, R., Killilea, A., Pulk, A., & Cate, J. H. (2016). Factors
that Influence the Formation and Stability of Thin, Cryo-EM Specimens. Biophys
J, 110(4), 749-755. https://doi.org/10.1016/j.bpj.2015.07.050
Goekjian, P. G., & Jirousek, M. R. (2001). Protein kinase C inhibitors as novel anticancer
drugs. Expert Opin Investig Drugs, 10(12), 2117-2140.
https://doi.org/10.1517/13543784.10.12.2117
Gomel, R., Xiang, C., Finniss, S., Lee, H. K., Lu, W., Okhrimenko, H., & Brodie, C. (2007).
The localization of protein kinase Cdelta in different subcellular sites affects its
proapoptotic and antiapoptotic functions and the activation of distinct
downstream signaling pathways. Mol Cancer Res, 5(6), 627-639.
https://doi.org/10.1158/1541-7786.MCR-06-0255
Gordge, P. C., Hulme, M. J., Clegg, R. A., & Miller, W. R. (1996). Elevation of protein
kinase A and protein kinase C activities in malignant as compared with normal
human breast tissue. Eur J Cancer, 32A(12), 2120-2126.
https://doi.org/10.1016/s0959-8049(96)00255-9
Gorrec, F. (2009). The MORPHEUS protein crystallization screen. J Appl Crystallogr,
42(Pt 6), 1035-1042. https://doi.org/10.1107/S0021889809042022
Gould, C. M., Kannan, N., Taylor, S. S., & Newton, A. C. (2009). The chaperones Hsp90
and Cdc37 mediate the maturation and stabilization of protein kinase C
through a conserved PXXP motif in the C-terminal tail. J Biol Chem, 284(8),
Griner, E. M., & Kazanietz, M. G. (2007). Protein kinase C and other diacylglycerol
effectors in cancer. Nat Rev Cancer, 7(4), 281-294.
https://doi.org/10.1038/nrc2110
Grodsky, N., Li, Y., Bouzida, D., Love, R., Jensen, J., Nodes, B., . . . Grant, S. (2006).
Structure of the catalytic domain of human protein kinase C beta II complexed
with a bisindolylmaleimide inhibitor. Biochemistry, 45(47), 13970-13981.
https://doi.org/10.1021/bi061128h
Grothey, A., Hashizume, R., Sahin, A. A., & McCrea, P. D. (2000). Fascin, an actin-
bundling protein associated with cell motility, is upregulated in hormone
386
REFERENCIAS
receptor negative breast cancer. Br J Cancer, 83(7), 870-873.

https://doi.org/10.1054/bjoc.2000.1395
Guerrero-Valero, M., Ferrer-Orta, C., Querol-Audí, J., Marin-Vicente, C., Fita, I., Gómez-
Fernández, J. C., . . . Corbalán-García, S. (2009). Structural and mechanistic
insights into the association of PKCalpha-C2 domain to PtdIns(4,5)P2. Proc Natl
Acad Sci U S A, 106(16), 6603-6607. https://doi.org/10.1073/pnas.0813099106
Gulick, A. M., Horswill, A. R., Thoden, J. B., Escalante-Semerena, J. C., & Rayment, I.
(2002). Pentaerythritol propoxylate: a new crystallization agent and
cryoprotectant induces crystal growth of 2-methylcitrate dehydratase. Acta
https://doi.org/10.1107/s0907444901018832
Gust, A., Zander, A., Gietl, A., Holzmeister, P., Schulz, S., Lalkens, B., . . . Grohmann, D.
(2014). A starting point for fluorescence-based single-molecule measurements
in biomolecular research. Molecules, 19(10), 15824-15865.
https://doi.org/10.3390/molecules191015824
Gutcher, I., Webb, P. R., & Anderson, N. G. (2003). The isoform-specific regulation of
apoptosis by protein kinase C. Cell Mol Life Sci, 60(6), 1061-1070.
https://doi.org/10.1007/s00018-003-2281-y
Hamaguchi, A., Suzuki, E., Murayama, K., Fujimura, T., Hikita, T., Iwabuchi, K., . . .
Hakomori, S. (2003). Sphingosine-dependent protein kinase-1, directed to 14-3-
3, is identified as the kinase domain of protein kinase C delta. J Biol Chem,
278(42), 41557-41565. https://doi.org/10.1074/jbc.M305294200
Han, S., Huang, J., Liu, B., Xing, B., Bordeleau, F., Reinhart-King, C. A., . . . Huang, X. Y.
(2016). Improving fascin inhibitors to block tumor cell migration
and metastasis. Mol Oncol, 10(7), 966-980.
https://doi.org/10.1016/j.molonc.2016.03.006
Han, Y., Fan, X., Wang, H., Zhao, F., Tully, C. G., Kong, J., . . . Yan, N. (2020). High-yield
monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.
Proc Natl Acad Sci U S A, 117(2), 1009-1014.
Harrington, E. O., Löffler, J., Nelson, P. R., Kent, K. C., Simons, M., & Ware, J. A. (1997).
Enhancement of migration by protein kinase Calpha and inhibition of
proliferation and cell cycle progression by protein kinase Cdelta in capillary
endothelial cells. J Biol Chem, 272(11), 7390-7397.
https://doi.org/10.1074/jbc.272.11.7390
Hartwig, J. H., Tyler, J., & Stossel, T. P. (1980). Actin-binding protein promotes the
bipolar and perpendicular branching of actin filaments. J Cell Biol, 87(3 Pt 1),
841-848. https://doi.org/10.1083/jcb.87.3.841
Hashimoto, Y., Kim, D. J., & Adams, J. C. (2011). The roles of fascins in health and
disease. J Pathol, 224(3), 289-300. https://doi.org/10.1002/path.2894
Hashimoto, Y., Parsons, M., & Adams, J. C. (2007). Dual actin-bundling and protein
kinase C-binding activities of fascin regulate carcinoma cell migration
downstream of Rac and contribute to metastasis. Mol Biol Cell, 18(11), 4591-
4602. https://doi.org/10.1091/mbc.e07-02-0157
Hashimoto, Y., Skacel, M., & Adams, J. C. (2005). Roles of fascin in human carcinoma
motility and signaling: prospects for a novel biomarker? Int J Biochem Cell Biol,
37(9), 1787-1804. https://doi.org/10.1016/j.biocel.2005.05.004
387
REFERENCIAS
Head, G. A., & Mayorov, D. N. (2006). Imidazoline receptors, novel agents and
therapeutic potential. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem, 4(1), 17-32.
https://doi.org/10.2174/187152506775268758
Heck, A. J. (2008). Native mass spectrometry: a bridge between interactomics and
structural biology. Nat Methods, 5(11), 927-933.
https://doi.org/10.1038/nmeth.1265
Henderson, R. (1995). The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays
for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Q Rev
Biophys, 28(2), 171-193. https://doi.org/10.1017/s003358350000305x
Hermanto, U., Zong, C. S., Li, W., & Wang, L. H. (2002). RACK1, an insulin-like growth
factor I (IGF-I) receptor-interacting protein, modulates IGF-I-dependent integrin
signaling and promotes cell spreading and contact with extracellular matrix.
Mol Cell Biol, 22(7), 2345-2365. https://doi.org/10.1128/mcb.22.7.2345-
2365.2002
Herzik, M. A., Wu, M., & Lander, G. C. (2019). High-resolution structure determination
of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nat Commun, 10(1),
1032. https://doi.org/10.1038/s41467-019-08991-8
Hoa, X. D., Kirk, A. G., & Tabrizian, M. (2007). Towards integrated and sensitive surface
plasmon resonance biosensors: a review of recent progress. Biosens
Bioelectron, 23(2), 151-160. https://doi.org/10.1016/j.bios.2007.07.001
Hochreiter, B., Garcia, A. P., & Schmid, J. A. (2015). Fluorescent proteins as genetically
encoded FRET biosensors in life sciences. Sensors (Basel), 15(10), 26281-26314.
https://doi.org/10.3390/s151026281
Hofmann, J. (2004). Protein kinase C isozymes as potential targets for anticancer
therapy. Curr Cancer Drug Targets, 4(2), 125-146.
https://doi.org/10.2174/1568009043481579
Holding, A. N. (2015). XL-MS: Protein cross-linking coupled with mass spectrometry.
Methods, 89, 54-63. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2015.06.010
Hommel, U., Zurini, M., & Luyten, M. (1994). Solution structure of a cysteine rich
domain of rat protein kinase C. Nat Struct Biol, 1(6), 383-387.
https://doi.org/10.1038/nsb0694-383
Homola, J. (2003). Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal
Bioanal Chem, 377(3), 528-539. https://doi.org/10.1007/s00216-003-2101-0
Hoppe, J., Hoppe, V., & Schäfer, R. (2001). Selective degradation of the PKC-epsilon
isoform during cell death in AKR-2B fibroblasts. Exp Cell Res, 266(1), 64-73.
https://doi.org/10.1006/excr.2001.5211
Hu, T. C., Korczyńska, J., Smith, D. K., & Brzozowski, A. M. (2008). High-molecular-
weight polymers for protein crystallization: poly-gamma-glutamic acid-based
precipitants. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 64(Pt 9), 957-963.
https://doi.org/10.1107/S0907444908021616
Huang, F. K., Han, S., Xing, B., Huang, J., Liu, B., Bordeleau, F., . . . Huang, X. Y. (2015).
Targeted inhibition of fascin function blocks tumour invasion and metastatic
colonization. Nat Commun, 6, 7465. https://doi.org/10.1038/ncomms8465
Huang, J., Dey, R., Wang, Y., Jakoncic, J., Kurinov, I., & Huang, X. Y. (2018). Structural
Insights into the Induced-fit Inhibition of Fascin by a Small-Molecule Inhibitor. J
Mol Biol, 430(9), 1324-1335. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2018.03.009
388
REFERENCIAS
Huberman, E., & Callaham, M. F. (1979). Induction of terminal differentiation in human

promyelocytic leukemia cells by tumor-promoting agents. Proc Natl Acad Sci U
S A, 76(3), 1293-1297. https://doi.org/10.1073/pnas.76.3.1293
Hundle, B., McMahon, T., Dadgar, J., & Messing, R. O. (1995). Overexpression of
epsilon-protein kinase C enhances nerve growth factor-induced
phosphorylation of mitogen-activated protein kinases and neurite outgrowth. J
Biol Chem, 270(50), 30134-30140. https://doi.org/10.1074/jbc.270.50.30134
Huse, M., & Kuriyan, J. (2002). The conformational plasticity of protein kinases. Cell,
109(3), 275-282. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(02)00741-9
Huynh, K., & Partch, C. L. (2015). Analysis of protein stability and ligand interactions by
thermal shift assay. Curr Protoc Protein Sci, 79, 28.29.21-28.29.14.
https://doi.org/10.1002/0471140864.ps2809s79
Ikenoue, T., Inoki, K., Yang, Q., Zhou, X., & Guan, K. L. (2008). Essential function of
TORC2 in PKC and Akt turn motif phosphorylation, maturation and signalling.
EMBO J, 27(14), 1919-1931. https://doi.org/10.1038/emboj.2008.119
Irie, K., Nakagawa, Y., & Ohigashi, H. (2005). Toward the development of new
medicinal leads with selectivity for protein kinase C isozymes. Chem Rec, 5(4),
185-195. https://doi.org/10.1002/tcr.20044
Ishii, H., Jirousek, M. R., Koya, D., Takagi, C., Xia, P., Clermont, A., . . . King, G. L. (1996).
Amelioration of vascular dysfunctions in diabetic rats by an oral PKC beta
inhibitor. Science, 272(5262), 728-731.
https://doi.org/10.1126/science.272.5262.728
Jansen, S., Collins, A., Yang, C., Rebowski, G., Svitkina, T., & Dominguez, R. (2011).
Mechanism of actin filament bundling by fascin. J Biol Chem, 286(34), 30087-
30096. https://doi.org/10.1074/jbc.M111.251439
Jayo, A., & Parsons, M. (2010). Fascin: a key regulator of cytoskeletal dynamics. Int J
Biochem Cell Biol, 42(10), 1614-1617.
https://doi.org/10.1016/j.biocel.2010.06.019
Jiang, Y., Berk, M., Singh, L. S., Tan, H., Yin, L., Powell, C. T., & Xu, Y. (2005). KiSS1
suppresses metastasis in human ovarian cancer via inhibition of protein kinase
C alpha. Clin Exp Metastasis, 22(5), 369-376. https://doi.org/10.1007/s10585-
005-8186-4
Joberty, G., Petersen, C., Gao, L., & Macara, I. G. (2000). The cell-polarity protein Par6
links Par3 and atypical protein kinase C to Cdc42. Nat Cell Biol, 2(8), 531-539.
https://doi.org/10.1038/35019573
Johnson, J. E., Giorgione, J., & Newton, A. C. (2000). The C1 and C2 domains of protein
kinase C are independent membrane targeting modules, with specificity for
phosphatidylserine conferred by the C1 domain. Biochemistry, 39(37), 11360-
11369. https://doi.org/10.1021/bi000902c
Joseloff, E., Cataisson, C., Aamodt, H., Ocheni, H., Blumberg, P., Kraker, A. J., & Yuspa,
S. H. (2002). Src family kinases phosphorylate protein kinase C delta on tyrosine
residues and modify the neoplastic phenotype of skin keratinocytes. J Biol
Chem, 277(14), 12318-12323. https://doi.org/10.1074/jbc.M111618200
Ju, J., Rajski, S. R., Lim, S. K., Seo, J. W., Peters, N. R., Hoffmann, F. M., & Shen, B.
(2008). Evaluation of new migrastatin and dorrigocin congeners unveils cell
migration inhibitors with dramatically improved potency. Bioorg Med Chem
Lett, 18(22), 5951-5954. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2008.07.072
389
REFERENCIAS
Jumper, J., Evans, R., Pritzel, A., Green, T., Figurnov, M., Ronneberger, O., . . . Hassabis,
D. (2021). Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature.
https://doi.org/10.1038/s41586-021-03819-2
Justilien, V., Walsh, M. P., Ali, S. A., Thompson, E. A., Murray, N. R., & Fields, A. P.
(2014). The PRKCI and SOX2 oncogenes are coamplified and cooperate to
activate Hedgehog signaling in lung squamous cell carcinoma. Cancer Cell,
25(2), 139-151. https://doi.org/10.1016/j.ccr.2014.01.008
Kane, R. E. (1975). Preparation and purification of polymerized actin from sea urchin
egg extracts. J Cell Biol, 66(2), 305-315. https://doi.org/10.1083/jcb.66.2.305
Kaufmann, A. (2018). Analytical performance of the various acquisition modes in
Orbitrap MS and MS/MS. J Mass Spectrom, 53(8), 725-738.
https://doi.org/10.1002/jms.4195
Kazanietz, M. G. (2002). Novel "nonkinase" phorbol ester receptors: the C1 domain
connection. Mol Pharmacol, 61(4), 759-767.
https://doi.org/10.1124/mol.61.4.759
Kazanietz, M. G. (2005). Targeting protein kinase C and "non-kinase" phorbol ester
receptors: emerging concepts and therapeutic implications. Biochim Biophys
Acta, 1754(1-2), 296-304. https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2005.07.034
Kazanietz, M. G., & Lemmon, M. A. (2011). Protein kinase C regulation: C1 meets C-tail.
Structure, 19(2), 144-146. https://doi.org/10.1016/j.str.2011.01.004
Keshamouni, V. G., Mattingly, R. R., & Reddy, K. B. (2002). Mechanism of 17-beta-
estradiol-induced Erk1/2 activation in breast cancer cells. A role for HER2 AND
PKC-delta. J Biol Chem, 277(25), 22558-22565.
Kheifets, V., & Mochly-Rosen, D. (2007). Insight into intra- and inter-molecular
interactions of PKC: design of specific modulators of kinase function. Pharmacol
Res, 55(6), 467-476. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2007.04.014
Khoshouei, M., Radjainia, M., Baumeister, W., & Danev, R. (2017). Cryo-EM structure
of haemoglobin at 3.2 Å determined with the Volta phase plate. Nat Commun,
8, 16099. https://doi.org/10.1038/ncomms16099
Khoshouei, M., Radjainia, M., Phillips, A. J., Gerrard, J. A., Mitra, A. K., Plitzko, J. M., . . .
Danev, R. (2016). Volta phase plate cryo-EM of the small protein complex Prx3.
Nat Commun, 7, 10534. https://doi.org/10.1038/ncomms10534
Kikkawa, U., Takai, Y., Tanaka, Y., Miyake, R., & Nishizuka, Y. (1983). Protein kinase C as
a possible receptor protein of tumor-promoting phorbol esters. J Biol Chem,
258(19), 11442-11445.
Kim, D. E., Chivian, D., & Baker, D. (2004). Protein structure prediction and analysis
using the Robetta server. Nucleic Acids Res, 32(Web Server issue), W526-531.
https://doi.org/10.1093/nar/gkh468
Kim, H. Y. (2017). Statistical notes for clinical researchers: Chi-squared test and Fisher's
exact test. Restor Dent Endod, 42(2), 152-155.
https://doi.org/10.5395/rde.2017.42.2.152
Kim, J., Choi, Y. L., Vallentin, A., Hunrichs, B. S., Hellerstein, M. K., Peehl, D. M., &
Mochly-Rosen, D. (2008). Centrosomal PKCbetaII and pericentrin are critical for
human prostate cancer growth and angiogenesis. Cancer Res, 68(16), 6831-
6839. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-07-6195
390
REFERENCIAS
Kim, J., & Guan, K. L. (2019). mTOR as a central hub of nutrient signalling and cell
growth. Nat Cell Biol, 21(1), 63-71. https://doi.org/10.1038/s41556-018-0205-1
Kim, J., Thorne, S. H., Sun, L., Huang, B., & Mochly-Rosen, D. (2011). Sustained
inhibition of PKCα reduces intravasation and lung seeding during mammary
tumor metastasis in an in vivo mouse model. Oncogene, 30(3), 323-333.
https://doi.org/10.1038/onc.2010.415
Kitajima, Y., Aoyama, Y., & Seishima, M. (1999). Transmembrane signaling for adhesive
regulation of desmosomes and hemidesmosomes, and for cell-cell datachment
induced by pemphigus IgG in cultured keratinocytes: involvement of protein
kinase C. J Investig Dermatol Symp Proc, 4(2), 137-144.
https://doi.org/10.1038/sj.jidsp.5640197
Kleywegt, G. J., & Jones, T. A. (1997). Model building and refinement practice. Methods
Enzymol, 277, 208-230. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(97)77013-7
Kost, T. A., Condreay, J. P., & Jarvis, D. L. (2005). Baculovirus as versatile vectors for
protein expression in insect and mammalian cells. Nat Biotechnol, 23(5), 567-
575. https://doi.org/10.1038/nbt1095
Koyanagi, T., Noguchi, K., Ootani, A., Inagaki, K., Robbins, R. C., & Mochly-Rosen, D.
(2007). Pharmacological inhibition of epsilon PKC suppresses chronic
inflammation in murine cardiac transplantation model. J Mol Cell Cardiol, 43(4),
517-522. https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2007.06.003
Kozakov, D., Hall, D. R., Xia, B., Porter, K. A., Padhorny, D., Yueh, C., . . . Vajda, S.
(2017). The ClusPro web server for protein-protein docking. Nat Protoc, 12(2),
255-278. https://doi.org/10.1038/nprot.2016.169
Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., & McIntosh, J. R. (1996). Computer visualization of
three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol, 116(1), 71-76.
https://doi.org/10.1006/jsbi.1996.0013
Kureishy, N., Sapountzi, V., Prag, S., Anilkumar, N., & Adams, J. C. (2002). Fascins, and
their roles in cell structure and function. Bioessays, 24(4), 350-361.
https://doi.org/10.1002/bies.10070
Labbé, C. M., Kuenemann, M. A., Zarzycka, B., Vriend, G., Nicolaes, G. A., Lagorce, D., . .
. Sperandio, O. (2016). iPPI-DB: an online database of modulators of protein-
protein interactions. Nucleic Acids Res, 44(D1), D542-547.
https://doi.org/10.1093/nar/gkv982
Labbé, C. M., Rey, J., Lagorce, D., Vavruša, M., Becot, J., Sperandio, O., . . . Miteva, M.
A. (2015). MTiOpenScreen: a web server for structure-based virtual screening.
Nucleic Acids Res, 43(W1), W448-454. https://doi.org/10.1093/nar/gkv306
Lamb, M. C., & Tootle, T. L. (2020). Fascin in Cell Migration: More Than an Actin
Bundling Protein. Biology (Basel), 9(11).
https://doi.org/10.3390/biology9110403
Larsson, C. (2006). Protein kinase C and the regulation of the actin cytoskeleton. Cell
Signal, 18(3), 276-284. https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2005.07.010
Layton, C. J., & Hellinga, H. W. (2010). Thermodynamic analysis of ligand-induced
changes in protein thermal unfolding applied to high-throughput determination
of ligand affinities with extrinsic fluorescent dyes. Biochemistry, 49(51), 10831-
10841. https://doi.org/10.1021/bi101414z
Le Good, J. A., Ziegler, W. H., Parekh, D. B., Alessi, D. R., Cohen, P., & Parker, P. J.
(1998). Protein kinase C isotypes controlled by phosphoinositide 3-kinase
391
REFERENCIAS
through the protein kinase PDK1. Science, 281(5385), 2042-2045.

https://doi.org/10.1126/science.281.5385.2042
Leach, K. L., James, M. L., & Blumberg, P. M. (1983). Characterization of a specific
phorbol ester aporeceptor in mouse brain cytosol. Proc Natl Acad Sci U S A,
80(14), 4208-4212. https://doi.org/10.1073/pnas.80.14.4208
Lee, S., Roh, S. H., Lee, J., Sung, N., Liu, J., & Tsai, F. T. F. (2019). Cryo-EM Structures of
the Hsp104 Protein Disaggregase Captured in the ATP Conformation. Cell Rep,
26(1), 29-36.e23. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2018.12.037
Leitner, A., Walzthoeni, T., Kahraman, A., Herzog, F., Rinner, O., Beck, M., & Aebersold,
R. (2010). Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass
spectrometry, and bioinformatics. Mol Cell Proteomics, 9(8), 1634-1649.
https://doi.org/10.1074/mcp.R000001-MCP201
Leonard, T. A., Różycki, B., Saidi, L. F., Hummer, G., & Hurley, J. H. (2011). Crystal
structure and allosteric activation of protein kinase C βII. Cell, 144(1), 55-66.
Leskow, F. C., Krasnapolski, M. A., & Urtreger, A. J. (2011). The pros and cons of
targeting protein kinase C (PKC) in the management of cancer patients. Curr
Pharm Biotechnol, 12(11), 1961-1973.
https://doi.org/10.2174/138920111798376950
Li, J., & Gobe, G. (2006). Protein kinase C activation and its role in kidney disease.
Nephrology (Carlton), 11(5), 428-434. https://doi.org/10.1111/j.1440-
1797.2006.00673.x
Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., . . . Cheng, Y.
(2013). Electron counting and beam-induced motion correction enable near-
atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods, 10(6), 584-590.
Lin, D., Edwards, A. S., Fawcett, J. P., Mbamalu, G., Scott, J. D., & Pawson, T. (2000). A
mammalian PAR-3-PAR-6 complex implicated in Cdc42/Rac1 and aPKC
signalling and cell polarity. Nat Cell Biol, 2(8), 540-547.
https://doi.org/10.1038/35019582
Littler, D. R., Walker, J. R., She, Y. M., Finerty, P. J., Newman, E. M., & Dhe-Paganon, S.
(2006). Structure of human protein kinase C eta (PKCeta) C2 domain and
identification of phosphorylation sites. Biochem Biophys Res Commun, 349(4),
1182-1189. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2006.08.160
Liu, F., & Heck, A. J. (2015). Interrogating the architecture of protein assemblies and
protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry. Curr Opin
Struct Biol, 35, 100-108. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2015.10.006
Liu, Y., Huynh, D. T., & Yeates, T. O. (2019). A 3.8 Å resolution cryo-EM structure of a
small protein bound to an imaging scaffold. Nat Commun, 10(1), 1864.
https://doi.org/10.1038/s41467-019-09836-0
Lorber, B., Fischer, F., Bailly, M., Roy, H., & Kern, D. (2012). Protein analysis by dynamic
light scattering: methods and techniques for students. Biochem Mol Biol Educ,
40(6), 372-382. https://doi.org/10.1002/bmb.20644
Lowry, J. A., & Brown, J. T. (2014). Significance of the imidazoline receptors in
toxicology. Clin Toxicol (Phila), 52(5), 454-469.
https://doi.org/10.3109/15563650.2014.898770
392
REFERENCIAS
Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., & Olins, P. O. (1993). Efficient generation of
infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated
insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia
coli. J Virol, 67(8), 4566-4579. https://doi.org/10.1128/JVI.67.8.4566-4579.1993
Luna-Ulloa, L. B., Hernández-Maqueda, J. G., Santoyo-Ramos, P., Castañeda-Patlán, M.
C., & Robles-Flores, M. (2011). Protein kinase C ζ is a positive modulator of
canonical Wnt signaling pathway in tumoral colon cell lines. Carcinogenesis,
32(11), 1615-1624. https://doi.org/10.1093/carcin/bgr190
Ma, L., Tao, Y., Duran, A., Llado, V., Galvez, A., Barger, J. F., . . . Moscat, J. (2013).
Control of nutrient stress-induced metabolic reprogramming by PKCζ in
tumorigenesis. Cell, 152(3), 599-611. https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.12.028
Macfarlane, D. E., & Manzel, L. (1994). Activation of beta-isozyme of protein kinase C
(PKC beta) is necessary and sufficient for phorbol ester-induced differentiation
of HL-60 promyelocytes. Studies with PKC beta-defective PET mutant. J Biol
Chem, 269(6), 4327-4331.
Machesky, L. M., & Li, A. (2010). Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis.
Commun Integr Biol, 3(3), 263-270. https://doi.org/10.4161/cib.3.3.11556
Mackay, K., & Mochly-Rosen, D. (2001). Localization, anchoring, and functions of
protein kinase C isozymes in the heart. J Mol Cell Cardiol, 33(7), 1301-1307.
https://doi.org/10.1006/jmcc.2001.1400
Mahler, H. C., Friess, W., Grauschopf, U., & Kiese, S. (2009). Protein aggregation:
pathways, induction factors and analysis. J Pharm Sci, 98(9), 2909-2934.
https://doi.org/10.1002/jps.21566
Maioli, E., & Valacchi, G. (2010). Rottlerin: bases for a possible usage in psoriasis. Curr
Drug Metab, 11(5), 425-430. https://doi.org/10.2174/138920010791526097
Mallavarapu, A., & Mitchison, T. (1999). Regulated actin cytoskeleton assembly at
filopodium tips controls their extension and retraction. J Cell Biol, 146(5), 1097-
1106. https://doi.org/10.1083/jcb.146.5.1097
Mamidipudi, V., Zhang, J., Lee, K. C., & Cartwright, C. A. (2004). RACK1 regulates G1/S
progression by suppressing Src kinase activity. Mol Cell Biol, 24(15), 6788-6798.
https://doi.org/10.1128/MCB.24.15.6788-6798.2004
Manji, H. K., & Lenox, R. H. (2000). Signaling: cellular insights into the pathophysiology
of bipolar disorder. Biol Psychiatry, 48(6), 518-530.
https://doi.org/10.1016/s0006-3223(00)00929-x
Martelli, A. M., Mazzotti, G., & Capitani, S. (2004). Nuclear protein kinase C isoforms
and apoptosis. Eur J Histochem, 48(1), 89-94. https://doi.org/10.4081/863
Martin, P., Duran, A., Minguet, S., Gaspar, M. L., Diaz-Meco, M. T., Rennert, P., . . .
Moscat, J. (2002). Role of zeta PKC in B-cell signaling and function. EMBO J,
21(15), 4049-4057. https://doi.org/10.1093/emboj/cdf407
Martínez, M., Jiménez-Moreno, A., Maluenda, D., Ramírez-Aportela, E., Melero, R.,
Cuervo, A., . . . Marabini, R. (2020). Integration of Cryo-EM Model Building
Software in. J Chem Inf Model, 60(5), 2533-2540.
https://doi.org/10.1021/acs.jcim.9b01032
Massoumi, R., Larsson, C., & Sjölander, A. (2002). Leukotriene D(4) induces stress-fibre
formation in intestinal epithelial cells via activation of RhoA and PKCdelta. J Cell
Sci, 115(Pt 17), 3509-3515.
393
REFERENCIAS
Matassa, A. A., Carpenter, L., Biden, T. J., Humphries, M. J., & Reyland, M. E. (2001).
PKCdelta is required for mitochondrial-dependent apoptosis in salivary
epithelial cells. J Biol Chem, 276(32), 29719-29728.
Matsudaira, P. (1994). Actin crosslinking proteins at the leading edge. Semin Cell Biol,
5(3), 165-174. https://doi.org/10.1006/scel.1994.1021
Mattila, P. K., & Lappalainen, P. (2008). Filopodia: molecular architecture and cellular
functions. Nat Rev Mol Cell Biol, 9(6), 446-454.
https://doi.org/10.1038/nrm2406
Mauro, L. V., Grossoni, V. C., Urtreger, A. J., Yang, C., Colombo, L. L., Morandi, A., . . .
Puricelli, L. L. (2010). PKC Delta (PKCdelta) promotes tumoral progression of
human ductal pancreatic cancer. Pancreas, 39(1), e31-41.
https://doi.org/10.1097/MPA.0b013e3181bce796
Maveyraud, L., & Mourey, L. (2020). Protein X-ray Crystallography and Drug Discovery.
Molecules, 25(5). https://doi.org/10.3390/molecules25051030
McLeod, M., Shor, B., Caporaso, A., Wang, W., Chen, H., & Hu, L. (2000). Cpc2, a fission
yeast homologue of mammalian RACK1 protein, interacts with Ran1 (Pat1)
kinase To regulate cell cycle progression and meiotic development. Mol Cell
Biol, 20(11), 4016-4027. https://doi.org/10.1128/mcb.20.11.4016-4027.2000
McPherson, A. (1990). Current approaches to macromolecular crystallization. Eur J
Biochem, 189(1), 1-23. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1990.tb15454.x
McPherson, A. (2001). A comparison of salts for the crystallization of macromolecules.
Protein Sci, 10(2), 418-422. https://doi.org/10.1110/ps.32001
McPherson, A., & Cudney, B. (2006). Searching for silver bullets: an alternative strategy
for crystallizing macromolecules. J Struct Biol, 156(3), 387-406.
https://doi.org/10.1016/j.jsb.2006.09.006
Mellor, H., & Parker, P. J. (1998). The extended protein kinase C superfamily. Biochem
J, 332 ( Pt 2), 281-292. https://doi.org/10.1042/bj3320281
Merk, A., Bartesaghi, A., Banerjee, S., Falconieri, V., Rao, P., Davis, M. I., . . .
Subramaniam, S. (2016). Breaking Cryo-EM Resolution Barriers to Facilitate
Drug Discovery. Cell, 165(7), 1698-1707.
Messerschmidt, A., Macieira, S., Velarde, M., Bädeker, M., Benda, C., Jestel, A., . . .
Blaesse, M. (2005). Crystal structure of the catalytic domain of human atypical
protein kinase C-iota reveals interaction mode of phosphorylation site in turn
motif. J Mol Biol, 352(4), 918-931. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2005.07.060
Meyer, T., & Oancea, E. (2000). Studies of signal transduction events using chimeras to
green fluorescent protein. Methods Enzymol, 327, 500-513.
https://doi.org/10.1016/s0076-6879(00)27298-4
Michie, A. M., & Nakagawa, R. (2005). The link between PKCalpha regulation and
cellular transformation. Immunol Lett, 96(2), 155-162.
https://doi.org/10.1016/j.imlet.2004.08.013
Millane, R. P., & Arnal, R. D. (2015). Uniqueness of the macromolecular
crystallographic phase problem. Acta Crystallogr A Found Adv, 71(Pt 6), 592-
598. https://doi.org/10.1107/S2053273315015387
394
REFERENCIAS
Mindell, J. A., & Grigorieff, N. (2003). Accurate determination of local defocus and
specimen tilt in electron microscopy. J Struct Biol, 142(3), 334-347.
https://doi.org/10.1016/s1047-8477(03)00069-8
Minton, A. P. (2007). Static light scattering from concentrated protein solutions, I:
General theory for protein mixtures and application to self-associating proteins.
Biophys J, 93(4), 1321-1328. https://doi.org/10.1529/biophysj.107.103895
Miotto, M., Olimpieri, P. P., Di Rienzo, L., Ambrosetti, F., Corsi, P., Lepore, R., . . .
Milanetti, E. (2019). Insights on protein thermal stability: a graph
representation of molecular interactions. Bioinformatics, 35(15), 2569-2577.
https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bty1011
Mochly-Rosen, D., Das, K., & Grimes, K. V. (2012). Protein kinase C, an elusive
therapeutic target? Nat Rev Drug Discov, 11(12), 937-957.
https://doi.org/10.1038/nrd3871
Mochly-Rosen, D., Miller, K. G., Scheller, R. H., Khaner, H., Lopez, J., & Smith, B. L.
(1992). p65 fragments, homologous to the C2 region of protein kinase C, bind
to the intracellular receptors for protein kinase C. Biochemistry, 31(35), 8120-
8124. https://doi.org/10.1021/bi00150a003
Mochly-Rosen, D., Wu, G., Hahn, H., Osinska, H., Liron, T., Lorenz, J. N., . . . Dorn, G. W.
(2000). Cardiotrophic effects of protein kinase C epsilon: analysis by in vivo
modulation of PKCepsilon translocation. Circ Res, 86(11), 1173-1179.
https://doi.org/10.1161/01.res.86.11.1173
Moscat, J., & Diaz-Meco, M. T. (2000). The atypical protein kinase Cs. Functional
specificity mediated by specific protein adapters. EMBO Rep, 1(5), 399-403.
https://doi.org/10.1093/embo-reports/kvd098
Moscat, J., Diaz-Meco, M. T., Albert, A., & Campuzano, S. (2006). Cell signaling and
function organized by PB1 domain interactions. Mol Cell, 23(5), 631-640.
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2006.08.002
Murray, N. R., Baumgardner, G. P., Burns, D. J., & Fields, A. P. (1993). Protein kinase C
isotypes in human erythroleukemia (K562) cell proliferation and differentiation.
Evidence that beta II protein kinase C is required for proliferation. J Biol Chem,
268(21), 15847-15853.
Murray, N. R., Davidson, L. A., Chapkin, R. S., Clay Gustafson, W., Schattenberg, D. G.,
& Fields, A. P. (1999). Overexpression of protein kinase C betaII induces colonic
hyperproliferation and increased sensitivity to colon carcinogenesis. J Cell Biol,
145(4), 699-711. https://doi.org/10.1083/jcb.145.4.699
Murshudov, G. N., Vagin, A. A., & Dodson, E. J. (1997). Refinement of macromolecular
structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol
Crystallogr, 53(Pt 3), 240-255. https://doi.org/10.1107/S0907444996012255
Nakae, K., Yoshimoto, Y., Ueda, M., Sawa, T., Takahashi, Y., Naganawa, H., . . . Imoto,
M. (2000). Migrastatin, a novel 14-membered lactone from Streptomyces sp.
MK929-43F1. J Antibiot (Tokyo), 53(10), 1228-1230.
https://doi.org/10.7164/antibiotics.53.1228
Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., . . . Perrakis, A.
(2005). Towards rationalization of crystallization screening for small- to
medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta
https://doi.org/10.1107/S0907444905024984
395
REFERENCIAS
Newstead, S., Ferrandon, S., & Iwata, S. (2008). Rationalizing alpha-helical membrane
protein crystallization. Protein Sci, 17(3), 466-472.
https://doi.org/10.1110/ps.073263108
Newton, A. C. (1995). Protein kinase C: structure, function, and regulation. J Biol Chem,
270(48), 28495-28498. https://doi.org/10.1074/jbc.270.48.28495
Newton, A. C. (2001). Protein kinase C: structural and spatial regulation by
phosphorylation, cofactors, and macromolecular interactions. Chem Rev,
101(8), 2353-2364. https://doi.org/10.1021/cr0002801
Newton, A. C. (2003). Regulation of the ABC kinases by phosphorylation: protein kinase
C as a paradigm. Biochem J, 370(Pt 2), 361-371.
https://doi.org/10.1042/BJ20021626
Newton, A. C. (2018). Protein kinase C: perfectly balanced. Crit Rev Biochem Mol Biol,
53(2), 208-230. https://doi.org/10.1080/10409238.2018.1442408
Newton, A. C., & Brognard, J. (2017). Reversing the Paradigm: Protein Kinase C as a
Tumor Suppressor. Trends Pharmacol Sci, 38(5), 438-447.
https://doi.org/10.1016/j.tips.2017.02.002
Ng, T., Parsons, M., Hughes, W. E., Monypenny, J., Zicha, D., Gautreau, A., . . . Parker,
P. J. (2001). Ezrin is a downstream effector of trafficking PKC-integrin
complexes involved in the control of cell motility. EMBO J, 20(11), 2723-2741.
https://doi.org/10.1093/emboj/20.11.2723
Ng, T., Shima, D., Squire, A., Bastiaens, P. I., Gschmeissner, S., Humphries, M. J., &
Parker, P. J. (1999). PKCalpha regulates beta1 integrin-dependent cell motility
through association and control of integrin traffic. EMBO J, 18(14), 3909-3923.
Nishimura, T., Kato, K., Yamaguchi, T., Fukata, Y., Ohno, S., & Kaibuchi, K. (2004). Role
of the PAR-3-KIF3 complex in the establishment of neuronal polarity. Nat Cell
Biol, 6(4), 328-334. https://doi.org/10.1038/ncb1118
Nishizuka, Y. (1992). Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and
activation of protein kinase C. Science, 258(5082), 607-614.
https://doi.org/10.1126/science.1411571
Njardarson, J. T., Gaul, C., Shan, D., Huang, X. Y., & Danishefsky, S. J. (2004). Discovery
of potent cell migration inhibitors through total synthesis: lessons from
structure-activity studies of (+)-migrastatin. J Am Chem Soc, 126(4), 1038-1040.
https://doi.org/10.1021/ja039714a
Nogales, E., & Scheres, S. H. (2015). Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of
Macromolecular Complexity. Mol Cell, 58(4), 677-689.
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2015.02.019
Nwaneshiudu, A., Kuschal, C., Sakamoto, F. H., Anderson, R. R., Schwarzenberger, K., &
Young, R. C. (2012). Introduction to confocal microscopy. J Invest Dermatol,
132(12), e3. https://doi.org/10.1038/jid.2012.429
Ohba, M., Ishino, K., Kashiwagi, M., Kawabe, S., Chida, K., Huh, N. H., & Kuroki, T.
(1998). Induction of differentiation in normal human keratinocytes by
adenovirus-mediated introduction of the eta and delta isoforms of protein
kinase C. Mol Cell Biol, 18(9), 5199-5207.
https://doi.org/10.1128/mcb.18.9.5199
396
REFERENCIAS
Ohno, S., & Nishizuka, Y. (2002). Protein kinase C isotypes and their specific functions:
prologue. J Biochem, 132(4), 509-511.
https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.jbchem.a003249
Oka, M., & Kikkawa, U. (2005). Protein kinase C in melanoma. Cancer Metastasis Rev,
24(2), 287-300. https://doi.org/10.1007/s10555-005-1578-8
Olson, E. R., Shamhart, P. E., Naugle, J. E., & Meszaros, J. G. (2008). Angiotensin II-
induced extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation is mediated by
protein kinase Cdelta and intracellular calcium in adult rat cardiac fibroblasts.
Hypertension, 51(3), 704-711.
https://doi.org/10.1161/HYPERTENSIONAHA.107.098459
Ono, S., Yamakita, Y., Yamashiro, S., Matsudaira, P. T., Gnarra, J. R., Obinata, T., &
Matsumura, F. (1997). Identification of an actin binding region and a protein
kinase C phosphorylation site on human fascin. J Biol Chem, 272(4), 2527-2533.
https://doi.org/10.1074/jbc.272.4.2527
Orlova, E. V., & Saibil, H. R. (2011). Structural analysis of macromolecular assemblies by
electron microscopy. Chem Rev, 111(12), 7710-7748.
https://doi.org/10.1021/cr100353t
Orr, J. W., & Newton, A. C. (1994). Intrapeptide regulation of protein kinase C. J Biol
Chem, 269(11), 8383-8387.
Otte, A. P., Kramer, I. M., & Durston, A. J. (1991). Protein kinase C and regulation of the
local competence of Xenopus ectoderm. Science, 251(4993), 570-573.
Otto, J. J., Kane, R. E., & Bryan, J. (1979). Formation of filopodia in coelomocytes:
localization of fascin, a 58,000 dalton actin cross-linking protein. Cell, 17(2),
285-293. https://doi.org/10.1016/0092-8674(79)90154-5
Paddock, S. W. (2000). Principles and practices of laser scanning confocal microscopy.
Mol Biotechnol, 16(2), 127-149. https://doi.org/10.1385/MB:16:2:127
Palaniyandi, S. S., Ferreira, J. C., Brum, P. C., & Mochly-Rosen, D. (2011). PKCβII
inhibition attenuates myocardial infarction induced heart failure and is
associated with a reduction of fibrosis and pro-inflammatory responses. J Cell
Mol Med, 15(8), 1769-1777. https://doi.org/10.1111/j.1582-4934.2010.01174.x
Palaniyandi, S. S., Sun, L., Ferreira, J. C., & Mochly-Rosen, D. (2009). Protein kinase C in
heart failure: a therapeutic target? Cardiovasc Res, 82(2), 229-239.
https://doi.org/10.1093/cvr/cvp001
Pantaloni, D., Le Clainche, C., & Carlier, M. F. (2001). Mechanism of actin-based
motility. Science, 292(5521), 1502-1506.
Pappa, H., Murray-Rust, J., Dekker, L. V., Parker, P. J., & McDonald, N. Q. (1998). Crystal
structure of the C2 domain from protein kinase C-delta. Structure, 6(7), 885-
894. https://doi.org/10.1016/s0969-2126(98)00090-2
Parekh, D. B., Ziegler, W., & Parker, P. J. (2000). Multiple pathways control protein
kinase C phosphorylation. EMBO J, 19(4), 496-503.
Parsons, M., Keppler, M. D., Kline, A., Messent, A., Humphries, M. J., Gilchrist, R., . . .
Ng, T. (2002). Site-directed perturbation of protein kinase C- integrin
interaction blocks carcinoma cell chemotaxis. Mol Cell Biol, 22(16), 5897-5911.
https://doi.org/10.1128/mcb.22.16.5897-5911.2002
397
REFERENCIAS
Passmore, L. A., & Russo, C. J. (2016). Specimen Preparation for High-Resolution Cryo-
EM. Methods Enzymol, 579, 51-86.
https://doi.org/10.1016/bs.mie.2016.04.011
Patel, R., Win, H., Desai, S., Patel, K., Matthews, J. A., & Acevedo-Duncan, M. (2008).
Involvement of PKC-iota in glioma proliferation. Cell Prolif, 41(1), 122-135.
https://doi.org/10.1111/j.1365-2184.2007.00506.x
Pattnaik, P. (2005). Surface plasmon resonance: applications in understanding
receptor-ligand interaction. Appl Biochem Biotechnol, 126(2), 79-92.
https://doi.org/10.1385/abab:126:2:079
Pearce, L. R., Komander, D., & Alessi, D. R. (2010). The nuts and bolts of AGC protein
kinases. Nat Rev Mol Cell Biol, 11(1), 9-22. https://doi.org/10.1038/nrm2822
Pelosi, G., Pasini, F., Fraggetta, F., Pastorino, U., Iannucci, A., Maisonneuve, P., . . .
Viale, G. (2003). Independent value of fascin immunoreactivity for predicting
lymph node metastases in typical and atypical pulmonary carcinoids. Lung
Cancer, 42(2), 203-213. https://doi.org/10.1016/s0169-5002(03)00294-0
Pelosi, G., Pastorino, U., Pasini, F., Maissoneuve, P., Fraggetta, F., Iannucci, A., . . .
Viale, G. (2003). Independent prognostic value of fascin immunoreactivity in
stage I nonsmall cell lung cancer. Br J Cancer, 88(4), 537-547.
https://doi.org/10.1038/sj.bjc.6600731
Peplow, M. (2020). Cryo-Electron Microscopy Reaches Resolution Milestone. ACS Cent
Sci, 6(8), 1274-1277. https://doi.org/10.1021/acscentsci.0c01048
Perletti, G. P., Concari, P., Brusaferri, S., Marras, E., Piccinini, F., & Tashjian, A. H.
(1998). Protein kinase Cepsilon is oncogenic in colon epithelial cells by
interaction with the ras signal transduction pathway. Oncogene, 16(25), 3345-
3348. https://doi.org/10.1038/sj.onc.1201871
Petran, M., Hadravsky, M., Benes, J., & Boyde, A. (1986). In vivo microscopy using the
tandem scanning microscope. Ann N Y Acad Sci, 483, 440-447.
https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.1986.tb34554.x
Pollard, T. D., & Borisy, G. G. (2003). Cellular motility driven by assembly and
disassembly of actin filaments. Cell, 112(4), 453-465.
https://doi.org/10.1016/s0092-8674(03)00120-x
Ponting, C. P., & Russell, R. B. (2000). Identification of distant homologues of fibroblast
growth factors suggests a common ancestor for all beta-trefoil proteins. J Mol
Biol, 302(5), 1041-1047. https://doi.org/10.1006/jmbi.2000.4087
Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., & Brubaker, M. A. (2017). cryoSPARC:
algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat
Methods, 14(3), 290-296. https://doi.org/10.1038/nmeth.4169
Puppa, G., Maisonneuve, P., Sonzogni, A., Masullo, M., Chiappa, A., Valerio, M., . . .
Pelosi, G. (2007). Independent prognostic value of fascin immunoreactivity in
stage III-IV colonic adenocarcinoma. Br J Cancer, 96(7), 1118-1126.
https://doi.org/10.1038/sj.bjc.6603690
Pushpakom, S., Iorio, F., Eyers, P. A., Escott, K. J., Hopper, S., Wells, A., . . .
Pirmohamed, M. (2019). Drug repurposing: progress, challenges and
recommendations. Nat Rev Drug Discov, 18(1), 41-58.
https://doi.org/10.1038/nrd.2018.168
Påhlman, S., Odelstad, L., Larsson, E., Grotte, G., & Nilsson, K. (1981). Phenotypic
changes of human neuroblastoma cells in culture induced by 12-O-
398
REFERENCIAS
tetradecanoyl-phorbol-13-acetate. Int J Cancer, 28(5), 583-589.

https://doi.org/10.1002/ijc.2910280509
Radaev, S., Li, S., & Sun, P. D. (2006). A survey of protein-protein complex
crystallizations. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 62(Pt 6), 605-612.
https://doi.org/10.1107/S0907444906011735
Rappsilber, J. (2011). The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass
spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J Struct
Biol, 173(3), 530-540. https://doi.org/10.1016/j.jsb.2010.10.014
Reddy Chichili, V. P., Kumar, V., & Sivaraman, J. (2013). Linkers in the structural biology
of protein-protein interactions. Protein Sci, 22(2), 153-167.
https://doi.org/10.1002/pro.2206
Regala, R. P., Weems, C., Jamieson, L., Khoor, A., Edell, E. S., Lohse, C. M., & Fields, A.
P. (2005). Atypical protein kinase C iota is an oncogene in human non-small cell
lung cancer. Cancer Res, 65(19), 8905-8911. https://doi.org/10.1158/0008-
5472.CAN-05-2372
Reyland, M. E. (2007). Protein kinase Cdelta and apoptosis. Biochem Soc Trans, 35(Pt
5), 1001-1004. https://doi.org/10.1042/BST0351001
Rohou, A., & Grigorieff, N. (2015). CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation
from electron micrographs. J Struct Biol, 192(2), 216-221.
Ron, D., Jiang, Z., Yao, L., Vagts, A., Diamond, I., & Gordon, A. (1999). Coordinated
movement of RACK1 with activated betaIIPKC. J Biol Chem, 274(38), 27039-
27046. https://doi.org/10.1074/jbc.274.38.27039
Ron, D., & Kazanietz, M. G. (1999). New insights into the regulation of protein kinase C
and novel phorbol ester receptors. FASEB J, 13(13), 1658-1676.
Ron, D., & Mochly-Rosen, D. (1995). An autoregulatory region in protein kinase C: the
pseudoanchoring site. Proc Natl Acad Sci U S A, 92(2), 492-496.
https://doi.org/10.1073/pnas.92.2.492
Ron, D., Vagts, A. J., Dohrman, D. P., Yaka, R., Jiang, Z., Yao, L., . . . Diamond, I. (2000).
Uncoupling of betaIIPKC from its targeting protein RACK1 in response to
ethanol in cultured cells and mouse brain. FASEB J, 14(14), 2303-2314.
https://doi.org/10.1096/fj.00-0143com
Routledge, K. E., Tartaglia, G. G., Platt, G. W., Vendruscolo, M., & Radford, S. E. (2009).
Competition between intramolecular and intermolecular interactions in an
amyloid-forming protein. J Mol Biol, 389(4), 776-786.
https://doi.org/10.1016/j.jmb.2009.04.042
Rozengurt, E. (1986). Early signals in the mitogenic response. Science, 234(4773), 161-
166. https://doi.org/10.1126/science.3018928
Ruiz Carrillo, D., Chandrasekaran, R., Nilsson, M., Cornvik, T., Liew, C. W., Tan, S. M., &
Lescar, J. (2012). Structure of human Rack1 protein at a resolution of 2.45 Å.
Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 68(Pt 8), 867-872.
https://doi.org/10.1107/S1744309112027480
Rupp, B. (2015). Origin and use of crystallization phase diagrams. Acta Crystallogr F
Struct Biol Commun, 71(Pt 3), 247-260.
https://doi.org/10.1107/S2053230X1500374X
399
REFERENCIAS
Russo, C. J., & Passmore, L. A. (2014). Electron microscopy: Ultrastable gold substrates
for electron cryomicroscopy. Science, 346(6215), 1377-1380.
Saridakis, E. E., Stewart, P. D., Lloyd, L. F., & Blow, D. M. (1994). Phase diagram and
dilution experiments in the crystallization of carboxypeptidase G2. Acta
https://doi.org/10.1107/S0907444993013186
Schechtman, D., & Mochly-Rosen, D. (2001). Adaptor proteins in protein kinase C-
mediated signal transduction. Oncogene, 20(44), 6339-6347.
Scheres, S. H. (2012). RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM
structure determination. J Struct Biol, 180(3), 519-530.
Schneider, C. A., Rasband, W. S., & Eliceiri, K. W. (2012). NIH Image to ImageJ: 25 years
of image analysis. Nat Methods, 9(7), 671-675.
Sedeh, R. S., Fedorov, A. A., Fedorov, E. V., Ono, S., Matsumura, F., Almo, S. C., &
Bathe, M. (2010). Structure, evolutionary conservation, and conformational
dynamics of Homo sapiens fascin-1, an F-actin crosslinking protein. J Mol Biol,
400(3), 589-604. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2010.04.043
Ser, Z., Cifani, P., & Kentsis, A. (2019). Optimized Cross-Linking Mass Spectrometry for
in Situ Interaction Proteomics. J Proteome Res, 18(6), 2545-2558.
https://doi.org/10.1021/acs.jproteome.9b00085
Serafin, M. B., Bottega, A., Foletto, V. S., da Rosa, T. F., Hörner, A., & Hörner, R. (2020).
Drug repositioning is an alternative for the treatment of coronavirus COVID-19.
Int J Antimicrob Agents, 55(6), 105969.
https://doi.org/10.1016/j.ijantimicag.2020.105969
Shan, D., Chen, L., Njardarson, J. T., Gaul, C., Ma, X., Danishefsky, S. J., & Huang, X. Y.
(2005). Synthetic analogues of migrastatin that inhibit mammary tumor
metastasis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 102(10), 3772-3776.
Sharkey, N. A., Leach, K. L., & Blumberg, P. M. (1984). Competitive inhibition by
diacylglycerol of specific phorbol ester binding. Proc Natl Acad Sci U S A, 81(2),
607-610. https://doi.org/10.1073/pnas.81.2.607
Shen, P. S. (2018). The 2017 Nobel Prize in Chemistry: cryo-EM comes of age. Anal
Bioanal Chem, 410(8), 2053-2057. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0899-8
Shiba, K., Niidome, T., Katoh, E., Xiang, H., Han, L., Mori, T., & Katayama, Y. (2010).
Polydispersity as a parameter for indicating the thermal stability of proteins by
dynamic light scattering. Anal Sci, 26(6), 659-663.
https://doi.org/10.2116/analsci.26.659
Shibata, H., Mukai, H., Inagaki, Y., Homma, Y., Kimura, K., Kaibuchi, K., . . . Ono, Y.
(1996). Characterization of the interaction between RhoA and the amino-
terminal region of PKN. FEBS Lett, 385(3), 221-224.
https://doi.org/10.1016/0014-5793(96)00385-7
Shoemaker, S. C., & Ando, N. (2018). X-rays in the Cryo-Electron Microscopy Era:
Structural Biology's Dynamic Future. Biochemistry, 57(3), 277-285.
https://doi.org/10.1021/acs.biochem.7b01031
400
REFERENCIAS
Short, M. D., Fox, S. M., Lam, C. F., Stenmark, K. R., & Das, M. (2006). Protein kinase
Czeta attenuates hypoxia-induced proliferation of fibroblasts by regulating
MAP kinase phosphatase-1 expression. Mol Biol Cell, 17(4), 1995-2008.
https://doi.org/10.1091/mbc.e05-09-0869
Simonis, G., Braun, M. U., Kirrstetter, M., Schön, S. P., & Strasser, R. H. (2003).
Mechanisms of myocardial remodeling: ramiprilat blocks the expressional
upregulation of protein kinase C-epsilon in the surviving myocardium early
after infarction. J Cardiovasc Pharmacol, 41(5), 780-787.
https://doi.org/10.1097/00005344-200305000-00016
Sinz, A. (2006). Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-
dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass
Spectrom Rev, 25(4), 663-682. https://doi.org/10.1002/mas.20082
Sinz, A. (2014). The advancement of chemical cross-linking and mass spectrometry for
structural proteomics: from single proteins to protein interaction networks.
Expert Rev Proteomics, 11(6), 733-743.
https://doi.org/10.1586/14789450.2014.960852
Small, J. V., Stradal, T., Vignal, E., & Rottner, K. (2002). The lamellipodium: where
motility begins. Trends Cell Biol, 12(3), 112-120. https://doi.org/10.1016/s0962-
8924(01)02237-1
Smith, L., & Smith, J. B. (2002). Lack of constitutive activity of the free kinase domain of
protein kinase C zeta. Dependence on transphosphorylation of the activation
loop. J Biol Chem, 277(48), 45866-45873.
Soderling, T. R. (1990). Protein kinases. Regulation by autoinhibitory domains. J Biol
Chem, 265(4), 1823-1826.
Soh, J. W., & Weinstein, I. B. (2003). Roles of specific isoforms of protein kinase C in
the transcriptional control of cyclin D1 and related genes. J Biol Chem, 278(36),
Solodukhin, A. S., Kretsinger, R. H., & Sando, J. J. (2007). Initial three-dimensional
reconstructions of protein kinase C delta from two-dimensional crystals on lipid
monolayers. Cell Signal, 19(10), 2035-2045.
https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2007.05.010
Soule, H. D., Vazguez, J., Long, A., Albert, S., & Brennan, M. (1973). A human cell line
from a pleural effusion derived from a breast carcinoma. J Natl Cancer Inst,
51(5), 1409-1416. https://doi.org/10.1093/jnci/51.5.1409
Stakyte, K., Rotheneder, M., Lammens, K., Bartho, J. D., Grädler, U., Fuchß, T., . . .
Hopfner, K. P. (2021). Molecular basis of human ATM kinase inhibition. Nat
Struct Mol Biol, 28(10), 789-798. https://doi.org/10.1038/s41594-021-00654-x
Stebbins, E. G., & Mochly-Rosen, D. (2001). Binding specificity for RACK1 resides in the
V5 region of beta II protein kinase C. J Biol Chem, 276(32), 29644-29650.
Steinberg, S. F. (2008). Structural basis of protein kinase C isoform function. Physiol
Rev, 88(4), 1341-1378. https://doi.org/10.1152/physrev.00034.2007
Stensman, H., & Larsson, C. (2007). Identification of acidic amino acid residues in the
protein kinase C alpha V5 domain that contribute to its insensitivity to
diacylglycerol. J Biol Chem, 282(39), 28627-28638.
401
REFERENCIAS
Stetefeld, J., McKenna, S. A., & Patel, T. R. (2016). Dynamic light scattering: a practical
guide and applications in biomedical sciences. Biophys Rev, 8(4), 409-427.
https://doi.org/10.1007/s12551-016-0218-6
Sugarman, B. J., Aggarwal, B. B., Hass, P. E., Figari, I. S., Palladino, M. A., & Shepard, H.
M. (1985). Recombinant human tumor necrosis factor-alpha: effects on
proliferation of normal and transformed cells in vitro. Science, 230(4728), 943-
945. https://doi.org/10.1126/science.3933111
Sumitomo, M., Ohba, M., Asakuma, J., Asano, T., Kuroki, T., & Hayakawa, M. (2002).
Protein kinase Cdelta amplifies ceramide formation via mitochondrial signaling
in prostate cancer cells. J Clin Invest, 109(6), 827-836.
https://doi.org/10.1172/JCI14146
Sun, M. K., & Alkon, D. L. (2010). Pharmacology of protein kinase C activators:
cognition-enhancing and antidementic therapeutics. Pharmacol Ther, 127(1),
66-77. https://doi.org/10.1016/j.pharmthera.2010.03.001
Sutton, R. B., & Sprang, S. R. (1998). Structure of the protein kinase Cbeta
phospholipid-binding C2 domain complexed with Ca2+. Structure, 6(11), 1395-
1405. https://doi.org/10.1016/s0969-2126(98)00139-7
Swannie, H. C., & Kaye, S. B. (2002). Protein kinase C inhibitors. Curr Oncol Rep, 4(1),
37-46. https://doi.org/10.1007/s11912-002-0046-7
Sweitzer, S. M., Wong, S. M., Peters, M. C., Mochly-Rosen, D., Yeomans, D. C., &
Kendig, J. J. (2004). Protein kinase C epsilon and gamma: involvement in
formalin-induced nociception in neonatal rats. J Pharmacol Exp Ther, 309(2),
616-625. https://doi.org/10.1124/jpet.103.060350
Symonds, J. M., Ohm, A. M., Carter, C. J., Heasley, L. E., Boyle, T. A., Franklin, W. A., &
Reyland, M. E. (2011). Protein kinase C δ is a downstream effector of oncogenic
K-ras in lung tumors. Cancer Res, 71(6), 2087-2097.
https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-10-1511
Takai, Y., Kishimoto, A., Inoue, M., & Nishizuka, Y. (1977). Studies on a cyclic
nucleotide-independent protein kinase and its proenzyme in mammalian
tissues. I. Purification and characterization of an active enzyme from bovine
cerebellum. J Biol Chem, 252(21), 7603-7609.
Takai, Y., Kishimoto, A., Kikkawa, U., Mori, T., & Nishizuka, Y. (1979). Unsaturated
diacylglycerol as a possible messenger for the activation of calcium-activated,
phospholipid-dependent protein kinase system. Biochem Biophys Res Commun,
91(4), 1218-1224. https://doi.org/10.1016/0006-291x(79)91197-5
Takimura, T., Kamata, K., Fukasawa, K., Ohsawa, H., Komatani, H., Yoshizumi, T., . . .
Iwasawa, Y. (2010). Structures of the PKC-iota kinase domain in its ATP-bound
and apo forms reveal defined structures of residues 533-551 in the C-terminal
tail and their roles in ATP binding. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66(Pt 5),
577-583. https://doi.org/10.1107/S0907444910005639
Takuwa, N., Takuwa, Y., & Rasmussen, H. (1988). Stimulation of mitogenesis and
glucose transport by 1-monooleoylglycerol in Swiss 3T3 fibroblasts. J Biol Chem,
263(20), 9738-9745.
Taylor, G. (2003). The phase problem. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 59(Pt 11),
1881-1890. https://doi.org/10.1107/s0907444903017815
Taylor, K. A., & Glaeser, R. M. (2008). Retrospective on the early development of
cryoelectron microscopy of macromolecules and a prospective on
402
REFERENCIAS
opportunities for the future. J Struct Biol, 163(3), 214-223.

Thomas, J. M. (2012). Centenary: The birth of X-ray crystallography. Nature, 491(7423),
186-187. https://doi.org/10.1038/491186a
Tilney, L. G., Connelly, P. S., Vranich, K. A., Shaw, M. K., & Guild, G. M. (1998). Why are
two different cross-linkers necessary for actin bundle formation in vivo and
what does each cross-link contribute? J Cell Biol, 143(1), 121-133.
https://doi.org/10.1083/jcb.143.1.121
Torchet, R., Druart, K., Ruano, L. C., Moine-Franel, A., Borges, H., Doppelt-Azeroual, O.,
. . . Sperandio, O. (2021). The iPPI-DB initiative: A Community-centered
database of Protein-Protein Interaction modulators. Bioinformatics.
https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btaa1091
Totoń, E., Ignatowicz, E., Skrzeczkowska, K., & Rybczyńska, M. (2011). Protein kinase Cε
as a cancer marker and target for anticancer therapy. Pharmacol Rep, 63(1), 19-
29. https://doi.org/10.1016/s1734-1140(11)70395-4
Turk, M., & Baumeister, W. (2020). The promise and the challenges of cryo-electron
tomography. FEBS Lett, 594(20), 3243-3261. https://doi.org/10.1002/1873-
3468.13948
Tuttle, K. R. (2008). Protein kinase C-beta inhibition for diabetic kidney disease.
Diabetes Res Clin Pract, 82 Suppl 1, S70-74.
https://doi.org/10.1016/j.diabres.2008.09.041
Tyagi, R., Tyagi, V. K., & Pandey, S. K. (2007). Imidazoline and its derivatives: an
overview. J Oleo Sci, 56(5), 211-222. https://doi.org/10.5650/jos.56.211
Ueda, Y., Hirai, S., Osada, S., Suzuki, A., Mizuno, K., & Ohno, S. (1996). Protein kinase C
activates the MEK-ERK pathway in a manner independent of Ras and
dependent on Raf. J Biol Chem, 271(38), 23512-23519.
https://doi.org/10.1074/jbc.271.38.23512
Uht, R. M., Amos, S., Martin, P. M., Riggan, A. E., & Hussaini, I. M. (2007). The protein
kinase C-eta isoform induces proliferation in glioblastoma cell lines through an
ERK/Elk-1 pathway. Oncogene, 26(20), 2885-2893.
Varin, M. M., Guerrier, T., Devauchelle-Pensec, V., Jamin, C., Youinou, P., & Pers, J. O.
(2012). In Sjögren's syndrome, B lymphocytes induce epithelial cells of salivary
glands into apoptosis through protein kinase C delta activation. Autoimmun
Rev, 11(4), 252-258. https://doi.org/10.1016/j.autrev.2011.10.005
Vaughn, J. L., Goodwin, R. H., Tompkins, G. J., & McCawley, P. (1977). The
establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda
(Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro, 13(4), 213-217.
https://doi.org/10.1007/BF02615077
Verdaguer, N., Corbalan-Garcia, S., Ochoa, W. F., Fita, I., & Gómez-Fernández, J. C.
(1999). Ca(2+) bridges the C2 membrane-binding domain of protein kinase
Calpha directly to phosphatidylserine. EMBO J, 18(22), 6329-6338.
Verma, A. K., Wheeler, D. L., Aziz, M. H., & Manoharan, H. (2006). Protein kinase
Cepsilon and development of squamous cell carcinoma, the nonmelanoma
human skin cancer. Mol Carcinog, 45(6), 381-388.
https://doi.org/10.1002/mc.20230
403
REFERENCIAS
Vignjevic, D., Kojima, S., Aratyn, Y., Danciu, O., Svitkina, T., & Borisy, G. G. (2006). Role
of fascin in filopodial protrusion. J Cell Biol, 174(6), 863-875.
https://doi.org/10.1083/jcb.200603013
Vijayan, K., Szotek, E. L., Martin, J. L., & Samarel, A. M. (2004). Protein kinase C-alpha-
induced hypertrophy of neonatal rat ventricular myocytes. Am J Physiol Heart
Circ Physiol, 287(6), H2777-2789. https://doi.org/10.1152/ajpheart.00171.2004
von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., & Raunser, S.
(2015). Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature, 519(7541), 114-
117. https://doi.org/10.1038/nature14033
Wagner, T., Merino, F., Stabrin, M., Moriya, T., Antoni, C., Apelbaum, A., . . . Raunser,
S. (2019). SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker
for cryo-EM. Commun Biol, 2, 218. https://doi.org/10.1038/s42003-019-0437-z
Walsh, M. F., Woo, R. K., Gomez, R., & Basson, M. D. (2004). Extracellular pressure
stimulates colon cancer cell proliferation via a mechanism requiring PKC and
tyrosine kinase signals. Cell Prolif, 37(6), 427-441.
https://doi.org/10.1111/j.1365-2184.2004.00324.x
Walter, T. S., Diprose, J. M., Mayo, C. J., Siebold, C., Pickford, M. G., Carter, L., . . .
Harlos, K. (2005). A procedure for setting up high-throughput nanolitre
crystallization experiments. Crystallization workflow for initial screening,
automated storage, imaging and optimization. Acta Crystallogr D Biol
Crystallogr, 61(Pt 6), 651-657. https://doi.org/10.1107/S0907444905007808
Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., & Aebersold, R. (2013). Mass spectrometry
supported determination of protein complex structure. Curr Opin Struct Biol,
23(2), 252-260. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2013.02.008
Wan, W., & Briggs, J. A. (2016). Cryo-Electron Tomography and Subtomogram
Averaging. Methods Enzymol, 579, 329-367.
https://doi.org/10.1016/bs.mie.2016.04.014
Wang, Y., Zhang, J. J., & Huang, X. Y. (2020). Anti-Metastasis Fascin Inhibitors Decrease
the Growth of Specific Subtypes of Cancers. Cancers (Basel), 12(8).
https://doi.org/10.3390/cancers12082287
Watanabe, T., Ono, Y., Taniyama, Y., Hazama, K., Igarashi, K., Ogita, K., . . . Nishizuka, Y.
(1992). Cell division arrest induced by phorbol ester in CHO cells overexpressing
protein kinase C-delta subspecies. Proc Natl Acad Sci U S A, 89(21), 10159-
10163. https://doi.org/10.1073/pnas.89.21.10159
Way, K. J., Chou, E., & King, G. L. (2000). Identification of PKC-isoform-specific
biological actions using pharmacological approaches. Trends Pharmacol Sci,
21(5), 181-187. https://doi.org/10.1016/s0165-6147(00)01468-1
Ways, D. K., Kukoly, C. A., deVente, J., Hooker, J. L., Bryant, W. O., Posekany, K. J., . . .
Parker, P. J. (1995). MCF-7 breast cancer cells transfected with protein kinase
C-alpha exhibit altered expression of other protein kinase C isoforms and
display a more aggressive neoplastic phenotype. J Clin Invest, 95(4), 1906-1915.
https://doi.org/10.1172/JCI117872
Wei, Y., & Guo, L. H. (2009). Binding interaction between polycyclic aromatic
compounds and DNA by fluorescence displacement method. Environ Toxicol
Chem, 28(5), 940-945. https://doi.org/10.1897/08-394.1
Woo, E. J., Starks, C. M., Carney, J. R., Arslanian, R., Cadapan, L., Zavala, S., & Licari, P.
(2002). Migrastatin and a new compound, isomigrastatin, from Streptomyces
404
REFERENCIAS
platensis. J Antibiot (Tokyo), 55(2), 141-146.

https://doi.org/10.7164/antibiotics.55.141
Woods, A., & Couchman, J. R. (1992). Protein kinase C involvement in focal adhesion
formation. J Cell Sci, 101 ( Pt 2), 277-290.
Wu, B., Zhou, H., Hu, L., Mu, Y., & Wu, Y. (2013). Involvement of PKCα activation in
TF/VIIa/PAR2-induced proliferation, migration, and survival of colon cancer cell
SW620. Tumour Biol, 34(2), 837-846. https://doi.org/10.1007/s13277-012-
0614-x
Wu, M., & Lander, G. C. (2020). How low can we go? Structure determination of small
biological complexes using single-particle cryo-EM. Curr Opin Struct Biol, 64, 9-
16. https://doi.org/10.1016/j.sbi.2020.05.007
Wu, X., & Rapoport, T. A. (2021). Cryo-EM structure determination of small proteins by
nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proc Natl Acad Sci U S A, 118(41).
Wälchli, M., Berneiser, K., Mangia, F., Imseng, S., Craigie, L. M., Stuttfeld, E., . . . Maier,
T. (2021). Regulation of human mTOR complexes by DEPTOR. Elife, 10.
https://doi.org/10.7554/eLife.70871
Xiang, Y., Li, Y., Zhang, Z., Cui, K., Wang, S., Yuan, X. B., . . . Duan, S. (2002). Nerve
growth cone guidance mediated by G protein-coupled receptors. Nat Neurosci,
5(9), 843-848. https://doi.org/10.1038/nn899
Xu, R. X., Pawelczyk, T., Xia, T. H., & Brown, S. C. (1997). NMR structure of a protein
kinase C-gamma phorbol-binding domain and study of protein-lipid micelle
interactions. Biochemistry, 36(35), 10709-10717.
https://doi.org/10.1021/bi970833a
Xu, Z. B., Chaudhary, D., Olland, S., Wolfrom, S., Czerwinski, R., Malakian, K., . . .
Mosyak, L. (2004). Catalytic domain crystal structure of protein kinase C-theta
(PKCtheta). J Biol Chem, 279(48), 50401-50409.
Xue, H., Li, J., Xie, H., & Wang, Y. (2018). Review of Drug Repositioning Approaches and
Resources. Int J Biol Sci, 14(10), 1232-1244. https://doi.org/10.7150/ijbs.24612
Yaka, R., Phamluong, K., & Ron, D. (2003). Scaffolding of Fyn kinase to the NMDA
receptor determines brain region sensitivity to ethanol. J Neurosci, 23(9), 3623-
3632.
Yamakita, Y., Matsumura, F., & Yamashiro, S. (2009). Fascin1 is dispensable for mouse
development but is favorable for neonatal survival. Cell Motil Cytoskeleton,
66(8), 524-534. https://doi.org/10.1002/cm.20356
Yamakita, Y., Ono, S., Matsumura, F., & Yamashiro, S. (1996). Phosphorylation of
human fascin inhibits its actin binding and bundling activities. J Biol Chem,
271(21), 12632-12638. https://doi.org/10.1074/jbc.271.21.12632
Yang, S., Huang, F. K., Huang, J., Chen, S., Jakoncic, J., Leo-Macias, A., . . . Huang, X. Y.
(2013). Molecular mechanism of fascin function in filopodial formation. J Biol
Chem, 288(1), 274-284. https://doi.org/10.1074/jbc.M112.427971
Yang, Y., & Igumenova, T. I. (2013). The C-terminal V5 domain of Protein Kinase Cα is
intrinsically disordered, with propensity to associate with a membrane
mimetic. PLoS One, 8(6), e65699.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065699
405
REFERENCIAS
Yarwood, S. J., Steele, M. R., Scotland, G., Houslay, M. D., & Bolger, G. B. (1999). The
RACK1 signaling scaffold protein selectively interacts with the cAMP-specific
phosphodiesterase PDE4D5 isoform. J Biol Chem, 274(21), 14909-14917.
https://doi.org/10.1074/jbc.274.21.14909
Yeates, T. O., Agdanowski, M. P., & Liu, Y. (2020). Development of imaging scaffolds for
cryo-electron microscopy. Curr Opin Struct Biol, 60, 142-149.
https://doi.org/10.1016/j.sbi.2020.01.012
Yesudasu, V., Pradhan, H. S., & Pandya, R. J. (2021). Recent progress in surface
plasmon resonance based sensors: A comprehensive review. Heliyon, 7(3),
e06321. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2021.e06321
Yoder, B. J., Tso, E., Skacel, M., Pettay, J., Tarr, S., Budd, T., . . . Hicks, D. G. (2005). The
expression of fascin, an actin-bundling motility protein, correlates with
hormone receptor-negative breast cancer and a more aggressive clinical
course. Clin Cancer Res, 11(1), 186-192.
Yoshida, K., Wang, H. G., Miki, Y., & Kufe, D. (2003). Protein kinase Cdelta is
responsible for constitutive and DNA damage-induced phosphorylation of
Rad9. EMBO J, 22(6), 1431-1441. https://doi.org/10.1093/emboj/cdg134
Zeidman, R., Löfgren, B., Pâhlman, S., & Larsson, C. (1999). PKCepsilon, via its
regulatory domain and independently of its catalytic domain, induces neurite-
like processes in neuroblastoma cells. J Cell Biol, 145(4), 713-726.
https://doi.org/10.1083/jcb.145.4.713
Zhang, D., Anantharam, V., Kanthasamy, A., & Kanthasamy, A. G. (2007).
Neuroprotective effect of protein kinase C delta inhibitor rottlerin in cell
culture and animal models of Parkinson's disease. J Pharmacol Exp Ther, 322(3),
913-922. https://doi.org/10.1124/jpet.107.124669
Zhang, G., Kazanietz, M. G., Blumberg, P. M., & Hurley, J. H. (1995). Crystal structure of
the cys2 activator-binding domain of protein kinase C delta in complex with
phorbol ester. Cell, 81(6), 917-924. https://doi.org/10.1016/0092-
8674(95)90011-x
Zhang, K. (2016). Gctf: Real-time CTF determination and correction. J Struct Biol,
193(1), 1-12. https://doi.org/10.1016/j.jsb.2015.11.003
Zhang, K., Li, S., Kappel, K., Pintilie, G., Su, Z., Mou, T. C., . . . Chiu, W. (2019). Cryo-EM
structure of a 40 kDa SAM-IV riboswitch RNA at 3.7 Å resolution. Nat Commun,
10(1), 5511. https://doi.org/10.1038/s41467-019-13494-7
Zhang, L., Huang, J., Yang, N., Liang, S., Barchetti, A., Giannakakis, A., . . . Coukos, G.
(2006). Integrative genomic analysis of protein kinase C (PKC) family identifies
PKCiota as a biomarker and potential oncogene in ovarian carcinoma. Cancer
Res, 66(9), 4627-4635. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-05-4527
Zhao, X., Gao, S., Ren, H., Sun, W., Zhang, H., Sun, J., . . . Hao, J. (2014). Hypoxia-
inducible factor-1 promotes pancreatic ductal adenocarcinoma invasion and
metastasis by activating transcription of the actin-bundling protein fascin.
Cancer Res, 74(9), 2455-2464. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-13-
3009
Zhao, Z., Wang, Y., Zhang, J. J., & Huang, X. Y. (2021). Fascin Inhibitors Decrease Cell
Migration and Adhesion While Increase Overall Survival of Mice Bearing
Bladder Cancers. Cancers (Basel), 13(11).
https://doi.org/10.3390/cancers13112698
406
REFERENCIAS
Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., & Agard, D. A. (2017).
MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved
cryo-electron microscopy. Nat Methods, 14(4), 331-332.
Śledź, P., & Caflisch, A. (2018). Protein structure-based drug design: from docking to
molecular dynamics. Curr Opin Struct Biol, 48, 93-102.
https://doi.org/10.1016/j.sbi.2017.10.010
407

Tesis Completa CD

Cargado por

Información del documento

Descripción original:

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Tesis Completa CD

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

UNIVERSIDAD DE MURCIA

ESCUELA INTERNACIONAL DE DOCTORADO

Caracterización estructural y funcional de

D. Jesús Baltanás Copado

− Interacciones de proteínas multidominio con membranas: proteínas quinasas c y

ENGLISH REPORT ....................................................................................................... 1

III. MATERIAL AND METHODS. ................................................................................... 5

IV.1 BIOPHYSICAL CHARACTERIZATION OF THE INTERACTION BETWEEN PKCα AND TARGET

LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................................... 17

CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS. .............................................................. 23

1. EL INICIO DEL ESTUDIO DE LAS PKCs. .................................................................... 25

2. ESTRUCTURA DE LAS PKCs. .................................................................................. 26

2.1 REGIÓN REGULADORA. .............................................................................................. 27

4. FOSFORILACIONES CLAVES EN LA ACTIVACIÓN DE LAS PKCs................................. 33

5. INFORMACIÓN ESTRUCTURAL ACTUAL DE LAS PKCs Y NUEVOS MODELOS DE

6. RACK1 COMO SOPORTE ESTRUCTURAL PARADIGMA DE PKCs. ............................. 42

6.1 ESTRUCTURA DE RACK. .............................................................................................. 42

7.1 ESTRUCTURA DE FASCIN1. ......................................................................................... 47

8.1 PROLIFERACIÓN CELULAR Y CICLO CELULAR. .............................................................. 55

10. PKC Y CÁNCER. ................................................................................................... 61

10.1 INTRODUCCIÓN. PMA E INICIO DEL ESTUDIO DE PKC EN CÁNCER. ............................ 61

CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS. ................................................................... 67

1. MÉTODOS DE BIOLOGÍA MOLECULAR. ................................................................. 69

1.1 VECTORES DE EXPRESIÓN. ......................................................................................... 69

1.1.3 Vector de expresión pGEX4T. ..................................................................................................71

2.1 CÉLULAS DE INSECTO SF9. .......................................................................................... 85

3.1 ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA. SDS-PAGE. ........................................ 89

4.1 EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE PKCα, PKCε, PKCζ y PROTEÍNAS DE FUSIÓN A, H, E y D.

5.1 SPR. ......................................................................................................................... 107

6. TÉCNICAS CON CÉLULAS MODELO DE CÁNCER DE MAMA. ................................. 124

6.1 ENSAYOS DE PERFUSIÓN ACOPLADOS AL MICROSCOPIO CONFOCAL. ...................... 124

7.1 CRIOMICROSCOPÍA ELECTRÓNICA. ........................................................................... 128

1 INTRODUCCIÓN. ................................................................................................. 155

2 RESULTADOS. ..................................................................................................... 156

2.1 PKCα. ....................................................................................................................... 157

CAPÍTULO IV. CARACTERIZACIÓN BIOFÍSICA DE LA INTERACCIÓN ENTRE PKCα Y

1 INTRODUCCIÓN. ................................................................................................. 183

1.1 Surface Plasmon Resonance (SPR). .......................................................................... 183

2.1. MEDIDA DE LA AFINIDAD ENTRE PKCα-FASCIN1 EN LAS DIVERSAS COMBINACIONES

2.3. ESPECTROMETRÍA DE MASAS NATIVA PARA PKCα, FASCIN1 Y EL COMPLEJO PROTEICO

CAPÍTULO V. DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE PKCα Y

1 INTRODUCCIÓN. ................................................................................................. 207

2 RESULTADOS. ..................................................................................................... 208

2.1 CRISTALIZACIÓN DE LA PROTEÍNA PKCα Y LOS COMPLEJOS PROTEICOS PKCα-FASCIN1

CAPÍTULO VI. DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DEL COMPLEJO

1 INTRODUCCIÓN. ................................................................................................. 259

2 RESULTADOS. ..................................................................................................... 262

2.1 CRIOMICROSCOPÍA ELECTRÓNICA Y RECOLECCIÓN DE DATOS PARA LA PROTEÍNA PKCα

2.4 ANÁLISIS POR MEDIO DE CRIOMICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE LAS CONSTRUCCIONES

CAPÍTULO VII. ESTUDIO DE LA UNIÓN ENTRE FASCIN1 Y F-ACTINA POR MEDIO DE

1 INTRODUCCIÓN. ................................................................................................. 299

2 RESULTADOS. ..................................................................................................... 302

2.1 FASCIN1-S39D CON ACTIVIDAD NO NUCLEADORA COMO CANDIDATA A

CAPÍTULO VIII. RESCATE Y REPOSICIONAMIENTO DE FÁRMACOS QUE SE UNEN AL

1.- INTRODUCCIÓN. ............................................................................................... 321

2. RESULTADOS. .................................................................................................... 323

2.1 BÚSQUEDA DE FÁRMACOS POR MEDIO DE BASES DE DATOS DE INTERACCCIÓN

CAPÍTULO IX. DISCUSIÓN GENERAL Y CONCLUSIONES. ........................................... 363

DISCUSIÓN FINAL. ......................................................................................................... 365

Quisiera agradecer también a mis compañeros de laboratorio Virginia, Sonia,

No quisiera olvidar tampoco a mis compañeros de carrera Paco y Ricardo, que

También quiero mostrar mi más profundo agradecimiento a Tere y MD, quienes